Nghiên cứu chế tạo bộ cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở các vật liệu nano vàng, bạc - oxide graphene khử để phát hiện một..

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu chế tạo bộ cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở các vật liệu nano vàng, bạc - oxide graphene khử để phát hiện một..

1. MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng về kinh tế - xã hội, con người cũng phải đối mặt với nhiều mầm bệnh nguy hiểm ở các mức độ khác nhau như ung thư, bệnh truyền nhiễm, ngộ độc thực phẩm và nhiễm trùng bệnh viện. Việc khống chế và ngăn chặn kịp thời các dịch bệnh luôn được quan tâm của mọi quốc gia và trên thế giới. Nghiên cứu ứng dụng các công nghệ mới, phương pháp phát hiện mới nhằm có thể nhanh chóng kiểm soát được dịch bệnh, sự khởi phát của bệnh cần phải có sự hỗ trợ nghiên cứu đa ngành kết hợp nghệ nano, vật lý, hóa học, sinh học, điện tử Trong những năm gầy đây, việc nghiên cứu và phát triển ứng dụng cảm biến sinh học điện hóa trong kiểm soát và chăm sóc sức khỏe nói chung, trong y tế dự phòng nói riêng đang được quan tâm. Phương pháp phân tích điện hóa sử dụng hệ thiết bị đơn giản, gọn nhẹ, chi phí thấp và có quá trình vận hành dễ dàng, do đó có thể tiết kiệm chi phí phân tích và đơn giản hóa các bước phân tích. Hơn nữa, do hệ thiết bị gọn nhẹ, và việc xử lý mẫu đơn giản nên phương pháp này được phát triển thành các thiết bị đo cầm tay để phân tích mẫu trực tiếp ngoài hiện trường và khảo sát thực địa. Cảm biến sinh học đang được nghiên cứu, áp dụng để phát hiện nhiều tác nhân gây bệnh khác nhau, trong đó có các tác nhân vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện và gây ngộ độc thực phẩm. Nhiễm trùng bệnh viện đang là vấn đề được cả thế giới quan tâm do ngày càng xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, thậm chí kháng đa thuốc. Nhiễm trùng bệnh viện là nhiễm trùng mắc phải trong thời gian nằm viện, xuất hiện ít nhất 48 giờ sau khi bệnh nhân vào viện và không có biểu hiện ở giai đoạn ủ bệnh khi nhập viện. Nhiễm trùng bệnh viện không chỉ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe người dân mà còn gây thiệt hại nặng nề về kinh tế xã hội. Nhiễm trùng bệnh viện làm tăng thời gian nằm viện, tăng chi phí cho một người bệnh nằm điều trị bị nhiễm trùng bệnh viện. Nhược điểm chính của các kỹ thuật chẩn đoán truyền thống là phải thực hiện nhiều bước và thời gian phân tích lâu cho kết quả sau vài giờ đến hàng ngày, các kỹ thuật trên yêu cầu mẫu bệnh phẩm phải được xử lý trước. Hơn nữa, những kỹ thuật này đòi hỏi trang thiết bị, hóa chất, sinh phẩm đắt tiền, cán bộ thực hiện được đào tạo chuyên nghiệp và được thực hiện trong phòng đạt tiêu chuẩn an toàn sinh học. Trong khi bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn nhiễm từ bệnh viện thường gặp phải là các chủng kháng kháng sinh hoặc kháng đa thuốc, do vậy cần điều trị đúng liệu pháp và kịp thời. Thông thường, với các phương pháp chẩn đoán truyền thống, thời gian nhận được kết quả chính xác chủng vi khuẩn nào gây bệnh nào phải mất 8 đến 48 giờ, giới hạn phát hiện tới 105- 106 CFU/mL nếu không được làm giàu sơ bộ. Trong khi đó, một số kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân tử có độ nhạy cao, có thể cho kết quả sau vài giờ, tuy nhiên chi phí thường đắt và đòi hỏi người làm xét nghiệm cần phải vững vàng về chuyên môn. Gần đây, với sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, đặc biệt là công nghệ nano và công nghệ cảm biến, đã thu hút được sự quan tâm rất lớn từ các nhà khoa học trên thế giới nhằm tạo ra những thiết bị chẩn đoán mầm bệnh nhanh chóng, tiện dụng, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Từ thực trạng tại Việt Nam và xuất phát từ thực tiễn, luận án nghiên cứu với tiêu đề: “Nghiên cứu chế tạo bộ cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở các vật liệu nano vàng, bạc - oxide graphene khử để phát hiện một số vi khuẩn gây bệnh” được đề xuất cho luận án tiến sĩ này. Đề tài được có 02 mục tiêu chính: (1) Tăng cường sự ổn định điện hóa của điện cực in lưới cacbon bằng một số hệ vật liệu như bạc-oxide graphene khử, hạt nano vàng và màng nano vàng để hình thành bộ cảm biến sinh học; 1
2. (2) Phát triển thành công bộ cảm biến điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon biến tính với các hệ vật liệu trên và hệ đo điện hóa cầm tay để phát hiện nhanh một số chủng vi khuẩn gây bệnh. Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu: Cách tiếp cận của luận án trong quá trình nghiên cứu dựa trên thực nghiệm kết hợp với lý thuyết biện chứng và các tài liệu tham khảo để bổ sung, so sánh, đánh giá từ đó tìm ra những quy trình, giải pháp tối ưu nhất thực hiện mục tiêu đề tài. Nội dung nghiên cứu của luận án: Nội dung nghiên cứu của luận án gồm 4 phần tương ứng với 4 chương thực nghiệm: (1) Chế tạo cảm biến điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon biến tính với bạc-oxide graphene khử; (2) Chế tạo cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon biến tính hạt nano vàng; (3) Chế tạo cảm biến điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon biến tính màng vàng; (4) Nghiên cứu, chế tạo thiết bị cầm tay cho cảm biến điện hóa. Đề tài được thực hiện tại Viện Tiên tiến Khoa học và Công nghệ, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội và Trung tâm nghiên cứu y sinh, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Kết quả của luận án sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới nhằm phát triển các bộ thiết bị chẩn đoán trên cơ sở cảm biến sinh học điện hóa có độ ổn định, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, kích thước nhỏ và tiện dụng để phát hiện nhanh và sàng lọc mầm bệnh tại chỗ trong các chiến dịch phòng, chống nhiễm trùng bệnh viện. Ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn của luận án: Ý nghĩa khoa học: ✓ Đã xây dựng được quy trình khoa học thực hiện chế tạo vật liệu nano lai AgNPs-rGO bằng phương pháp thủy nhiệt và chế tạo hạt nano vàng AuNPs bằng phương pháp điện hóa để biến tính cho các điện cực SPE. Các điều kiện phún xạ màng mỏng vàng lên điện cực làm việc (WE) của SPE; ✓ Tìm ra phương pháp và các điều kiện ổn định đặc trưng điện hóa điện cực cacbon SPE biến tính làm cơ sở cho quá trình chế tạo cảm biến sinh học điện hóa; ✓ Xây dựng, xác lập được các điều kiện tối ưu trong quá trình chế tạo cảm biến sinh học bằng việc biến tính AgNPs-rGO để phát hiện vi khuẩn Salmonella; biến tính AuNPs và AuNFs để phát hiện vi khuẩn E.coli O157 và vi khuẩn MRSA; ✓ Tính toán và đánh giá vai trò của vật liệu nano biến tính trên cơ sở các giá trị diện tích hoạt động điện hóa tương ứng. Vật liệu màng vàng cho giá trị tối ưu về tính chất điện hóa được ứng dụng chế tạo cảm biến điện hóa ứng dụng phát hiện vi khuẩn MRSA gây nhiễm trùng bệnh viện; ✓ Nghiên cứu, chế tạo thành công thiết bị đo điện hóa cầm tay cho cảm biến sinh học điện hóa để phát hiện vi khuẩn tại thực địa. Ý nghĩa thực tiễn: Chủ động chế tạo các vật liệu nano lai AgNPs-rGO và hạt AuNPs, màng vàng (AuNFs) để biến tính điện cực SPE nhằm chế tạo thành công cảm biến sinh học điện hóa phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella, vi khuẩn E.coli O157 và vi khuẩn MRSA ứng dụng sàng lọc tác nhân gây bệnh. Kết quả của luận án là các cảm biến sinh học điện hóa được chế tạo dựa trên điện cực cacbon in lưới biến tính các vật liệu nano lai bạc và graphene oxít và hạt nano vàng (hạt và màng vàng) nhằm tăng cường khả năng khuếch đại tín hiệu bộ chuyển đổi, sự bám dính 2
3. thích ứng sinh học của phần tử cảm nhận nhằm tạo ra cảm biến có độ nhạy, độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp kết hợp với thiết bị cầm tay nhằm phát hiện vi khuẩn gây bệnh ngay tại thực địa. Sản phẩm của Luận án không chỉ dừng lại ở các bài báo khoa học và còn có sản phẩm đăng ký sở hữu trí tuệ. Những đóng góp mới của luận án: ✓ Sự ổn định điện hóa của điện cực in lưới cacbon khi biến tính vật liệu nano lai giữa hạt nano bạc -oxide graphene khử (AgNPs-rGO) ứng dụng chế tạo cảm biến phát hiện vi khuẩn Samonella. Cảm biến phát hiện vi khuẩn Salmonella thời gian 25 phút, 6 2 dải đo 10 CFU/mL đến 10 CFU/mL tuân theo hàm I peak = 0,02x - 0,01, có R = 0,9559 và giới hạn phát hiện LOD = 22 CFU/mL. ✓ Khảo sát sự ổn định điện hóa trong quá trình sử dụng SPE cacbon biến tính hạt nano vàng (AuNPs) ở các kích thước hạt khác nhau 10 nm, 15 nm, 25 nm trong việc phát hiện một số tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện phổ biến hiện nay là vi khuẩn MRSA và E.coli O157. Kết quả là giới hạn phát hiện: 13 CFU/mL (MRSA, AuNPs 15 nm) và 15 CFU/mL (AuNPs 18 nm), dải đo từ 10 CFU/mL đến 10 6 CFU/mL, thời gian phát hiện 25 phút. Kết quả này tốt hơn so với 40 công trình công bố gần đây; ✓ Chế tạo thành công ban đầu cảm biến điện hóa trên cơ sở màng vàng có độ bền, độ chọn lọc, độ nhạy cao để phát hiện vi khuẩn MRSA gây bệnh. Kết quả cho thấy thời gian phát hiện 25 phút, với dải đo từ 10 CFU/mL đến 10 6 CFU/mL tuân theo hàm 2 Rct = 1,102 x - 0,677, R = 0,9879, giới hạn phát hiện: 9 CFU/mL. ✓ Luận án đã công bố được các giá trị diện tích hoạt động điện hóa (SPE biến tính - Ahđ) so sánh với diện tích hình học (SPE trần - Ahh) từ kết quả đo thực nghiệm khi sử dụng điện cực in lưới cacbon biến tính với vật liệu nano bạc/graphene oxide khử (AgNPs-rGO, tăng 1,53 lần), hạt nano vàng (AuNPs, tăng 1,76 lần), màng nano vàng (AuNFs, tăng 1,92 lần). Kết quả thu được tạo cơ sở cho việc lựa chọn vật liệu nano phù hợp để ứng dụng chế tạo cảm biến phát hiện một số tác nhân gây bệnh; ✓ Chế tạo thiết bị cầm tay cho sử dụng cảm biến chế tạo được. Thiết bị cho phép chẩn đoán lưu động dựa trên kỹ thuật đo thế để phát hiện vi khuẩn tại thực địa ở dạng định tính, dễ sử dụng, thân thiện với môi trường, hiển thị ở 02 dạng chế độ Pos +: dương tính, Neg-: âm tính. Cấu trúc của luận án: Luận án được trình bày cấu trúc gồm: phần mở đầu và 5 chương, kết luận chung Các kết quả chính của luận án được công bố trong 9 công trình khoa học (tác giả chính), trong đó có 02 bài báo được đăng trên tạp chí chuyên ngành quốc tế (ISI), 04 báo cáo tại các hội nghị trong nước và quốc tế, 03 bài báo được đăng trên tạp chí chuyên ngành trong nước. Sản phẩm của luận án được NCS đăng ký sáng chế, giải pháp hữu ích với mã đơn đăng ký: 2-2020-00200 và được chấp nhận đơn theo quyết định số 1006w/QĐ-SHTT, ngày 21/7/2020. 3
4. Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Cảm biến sinh học và nhiễm trùng bệnh viện 1.1.1. Cảm biến sinh học và cảm biến sinh học điện hóa Cảm biến sinh học được khái niệm là một linh kiện tích hợp độc lập, nhỏ gọn, có khả năng dò tìm sự thay đổi từ các phản ứng sinh học và chuyển đổi thành tín hiệu điện ở đầu ra. Các yếu tố nhận biết sinh học có thể là enzyme, thụ thể, peptide, oligonucleotide, tế bào sống, kháng thể hoặc kháng nguyên. Cảm biến sinh học điện hóa được phát triển dựa trên sự tương tác của các thành phần sinh học được cố định trên bề mặt bộ chuyển đổi với thành phần sinh học cần phân tích sẽ làm thay đổi các tín hiệu sinh hoá ở lân cận bề mặt bộ chuyển đổi. Sự thay đổi các tín hiệu này sẽ được nhận biết bằng bộ chuyển đổi tín hiệu và được xác định bằng các phương pháp đo điện thế, dòng điện, tổng trở hay độ dẫn. 1.1.2. Tình hình nghiên cứu cảm biến sinh học trong và ngoài nước Cảm biến sinh học nói chung và cảm biến sinh học điện hóa nói riêng đang là hướng nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Trong thời gian gần đây, Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học và các nhóm nghiên cứu về cảm biến sinh học đáng được ghi nhận. Đầu tiên kể đến là nhóm nghiên cứu cảm biến sinh học thuộc trường Đại học Bách Khoa Hà Nội với định hướng của các cảm biến sinh học dựa trên cấu trúc vi điện cực để phát hiện lượng dự thuốc trừ sâu, phát hiện sự chuyển đổi gen trong cây trồng. Trong kỹ thuật y sinh, bước đầu đã phối hợp với Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã chế tạo được thiết bị chẩn đoán nhằm phát hiện nhanh vi rút viêm não Nhật Bản. Trong lĩnh vực phát hiện vi khuẩn gây bệnh, TS. Nguyễn Thị Thủy và cộng sự đã chế tạo thành công bộ cảm biến điện hóa trên cơ sở cấu trúc FET biến tính MWNCTs. TS. Trần Thị Luyến và cộng sự đã chế tạo thành công bộ cảm biến DNA tích hợp với hệ vi lưu, bình phản ứng mini trên cơ sở biến tính Ppy để phát hiện vi rút Newcastle kết quả cho giới hạn phát hiện 10 2 EID 50/mL trong 60 phút. Bên cạnh đó, các nhóm nghiên cứu khác cũng đạt được nhiều kết quả tốt, thu hút được sự quan tâm của quốc tế như các nhóm thuộc Trung tâm nghiên cứu thuộc phòng thí nghiệm nano của trường Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh với những cảm biến sinh học phát hiện glucozơ và axít uric trong máu. Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam với các công trình chế tạo cảm biến xác định sớm ung thu cổ tử cung, vi rút HIV, cholesterol trong huyết thanh, chất độc aflatoxin trong sữa. Hay các nhóm nghiên cứu y sinh thuộc Đại học Công nghệ, Đại học Quốc gia Hà Nội đã có những công bố khoa học uy tín về kết quả nghiên cứu trong thời gian gần đây. 1.1.3. Nhiễm trùng bệnh viện Nhiễm trùng bệnh viện là nhiễm trùng mắc phải trong thời gian nằm viện, xuất hiện ít nhất 48 giờ sau khi bệnh nhân vào viện và không có biểu hiện ở giai đoạn ủ bệnh khi nhập viện. Đối với bệnh nhân nhi sơ sinh nhiễm trung bệnh viện có thể xuất hiện 3 ngày sau sinh, đối với nhiễm trùng vết mổ có thể sau 1 tháng, đối với phẫu thuật cấy ghép có thể nhiễm trùng sau 1 năm. Theo báo cáo khảo sát năm 2015 của TS. Đinh Vạn Trung, chủ nhiệm khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn Bệnh viện Trung Ương Quân đội 108 đã điều tra và khảo sát 1.320 bệnh nhân đang nằm viện trên 48 giờ tính đến thời điểm điều tra. Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện là 3,86 % trong đó nhiễm khuẩn vết mổ chiếm 37,25%, nhiễm khuẩn đường tiêu hóa 1,96% và nhiễm vi rút đường hô hấp 1,96%, nhiễm khuẩn phổi chiếm 33,33%, nhiễm khuẩn đường tiết niệu chiếm 19,61%, nhiễm khuẩn huyết do catheter chiếm 5,88%. Do vậy, 4
5. việc đầu tư các trang thiết bị, các bệnh pháp nhằm cho chẩn đoán, khẳng định sớm tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện đang là vấn đề cần thiết đối với các bệnh viện hiện nay. 1.1.4. Vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng bệnh viện Vi khuẩn tụ cầu kháng methicillin (methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA) đây là loại vi khuẩn chịu được một số kháng sinh nhất định. Tụ cầu vàng kháng methicillin đang được coi là một vấn đề y tế toàn cầu và là một thách thức trong điều trị. Hiện nay, tần suất nhiễm MRSA đang gia tăng và hiện hữu ở nhiều cơ sở y tế và cộng đồng, là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm trùng bệnh viện và là một vấn đề lớn trong sức khỏe cộng đồng toàn cầu. Vi khuẩn E.coli là chủng vi khuẩn thường sống trong ruột của người và động vật. Có nhiều chủng E.coli khác nhau một số loại có thể gây tiêu chảy và các bệnh khác. E. coli O157:H7 là chủng vi khuẩn phổ biến, gây ra bệnh cho hầu hết cho các bệnh nhân mắc phải. Vi khuẩn Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột, là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, sinh sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi. 1.2. Cảm biến sinh học trên cở sở SPE phát hiện vi khuẩn gây bệnh 1.2.1. Điện cực in lưới cacbon- SPE Điện cực in lưới (SPE) cacbon được phát triển từ những năm 1990, đây là một linh kiện được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật phân tích điện hóa và kỹ thuật y sinh nhằm xác định các tác nhân gây bệnh, các kim loại nặng gây ô nhiễm môi trường. Điện cực này có những tính năng vượt trội như giá thành thí nghiệm và chi phí thấp hơn nhiều so với các vật liệu kim loại quý, là vật liệu nền dễ dàng cho quá trình biến tính nhằm nâng cao khả năng khuếch đại tín hiệu của bộ phận chuyển đổi. Điện cực in lưới (SPE) cacbon được các nhà khoa học chế tạo bằng kỹ thuật in lưới trên nền keo cacbon. Ưu điểm của điện cực cacbon thể hiện qua việc chế tạo đơn giản, khả năng đáp ứng nhanh, dò tìm ở dải tuyến tính rộng, yêu cầu nguồn nuôi thấp, điện cực có tính ổn định cao và có thể sản xuất hàng loạt cho mục đích ứng dụng khác nhau. 1.2.2. Vật liệu nano kim loại quý để biến tính điện cực 1.2.2.1. Vật liệu nano vàng Trong việc sử dụng hạt nano vàng để ứng dụng chế tạo cảm biến sinh học. Hạt nano vàng (AuNPs) đã được các nhà khoa học sử dụng để biến tính điện cực làm việc. Ưu điểm của các hạt nano vàng như diện tích bề mặt riêng lớn, năng lượng bề mặt cao, khả năng giảm khoảng cách giữa hạt nano vàng và phần tử sinh học khi cố định, hạt nano vàng hoạt động như sợi dây dẫn giữa phần tử cảm nhận và bề mặt điện cực trong quá trình oxy hóa - khử. Các kết quả chỉ ra rằng các hạt AuNPs truyền điện tử cao hơn nhiều tốc độ truyền so với vàng khối. Các vật liệu khối có khả năng truyền điện tử là 700 điện tử/giây, trong khi hạt nano vàng - AuNPs có thể đạt tới tốc độ chuyển tích điện tử là 5.000 điện tử/giây. 1.2.2.2. Vật liệu nano lai bạc - oxide graphene khử Các hạt nano kim loại có tính chất ưu việc vượt trội so với vật liệu khối của chúng. Hạt nano bạc (AgNPs) được quan tâm nghiên cứu, chế tạo và ứng dụng do chúng có nhiều ưu điểm thể hiện các tính chất hóa lý đặc biệt như độ dẫn điện và dẫn nhiệt cao, ổn định hóa học, hoạt tính xúc tác và đặc biệt là hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. Oxide graphene khử (rGO) là vật liệu đơn lớp cacbon được sắp xếp thành dạng lưới hai chiều cấu thành từ các hình lục giác, chúng có những tính chất hoàn hảo để ứng dụng trong phân tích điện hóa như độ bền cơ học cao, có tốc độ dịch chuyển electron nhanh, tỷ lệ diện tích bề mặt với thể tích rất lớn. 5
6. 1.4. Kỹ thuật đo điện hóa trong cảm biến sinh học 1.4.1. Phương pháp quét thế vòng tuần hoàn (CV) Phương pháp quét thế tuần hoàn Von-Ampe (Cyclic Voltametry) được dùng để xác định hệ số khuếch tán và xem xét sự biến thiên thuận nghịch (khả năng có thể phóng và nạp) của vật liệu nghiên cứu, điện thế ở đây biến thiên tuyến tính theo thời gian. Nguyên lý cơ bản của phương pháp CV là áp đặt một điện áp biến đổi tuần hoàn vào điện cực làm việc và ghi lại dòng tương ứng. 1.4.2. Phương pháp đo Von - Ampe xung vi sai (DPV) Phương pháp đo Von-Ampe xung vi sai được sử dụng rộng rãi trong phân tích điện hóa, do phương pháp này sử dụng các thiết bị đo khá đơn giản tuy nhiên có khả năng phát hiện với giới hạn khá thấp. Dòng điện được lấy mẫu ngay sau khi xung ứng dụng được thiết lập, quá trình đo được lặp đi lặp lại cho một loạt xung có biên độ không đổi liên tiếp, kết quả là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của dòng điện vào tốc độ quét xung thế. 1.4.3. Phương pháp phổ tổng trở điện hóa (EIS) Nguyên lý của phương pháp đo phổ tổng trở (EIS) là khi ta cho một dao động biên độ nhỏ xoay chiều hình sin U0, tần số góc  2 f đi qua một hệ điện hóa. Trong mạch sẽ xuất hiện một dòng điện đáp ứng hình sin có biên độ I 0 cùng tần số góc  nhưng lệch pha một góc so với điện thế đưa vào. Kết quả hệ điện hóa đo được ở 2 dạng phổ Nyquist plot và Bode plot, các giá trị được xác định trong phổ tổng trở là tổng trở Z im (tổng trở ảo) và Z re (tổng trở thực). Mỗi một phần tử trong mạch điện tương ứng với một tính chất của hệ điện hóa. 1.5. Thiết bị cầm tay cho cảm biến sinh học Mục tiêu nhằm xác định nhanh, kịp thời các loại vi khuẩn, vi rút gây bệnh nói riêng và các thiết bị liên quan đến bảo vệ sức khỏe con người luôn được quan tâm của các nhà khoa học. Các thiết bị cầm tay kết hợp với cảm biến sinh học tạo ra một bộ chuẩn đoán, xác định vi khuẩn gây bệnh tại thực địa (PoC - Point of Care), việc ứng dụng các thiết bị và cảm biến để chẩn đoán PoC làm cho giảm các chi phí trong kỹ thuật chẩn đoán, kết quả xác định nhanh hơn và hiệu quả hơn trong quá trình khoanh vùng dập dịch, ngăn chặn vùng phát nhiễm trùng do các tác nhân gây lên. 6
7. Chương 2. CHẾ TẠO CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ ĐIỆN CỰC IN LƯỚI CACBON BIẾN TÍNH VỚI BẠC-OXIDE GRAPHENE KHỬ 2.1. Đặt vấn đề Hệ vật liệu nano lai bạc-oxide graphene với những tiềm năng như hiệu suất cao, sự kết hợp giữa độ dẫn của hạt nano bạc và khả năng trơ về mặt hóa học của GO được một số nhà khoa học sử dụng để trực tiếp hoặc gián tiếp (biến tính) ứng dụng chế tạo cảm biến sinh học nhằm phát hiện vi khuẩn gây bệnh. Tuy nhiên, theo hiểu biết của nghiên cứu sinh, việc sử dụng vật liệu nano lai AgNPs-rGO để biến tính và chế tạo cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới cacbon vẫn còn khiêm tốn. So sánh với các hạt nano bạc, graphene oxít, vật liệu nano lai AgNPs-GO có nhiều đặc tính ưu việt khi kết hợp với nhau. Trong nội dung này, luận án nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học điện hóa trên cở sở điện cực in lưới cacbon (SPE) biến tính với vật liệu nano lai bạc và graphene oxít (AgNPs- rGO) để khảo sát khả năng phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella. 2.2.3. Quy trình chế tạo vật liệu nano lai AgNPs-rGO Vật liệu nano lai AgNPs-rGO được tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt. Phương pháp thủy nhiệt là quá trình tổng hợp bằng phương pháp khử ion phức bạc trên bề mặt của GO sử dụng PVP ở nhiệt độ, áp suất cao. Bước 1. Hòa tan 0,1 g AgNO3 trong 30 mL nước cất bằng máy khuấy từ. Sau đó cho thêm 2,5 mL dung dịch NH4OH bằng các nhỏ từ từ (10 phút/lần) từng giọt để tạo ion phức bạc. Bước 2. Hòa tan 0,1g PVP trong 7 mL nước cất. Nhỏ từ từ dung dịch PVP vào dung dịch ở trên và khuấy đều trong 30 phút. Bước 3. Cho 4 mL dung dịch GO vào hỗn hợp ở bước 2. Khuấy đều trong 30 phút. Bước 4. Thủy nhiệt: Hỗn hợp được đưa vào ống Teflon và thủy nhiệt ở 160 oC trong vòng 5 giờ. 2.2.4. Biến tính điện cực in lưới cacbon bằng vật liệu bạc-oxide graphene khử Bề mặt SPE cacbon được biến tính với vật liệu nano lai bạc - graphene oxide khử (AgNPs-rGO) thông qua phương pháp nhỏ phủ (drop-casting). Lấy 15 mL dung dịch keo nồng độ 1000 ppM cho vào 6 ống ly tâm eppendorf 1,5 mL khác nhau và rung lắc (MX-S, EMC lab) trong 3 phút, sau đó được ly tâm (Airfuge, Beckman Coulter) trong 5 phút ở tốc độ quay 5,000 vòng/phút loại bỏ cẩn thận phần đáy cặn, phần dung dịch sau khi đã loại bỏ cặn tiếp tục được ly tâm ở tốc độ 15,000 vòng/phút để lọc lấy các hạt nano lai AgNPs-rGO. Dung dịch sau khi được phân tán rung lắc đều, lần lượt sử dụng pipet (loại 10l) để nhỏ phủ lên bề mặt điện cực WE của SPE sau đó để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 30 phút đem sử dụng ngay hoặc đưa vào hộp bảo quản khô trong tủ lạnh ở 4oC. 2.2.5. Cố định kháng thể lên trên bề mặt điện cực biến tính Quy trình cố định kháng thể vi khuẩn Salmonella được thực hiện như sau: Bước 1. Điện cực SPE biến tính được rửa bằng nước khử ion (3 lần), sau đó sấy khô bằng khí N2; Bước 2. Chức năng hóa bề mặt điện cực: Ủ với 2% MTS/ethanol (1 mL MTS và 49 mL ethanol) trong 60 phút để tạo nhóm thiols (-SH), rửa điện cực trong ethanol và làm khô bằng khí N2, tiếp tục ủ 30 phút với dung dịch GMBS/EtOH (hòa 12,5 mg GMBS: N- gamma - maleimidobutyrloxy sulphosuccinimide Ester trong 250 μL Dimethyl sulfoxide - DMSO, sau đó cho 43 mL EtOH vào trong dung dịch trên). Quá trình này nhằm tạo nhóm - NHS[109]; 7
8. Bước 3. Ủ kháng thể Salmollena: Pha kháng thể 1 μg/mL trong PBS pH=7,4 dùng pipet (Eppendorf loại 10L) nhỏ 40 µL của 1 µg/mL của kháng thể Salmonella lên bề mặt điện cực WE, tiếp tục ủ kháng thể lên điện cực trong 60 phút tại nhiệt độ phòng hoặc qua đêm ở 4oC [39][109]; Bước 4. Rửa điện cực bằng PBS 0,05M 3 lần, ủ với 0,5% (0.1 M) BSA trong 30 phút để khóa những vị trí gắn kết không đặc hiệu; Rửa bằng PBS 0,05 M 3 lần và lưu cảm biến ở 4oC; 2.2.6. Khảo sát khả năng phát hiện vi khuẩn Salmonella Cảm biến sinh học điện hóa sau khi được chế tạo nhằm xác định nồng độ vi khuẩn Salmonella trong điều kiện phòng thí nghiệm. Bước 1. Chuẩn bị các cảm biến sinh học đã được biến tính và cố định kháng thể bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị và ủ kháng nguyên với các nồng độ thực nghiệm như trên. Để thực hiện đối chứng âm, 1mg/mL BSA, 10 2CFU/mL vi khuẩn E.coli O157được ủ với cảm biến sinh học. Bước 2. Chuẩn bị một giếng nhỏ (cốc có đường kính 1 cm, 5 mL), có dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl được đặt vững chắc trong hệ đo, dung dịch điện ly vừa đủ để ngập vùng điện cực. Bước 3. Cảm biến sau khi ủ vi khuẩn Salmonella được kết nối trạm điện hóa Palmsen thông qua sockit. Thông số đo thế quét vòng tuần hoàn với các thông số (dải đo Ever= -0,3 V -1 đến 0,6 V, tốc độ quét 50 mVs , Estep = 0,01 V, tdep = 60 s, tequ = 10 s), đo phổ tổng trở điện hóa (dải tần số từ 0,01 Hz đến 50 kHz, tequ = 10 s, Eac = 0,01 V). Bước 4. Thực hiện các phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa và thế quét vòng tuần hoàn tương ứng, xuất dữ liệu sang tệp excel và đọc, ghi lại các giá trị Ip,a, Ip,c đối với phương pháp đo CV và FIT mạch điện tương đương với phương pháp đo EIS. 2.3. Kết quả và thảo luận 2.3.2. Hình thái và kích thước hạt nano bạc trên graphene oxide khử Kết quả phân tích TEM cho thấy mẫu AgNPs-rGO sau khi chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt ở điều kiện nhiệt độ 160 0C trong khoảng thời gian 5 giờ có tỷ lệ phân bố tập trung nhiều nhất ở kích thước  20 nm, các hạt nano bạc được bám dính chặt chẽ trên các tấm GO bền vững. Kiểm tra, khảo sát sự ổn định của vật liệu chế tạo được, mẫu được đo hiển vi điện tử truyền qua sau 6 tháng bảo quản ở điều kiện 4 0C, bọc kín giấy bạc để tránh ánh sáng. Kết quả cho thấy các vật liệu nano lai vẫn được phân bố đều sau khi phân tán trong nước DI, kích thước và hình dạng của loại vật liệu này thay đổi tập trung vào các hạt có kích thước trung bình 20 nm, 25 nm. 2.3.3. Khảo sát hình thái bề mặt điện cực biến tính Điện cực SPE trước và sau khi biến tính được khảo sát bề mặt của WE bằng hiển vi điện tử quét (SEM, S-4800) và thành phần nguyên tố bằng phổ EDX. Bề mặt của SPE cacbon trước và sau khi biến tính được đưa vào phân tích dưới kính hiển vi điện tử quét. Trước khi biến tính với AgNPs-rGO, WE của SPE được kiểm tra dưới kính hiển vi điện tử quét ở độ phóng đại ở 2 m và 500 nm, hình ảnh cho thấy bề mặt điện cực sạch với các hạt cacbon gắn kết tạo thành dạng xốp. Sau khi biến tính, kết quả cho thấy trên bề mặt có các hạt AgNPs bám dính và đan xen với các khe hở của màng cacbon. 8
9. 2.3.4. Đặc tuyến điện hóa của điện cực biến tính 2.3.4.1. Đặc tuyến điện hóa của điện cực biến tính Hình 2.10a Kết quả cho thấy đặc trưng của phép đo CV của điện cực trần xuất hiện một cặp đỉnh oxy hóa khử tại điểm thế Ep,a1=0,28 V/Ep,c1=0,01 V tương ứng với quá trình oxy hóa 4- 3-. [Fe(CN)6] và quá trình khử [Fe(CN)6] . Các thông số điện hóa về dòng điện xác định được của điện cực trần Ip,a1 = 76,81 µA, Ip,c1 = -75,20 µA, Hình 2.10b biểu diễn quá trình đo CV của điện cực SPE/AgNPs-rGO, kết quả chỉ ra cho thấy các đặc trưng điện hóa tương ứng với điện cực SPE trần như đỉnh anốt và đỉnh catốt E p,a2=0,27 V/Ep,c2=0,01 V tuy nhiên giá trị dòng điện đã có cho thấy sự khuếch đại được tăng cường lên I p,a2 = 114,90 µA, Ip,c2 = - 112,71 µA. Hình 2.1: Đặc tuyến CV điện cực biến tính AgNPs-rGO (b) và điện cực SPE trần (a) trong dung dịch điện ly K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 5,0 mM, KCl 0,1 M, tốc độ quét 50 mVs-1. Đo phổ tổng trở EIS: Đặc tuyến điện hóa của điện cực biến tính khảo sát bằng đo phổ tổng trợ điện hóa (EIS). Hình 2.12 là kết quả đo đặc trưng phổ tổng trở dạng phổ Nyquist plots, tần số quét từ 50 kHz đến 0,01 Hz, Eac = 0,01 V, Edc = 0,0 V thời gian tequ = 10 s, thời gian cân bằng 1s, lấy mẫu 71 điểm. Kết quả ngoại suy và phân tích mạch tương đương bằng phần mềm Equivalent circuit analysis, xác định được điện trở chuyển tiếp của điện cực SPE trần Rct1 = 2,48 k, điện trở chuyển tiếp của điện cực biến tính SPE/AgNPs-rGO là Rct2 = 2,03 k, giá trị điện trở chuyển tiếp giảm Rct = 0,45 k điện trở dung dịch điện ly R dd = -4 -4 500 , điện dung lớp kép C d1 = 1,5×10 F và Cd2 = 1,1×10 F, điện trở Warburg là T = 1,0x109 K. Hình 2.2: Phổ tổng trở điện hóa của điện cực SPE trần (a) và điện cực SPE biến tính vật liệu nano lai AgNPs-rGO (b) trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 5,0 mM. 2.3.6. Phát hiện vi khuẩn Salmonella Để khảo sát phát hiện vi khuẩn Salmonella và độ nhạy của cảm biến sinh học, 06 điện cực biến tính SPE/AgNPs-rGO được cố định với cùng một quy trình giống nhau ở nồng độ kháng thể 1 μg/mL trong PBS 7,4; các điện cực được thực hiện trong cùng một điều kiện, 9
10. sau đó được đem ủ lần lượt với các nồng độ vi khuẩn Salmonella tương ứng là 101 CFU/mL, 102 CFU/mL, 103 CFU/mL, 104 CFU/mL, 105 CFU/mL cùng thời gian là 25 phút. Hình 2.3: Sự thay đổi tuyến tính tín hiệu () đầu ra của cảm biến sinh học theo nồng độ vi khuẩn từ 1 5 10 CFU/mL  10 CFU/mL trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] và 0,1 M KCl ở tốc độ quét 50 mVs-1 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa sự thay đổi tín hiệu dòng điện ở đầu ra của cảm biến và nồng độ vi khuẩn Salmonella (10 nCFU/mL) được thực hiện trong Hình 2.18 cho thấy, cảm biến điện hóa đạt tuyến tính tốt trong dải làm việc với nồng độ vi khuẩn từ 1 5 n 10 CFU/mL đến 10 CFU/mL với phương trình I peak = 0,02x - 0,01; x là 10 CFU/mL, n là 1 đến 5 và bình phương hệ số tương quan (R2) đạt 0,94559. 2.3.7. Độ chọn lọc và giới hạn phát hiện vi khuẩn Salmonella Để đánh giá khả năng chọn lọc của cảm biến điện hóa sử dụng điện cực biến tính SPE/AgNPs-rGO, cảm biến sau khi được chế tạo được thực nghiệm ủ với vi khuẩn E.coli O157 ở thời gian 25 phút với nồng độ 10 5 CFU/mL. Kết quả tính toán từ đường cong CV Hình 2.17 xác định được giá trị cực đại của cảm biến sinh học điện hóa khi cho ủ với vi 5 khuẩn Salmonella nồng độ 10 CFU/mL (vi khuẩn đặc hiệu) là I peak/Ipeak = 0,139 và cảm biến sinh học điện hóa khi ủ với vi khuẩn E.coli O157nồng độ 105CFU/mL (không đặc hiệu) có giá trị tính được là I peak/Ipeak = 0,021, quá trình thực nghiệm nhạy sinh học và thực nghiệm với vi khuẩn không đặc hiệu trên cho thấy cảm biến sinh học ổn định với tỷ lệ tín hiệu/nhiễu lớn hơn 3:1 (S/N>3). Để xác định giới hạn phát hiện (LOD) của cảm biến sử dụng phương pháp thực nghiệm, cảm biến được xác định độ nhạy với dải phát hiện tuân theo hàm () I peak /Ipeak= 0,02x - 0,01; x là 10nCFU/mL, n là 1 đến 5 và bình phương hệ số tương quan (R2) đạt 0,94559 trong nội dung 2.3.7. và tỷ số tín hiệu trên nhiễu S/N>3 [144]. Tính toán và xác định được giới hạn phát hiện của cảm biến SPE/AgNPs-rGO/NHS/Ab/BSA là 22 CFU/mL (LOD = 22 CFU/mL). 2.4. Kết luận chương 2 Kết quả nội dung nghiên cứu sử dụng điện cực SPE biến tính AgNPs-rGO cố định kháng thể bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị để phát hiện vi khuẩn Salmonella cho thấy cảm biến sinh học điện hóa làm việc ổn định, có độ nhạy, độ chọn lọc cao, thời gian phát hiện vi khuẩn sớm khoảng từ 25 phút, trong dải đo từ 101 đến105 CFU/mL, giới hạn phát hiện (LOD) là 22 CFU/mL. Tuy nhiên việc sử dụng vật liệu AgNPs-rGO biến tính SPE cacbon cho thấy các đường nền quét thế vòng tuần hoàn (CV) trước và sau khi ủ với vi khuẩn Salmonella của cảm biến 2 có giá trị Ipeak = 0,048 (10 CFU/mL) nhỏ, giới hạn phát hiện LOD ở giá trị 22 CFU/mL. Do đó, nội dung nghiên cứu sử dụng vật liệu AuNPs được NCS triển khai thực hiện trong Chương 3 của luận án. 10
11. Chương 3. CHẾ TẠO CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ ĐIỆN CỰC IN LƯỚI CACBON BIẾN TÍNH HẠT NANO VÀNG (AuNPs) 3.1. Đặt vấn đề Trong nội dung này, NCS tập trung vào việc nghiên cứu và chế tạo cảm biến theo một quy trình hoàn thiện và có định hướng ứng dụng thực tế. Vi khuẩn trong mẫu để dò tìm và phát hiện là 02 loại vi khuẩn E.coli O157và vi khuẩn MRSA gây nhiễm trùng bệnh viện được cung cấp bởi Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương. Các nội dung nghiên cứu chương này bao gồm: 1) Nghiên cứu chế tạo hạt nano vàng bằng phương pháp điện hóa đồng thời khảo sát các điều kiện về điện áp, thời gian để khống chế và lựa chọn kích thước hạt nano vàng ứng dụng biến tính điện cực in lưới cacbon; 2) Biến tính điện cực in lưới cacbon bằng hạt nano vàng đồng thời khảo sát sự ổn định trong đặc tuyến điện hóa và khả năng bám dính của hạt nano vàng trên vật liệu nền cacbon của SPE; 3) Khảo sát đặc trưng điện hóa của điện cực SPE biến tính với AuNPs ở kích thước hạt 10 nm, 15 nm, 18 nm, 25 nm để lựa chọn phương án tối ứu chế tạo cảm biến; 4) Chế tạo cảm biến bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị sử dụng nhóm thiol để gắn kết kháng thể vi khuẩn E.coli, MRSA; 5) Khảo sát khả năng phát hiện vi khuẩn đối với 02 chủng vi khuẩn E.coli O157 và MRSA gây nhiễm trùng bệnh viện. 3.2. Vật liệu và phương pháp 3.2.3. Quy trình chế tạo hạt nano vàng Bước 1. Hai điện cực vàng được làm sạch bằng nước DI, sau đó rung siêu âm 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tiếp theo làm khô bằng thổi khí nitơ Bước 2. Pha 0,05 g natri citrate (0,1%) trong 50 mL nước DI rung lắc đều trong 15 phút, sau đó đưa vào bình thủy tinh đặt trên máy khuấy từ gia nhiệt ở 400C. Bước 3. Lắp hai điện cực trên giá làm hai cực anốt và catốt với khoảng cách 2 cm, đặt song song nhau, hai điện cực được nhúng vào cốc thủy tinh chứa dung dịch natri citrate ngập 5 cm. Bước 4. Kết nối hai điện cực giá trị biên độ U = 3-15 V, thay đổi bước nhảy biên độ thế 3 V để điều chỉnh kích thước hạt (nếu cần). Thời gian thực hiện điện hóa là 60 phút đến 240 phút. 3.3. Kết quả và thảo luận 3.3.2. Khảo sát hình thái bề mặt của điện cực biến tính Điện cực SPE trước và sau khi biến tính được khảo sát thành phần nguyên tố bằng phổ EDX và kiểm tra bề mặt của WE bằng hiển vi điện tử quét (SEM, S-4800). Trước khi điện cực SPE cacbon được biến tính, WE được kiểm tra bề mặt bằng kính hiển vi điện tử quét hình 3.9. A-B. Bề mặt của điện cực WE sạch và có các hạt cacbon gắn kết dạng xốp. Sau khi biến tính, cấu trúc hình thái bề mặt điện cực SPE/AuNPs được quan sát trên SEM, kết quả cho thấy trong Hình 3.9. C-D, trên bề mặt điện cực các hạt nano vàng - AuNPs bám dính và đan xen với các khe hở của màng cacbon được phân bố đều trên khắp bề mặt WE của SPE. 11
12. Hình 3.1: (A-B) Ảnh hiển vi điện tử quét có độ phân giải cao SEM của bề mặt điện cực SPE trần, (C-D) bề mặt điện cực SPE biến tính AuNPs ở độ phân giải 500 nm và 1m 3.3.3. Đặc tuyến điện hóa của điện cực biến tính Hình 3.11 A cho thấy sau khi biến tính đặc tính điện hóa của điện cực trước và sau khi biến tính có hình thái không thay đổi trong cùng thông số với dải đo E vertex= -0,4 V đến 0,6 -1 V, tốc độ quét 50 mVs , Estep = 0,01 V, tdep = 60 s, tequ = 10 s. ở đó peak thế anốt được thực hiện sớm hơn với Ep,a = 180 mV đối với điện cực SPE/AuNPs và Ep,a = 220 mV đối với điện cực SPE trần, dòng điện oxy hóa - khử được tăng cường Iredox = 236,01 A. Hình 3.2: Đặc trưng điện hóa của điện cực biến tính SPE/AuNPs,(A) thế quét vòng tuần hoàn, (B) phổ tồng trở điện hóa EIS, (C) ổn định của điện cực biến tính với 30 vòng quét CV, (D)Von - Ampe xung vi sai trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl Trong phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa với dải tần số từ 0,01 Hz đến 100 kHz, t equ = 10 s, Eac = 0,01 V (Hình 3.11 B), giá trị điện trở chuyển tiếp tương ứng được xác định đối với SPE trần là Rct1 = 1,8 k, điện cực SPE/AuNPs là R ct2 = 0,7 k, Rct = 1,1 k. Đặc trưng của phương pháp đo Von-Ampe xung vi sai DPV ở dải điện áp E = -0,3 V tới 0,5 V, -1 Epulse = 10 mV, tốc độ quét 20 mVs và tpulse = 0,02 s trong hình 3.11 D xác định giá trị dòng anốt của điện cực SPE/AuNPs tương ứng I p,a1 = 208 A (b) và dòng anốt của điện cực trần SPE, Ip,a2 = 146 A (a). Các đặc trưng điện hóa trong 3 phép đo khảo sát đã chỉ ra rằng, bề mặt điện cực SPE sau khi được biến tính hat nano vàng AuNPs đã làm tăng cường quá trình oxyhóa - khử do sự dịch chuyển các điện tử giữa bề mặt điện cực và dung dịch điện ly [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]. Sự tăng cường dòng điện và giảm điện trở R ct được giải thích do trên điện cực WE có sự bám dính các hạt AuNPs, với cấu trúc dạng hạt nano và có độ dẫn điện tốt làm quá trình thuận nghịch của phản ứng điện hóa xảy ra tốt với tốc độ chuyển tích 12
13. nhanh chóng, tín hiệu dòng điện đầu ra được khuếch đại so với tín hiệu dòng điện trước khi biến tính. Hình 3.3: Đặc trưng điện hóa trong phương pháp đo Von - Ampe xung vi sai DPV với bước xung -1 Epulse = 10 mV trong dải 0,1V đến 0,35 V, tốc độ quét 20 mVs , t pulse = 0,02s trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] Phương pháp đo Von - Ampe xung vi sai DPV được thực hiện trong dải 0,1 V đến 0,35 V -1 với bước nhảy E pulse = 10 mV, tốc độ quét 20 mVs , t pulse = 0,02 s. Hình 3.12 biểu diễn phương pháp đo Von - Ampe vi sai DPV tuyến tính theo hàm số I p,a = 1672,43 x Epulse - 12,09, với hệ số tương quan bình phương R 2 = 0,98683. Kết quả cho thấy sự ổn định và tuyến tính của đặc trưng điện hóa trong điện cực SPE cacbon biến tính hạt nano vàng. 3.3.4. Điện cực biến tính phụ thuộc kích thước hạt nano vàng Điện cực WE của SPE được biến tính với hạt nano vàng có cùng nồng độ 100 ppm ở các kích thước hạt 10 nm, 15 nm, 25 nm. Hình 3.13 biểu diễn các đặc trưng điện hóa quét thế -1 CV ở điều kiện E ver= -0,3 V đến 0,6 V, tốc độ quét 50 mVs , Estep = 0,01 V, tdep = 60 s, tequ = 10 s và phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa ở dải tần số từ 0.01Hz đến 50kHz, tequ = 10 s, Eac = 0,01 V; đo Von - Ampe xung vi sai (DPV) dải điện áp E = -0,3 V tới 0,5 V, E pulse = -1 10 mV, tốc độ quét 20 mVs và tpulse = 0,02 s. Hình 3.4: Đặc trưng điện hóa của điện cực SPE/AuNPs phụ thuộc kích thước hạt nano vàng, (A)thế quét vòng tuần hoàn, (B) phổ tồng trở điện hóa EIS,(C) Von - Ampe xung vi sai DPV trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl Kết quả cho thấy, đối với kích thước hạt nano vàng trung bình là 10 nm cho cường độ dòng điện cực đại oxy hóa khử đạt lớn nhất và giảm dần theo độ lớn của kích thước hạt AuNPs, Hình 3.13 A. Tương ứng với phép đo phổ tổng trở điện hóa, Hình 3.13 B, giá trị các điện trở chuyển tiếp giảm dần theo kích thước hạt AuNPs biến tính điện cực SPE. Trong Hình 3.13 C, bằng phương pháp đo Von - Ampe xung vi sai cho thấy trong dải đo từ -0,3 V đến +0,5 V, điểm pic thế E p,a = +0,146 V, kết quả này đã minh chứng cho sự ổn định của 13
14. điện cực biến tính SPE/AuNPs và thế điện hóa không phụ thuộc vào kích thước hạt nano vàng biến tính. Bảng 3.1: Tổng hợp các thông số điện hóa thu được từ kết quả đo CV của các điện cực SPE trần, SPE/AuNPs-10 nm , SPE/AuNFs-15 nm và SPE/AuNPs-25 nm Giá trị I SPE/ SPE/ SPE/ redox SPE trần (A) AuNPs-10 nm AuNPs-15 nm AuNPs-25 nm Ip,a 80,01 130,08 110,04 105,25 Ip,c -74,00 -125,12 -105,02 105,41 Ipeak 154,01 255,20 215,06 210,66 Ipeak/Ipeak 0,396 0,283 0,251 Bảng 3.2: Tổng hợp các thông số điện hóa thu được từ kết quả đo EIS của các điện cực SPE trần, SPE/AuNPs-10 nm, SPE/AuNFs-15 nm và SPE/AuNPs-25 nm Giá trị R SPE/ SPE/ SPE/ ct SPE trần (k) AuNPs-10 nm AuNPs-15 nm AuNPs-25 nm Rct 1,81 0,71 1,13 1,48 Rct 1,10 0,68 0,33 Bảng 3.3: Tổng hợp các thông số điện hóa thu được từ kết quả đo DPV của các điện cực SPE trần, SPE/AuNPs-10 nm, SPE/AuNFs-15 nm và SPE/AuNPs-25 nm SPE/ SPE/ SPE/ SPE trần AuNPs-10 nm AuNPs-15 nm AuNPs-25 nm Ipeak (A) 146,01 214,08 185,61 174,20 Ipeak/Ipeak 0,32 0,21 0,16 Kết quả tổng hợp trong các Bảng 3.2, Bảng 3.3, Bảng 3.4 cho thấy các hạt AuNPs có kích thước 10 nm khi biến tính điện cực SPE có cường độ khuếch đại lớn nhất, sau đó đến điện cực SPE/AuNPs-15 nm và SPE/AuNPs-25 nm. 3.3.5. Đặc trưng tín hiệu cố định kháng thể Kết quả khảo sát điện cực biến tính ở quy trình cố định kháng thể bằng phương pháp thế quét vòng tuần hoàn được tính toán xác định trong bảng 3.5 Bảng 3.4: Các giá trị Ip,a, Ip,c, Ipeak tính toán được từ phép đo CV đối với điện cực SPE/AuNPs cố định kháng thể Điện cực Ip,a (A) Ip,c (A) Ipeak (A) SPE/AuNPs 149,08 - 126,93 266,01 SPE/AuNPs/NHS 75,80 - 75,01 150,81 SPE/AuNPs/NHS/Ab 48,60 - 48,10 96,70 SPE/AuNPs/NHS/Ab/BSA 46,20 - 45,62 91,82 (cảm biến sinh học) 3.3.6. Khảo sát khả năng phát hiện vi khuẩn E.coli O157 của cảm biến 3.3.6.1. Phát hiện vi khuẩn E.Coli O157 Cảm biến điện hóa sử dụng điện cực SPE/AuNPs đã được cố định kháng thể và khóa đặc hiệu bằng BSA. Cảm biến miễn dịch được rửa 3 lần bằng nước DI và ủ vi khuẩn E.coli ở nồng đồ từ 102 CFU/mL đến 106CFU/mL trong thời gian 25 phút. 3.3.6.2. Độ nhạy và độ chọn lọc của cảm biến Để khảo sát độ nhạy của cảm biến khi dò phát hiện vi khuẩn E.coli, 06 điện cực biến tính SPE/AuNPs trong hình 3.15 A-B được thực hiện cùng một quy trình chế tạo. Sau khi khóa 14
15. đặc hiệu các điện cực đã cố định bằng BSA, các điện cực được rửa bằng nước DI và ủ 25 phút với vi khuẩn E.coli ở các nồng độ 10 1 CFU/mL, 102 CFU/mL, 103CFU/mL, 104 CFU/mL, 105 CFU/mL, 106 CFU/mL. Hình 3.15 C cho thấy, cảm biến điện hóa có dải làm việc tuyến tính từ 101 CFU/mL đến 6 n 10 CFU/mL tuân theo phương trình Rct = 1,37x10 - 0,122 với bình phương hệ số tương quan (R2) = 0,96999, n là các giá trị từ 1 đến 6. Hình 3.5: (A-B) Cảm biến miễn dịch có điện cực biến tính SPE/AuNPs phát hiện vi khuẩn E.coli biến ở các nồng độ 101CFU/ml (a), 102CFU/ml (b), 103CFU/ml (c), 104CFU/ml (d), 105CFU/ml 6 (e), 10 CFU/ml (f) bằng phương pháp CV-EIS trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl; (C) Sự thay đổi giá trị Rct của cảm biến là hàm tuyến tính theo nồng độ vi khuẩn E.coli Bằng tính toán đã xác định được giới hạn làm việc của cảm biến điện hóa sử dụng điện cực SPE/AuNPs là 15 CFU/mL (LOD = 15 CFU/mL). Hình 3.6: (A) Độ chọn lọc của cảm biến khi khảo sát ủ với vi khuẩn đối chứng Salmonella nồng độ 1x103cfu/ml; (B) Kiểm tra thời gian sống của cảm biến bằng phương pháp quét thế vòng tuần hoàn CV sau 21 ngày bảo quản trong kho ở điều kiện 40C, PBS pH 7,4. Nồng độ vi khuẩn E.coli ủ kiểm tra 102CFU/mL 3.3.6.3. Thời gian sống của cảm biến Kết quả được biểu diễn trong Hình 3.16 B cho thấy, các đặc trưng điện hóa không thay đổi nhiều trong quá trình bảo quản sau 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày (các đường CV chồng khít lên nhau) đồng thời khi cho ủ với vi khuẩn E.coli trong 25 phút, các cảm biến được khảo sát cho đặc trưng tốt (tín hiệu dòng điện suy giảm) như trong ngày đầu thí nghiệm. 3.3.7. Khảo sát phát hiện vi khuẩn MRSA của cảm biến Trước khi thực hiện việc khảo sát vi khuẩn MRSA được kiểm tra sự có mặt trong mẫu bằng kính hiển vi điện tử quét SEM (Hình 3.17 A) và so sánh đánh giá đặc trưng điện hóa của phương pháp cố định kháng thể bằng liên kết cộng hóa trị (Hình 3.17 B) 15
16. Hình 3.7: (A) kiểm tra sự có mặt của MRSA trong mẫu; (B) đặc trưng CV các bước trong quá trình cố định kháng thể MRSA, (a) SPE trần, (b)SPE/AuNPs - 15 nm, (c) SPE/AuNPs/NHS, (d) SPE/AuNPs/NHS/Ab, (e) SPE/AuNPs/NHS/Ab/BSA, (f) SPE/AuNPs/NHS/Ab/BSA/MRSA trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl Khảo sát độ nhạy của cảm biến điện hóa. Kết quả chỉ ra trong Hình 3.18 A cho thấy giá trị điện trở tăng theo nồng độ của vi khuẩn MRSA. Giá trị R ct tương ứng được xác định sau khi FIT mạch tương đương bằng phần mềm Z-view, các giá trị R ct tính toán được cho thấy tuyến tính theo hàm y = 0,40073 x + 0,00871 với hệ số tương quan bình phương R2 = 0,98028 (Hình 3.18 B). Đánh giá độ chọn lọc của cảm biến được xác định thông qua việc ủ với 106 CFU/mL vi khuẩn E.coli O157, tín hiệu cho thấy tỷ lệ S/N 3, đồng thời giá trị giới hạn tính được là LOD = 13 CFU/mL. Hình 3.8: (A) Phổ Nyquist plots của cảm biến phát hiệu vi khuẩn MRSA ở các nồng độ 10 CFU/mL(a), 102 CFU/mL (b), 103 CFU/mL (c), 104 CFU/mL (d), 105 CFU/mL (e), 106 CFU/mL (f); (B) Dải phát hiện của cảm biến bằng Rct ở nồng độ khác nhau; (C) độ chọn lọc của cảm biến khi sử dụng vi khuẩn đối chứng E.coli O157ở nồng độ 106 CFU/mL 3.4. Kết luận chương 3 Cảm biến chế tạo được ứng dụng phát hiện 2 chủng vi khuẩn E.coli O157 và MRSA cho 6 n thấy, dải phát hiện từ 10 CFU/mL đến 10 CFU/mL tuyến tính theo hàm R ct = 1,37x10 - 0,122 với bình phương hệ số tương quan (R 2) = 0,96999, n là các giá trị từ 1 đến 6 (sử dụng AuNPs kích thước hạt 18 nm, vi khuẩn E.coli) và hàm y = 0,40073 x + 0,00871 với hệ số tương quan bình phương R2 = 0,98028 (AuNPs kích thước hạt 15 nm, vi khuẩn MRSA) , thời gian phát hiện 25 phút, giới hạn phát hiện tương ứng với 02 vi khuẩn là 15 CFU/mL (E.coli) và 13 CFU/mL (MRSA), kết quả được so sánh với các phương pháp phát hiện khác đã được công bố trên thế giới. 16
17. Chương 4. CHẾ TẠO CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ ĐIỆN CỰC IN LƯỚI CACBON BIẾN TÍNH MÀNG NANO VÀNG 4.1. Đặt vấn đề Biến tính màng vàng trên điện cực nền in lưới cacbon sẽ tạo ra một lớp hạt vàng đồng đều trên bề mặt, qua đó cho phép tăng cường độ dẫn điện cực làm việc, tăng diện tích riêng và khả năng tương thích sinh học đặc biệt là ổn định tính điện hóa ứng dụng trong cảm biến sinh học. Ngoài ra, do lớp vàng trải đều nên khả năng liên kết với các phần tử sinh học cũng lớn hơn. Với mục đích chế tạo ra một loại cảm biến điện hóa có độ bền, độ chọn lọc cao, tăng khả năng phát hiện, khoảng tuyến tính rộng và đặc biệt là ứng dụng trong dò tìm một số tác nhân sinh học trong môi trường điện ly yếu, thể tích nhỏ. Trong nội này, nghiên cứu khả năng phún xạ lớp màng nano vàng lên điện cực làm việc của điện cực SPE để khảo sát các đặc trưng điện hóa, cố định kháng thể, khả năng dò tìm vi khuẩn MRSA gây nhiễm trùng bệnh viện. 4.2. Vật liệu và phương pháp 4.2.3. Biến tính bề mặt điện cực SPE - Chuẩn bị: 5 điện cực SPE (1 lần biến tính), mặt mạ mask (hình 4.1 B), máy hút chân không (REOJ-EM, SDT10, Nhật Bản); máy rung siêu âm RK 102CH, Bandelin, Đức; hệ phún xạ E1045, ION sputter, HITACHI, Nhật bản. - Phương pháp: Mask được vệ sinh ban đầu bằng nước DI, sau đó được đưa vào máy rung siêu âm RK 102CH, Bandelin rung lắc 30 phút (gia nhiệt ở 40 0C) sau đó làm khô bằng khí nitơ. Điện cực SPE được đưa vào hút chân không ( máy REOJ-EM, SDT10, Nhật Bản) trong 60 phút, tiếp đến lấy 5 điện cực SPE thực hiện so mask và gắn kết trên mặt sau của mask. Mask sau khi gắn kết với điện cực được đưa vào buồng của máy phún xạ E1045 ION, HITACHI. Hình 4.1: (A) hệ phún xạ 1045 ION Sputter,(B) mặt lạ - Mask,(C) điện cực SPE biến tính màng nano vàng 4.3. Kết quả và thảo luận 4.3.1. Hình thái bề mặt điện cực quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét Bề mặt của điện cực sau khi phún xạ được khảo sát bằng kính hiển vi điện tử SEM. Hình 4.2 C-D biểu diễn kết quả khảo sát bề mặt điện cực SPE/AuNFs bằng kính hiển vi điện tử quét SEM có thang đo phóng đại ở 500 nm và 1. Kết quả cho thấy các lớp màng vàng được bám dính chắc chắn trên nền lớp cacbon tạo thành dạng lỗ xốp (np-Au) với mục đích làm tăng diện tích hoạt động riêng của điện cực so với điện cực dạng đĩa và độ bám dính của các phần tử sinh học. 17
18. Hình 4.2: (A-B) Ảnh hiển vi điện tử quét SEM của bề mặt điện cực SPE trần, (C-D) bề mặt điện cực SPE biến tính AuNFs ở độ phân giải 500 nm và 1m 4.3.2. Khảo sát các đặc tuyến điện hóa của điện cực biến tính Các thông số điện hóa của SPE biến tính với màng vàng có độ dày phún xạ đo được  20 nm ở điều kiện phún xạ dòng điện 20 mA và thời gian phún xạ là100 s màng vàng được khảo sát bằng 2 phương pháp điện hóa. Hình 4.4 B-C-D biểu diễn đặc tuyến điện hóa của điện cực SPE biến tính màng nano vàng. Hình 4.3: Đặc trưng điện hóa của điện cực biến tính SPE/AuNFs hình SEM chiều dày màng là 20 nm, (B) thế quét vòng tuần hoàn, (C) phổ tồng trở điện hóa EIS, (D) ổn định của điện cực biến tính với 30 vòng quét CV trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl Kết quả cho thấy các hình dạng đặc trưng điện hóa không thay đổi so với trạng thái điện cực SPE trước khi biến tính, các đỉnh thế trong cặp đỉnh oxy hóa khử tại điểm thế là E p,a = 4- 0,22 V/Ep,c = 0,02 V tương ứng với quá trình oxy hóa [Fe(CN) 6] và quá trình khử 3- [Fe(CN)6] trong dung dịch điện ly (hình 4.4. B). Hình 4.4 D biểu diễn đặc tuyến với 30 vòng quét thế tuần hoàn, kết quả cho thấy đặc tuyến điện hóa của điện cực biến tính màng vàng có nhiều tính ưu việc để triển khai trong quá trình chế tạo cảm biến sinh học. 4.3.3. Đặc tuyến điện hóa của điện cực biến tính phụ thuộc chiều dày màng nano vàng Hình 4.5 biểu diễn đặc trưng điện hóa CV, EIS của điện cực SPE biến tính màng vàng với các độ dày khác nhau. Kết quả cho thấy, điện cực biến tính ở chiều dày 20 nm cho đặc trưng điện hóa ổn định và có độ khuếch đại dòng điện tốt với I peak = 287,92 A. So sánh với việc sử dụng điện cực SPE biến tính bằng hạt nano vàng ở kích thước hạt  20 nm cho thấy sự tăng cường dòng điện khoảng 30 A, với giá trị Ipeak/Ipeak tương ứng tăng 11,2%. 18
19. Hình 4.4: Đặc trưng điện hóa của điện cực biến tính SPE/AuNFs phụ thuộc chiều dày của lớp màng mỏng nano vàng,(A) quét thế vòng tuần hoàn,(B) phổ tồng trở điện hóa EIS trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl 4.3.4. Diện tích hoạt động điện hóa của điện cực biến tính Trong hệ thống thuận nghịch dòng cực đại được xác định theo công thức phương trình Randles - Sevcik: 5 3/2 1/2 1/2 Ip = (2,69.10 ). n . A. D . C.  (4.1) Trong đó, Ip: dòng điện pic (A) F: hằng số Faraday A: diện tích điện cực (cm2) D: hệ số khuếch tán (cm2/s) C: nồng độ chất phản ứng (mol/cm3) : tốc độ quét thế (V/s) n: số electron trao đổi trong quá trình oxy hóa khử Kết quả tính toán điện tích hoạt động điện hóa của điện cực SPE biến tính với hạt nano vàng và màng nano vàng thu được trong bảng 4.6. Các giá trị lựa chọn I peak tương ứng để đánh giá xác định diện tích hoạt động điện hóa ở các điều kiện có tín hiệu khuếch đại điện hóa ổn định, không có sự thay đổi đặc tuyến điện hóa. Đối với hạt nano vàng lựa chọn có kích thước hạt  18 nm (nồng độ 100 ppM), màng nano vàng lựa chọn chiều dày  20 nm. Trong đó so sánh với diện tích hình học của điện cực trần cho giá trị lớn hơn lần lượt là 1.53 lần (SPE/AgNPs-rGO), 1.76 lần (SPE/AuNPs) và 1.92 lần (SPE/AuNFs). 4.3.7. Phát hiện vi khuẩn MRSA Để khảo sát độ nhạy của cảm biến chế tạo bằng SPE biến tính màng nano vàng, luận án thực hiện đo phổ tổng trở điện hóa của 6 cảm biến được ủ với vi khuẩn ở các nồng độ từ 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL. Hình 4.5: (A) Cảm biến sinh học có điện cực biến tính SPE/AuNFs phát hiện vi khuẩn MRSA ở các nồng độ 101CFU/mL (a), 102CFU/mL (b), 103CFU/mL (c), 104CFU/mL (d), 105CFU/mL (e), 6 10 CFU/mL (f) bằng phương pháp EIS trong dung dịch điện ly 5,0 mM K3 [Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] chứa 0,1 M KCl; (B) Sự thay đổi giá trị Rct của cảm biến sinh học sử dụng điện cực SPE/AuNFs phụ thuộc nồng độ vi khuẩn MRSA. 19
20. Các đường cong Nyquist plots bán cầu trong hình 4.9 A cho thấy, đặc trưng của phương pháp đo điện hóa là điện trở chuyển điện tích R ct, các điện trở này có giá trị phụ thuộc vào nồng độ vi khuẩn ủ trong mẫu. Điện trở chuyển điện tích tăng tuyến tính khi các nồng độ vi khuẩn tăng từ 101 CFU/mL đến 106 CFU/mL, đạt giá trị cực đại ở nồng độ vi khuẩn 106 CFU/mL. Hình 4.9 B cho thấy cảm biến điện hóa có dải làm việc tuyến tính từ 101 CFU/mL đến 106 CFU/mL tuân theo phương trình y = 1,102 x - 0,677 với bình phương hệ số tương quan (R2) 1 6 = 0,9879, y là Rct, x là các giá trị từ 10 CFU/mL đến 10 CFU/mL. LOD của điện cực biến tính màng nano vàng được tính toán từ thực nghiệm với 20 mẫu đo cho kết quả LOD = 9 CFU/mL. 4.4. Kết luận chương 4 Trong nội dung chương 4, các kết quả cho thấy những đóng góp mới của luận án. 1. Biến tính điện cực SPE cacbon bằng màng nano vàng và khảo sát đặc tuyến điện hóa đặc trưng ở 03 chiều dày màng khác nhau ở 10 nm, 20 nm, 30 nm. Từ các kết quả thực nghiệm, tính toán xác định so sánh được các giá trị diện tích hoạt động điện hóa so với diện tích hình học của các điện cực SPE/AgNPs-GO (tăng 1.53 lần), SPE/AuNPs (tăng 1.76 lần), SPE/AuNFs (tăng 1.92 lần). 2. Cảm biến được ủ kháng thể ở 10 g/mL, thời gian phát hiện là 25 phút, tín hiệu ra của cảm biến đạt cực đại Ipeak = 43,23 A. Giới hạn phát hiện của cảm biến đạt LOD = 9 CFU/mL ở nhiệt độ phòng, dải phát hiện theo nồng độ vi khuẩn MRSA ở nồng độ 10 6 1 CFU/mL đến 10 CFU/mL tuân theo hàm R ct = 1,102 x - 0,677, x là các giá trị từ 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL, hệ số tương quan bình phương R2 = 0,9879. 20
21. Chương 5. CHẾ TẠO THIẾT BỊ ĐO CẦM TAY CHO CẢM BIẾN ĐIỆN HÓA 5.1. Đặt vấn đề Khống chế và ngăn chặn kịp thời các tác nhân gây nhiễm trùng bệnh viện luôn là yêu cầu cấp thiết không chỉ đối với ngành y tế mà còn với tất cả các ngành nghề khác liên quan đến việc chăm sóc sức khỏe hiện nay, nhằm giảm thiểu nguy cơ liên quan tới sức khỏe và những thiệt hại ảnh hưởng về mặt kinh tế xã hội. Một điểm mới của luận án đó là hướng giải quyết thực trạng khi triển khai các chiến dịch phân tích, chẩn đoán tại thực địa cần các bộ thiết bị cảm biến lưu động để có thể phát hiện nhanh vi khuẩn với mục tiêu để sàng lọc, khoanh vùng, chủ động các biện pháp cách ly phòng ngừa phù hợp đối với người mắc bệnh hoặc nghi ngờ mắc bệnh từ đó đưa ra các biện pháp phòng hộ cho nhân viên y tế, học viên, người bệnh, người tiếp xúc với mầm bệnh. 5.2. Vật liệu và phương pháp 5.2.2. Thiết kế các khối của thiết bị Các thiết bị đo điện hóa trên thế giới hiện nay chủ yếu tập trung cho các phân tích trong phòng thí nghiệm, được thiết kế chế tạo theo từng trạm phân tích có kích thước và nguyên lý làm việc tương đối phức tạp đặt biệt là chi phí để được sử dụng và khai thác tương đối lớn đến hàng chục nghìn USD và khó khăn trong quá trình sử dụng phân tích lưu động. Hình 5.1: Sơ đồ khối của hệ đo điện hóa Thiết bị điện hóa được xây dựng và thiết kế chế tạo với mục đích sử dụng cho bộ cảm biến sinh học điện hóa được chế tạo để kết hợp thành một thiết bị chẩn đoán nhằm dò tìm phát hiện nhanh vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện. Hệ đo có nhiệm vụ thực hiện cung cấp, xử lý và hiển thị tín hiệu ra từ cảm biến sinh học và cảnh báo khi phát hiện các dấu hiệu quá mức cho phép. Với đặc thù đó, luận án đã phân tích và thiết kế dựa trên các điều kiện sẵn có tại Việt Nam. Sơ đồ khối của hệ đo được biểu diễn trong hình 5.1. 5.3. Kết quả và thảo luận 5.3.1. Bảng mạch chủ và tín hiệu thực nghiệm Bảng mạch chính được chế tạo hai lớp có cấu trúc TOP và BOTTOM được chế tạo thành hai khối độc lập có kích thước tổng là 160 mm x 80 mm Hình 5.7. Việc thiết kế và chế tạo thành hai khối tách biệt giúp dễ dàng thực nghiệm và chế tạo, lắp ráp. Hình 5.7 biểu diễn bảng mạch chính của hệ đo. Trên hình đã chỉ ra các khối nguồn nuôi đối xứng, bộ phát tín hiệu vào cảm biến Max 038, 02 bộ tách tín hiệu nhận được từ cảm biến, bộ xử lý trung tâm STM32, các hệ thống giao tiếp máy tính USB, RS323 và hiển thị LCD. 21
22. Hình 5.2: Bảng mạch chỉnh của hệ đo (A) là khối xử ký trung tâm và giao tiếp, hiển thị, (B) là khối nguồn nuôi, phát tín hiệu vào cảm biến, (C) hình chụp chiếu đứng của bảng mạch chính. Bảng mạch thiết kế có 02 bộ hiệu chính tín hiệu vào cho cảm biến điện hóa đó là A.adj và F.adj sự hiệu chỉnh này là cần thiết với mục đích ứng dụng cho các loại cảm biến sinh học khác nhau để phân tích các đối tượng khác nhau theo đặc trưng thông số riêng của mỗi loại. Hình 5.3: Tín hiệu được đo thực nghiệm từ bảng mạch chủ trên máy Osilloscope(A), thiết kế đóng vỏ (B), thử nghiệm tín hiệu khuếch đại (C) Hình 5.8. biểu diễn hình ảnh tín hiệu phát since gốc chưa qua xử lý cho thấy tín hiệu có độ nét tốt, không có tác động nhiễu từ bên ngoài, các giá trị thực nghiệm với biên độ cỡ 0,1 mV  850 mV và tần số lên tới 100 kHz với dải làm việc này bản mạch sẽ cải thiện về tỷ số tín hiệu/nhiễu đồng thời thông qua quá trình hiệu chỉnh từ A.adj và F.adj sẽ được ứng dụng cho các đối tượng cảm biến cố định với các phần tử sinh học khác nhau. 5.3.4. Các bước thực nghiệm với hệ đo - Công tác chuẩn bị: Cảm biến miến dịch điện hóa đã cố định kháng thể bảo quản ở điều kiện 4 0C, dung dịch PBS pH7,4, dung dịch điện ly K 3K4, cốc pha dung dịch điện ly 50 mL, giếng đặt cảm biến đường kính 10 mm, khẩu trang, găng tay, vi khuẩn E.coli O157 và vi khuẩn Salmonella, MRSA. - Trình tự thực hiện: (thực hiện theo quy trình đo 8 bước). Hình 5.10 biểu diễn quá trình đo thực nghiệm vi khuẩn E.coli O157 sử dụng thiết bị và cảm biến điện hóa. 22
23. Hình 5.4: Mô hình sử dụng thiết bị (A) và cảm biến điện hóa đo thử nghiệm lưu động tại CDC tỉnh Bắc Ninh (B) 5.3.5. Kết quả phát hiện vi khuẩn của thiết bị đo Hình 5. 56: So sánh khả năng khảo sát vi khuẩn của trạm đo điện hóa Palsen 3.0 sử dụng cảm biến SPE/AgNPs-GO (A), SPE/AuNPs (B), SPE/AuNFs (C) với thiết bị chế tạo(D)sử dụng điện cực SPE/AuNFs Các giá trị chẩn đoán dương tính hay âm tính được chỉ ra sau khi xác định thử nghiệm 20 lần đánh giá so sánh sự hoạt động của thiết bị chẩn đoán với phương pháp sử dụng máy điện hóa Palsens 3.0, giá trị thử nghiệm ban đầu được thực hiện theo các quy định kỹ thuật về giới hạn ô nhiễm vi sinh vật trong trứng và sản phẩm thịt bò. Các sản phẩm trứng thì chỉ tiêu giới hạn với 5 mẫu thì mẫu tối đa cho phép là 2 có hàm lượng đối với vi khuẩn E.coli O157 từ 101 CFU/mL đến 106 CFU/mL. Hình 5.11. biểu diễn tổng hợp quá trình thử nghiệm sử dụng thiết bị và cảm biến (SPE/AuNFs) phát hiện vi khuẩn E.coli tại Trung tâm kiểm soát bệnh tật tỉnh Bắc Ninh, kết quả cho thấy tín hiệu ra là điện áp hiển thị trên màn hình LCD có độ tuyến tính tốt khi cảm biến ủ với vi khuẩn ở các nồng độ khác nhau. Giá trị hệ số tương quan bình phương (R 2) có giá trị  1. 5.4. Kết luận chương 5 Thiết bị có kết quả đo hiển thị trên LCD kích thước hiển thị 4 x 20 kí tự cho biết giá trị làm việc của cảm biến sinh học; nhiệt độ môi trường đo mẫu; Kết quả thử nghiệm đo phát hiện vi khuẩn E.coli O157cho thấy: Thiết bị kết hợp với cảm biến sinh học phát hiện vi khuẩn E.coli O157 trong dải đo từ 101 CFU/mL đến 10 6 CFU/mL hiển thị trên màn hình LCD trạng thái làm việc của cảm biến trên cơ sở các điện cực biến tính SPE/AgNPs-rGO, SPE/AuNPs, SPE/AuNFs. 23
24. KẾT LUẬN CHUNG Luận án ”Nghiên cứu chế tạo bộ cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở các vật liệu nano vàng, bạc - oxide graphene khử để phát hiện một số vi khuẩn gây bệnh” được nghiên cứu sinh nghiên cứu và thực hiện trong giai đoạn từ năm 2016 tại Việt Nam. Các kết quả chính của luận án được tóm tắt như sau: 1. Chế tạo được cảm biến điện hóa trên cơ sở SPE cacbon biến tính với hệ vật liệu nano bạc/graphene oxít (AgNPs-rGO). Thử nghiệm cảm biến để phát hiện vi khuẩn Salmonella trong thời gian 25 phút, giới hạn phát hiện (LOD): 22 CFU/mL. 2. Chế tạo được cảm biến điện hóa trên cơ sở SPE cacbon biến tính với hạt nano vàng (AuNPs). Cảm biến được thử nghiệm phát hiện 2 chủng vi khuẩn E.coli O157 và MRSA trong dải 10 CFU/mL đến 10 6 CFU/mL; thời gian phát hiện 25 phút, LOD tương ứng là 15 (E.coli O157) và 13 CFU/mL (MRSA). 3. Chế tạo được cảm biến điện hóa trên cơ sở SPE cacbon biến tính với màng nano vàng (AuNFs). Cảm biến điện hóa chế tạo được thử nghiệm phát hiện vi khuẩn MRSA trong thời gian 25 phút, LOD: 9 CFU/mL, dải phát hiện: 10 CFU/mL đến 106 CFU/mL; 4. Chế tạo được thiết bị đo cầm tay cho cảm biến điện hóa nhằm phát hiện vi khuẩn gây bệnh tại thực đị. Chẩn đoán định tính với hiển thị Pos +: dương tính (màu đỏ); Neg-: âm tính (màu xanh). KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT 1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự ổn định làm việc của cảm biến với từng hệ vật liệu biến tính khác nhau ở các điều kiện như nhiệt độ, kích thước hạt nano, cường độ dòng phún xạ; 2. Sử dụng kháng thể thứ 2 (antibody-2) trong quá trình chế tạo cảm biến với mục tiêu tiếp tục làm giảm giới hạn phát hiện LOD của cảm biến; 3. Kiểm chuẩn thiết bị đo cầm tay thông qua một cơ quan đánh giá toàn diện các thông số nhằm tối ưu quy trình chế tạo thiết bị phân tích với tín hiệu nhỏ. 24