Đặc tính sinh học phân tử chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC phân lập tại một số bệnh viện trên địa..

Nội dung tài liệu: Đặc tính sinh học phân tử chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC phân lập tại một số bệnh viện trên địa..

1. VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN HOÀI THU ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CHỦNG KLEBSIELLA PNEUMONIAE KHÁNG CARBAPENEM MANG GEN BLAKPC PHÂN LẬP TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 62 42 01 07 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2018
2. Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Bình Minh Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương 2. PGS.TS. Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: PGS. TS. Hồ Thị Minh Lý Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Phản biện 2: PGS. TS. Lê Văn Phủng Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Phản biện 3: PGS. TS. Tô Kim Anh Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ phiên chính thức tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Vào hồi ngày tháng năm 201 . Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học - Trang web của Bộ GD&ĐT:
3. 1 MỞ ĐẦU Kể từ khi được phát minh, kháng sinh đã đóng vai trò quan trọng hàng đầu trong nền y học hiện đại góp phần to lớn vào công tác điều trị và khống chế bệnh nhiễm trùng. Tuy nhiên, do sử dụng kháng sinh nhiều và kéo dài đã dẫn đến tình trạng gia tăng các chủng vi khuẩn kháng đa kháng sinh thế hệ mới phổ rộng ở nhiều nước trên thế giới. Do vậy, nhóm carbapenem hiện nay được sử dụng là thuốc đầu tay trong các bệnh viện để điều trị các trường hợp nhiễm trùng nặng với các chủng vi khuẩn kháng các kháng sinh phổ rộng. Thực trạng sử dụng và lạm dụng kháng sinh đã gây ra áp lực chọn lọc cho vi khuẩn kháng lại các kháng sinh nhóm carbapenem. Đây là một trong những vấn đề hiện nay đang được tổ chức Y tế Thế giới, các quốc gia và nhiều nhà khoa học quan tâm hàng đầu. Các bệnh nhân bị nhiễm trùng bởi các vi khuẩn kháng carbapenem sẽ làm tăng nguy cơ thất bại trong điều trị, tăng chi phí, kéo dài thời gian điều trị và nguy cơ tử vong cao cho bệnh nhân. Thêm vào đó những bệnh nhân bị nhiễm các chủng kháng carbapenem khi trở về cộng đồng sẽ là nguồn lây lan các chủng vi khuẩn kháng thuốc trong cộng đồng. Với tình trạng kháng kháng sinh mạnh mẽ của các vi khuẩn như hiện nay sẽ dẫn tới tình trạng không có kháng sinh điều trị hiệu quả các vi khuẩn này trong 5-10 năm tới. Tại Việt Nam các nghiên cứu trước đây về tình hình kháng thuốc đã cung cấp nhiều thông tin quan trọng giúp cho công tác điều trị, phòng chống dịch và quản lý sử dụng kháng sinh. Mặc dù Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem nguyên nhân hàng đầu trong nhiễm khuẩn bệnh viện, cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào về dịch tễ học phân tử được thực hiện trên các chủng tại Việt Nam. Để tìm hiểu về tỷ lệ các chủng mang gen kháng kháng sinh tại các bệnh viện trên địa bàn Hà Nội, cũng như đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Đặc tính sinh học phân tử chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC phân lập tại một số bệnh viện trên địa bàn Hà Nội” với ba mục tiêu cụ thể sau: - Xác định đặc tính đề kháng carbapenem qua KPC của các chủng K. pneumoniae phân lập tại ba bệnh viện trên địa bàn Hà Nội. - Xác định khả năng truyền gen kháng kháng sinh của các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC. - Xác định đặc tính dịch tễ học phân tử của các chủng K. pneumoniae mang gen blaKPC.
4. 2 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Phát hiện vi khuẩn K. pneumoniae đề kháng carbapenem thông qua gen mã hóa KPC-2 tại miền Bắc Việt Nam. 2. Chứng minh sự lan truyền gen mã hóa enzyme KPC kháng carbapenem sang E. coli J53 của các chủng K. pneumoniae phân lập được tại ba bệnh viện lớn của Hà Nội trong điều kiện phòng thí nghiệm. 3. Chứng minh mối liên quan dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được tại các bệnh viện qua các năm và giữa các bệnh viện. BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 161 trang. Mở đầu 2 trang, Kết luận - Đề nghị 2 trang. Luận án có 4 chương: Tổng quan 37 trang, Vật liệu - Phương pháp 10 trang, Kết quả 30 trang, Bàn luận 20 trang. Luận án có 22 bảng, 24 hình, 1 sơ đồ, 5 phụ lục và 182 tài liệu tham khảo với 7 tài liệu tiếng Việt, 167 tài liệu tiếng Anh và 8 tài liệu là website. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Klebsiella pneumoniae gây bệnh trên người Klebsiella pneumoniae là trực khuẩn gram âm, không di động, có khả năng lên men lactose, là vi khuẩn kị khí tùy tiện (Ryan, 2004). Vi khuẩn này được bao quanh bởi một lớp vỏ, có tác dụng làm tăng độc tính của vi khuẩn bằng cách hoạt động như một rào cản vật lý để tránh phản ứng miễn dịch của vật chủ. K. pneumoniae là vi khuẩn phổ biến trong môi trường sống, nó có thể cư trú trong hệ vi sinh của người. Mặc dù được tìm thấy trong hệ vi khuẩn chí bình thường ở người, K. pneumoniae có thể biến đổi thành dạng vi khuẩn có khả năng gây nhiễm khuẩn nặng cho người. K. pneumoniae là một trong ba tác nhân vi khuẩn hàng đầu (K. pneumoniae, E. coli, S. aureus) trong 7 tác nhân gây nhiễm khuẩn cho người được Tổ chức Y tế thế giới liệt kê, đưa vào danh sách các chủng vi khuẩn kháng kháng sinh mấu chốt (O’Neill, 2014). Chính vì vậy, nghiên cứu các đặc tính kháng kháng sinh và dịch tễ học phân tử các chủng K. pneumoniae gây bệnh trên người có vai trò hết sức quan trọng trong việc kiểm soát sự gia tăng kháng kháng sinh trên toàn cầu.
5. 3 1.2. Kháng sinh carbapenem Carbapenem (imipenem, meropenem, biapenem, ertapenem và doripenem) là các thuốc kháng sinh nhóm β lactam. Vì carbapenem có phổ rộng nhất trong số tất cả các β lactam và chủ yếu được sử dụng để điều trị nhiễm trùng bởi các vi khuẩn Gram âm đa kháng kháng sinh, sự xuất hiện và lan truyền carbapenemase đã trở thành một mối thách thức lớn đối với sức khoẻ cộng đồng (Jeon, 2015). Hiện nay, carbapenem là kháng sinh thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng” để điều trị cho các trường hợp nhiễm trùng với các vi khuẩn kháng kháng sinh phổ rộng như E. coli, K. pneumoniae. Tuy nhiên do việc sử dụng rộng rãi đã tạo áp lực chọn lọc cho vi khuẩn kháng lại kháng sinh này. 1.3. Klebsiella pneumoniae kháng kháng sinh qua cơ chế sinh KPC 1.3.1. Đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Khả năng kháng thuốc là sức đề kháng của vi sinh vật với một loại kháng sinh mà ban đầu có hiệu quả để điều trị các bệnh nhiễm trùng. Do tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn mà phương pháp điều trị tiêu chuẩn trở nên không còn hiệu quả và nhiễm trùng trở nên kéo dài, làm tăng nguy cơ lây lan trong cộng đồng. Vi khuẩn trở nên kháng kháng sinh qua một loạt các cơ chế. Trong tất cả các cơ chế kháng kháng sinh, khả năng sinh enzyme phân hủy kháng sinh là một trong những cơ chế quan trọng hàng đầu đang được các nhà nghiên cứu trên thế giới tập trung nghiên cứu. Trong một vài năm gần đây, các gen kháng kháng sinh vi khuẩn thu nhận được mang gen mã hóa ESBL, carbapenem đang trở thành một vấn đề nan giải trên toàn cầu (Bradford, 2001). 1.3.2. Đặc tính kháng carbapenem 1.3.2.1. Các cơ chế kháng carbapenem Khả năng kháng lại carbapenem của các vi khuẩn Gram âm có thể xảy ra thông qua các cơ chế: kênh vận chuyển carbapenem ra khỏi tế bào, tăng cường cơ chế bơm đẩy đã được ghi nhận ở một số chủng kháng kháng sinh, sự đột biến hay mất một số porin màng ngoài, ngăn cản các kháng sinh vào trong tế bào, túi màng ngoài (OMV), có thể vận chuyển ADN giữa các tế bào vi khuẩn qua hoạt động trao đổi chất và OMV không phải là sản phẩm của cơ chế ly giải tế bào hoặc gây chết tế bào. OMV bảo vệ plasmid không bị ly giải bởi nuclease màng ngoài tế bào và đây là điều kiện phù hợp để chúng được chuyển gen ngang ( Buynak,
6. 4 2004). Cơ chế quan trọng nhất tạo nên khả năng kháng carbapenem của Klebsiella là khả năng sản sinh enzyme carbapenemase. 1.3.2.2. Enzyme carbapenemase Các vi khuẩn đường ruột kháng lại carbapenem do có khả năng sinh ra enzyme carbapenemase, là một dạng của beta lactamase (Bratu, 2007). Những enzyme này chia cắt vòng -lactam, là thành phần cần thiết của các kháng sinh họ -lactam dùng để nhận diện và bám vào các PBP (penicillin binding protein). Carbapenemase là họ β-lactamase linh hoạt nhất có khả năng thủy phân carbapenems và nhiều β-lactam khác. Dựa trên sự hoạt hóa enzyme dưới tác động của các cation hóa trị hai, các carbapenemase có thể chia thành các metallo carbapenemase (carbapenemase nhóm B hoạt hóa bởi kẽm) và non metallo carbapenemase (các carbapenemase nhóm A, C và D hoạt hóa không phụ thuộc kẽm) ( Lee, 2006). Carbapenemase quan trọng hàng đầu của họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriace là enzyme nhóm A (KPC) và nhóm B (MbLs), đại diện cho các nhóm này là các gen VIM, IMP, và NDM. Các plasmid nhóm D bao gồm OXA 48 cũng góp phần hoàn thiện bản đồ phân bố của enzyme này (Grundmann, 2010; Miriagou, 2010; Patel, 2011). 1.3.3. Đặc điểm dịch tễ học các chủng Klebsiella pneumoniae sinh KPC 1.3.3.1. Klebsiella pneumoniae sinh KPC kháng carbapenem trên thế giới Trong vòng 10 năm trở lại đây, sự gia tăng đột biến tỷ lệ Klebsiella kháng carbapenem đã được ghi nhận trên toàn cầu. Bản đồ dịch tễ cho thấy sự gia tăng một cách nhanh chóng của các chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen bla KPC mã hóa KPC. Sự phân bố của KPC thay đổi tùy vùng. Sự có mặt của những vi khuẩn này đã được ghi nhận ở Mỹ, Trung Quốc, Ý, Ba Lan, Hy Lạp, Israel, Brazil, Argentina, Colombia và Đài Loan. Các ca bệnh nhiễm khuẩn rải rác có nguyên nhân do K. pneumoniae sinh KPC cũng đã được báo cáo ở nhiều nước châu Âu như Tây Ban Nha, Pháp, Đức, Hà Lan, Anh, Ailen, Bỉ, Thụy Điển, Phần Lan, và một số nước ở khu vực châu Á, bao gồm Ấn Độ, Hàn Quốc và Úc ( Munoz-Price, 2013; Nordmann, 2014). 1.3.3.2. Klebsiella pneumoniae sinh KPC kháng carbapenem tại Việt Nam Tại Việt Nam, hiện các nghiên cứu tập trung vào xác định tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện do vi khuẩn K. pneumoniae gây ra và mức độ kháng kháng sinh của các chủng phân lập được mà chưa có nhiều các nghiên cứu chuyên sâu về đặc tính sinh học của các chủng này. Mới
7. 5 đây nhất, nghiên cứu của Trần Nhật Phương và cộng sự trên các vi khuẩn K. pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC tại một số bệnh viện trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh cho thấy các chủng K. pneumoniae phân lập được mang gen bla KPC nhóm 2 và cũng kháng nhiều kháng sinh ở mức độ cao (Trần Nhật Phương, 2012). Nhóm nghiên cứu cũng phát hiện sự kết hợp giữa các gen bla KPC và ESBL trên các chủng K. pneumoniae. Thêm vào đó, khả năng truyền plasmid mang gen bla KPC của các chủng K. pneumoniae sang E. coli J53 trong điều kiện phòng thí nghiệm của các chủng phân lập được tại miền Nam Việt Nam cũng đã được chứng minh trong nghiên cứu (Trần Nhật Phương, 2015). 1.3.4. Đặc tính sinh học phân tử của các chủng Klebsiella pneumoniae mang gen blaKPC Gene blaKPC đầu tiên được phân lập tại Bắc Carolina được đặt tên là KPC-1 ( Yigit, 2001). Các biến thể sau này của KPC được đặt tên lần lượt theo thứ tự từ KPC-2 đến KPC- 22 (Wang, 2014; Wang D, 2014). Tuy nhiên, một nghiên cứu mới đã tìm ra sai sót trong việc giải trình tự của KPC-1 đã cho thấy KPC-1 và KPC-2 trên thực tế chỉ là một. Hiện tại, các biến thể KPC chỉ khác KPC-2 ở 2 nucleotid trong 4 codon (Chen L, 2011). Trong hơn 20 biến thể khác nhau của gen bla KPC (Girmenia, 2016), KPC-2 và KPC-3 là phổ biến nhất trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng và trong hầu hết các vụ dịch địa phương. KPC-2 được xem là phổ biến nhất trên toàn thế giới, với các vụ dịch không chỉ giới hạn trong phạm vi nước Mỹ mà còn cả ở Châu Âu (đặc biệt là Hy Lạp) và Trung Quốc. KPC-3 chủ yếu được phát hiện ở Mỹ, Mỹ La tinh và Israel. Việc chuyển gen ngang của bla KPC có thể xảy ra giữa các vi khuẩn nhờ các yếu tố chứa gen này thường xuyên được di chuyển nhờ các gen nhảy (đặc biệt là Tn4401) và được gắn trên các plasmid có khả năng lan truyền trong các vi khuẩn Gram âm (Naas T, 2008; Rasheed JK, 2008). 1.4. Các con đường lan truyền gen kháng kháng sinh blaKPC Các gen kháng kháng sinh thu được thường nằm trong các đoạn ADN di động dễ có khả năng hoán vị từ vị trí này sang vị trí khác giữa các bộ gen khác nhau. Các yếu tố nhảy này bao gồm các nhân tố di động riêng biệt khác nhau. Mấu chốt chính trong quá trình chuyển gen ngang (HGT-horizontal gene transfer) chính là các nhân tố ADN di động có khả năng tiếp hợp. Vi khuẩn cho chứa tất cả các thông tin di truyền cần thiết để thực hiện việc chuyển các nhân tố di truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. Sau đó, vi khuẩn nhận sẽ sử dụng chức năng tiếp hợp này để truyền các ADN nhận được sang vật chủ khác thông qua plasmid tiếp hợp hoặc các tiểu phần chuyển vị tiếp hợp.
8. 6 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm nghiên cứu Chọn có chủ đích ba bệnh viện lớn của Hà Nội làm địa điểm thu thập mẫu: Xanh pôn, Thanh Nhàn và Việt Đức. Các bệnh viện trên đều luôn trong tình trạng quá tải, kháng sinh được sử dụng thường xuyên trong điều trị. Đây là các điều kiện thuận lợi để tạo áp lực chọn lọc cho vi khuẩn kháng lại các kháng sinh trong đó có carbapenem. 2.2. Đối tượng và cỡ mẫu nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Tất cả các vi khuẩn phân lập được tại vị trí nghi nhiễm khuẩn (tổ chức bị nhiễm khuẩn, dịch hô hấp, dịch áp xe, nước tiểu ) được khoa xét nghiệm vi sinh của bệnh viện làm xét nghiệm xác định các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn. Các chủng vi khuẩn được định danh là K. pneumoniae và có khả năng kháng lại một trong 3 loại kháng sinh meropenem, imipenem, ertapenem và doripenem trong thử nghiệm khoanh giấy sẽ được đưa vào nghiên cứu. 2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu Toàn bộ 139 chủng K. pneumoniae kháng carbapenem phân lập được tại 3 bệnh viện từ 2010-2014. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn (theo thường quy của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương) Các mẫu bệnh phẩm sau khi thu thập sẽ được cấy lên đĩa thạch Mac Conkey (Bio-rad) ủ 37oC trong 18-24 giờ. Lựa chọn các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch làm phản ứng sinh hóa bằng bộ định danh API-20E system (Biomerieux). 2.3.2. Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh (CLSI) • Sử dụng khoanh giấy (Bio-rad) của 13 loại kháng sinh gồm: - Beta lactam: amoxicillin clavulanate (AMC, 20+10µg), imipenem (IPM, 10 µg), meropenem (MEM, 10µg), ertapenem (ETP, 10µg) - Cephalosporin: cephalothin (CF, 30µg), cefuroxim (CXM, 30µg), ceftazidime (CAZ, 30µg), cefotaxim (CTX, 30µg), ceftriaxone (CRO, 30µg), Cefepime (FEP, 30µg)
9. 7 - Aminoglycoside: gentamicin (GM, 30µg) - Quinolon: ciprofloxacin (CIP, 5µg) - Cotrimoxazole: Trimethoprim sulphamethoxazole (SXT, 1,25+23,75µg) • Kỹ thuật nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): Nồng độ ức chế tối thiểu được xác định bằng phương pháp pha loãng kháng sinh trên thạch Mueller-hinton dựa theo tiêu chuẩn của CLSI 2015. Các kháng sinh thử nghiệm bao gồm: IMP, MEM, CAZ, CTX, CIP và COL (Bio-rad). Chủng chuẩn quốc tế Escherichia coli ATCC-25922 được tiến hành song song để đảm bảo tính chính xác của các thử nghiệm. 2.3.3. PCR phát hiện gen blaKPC kháng carbapenem (Shanmugam, 2013) - Thành phần PCR: 10µl 2X Master-Mix (Promega), 0,2µl mồi xuôi, 0,2µl mồi ngược, 7,6µl nước siêu sạch và 2µl khuôn mẫu ADN. o o - Chu trình PCR đơn mồi phát hiện gen bla KPC: 94 C/5 phút, 30 chu kỳ 94 C/1 phút, 60oC/1 phút, 72oC/1 phút, 72oC/7 phút (máy luân nhiệt Applied Biosystem). 2.3.4. Giải trình tự gen kháng kháng sinh Giải trình tự gen bla KPC của các chủng vi khuẩn bằng máy đọc trình tự gen Applied Biosystem-3310 để xác định chính xác gen blaKPC. 2.3.5. PCR phát hiện gen ESBL kháng kháng sinh phổ rộng (Yang, 2013) - Thành phần PCR cho gen blaTEM: 15µl Go Taq Master Mix (Promega); 0,3µl mồi mỗi loại; 3 µl khuôn mẫu ADN và 11,4µl nước cất - Thành phần PCR cho các gen blaSHV, blaCTX-M: 15µl Go Taq Master Mix (Promega); 0,5µl mồi mỗi loại; 3µl khuôn mẫu DNA và 11µl nước cất. - Chu trình PCR: 94oC trong 5 phút; 30 chu kỳ bao gồm: 94oC trong 36 giây, 60oC trong 36 giây, 72oC trong 1 phút và 72oC trong 5 phút (máy luân nhiệt Applied Biosystem). 2.3.6. Phát hiện plasmid mang gen kháng kháng sinh (Yang, 2013) Sử dụng kỹ thuật Southern blot để phát hiện plasmid mang gen kháng kháng sinh. ADN vi khuẩn sau khi cắt bằng emzyme S1 được chuyển sang màng nitrocellulose và được lai với các đoạn mồi đặc hiệu của gen kháng kháng sinh blaKPC đã được đánh dấu để phát hiện các plasmid mang gen kháng kháng sinh.
10. 8 2.3.7. Thử nghiệm khả năng truyền plamsid mang gen blaKPC (Al-Marzooq, 2015) Chủng cho: K. pneumoniae có plasmid mang gen bla KPC. Chủng nhận: E. coli J53 kháng sodium azide. Thử nghiệm được thực hiện trong môi trường LB và chọn lọc trên môi trường có chứa 2g/ml meropenem và sodium azide. 2.3.8. Xác định mối liên hệ kiểu gen của các chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem bằng kỹ thuật PFGE ADN tổng số được diện di trên thạch SeakemGold. Kết quả được phân tích bằng phần mềm Bionumeric. 2.3.9. Xác định mối liên hệ kiểu gen của các chủng vi khuẩn Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem bằng kỹ thuật MLST Dựa trên 7 house keeping gene thiết kế các cặp mồi đặc hiệu và chạy PCR. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xác định đặc tính đề kháng carbapenem qua KPC của các chủng Klebsiella pneumoniae 3.1.1. Phát hiện Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem Tổng số 174 chủng vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem thu thập được từ ba bệnh viện Xanh pôn, Thanh Nhàn và Việt Đức bao gồm nhiều loại vi khuẩn: E. coli, K. pneumoniae, E. cloacae, C. freundii và Enterobacter, trong đó có 139 chủng K. pneumoniae chiếm tỷ lệ 79,9%. Bệnh viện Xanh pôn có tỷ lệ chủng K. pneumoniae kháng carbapenem cao trên 95% (89/93 chủng), tiếp đến là bệnh viện Thanh Nhàn với xấp xỉ 64% (35/55 chủng). Tỷ lệ phân lập được các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem đạt thấp nhất tại bệnh viện Việt Đức với 58% (15/26 chủng). 3.1.2. Phát hiện Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC Tỷ lệ chủng K. pneumoniae kháng carbapenem thu thập được từ 2010 đến 2014 tại ba bệnh viện Xanh pôn, Thanh Nhàn và Việt Đức mang gen bla KPC chiếm tỷ lệ 54% (75/139 chủng). Gen blaKPC có kích thước 881 bp. Trong tổng số chủng K. pneumoniae kháng carbapenem tại mỗi bệnh viện, bệnh viện Xanh pôn có tỷ lệ phát hiện K. pneumoniae mang gen blaKPC cao với 66/89 chủng (74,16%) (2010: 5 chủng, 2011: 27 chủng, 2012: 16 chủng,
11. 9 2013: 15 chủng, 2014: 3 chủng). Trong 75 chủng K. pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC, bệnh viện Xanh pôn có tỷ lệ K. pneumoniae mang gen blaKPC cao nhất với 66/75 chủng (88%), tiếp đến là Thanh Nhàn với 8/75 chủng (10,6%), thấp nhất là Việt Đức chỉ phân lập được 1 chủng (1,3%). 3.1.3. Kết quả giải trình tự gen blaKPC Kết quả giải trình tự cho thấy các gen blaKPC của 75 chủng K. pneumoniae phân lập tại ba bệnh viện giống 100% với gen bla KPC-2 trong ngân hàng gen mã số: AF297554.1 (hình 3.4). Graphic Summary:Distribution of 101 Blast Hits on the Query Sequence Klebsiella pneumoniae strain NF911069 class A carbapenemase blaKPC-2 (blaKPC-2) gene, partial cds Hình 3.4.1So sánh trình tự gen blaKPC của K. pneumoniae kháng carbapenem trong nghiên cứu với trình tự chuẩn trong ngân hàng gen 3.1.4. Mức độ đề kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 3.1.4.1. Kết quả thử nghiệm khoanh giấy kháng sinh Kháng sinh đồ được thực hiện theo phương pháp khuếch tán trên thạch Kirby Bauer theo hướng dẫn của Viện tiêu chuẩn lâm sàng và phòng thí nghiệm (CSLI 2015) cho 13 loại kháng sinh gồm: beta lactam (AMC: amoxicillin clavulanate, IPM: imipenem, MEM:
12. 10 meropenem, ETP: ertapenem), cephalosporin (CF: cephalothin, CXM: cefuroxim, CAZ: ceftazidime, CTX: cefotaxim, CRO: ceftriaxone, FEP), aminoglycoside (GM: gentamicin), quinolon (CIP: ciprofloxacin), và cotrimoxazole (SXT: Trimethoprim sulphamethoxazole). Kết quả khoanh giấy kháng sinh cho thấy 100% các chủng K. pneumoniae phân lập được tại 3 bệnh viện kháng với ertapenem (kháng sinh thuộc nhóm carbapenem thường dùng trong điều trị). Hầu hết các chủng kháng với các loại kháng sinh, chỉ còn một số ít chủng Klebsiella còn nhạy cảm với GM, CIP, IPM, MEM và SXT tại bệnh viện Xanh pôn (chiếm tỷ lệ từ 1 đến dưới 20%, cỡ mẫu 66) và AMC, IPM, MEM tại bệnh viện Thanh Nhàn (dưới 50%, cỡ mẫu 8). Tỷ lệ đề kháng của K. pneumoniae với các kháng sinh ATM, CF, CXM, CAZ, CTX, CRO, ETP là 100% với cả 3 bệnh viện. Duy nhất kháng sinh FEP phát hiện có đề kháng ở mức trung gian với tỷ lệ là 4,5% ở bệnh viện Thanh Nhàn. 3.1.4.2. Kết quả thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu • Kết quả thử nghiệm MIC của bệnh viện Xanh pôn cho thấy: 89,4% (59/66 chủng) kháng với IMP, trong đó có 12 chủng kháng rất mạnh với MIC > 64 mg/L, 36 chủng kháng mạnh với MIC dao động 32-64 mg/L; 89,4% (59/66 chủng) kháng với MEM, trong đó có 21 chủng kháng rất mạnh với MIC>64 mg/L, 32 chủng kháng mạnh với MIC dao động 32-64 mg/L; 91% (60/66 chủng) kháng rất mạnh với CAZ, trong đó có 58 chủng kháng mạnh với MIC>64 mg/L; 89,4% (59/66 chủng) kháng rất mạnh với CTX, trong đó 57 chủng kháng mạnh với MIC>32 mg/L, 3% (2/66 chủng) kháng trung gian; 91% (60/66) chủng kháng với CIP, trong đó 10 chủng kháng rất mạnh với MIC>128 mg/L, 4 chủng kháng ở mức trung gian. Duy nhất kháng sinh COL còn có tỷ lệ chủng nhạy cảm cao hơn 75% (50/66 chủng). Bảng 3.5.1Kết quả MIC50 và MIC90 tại bệnh viện Xanh pôn MIC (g/ml) Kháng sinh Phạm vi MIC50 MIC90 Imipenem 8->64 32 >64 Meropenem 8->64 32 >64 Ceftazidime 16-512 64 128 Cefotaxime 16-128 32 64 Ciprofloxacin 4-512 16 256 Colistin 8-32 8 16
13. 11 MIC50 và MIC90 được thể hiện ở bảng 3.5 cho thấy kháng sinh nhóm carbapenem và cephalosporin có MIC50 ở mức cao (>32 g/ml). • Kết quả MIC tại bệnh viện Thanh Nhàn cho thấy: 62,5% (5/8 chủng) kháng với IMP với MIC 16-32 g/L; 75% (6/8 chủng) kháng với MEM với MIC 16-32 g/L; đề kháng rất mạnh MIC dao động từ 64-128 g/L và 32-128 g/L thu được ở cả 8 chủng với các kháng sinh lần lượt là CAZ, CTX; 87,5% (7/8 chủng) kháng với CIP với MIC 32 g/L; 62,5% (5/8 chủng) kháng với COL với MIC dao động từ 4-16 g/L. Không giống như bệnh viện Xanh pôn, MIC 50 và MIC90 của bệnh viện Thanh Nhàn (bảng 3.7) cho thấy chỉ kháng sinh nhóm cephalosporin có MIC 50 cao trên 32 g/ml. Các kháng sinh nhóm carbapenem và ciprofloxacin có MIC50 giống nhau là 16 g/ml. Thấp nhất vẫn là kháng sinh colistin với MIC50 là 8 g/ml. Bảng 3.7.2Kết quả MIC50 và MIC90 tại bệnh viện Thanh Nhàn MIC (g/ml) Kháng sinh Phạm vi MIC50 MIC90 Imipenem 16-32 16 32 Meropenem 16-32 16 32 Ceftazidime 64-128 64 128 Cefotaxime 32-128 32 64 Ciprofloxacin 8-128 16 32 Colistin 4-16 8 16 • Kết quả MIC tại bệnh viện Việt Đức Tuy chỉ phân lập được duy nhất 1 chủng K. pneumoniae tại bệnh viện Việt Đức nhưng kết quả nồng độ ức chế tối thiểu cho thấy chủng này cũng kháng lại toàn bộ 6 loại kháng sinh hay được sử dụng trong lâm sàng ở mức độ kháng rất mạnh: IMP và MEM (MIC>64 g/L), CIP (MIC=128 g/L), CAZ (MIC=256 g/L), CTX (MIC=512 g/L). Duy nhất kháng sinh COL kháng ở mức thấp với MIC=8 g/L.
14. 12 3.1.5. Phát hiện vi khuẩn mang gen ESBL trên các chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC phân lập tại các bệnh viện Bảng 3.10.3Kiểu hình ESBL của các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC Số gen ESBL Kiểu hình ESBL Số chủng (%) Bệnh viện n=75 1 SHV 5 (6,67) Xanh pôn, Thanh Nhàn 2 TEM 3 (4) Xanh pôn 2 SHV, TEM 59 (78,67) Xanh pôn, Thanh Nhàn 2 SHV, CTX-M 1 (1,33) Việt Đức 3 SHV, TEM, CTX-M 7 (9,33) Xanh pôn, Thanh Nhàn 3.1.6. Một số đặc điểm của bệnh nhân nhiễm khuẩn bệnh viện do Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC phân lập từ bệnh viện tại Hà Nội Bệnh viện Xanh pôn là nơi tập trung của các ca bệnh với 62 trường hợp thuộc nhóm trẻ nhỏ dưới 1 tuổi. Bệnh viện Việt Đức không có trường hợp nhiễm khuẩn nào dưới 1 tuổi. Kết quả phân tích dữ liệu cho thấy bệnh phẩm là dịch phế quản chiếm tỷ lệ dương tính cao nhất trong các loại bệnh phẩm thu thập được với 61 mẫu (81,33%); sau đó là bệnh phẩm máu với 11 mẫu (14,67%); bệnh phẩm đờm khí quản có tỷ lệ là 2,67% (2 mẫu) và thấp nhất là bệnh phẩm dịch ổ bụng chỉ có duy nhất 1 ca bệnh chiếm tỷ lệ 1,33%. 3.2. Xác định khả năng truyền gen kháng kháng sinh giữa các chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapnem mang gen blaKPC 3.2.1. Phát hiện plasmid mang gen blaKPC Kết quả cho thấy nhiều plasmid có kích thước xấp xỉ 20-30 kb mang gen blaKPC, riêng plasmid tách được từ chủng phân lập tại Việt Đức có kích thước xấp xỉ 180 bp được phát hiện sau khi lai với các đoạn dò đặc hiệu. Phần lớn các chủng đều có 1 plasmid mang gen bla KPC (hình 3.10, 3.11).
15. 13 Hình 3.10, 3.11.2Kết quả PFGE sau khi cắt bằng enzyme S1 và Southern blot 1: marker; 2-4: chủng từ bệnh viện Xanh pôn phân lập năm 2011; 5-9: chủng từ bệnh viện Xanh pôn phân lập năm 2012; 10-11: chủng từ bệnh viện Thanh Nhàn phân lập năm 2013; 9, 12-14: chủng từ bệnh viện Xanh pôn phân lập năm 2013-2014; 15: chủng từ bệnh viện Việt Đức phân lập năm 2014 3.2.2. Thử nghiệm khả năng truyền plasmid mang gen blaKPC Bảng 3.11.4Tỷ lệ truyền plasmid mang gen blaKPC từ chủng K. pneumoniae kháng carbapenem sang chủng E. coli J53 Bệnh viện Số lượng (n=75) Khả năng truyền plasmid mang gen blaKPC sang E. coli J53 Có Không Xanh pôn 66 9 57 Thanh Nhàn 8 2 6 Việt Đức 1 0 1 Tổng 11 (14,67%) 64 (85,33%) Kết quả thử nghiệm khả năng truyền plasmid mang gen bla KPC kháng carbapenem từ 75 chủng vi khuẩn phân lập trên lâm sàng cho thấy: tại mô hình phòng thí nghiệm có 11/75 chủng K. pneumoniae, chiếm tỷ lệ 14,67%, có khả năng truyền plasmid sang chủng E. coli J53 kháng sodium azide (bảng 3.11).
16. 14 3.3. Xác định đặc tính dịch tễ học phân tử của Klebsiella pneumoniae kháng carbapnem mang gen blaKPC 3.3.1. Kết quả điện di trường xung (PFGE) Hình 3.15.3Cây phả hệ của 75 chủng K. pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC phân lập được tại ba bệnh viện từ năm 2010 đến năm 2014
17. 15 Toàn bộ 75 chủng K. pneumoniae kháng carbapenem sinh KPC trong nghiên cứu được chia thành 15 genotype khác nhau. Khi sử dụng phần mềm Bionumerics để phân tích kết quả PFGE (hình 3.15), chúng tôi nhận thấy có 3 genotype nổi trội bao gồm genotype B và L cùng có 15 chủng có tỷ lệ tương đồng cao lần lượt là trên 91% và trên 84%, genotype N chiếm tỷ lệ cao nhất với tổng số 17 chủng có độ tương đồng trên 83,9%. Các genotype còn lại là A, C, D, G, H, K, M, P bao gồm từ 2 đến 5 chủng với độ tương đồng thấp nhất là 80% (genotype E) và cao nhất là 97,4% (genotype K). Riêng các genotype E, I, O, Q chỉ bao gồm 1 chủng K. pneumoniae sinh KPC duy nhất. Trong đó, 3 chủng thuộc về bệnh viện Xanh pôn và 1 chủng còn lại thuộc về bệnh viện Việt Đức. Đây cũng là chủng duy nhất phân lập được tại bệnh viện Việt Đức trong quá trình nghiên cứu. Các chủng trong cùng 1 genotype có độ tương đồng hơn 80% được cho là cùng thuộc 1 dòng vi khuẩn ban đầu (hình 3.15). Genotype N bao gồm các chủng của cả 2 bệnh viện Xanh pôn và Thanh Nhàn là chủng nổi trội xuyên suốt qua các năm 2010 đến 2011 với 8 chủng phân lập được từ năm 2010 (4 từ bệnh viện Xanh pôn và 4 từ bệnh viện Thanh Nhàn) và 9 chủng đều của bệnh viện Xanh pôn phân lập được từ năm 2011. Các genotype A, C, D, E, G, H, K, M, O, Q chỉ bao gồm các chủng phân lập được từ bệnh viện Xanh pôn qua các năm. Genotype L là genotype nổi trội xuyên suốt trong năm 2011 đến 2012 của bệnh viện Xanh pôn với 7 chủng phân lập từ năm 2011 và 8 chủng phân lập được năm 2012. Genotype B là dòng nổi trội trong năm 2012 đến 2013 của cả bệnh viện Xanh pôn và Thanh Nhàn với 12 chủng phân lập được trong năm 2013 (10 chủng từ bệnh viện Xanh pôn và 2 chủng từ bệnh viện Thanh Nhàn) và 3 chủng phân lập được trong năm 2012 của bệnh viện Xanh pôn. Năm 2014 phân lập được 3 chủng của bệnh viện Xanh pôn đều thuộc genotype C, 1 chủng còn lại của bệnh viện Việt Đức tách ra thành 1 genotype riêng (genotype I không giống với bất kỳ genotype nào của 2 bệnh viện Xanh pôn và Thanh Nhàn). 3.3.2. Kết quả MLST Sau khi phân tích trình tự gen bằng phần mềm GeneStudio thu được các đoạn contig. Sử dụng phần mềm trên trang web NCBI để so sánh và định ST cho thấy toàn bộ 35 chủng K. pnuemoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC đều thuộc ST15 (bảng 3.15.A, B).
18. 16 Bảng 3.15.A.5Kết quả MLST của các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC phân lập tại các bệnh viện từ 2010-2013 STT Bệnh viện Năm gapA infB mdh pgi phoE rpoB tonB ST 1 Xanh pôn 2010 1 1 1 1 1 1 1 15 2 Thanh Nhàn 2010 1 1 1 1 1 1 1 15 3 Xanh pôn 2011 1 1 1 1 1 1 1 15 4 Xanh pôn 2011 1 1 1 1 1 1 1 15 5 Xanh pôn 2011 1 1 1 1 1 1 1 15 6 Xanh pôn 2011 1 1 1 1 1 1 1 15 7 Xanh pôn 2011 1 1 1 1 1 1 1 15 8 Xanh pôn 2011 1 1 1 1 1 1 1 15 9 Xanh pôn 2011 1 1 1 1 1 1 1 15 10 Xanh pôn 2011 1 1 1 1 1 1 1 15 11 Xanh pôn 2011 1 1 1 1 1 1 1 15 12 Xanh pôn 2011 1 1 1 1 1 1 1 15 13 Xanh pôn 2011 1 1 1 1 1 1 1 15 14 Xanh pôn 2011 1 1 1 1 1 1 1 15 15 Xanh pôn 2012 1 1 1 1 1 1 1 15 16 Xanh pôn 2012 1 1 1 1 1 1 1 15 17 Xanh pôn 2012 1 1 1 1 1 1 1 15 18 Xanh pôn 2012 1 1 1 1 1 1 1 15 19 Xanh pôn 2012 1 1 1 1 1 1 1 15 20 Xanh pôn 2012 1 1 1 1 1 1 1 15 21 Xanh pôn 2012 1 1 1 1 1 1 1 15 22 Xanh pôn 2012 1 1 1 1 1 1 1 15 23 Xanh pôn 2012 1 1 1 1 1 1 1 15 24 Xanh pôn 2012 1 1 1 1 1 1 1 15 25 Xanh pôn 2013 1 1 1 1 1 1 1 15 26 Xanh pôn 2013 1 1 1 1 1 1 1 15 27 Xanh pôn 2013 1 1 1 1 1 1 1 15 28 Xanh pôn 2013 1 1 1 1 1 1 1 15 29 Xanh pôn 2013 1 1 1 1 1 1 1 15 30 Xanh pôn 2013 1 1 1 1 1 1 1 15
19. 17 Bảng 3.15.B.6Kết quả MLST của các chủng K. pneumoniea kháng carbapenem mang gen blaKPC phân lập tại các bệnh viện từ năm 2013-2014 STT Bệnh viện Năm gapA infB mdh pgi phoE rpoB tonB ST 31 Thanh Nhàn 2013 1 1 1 1 1 1 1 15 32 Thanh Nhàn 2013 1 1 1 1 1 1 1 15 33 Xanh pôn 2014 1 1 1 1 1 1 1 15 34 Xanh pôn 2014 1 1 1 1 1 1 1 15 35 Việt Đức 2014 1 1 1 1 1 1 1 15 BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Đặc tính đề kháng carbapenem qua KPC của các chủng Klebsiella pneumoniae phân lập tại ba bệnh viện trên địa bàn Hà Nội 4.1.1. Phát hiện Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC Trong tổng số 174 chủng vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem thu thập được tại ba bệnh viện trên địa bàn Hà Nội trong khoảng thời gian 2010 đến tháng 3/2014 bao gồm nhiều loại vi khuẩn khác nhau. Tuy nhiên, số lượng chủng vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem phân lập được khác nhau tùy từng bệnh viện. Kết quả này chỉ ra rằng chủng vi khuẩn kháng kháng sinh tại các bệnh viện khác nhau tùy từng bệnh viện. Tỷ lệ các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem thu được tại Việt Nam cao tương tự một số nghiên cứu khác tại các nước phát triển trên thế giới như nghiên cứu của Satlin (2017) và Rihani (2011) tại Mỹ, Capone tại Ý với tỷ lệ K. pneumoniae kháng carbapenem thu thập được đều cao trên 80%. Trong tổng số 139 chủng K. pneumoniae kháng carbapenem phân lập được, bằng kỹ thuật PCR đã phát hiện được 75 chủng mang gen bla KPC tại ba bệnh viện Xanh pôn, Thanh Nhàn và Việt Đức. Nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ K. pneumoniae mang gen blaKPC giữa các bệnh viện. Có thể giải thích sự khác biệt này là do sự khác nhau trong phác đồ điều trị hoặc chiến lược sử dụng kháng sinh ở các bệnh viện này đã tạo áp lực cho vi khuẩn tiến hóa theo các hướng khác nhau. Cụ thể là trong khi nghiên cứu này ghi nhận vi khuẩn sinh KPC nhóm A chiếm ưu thế ở bệnh viện Xanh pôn thì một nghiên cứu khác lại cho thấy tỉ lệ chủng kháng carbapenem mang gen NDM-1 mã hóa carbapenemase
20. 18 nhóm B tập trung chủ yếu ở bệnh viện Việt Đức ( Hoang, 2013; Tran, 2015). Thêm vào đó, một nghiên cứu tại bệnh viện Trung ương Quân đội 108 cùng thời điểm lại cho thấy vi khuẩn mang gen OXA sinh carbapenemase nhóm D là cơ chế kháng kháng sinh nổi trội (số liệu chưa công bố). Khi phân tích sâu hơn về sự phân bố theo lứa tuổi, kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng có đến 85,3% chủng mang gen bla KPC được phân lập từ đối tượng là trẻ nhỏ dưới 1 tuổi và chủ yếu tập trung ở Xanh pôn. Kết quả này phản ánh đặc thù của bệnh viện Xanh pôn có thế mạnh về khoa Nhi với số lượng bệnh nhi đông nổi trội so với 2 bệnh viện còn lại (bệnh viện Việt Đức thiên về ngoại khoa còn bệnh viện Thanh Nhàn chuyên sâu hơn về nội khoa). Tỷ lệ dương tính cao nhất trong các loại bệnh phẩm là dịch phế quản (81,33%) phù hợp với các kết quả nghiên cứu trong nước và trên thế giới về nhiễm khuẩn bệnh viện do viêm nhiễm đường hô hấp và nhóm tuổi dưới 1 tuổi là nhóm có nguy cơ cao đối với các nhiễm trùng có nguyên nhân do vi khuẩn sinh KPC có khả năng kháng carbapenem (Phạm Hùng Vân, 2010; Arnold, 2011; Nguyễn Thanh Bảo, 2012). 4.1.2. Kết quả giải trình tự gen blaKPC Các gen bla KPC đã được giải trình tự và có độ tương đồng là 100% khi so sánh với trình tự gen bla KPC nhóm 2 (blaKPC-2) chuẩn. Kết quả này đã chứng minh các chủng vi khuẩn phân lập từ các bệnh viện tại Hà Nội mang gen bla KPC là hoàn toàn chính xác và giống với kết quả của Trần Nhật Phương và cộng sự tại thành phố Hồ Chí Minh (Trần Nhật Phương, 2012). Vi khuẩn sinh KPC-2 cũng là chủng vi khuẩn nổi trội được phát hiện trong nghiên cứu tại Trung Quốc và Brazil ( Andrade, 2011; Cheng, 2016). 4.1.3. Mức độ đề kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae kháng carbapnem mang gen blaKPC Theo kết quả kháng sinh đồ bằng khoanh giấy kháng sinh, hầu hết các chủng vi khuẩn kháng lại tất cả các kháng sinh cephalosporin thế hệ I đến IV (CRO, CXM, CAZ, CTX, FEP), các beta lactam (bao gồm nhóm carbapenem: ETP, IMP, MEM và penicilline: AMC), mono bactam (ATM), aminoglycoside (GM), quinolon (CIP) và cotrimoxazole (SXT). Một số ít chủng còn nhạy cảm với các kháng sinh nhóm quinolon (CIP), aminoglycoside (GM), cotrimoxazol (STX). Để nghiên cứu sâu hơn về khả năng kháng kháng sinh, nhóm nghiên cứu đã sử dụng thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Thử nghiệm MIC cũng cho kết quả tương tự
21. 19 khoanh giấy kháng sinh với tỷ lệ kháng cao. Tình trạng kháng đa kháng sinh của vi khuẩn K. pneumoniae sinh KPC có thể lý giải do các vi khuẩn này mang đồng thời nhiều gen kháng kháng sinh phổ rộng khác nhau (Yong, 2009). Mặc dù hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập được tại ba bệnh viện Xanh pôn, Thanh Nhàn và Việt Đức đều kháng với kháng sinh nhóm carbapenem, có một số chủng vẫn nhạy cảm hoàn toàn hoặc kháng lại ở mức độ trung gian. Kết quả này có thể giải thích bằng việc mức độ sinh enzyme KPC còn phụ thuộc yếu tố môi trường bao gồm điều kiện tự nhiên và các chất cần cho việc xúc tác hoạt hóa gen điều khiển của gen blaKPC. Thêm vào đó, vi khuẩn chỉ có khả năng bất hoạt carbapenem nếu kết hợp sự giảm khả năng thẩm thấu ở màng tế bào vi khuẩn (Yang, 2013). Trong nghiên cứu này, hầu hết các chủng lâm sàng đều có khả năng đề kháng với carbapenem cao. Kết quả này chỉ ra rằng kiểu hình kháng carbapenem là do sự kết hợp của KPC và các cơ chế khác. 4.1.4. Tỷ lệ vi khuẩn mang gen ESBL trên các chủng Klebsiella pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC phân lập tại các bệnh viện Các gen mã hóa blaKPC, cùng với gen mã hóa  lactamase phổ rộng mã hóa trên plasmid làm tăng cường khả năng kháng aminoglycoside, cũng như đề kháng với các kháng sinh khác như quinolon (qnrA, qnrB) (Wang D, 2014). Tại Việt Nam, nhóm SHV và TEM chiếm đa số trong các chủng Klebsiella mang gen ESBL, tương tự như nghiên cứu tại Mỹ của Wang và cộng sự (Wang, 2013). Duy nhất chủng phân lập được tại bệnh viện Việt Đức có kiểu hình TEM (-), SHV (+), CTX-M (+). Bảy chủng mang cả 3 gen mã hóa beta lactamase dương tính. Hầu hết các chủng phân lập từ năm 2013 đến 2014 đều có kiểu hình TEM (+), SHV (+), CTX- M (-). Kết quả nghiên cứu cho thấy ngoài việc mang gen bla KPC kháng carbpenem (là các kháng sinh trong nhóm kháng sinh mạnh nhất hiện nay), việc sở hữu đồng thời các gen ESBL góp phần làm gia tăng khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn đang là một vấn đề nan giải. 4.2. Khả năng lan truyền gen kháng kháng sinh của các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC 4.2.1. Phát hiện plasmid mang gen blaKPC Trong nghiên cứu này, bằng kỹ thuật Southern blot đã phát hiện được nhiều chủng vi khuẩn có plasmid mang gen blaKPC có kích thước xấp xỉ từ 20-180 kb. Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu được thực hiện trước đây trên thế giới tại Canada và Trung Quốc
22. 20 (Qi, 2011; Tijet, 2014). Tất cả các chủng vi khuẩn đều chỉ mang 1 plasmid chứa gen kháng kháng sinh này. Chủng phân lập năm 2011 mang plasmid có kích thước tương đương với 1 chủng phân lập năm 2012 của bệnh viện Xanh pôn (xấp xỉ 30 kb) và khác với plasmid khác của năm 2012 và các năm còn lại (xấp xỉ 25 kb) cho thấy đây là dòng plasmid riêng. Còn lại các plasmid lưu hành theo các năm 2012 đến 2014 tại bệnh viện Thanh Nhàn và Xanh pôn là giống nhau. Dựa trên kết quả PFGE có thể thấy 2 chủng mang plasmid tương tự nhau của chủng năm 2011 và 2012 cùng thuộc một dòng vi khuẩn và là dòng nổi trội xuyên suốt 2011 và 2012. Các plasmid phân lập được từ các chủng 2012 và 2013 cũng cùng một kiểu hình PFGE của dòng vi khuẩn xuyên suốt hai năm này. Kết quả này hoàn toàn tương đồng với kết quả PFGE cho thấy giả thuyết về sự lưu hành của các chủng K. pneumoniae sinh KPC tại các bệnh viện là hoàn toàn có cơ sở khoa học. Nghiên cứu cũng đã cho thấy các plasmid mang gen blaKPC đóng vai trò quy định tính kháng carbapenem của các chủng vi khuẩn tại ba bệnh viện lớn trên địa bàn Hà Nội. Năm 2011 và 2012 có hai chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang gen blaKPC không có plasmid mang gen này. Nguyên nhân có thể do gen kháng kháng sinh của vi khuẩn không nằm trên plasmid mà nằm trên chromosome của vi khuẩn. 4.2.2. Thử nghiệm khả năng truyền plasmid mang gen blaKPC Kết quả thử nghiệm khả năng truyền plasmid mang gen bla KPC kháng carbapenem từ 75 chủng vi khuẩn phân lập trên lâm sàng cho thấy tại mô hình phòng thí nghiệm có 11/75 chủng K. pneumoniae, chiếm tỷ lệ 14,67%, có khả năng truyền plasmid sang chủng E. coli J53 kháng sodium azide. Tỷ lệ này cũng tương tự như các nghiên cứu trước đây trên thế giới (Naas T, 2008; Al-Marzooq, 2015). Tại Việt Nam, nghiên cứu của Trần Nhật Phương và cộng sự tại hai bệnh viện của thành phố Hồ Chí Minh trong cùng một khoảng thời gian với nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỷ lệ tiếp hợp thu được là 18,18%, cao hơn tỷ lệ đạt được trong nghiên cứu tại miền Bắc ( Trần Nhật Phương, 2015). Kết quả này cho thấy K. pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem có khả năng truyền plasmid mang gen kháng kháng sinh sang các chủng vi khuẩn khác qua con đường tiếp hợp. 4.3. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của Klebsiella pneumoniae kháng carbapnem mang gen blaKPC 4.3.1. Kết quả PFGE
23. 21 Dựa vào tính toán tỷ lệ tương đồng của phần mềm Bionumeric trên cây phả hệ PFGE, tất cả các chủng có độ tương đồng trên 80% được coi là cùng xuất phát từ một dòng vi khuẩn (Villalon, 2011; Cheng, 2015). Các chủng K. pneumoniae sinh KPC-2 thu thập được tại bệnh viện Xanh pôn từ năm 2010 đến 2014 thuộc nhiều nhóm PFGE (genotype) khác nhau cho thấy có sự đa dạng về nguồn gốc của các chủng gây nhiễm trùng bệnh viện trong giai đoạn này. Tuy nhiên, kết quả phân tích cho thấy vẫn tồn tại 3 dòng gây dịch nổi trội là các chủng thuộc genotype B (15 chủng), L (15 chủng) và N (17 chủng). Genotype N với 17 chủng đều là các chủng phân lập từ năm 2010-2011 là dòng vi khuẩn gây dịch nổi trội từ năm 2010 đến 2011 bao gồm 8 chủng phân lập năm 2010 tại bệnh viện Xanh pôn và bệnh viện Việt Đức, 9 chủng phân lập năm 2011 tại bệnh viện Xanh pôn. Thêm vào đó, genotype P tuy chỉ có 5 chủng nhưng cũng đều là 2 chủng thuộc năm 2010 (bệnh viện Thanh Nhàn) và 3 chủng thuộc năm 2011 (bệnh viện Xanh pôn). Điều này cho thấy giữa các chủng vi khuẩn phân lập được tại bệnh viện Xanh pôn và bệnh viện Thanh Nhàn có mối liên quan đến nhau. Khi so sánh thời gian phân lập các chủng chúng tôi nhận thấy các vi khuẩn K. pneumoniae tại bệnh viện Xanh pôn có thể bắt nguồn từ bệnh viện Thanh Nhàn. Đáng chú ý là tại bệnh viện Xanh pôn, 2 chủng vi khuẩn đầu tiên được thu thập từ bệnh nhân của khoa hồi sức cấp cứu (chủng số 64 và 66), 2 chủng tiếp theo thu thập được là chủng thuộc khoa Nhi (chủng số 67 và 84). Từ phân tích trên, nhóm nghiên cứu đưa ra giả thiết có khả năng tồn tại sự lây nhiễm vi khuẩn trong phạm vi 2 khoa này của bệnh viện Xanh pôn. Các chủng sinh KPC phân lập được trong năm 2012 tuy thuộc nhiều type khác nhau nhưng nổi trội nhất vẫn là các dòng vi khuẩn thuộc genotype L với 8 chủng 2012 và 7 chủng 2011. Số liệu dịch tễ học cho thấy các chủng này đều là chủng thuộc bệnh viện Xanh pôn và phân lập được tại cùng một khoa (khoa Nhi). Genotype B với 12 chủng năm 2013 là dòng vi khuẩn nổi trội tại bệnh viện Xanh pôn và Thanh Nhàn. Tuy không chiếm đa số nhưng 3 chủng phân lập được năm 2012 tại bệnh viện Xanh pôn cho thấy khả năng các chủng vi khuẩn năm 2013 bắt nguồn từ một dòng các chủng lưu hành tại bệnh viện năm 2012. Qua đó có thể thấy từ năm 2012 đến năm 2013, dòng B đã thay thế cho sự tồn tại của dòng L trong những năm từ 2011 đến năm 2013. Kết quả này chỉ ra rằng chủng K. pneumoniae sinh KPC gây nhiễm trùng bệnh viện trong bệnh viện Xanh pôn không phải thuộc một dòng duy nhất kéo dài từ năm này qua năm khác mà có sự chuyển
24. 22 đổi giữa các type khác nhau. Thêm vào đó, genotype B với 2 chủng 2013 phân lập được tại bệnh viện Thanh Nhàn cho thấy thời điểm này lại có sự lây nhiễm chéo ngược lại từ bệnh viện Xanh pôn sang bệnh viện Thanh Nhàn. Tương tự các chủng 2012 và 2013, chủng phân lập được năm 2014 tại bệnh viện Xanh pôn cũng có khả năng bắt nguồn từ chủng vi khuẩn năm 2013. Chủng duy nhất phân lập được tại bệnh viện Việt Đức tách ra thành 1 genotype riêng không giống với bất kỳ genotype nào của 2 bệnh viện Xanh pôn và Thanh Nhàn. Kết quả này cho thấy do tình trạng sử dụng kháng sinh tại các bệnh viện khác nhau nên tạo áp lực chọn lọc lên các chủng vi khuẩn kháng thuốc khác nhau và tạo thành các dòng vi khuẩn mang các gen kháng thuốc riêng rẽ. 4.3.2. Kết quả MLST Có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy kết quả MLST có độ tương đồng cao với kết quả PFGE (Samuelsen, 2009; Qi, 2011; Li, 2012). Nếu PFGE là tiêu chuẩn vàng để nghiên cứu nguồn gốc của các chủng vi khuẩn, MLST lại có cơ sở dữ liệu mở để có thể so sánh Sequence Type (ST) của các chủng K. pneumoniae mang gen blaKPC kháng carbapenem tại Việt Nam và các dòng đang gây dịch trên thế giới. Chính vì vậy kết quả MLST có thể được sử dụng một cách linh hoạt hơn kết quả PFGE. Hiện nay, K. pneumoniae ST 258 đang là dòng vi khuẩn nổi trội lưu hành trên toàn thế giới ( Kitchel, 2009; Vubil, 2017), đặc biệt là tại Mỹ chiếm tỷ lệ lên tới hơn 70% số lượng các vụ dịch. Trong khi đó, ST11 lại là dòng K. pneumoniae sinh KPC-2 nổi trội tại khu vực châu Á ( Yang, 2013; Liang Chen, 2014). Tuy nhiên, khi chọn các chủng đại diện của các bệnh viện qua các năm nghiên cứu dịch tễ học phân tử bằng kỹ thuật MLST cho thấy toàn bộ các chủng đều thuộc ST15. Không giống như một số nghiên cứu cho thấy có sự tương đồng cao giữa kết quả PFGE và MLST, nghiên cứu này cho thấy có sự khác nhau giữa hai kết quả. Trong một số trường hợp, PFGE có khả năng phân loại tốt hơn MLST. Sự khác biệt giữa kết quả PFGE và MLST có thể bắt nguồn từ số lượng plasmid chủng vi khuẩn thu nhận được trong quá trình lưu hành tại bệnh viện. 4.4. Bàn luận về hướng nghiên cứu tiếp theo Các kết quả ban đầu thu được cho thấy sự lan truyền vi khuẩn mang gen bla KPC tại miền Bắc Việt Nam còn nhiều vấn đề cần được làm sáng tỏ như tỷ lệ vi khuẩn mang gen kháng kháng sinh trên plasmid và trên chromosome, con đường lây truyền các plasmid mang gen blaKPC cũng như phân loại và cấu trúc của các plasmid mang gen này. Qua phân tích một số chủng K. pneumoniae không mang gen blaKPC thu thập trong nghiên cứu cho thấy các gen
25. 23 blaNDM-1 và bla OXA cũng đóng vai trò quan trọng quy định tính kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn này. Thêm vào đó, chúng tôi cũng phát hiện ra các vi khuẩn khác ngoài K. pneumoniae tại Việt Nam cũng có khả năng sinh KPC. Chính vì vậy, cần tập trung nghiên cứu về các cơ chế kháng carbapenem khác như khả năng sinh VIM, NDM-1, OXA và so sánh giữa các vi khuẩn khác loài cùng mang các gen quy định tính kháng kháng sinh này nhằm hiểu rõ hơn về cơ chế và tính đa dạng của vi khuẩn kháng carbapenem tại Việt Nam. KẾT LUẬN • Xác định đặc tính đề kháng carbapenem qua KPC của các chủng K. pneumoniae phân lập tại ba bệnh viện trên địa bàn Hà Nội: - Phát hiện bệnh nhân nhiễm khuẩn do K. pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC-2 cao trên tổng số bệnh nhân nhiễm khuẩn tại ba bệnh viện Xanh pôn, Thanh Nhàn và Việt Đức của Hà Nội giai đoạn 2010-2014. - Các chủng vi khuẩn mang gen blaKPC-2 phân lập được sở hữu đồng thời các gen ESBL. • Xác định khả năng truyền gen kháng kháng sinh của các chủng K. pneumoniae mang gen blaKPC: - Phát hiện một số chủng K. pneumoniae kháng carbapenem chứa các plasmid mang gen blaKPC-2. - Plasmid mang gen bla KPC-2 có khả năng truyền từ K. pneumoniae sang E. coli J53 bằng con đường tiếp hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm. • Xác định đặc tính dịch tễ học phân tử giữa các chủng K. pneumoniae mang gen blaKPC: - Phát hiện mối liên quan dịch tễ học phân tử giữa các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC-2 giữa 2 bệnh viện Xanh pôn và Thanh Nhàn - Phát hiện mối liên quan dịch tễ học phân tử giữa các chủng K. pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC-2 trong phạm vi giữa các khoa trong bệnh viện Xanh pôn. - K. pneumoniae kháng carbapenem mang gen blaKPC tại bệnh viện Việt Đức là 1 dòng riêng.
26. 24 KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục giám sát vi khuẩn K. pneumoniae mang gen bla KPC tại các bệnh viện nhằm tìm hiểu mối liên quan dịch tễ học phân tử của vi khuẩn gẫy nhiễm trùng bệnh viện trên toàn lãnh thổ Việt Nam. 2. Nghiên cứu xác định tỷ lệ vi khuẩn mang gen kháng kháng sinh trên plasmid và chromosome, các cơ chế lây truyền các plasmid mang gen blaKPC cũng như phân loại và cấu trúc của các plasmid mang gen này. 3. Cần tập trung nghiên cứu về các cơ chế kháng carbapenem khác như khả năng sinh VIM, NDM-1, OXA của K. pneumoniae kháng carbapenem và so sánh giữa vi khuẩn này với các vi khuẩn khác loài cùng mang các gen quy định tính kháng kháng sinh carbapenem nhằm hiểu rõ hơn về cơ chế và tính đa dạng của vi khuẩn kháng carbapenem tại Việt Nam NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 1. Nguyễn Hoài Thu, Trần Diệu Linh, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Phạm Duy Thái, Trần Vân Phương, Nguyễn Hiệp Lê Yên, Trần Như Dương, Đặng Đức Anh, Nguyễn Bình Minh, Đ inh Duy Kháng, Phạm Văn Ty, Trần Huy Hoàng. (2016). Một số đặc điểm dịch tễ học nhiễm khuẩn bệnh viện có nguyên nhân từ các chủng vi khuẩn đường ruột sinh KPC kháng carbapenem phân lập tại các bệnh viện Hà Nội. Tạp chí Y học Việt Nam số 02 (444): 148- 151. 2. Nguyễn Hoài Thu, Trần Diệu Linh, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Phạm Duy Thái, Trần Vân Phương, Nguyễn Hiệp Lê Yên, Trần Như Dương, Đặng Đức Anh, Nguyễn Bình Minh, Đ inh Duy Kháng, Phạm Văn Ty, Trần Huy Hoàng. (2016). Dịch tễ học phân tử của các chủng Klebsiella pneumoniae sinh KPC-2 phân lập tại bệnh viện Xanh pôn. Tạp chí Y học dự phòng. Tập 26 số 08 (181): 15-20. 3. Nguyễn Hoài Thu, Trần Diệu Linh, Phạm Duy Thái, Trần Vân Phương, Nguyễn Hiệp Lê Yên, Trần Như Dương, Đặng Đức Anh, Nguyễn Bình Minh, Đinh Duy Kháng, Phạm Văn Ty, Trần Huy Hoàng. (2016). Tỷ lệ vi khuẩn mang gen mã hóa tính kháng extended  lactamase (ESBL) trên các chủng vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem mang gen blaKPC-2 phân lập tại các bệnh viện. Tạp chí Y học dự phòng. Tập 26 số 07 (180): 27-33.
27. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích Ký hiệu Chú thích ADN Axit deoxyribonucleic LB Luria-Bertani ADH Arginine Dihydrolase LDC Lysine Decarboxylase AM Ampicillin MAN Mannito AMC Amoxicillin + clavunalate MBLs Metallo-beta-lactamase AMY amygdalin mdh malate dehydrogenase ATCC Bộ sưu tập chủng chuẩn Mỹ MEL Melibiose ATM Aztreonam MEM Meropenem ARA Arabinose MIC Nồng độ ức chế tối thiểu bp Base pair MLST Định typ dựa trên trình tự đa locus CAZ Ceftazidime NCBI Trung tâm thông tin sinh học quốc gia Mỹ CDC Center for Disease Control NDM-1 New Delhi metallo-betalactamase-1 CEF Cefixime NGS Next generation sequencing CF Cephalothin ODC Ornithine Decarboxylase CIP Ciprofloxacin ONPG Ortho Nitrophenyl-ßD-galactopyranosidase CLSI Viện Lâm sàng và xét nghiệm Mỹ OXA Oxacillinase CRKP Carbapenem resistant K. pneumoniae PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp CRO Ceftriaxone PFGE Điện di trường xung CTX Cefotaxim pgi phosphoglucose isomerase CTX Cefotaxime phoE phosphorine E CTX-M Cefotaximase RHA Rhamnose CXM Cefuroxim rpoB beta subunit of RNA polymerase CIT Citrate utilization SAC Saccharose DCA deoxycholate citrate agar SMA Sodium mercapto acetic acid ESBL Extended-spectrum beta lactamase SME Serratia marcescens enzyme FEP Cefepime SOR Sorbitol gapA Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase SS Salmonella Shigella agar GEL Gelatinase ST Sequence type (Kiểu trình tự) GM Gentamicin SXT Trimethoprim sulphamethoxazole GLU Glucose TDA Tryptophane Deaminase ICE Intergrative conjugative element TEM A Temoneira IND Indole ton B periplasmic energy transducer INO Inosito URE Urease infB translation initiation factor 2 VIM Verona integron-encoded metallo-β-lactamase IPM Imipenem VP Voges Proskauer KPC K. pneumoniae carbapenemase