Nghiên cứu chọn tạo giống lúa thơm kháng rầy nâu (Nilaparvata lugenes Stal) bằng dấu phân tử SSR

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu chọn tạo giống lúa thơm kháng rầy nâu (Nilaparvata lugenes Stal) bằng dấu phân tử SSR

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: 62 42 02 01 NGUYỄN TRÍ YẾN CHI NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA THƠM (Oryza sativa L.) KHÁNG RẦY NÂU (Nilaparvata lugens Stal) BẰNG DẤU PHÂN TỬ SSR Cần Thơ, 2017
2. CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. TRƢƠNG TRỌNG NGÔN Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trƣờng Họp tại: , Trƣờng Đại học Cần Thơ Vào lúc giờ ngày tháng năm Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: 1. Trung tâm Học liệu, Trƣờng Đại học Cần Thơ. 2. Thƣ viện Quốc gia Việt Nam.
3. DANH MỤC LIỆT KÊ CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ Các bài báo đăng trên tạp chí: 1. Nguyễn Trí Yến Chi, Trƣơng Trọng Ngôn. Khảo sát sự phân ly tổ hợp lai hồi giao lúa thơm kháng rầy nâu dựa vào đặc tính nông học và dấu phân tử. Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam – Số 7(68). Trang 34-39. 2016. 2. Nguyen Tri Yen Chi, Truong Trong Ngon. Screening of aromatic rice lines by using molecular marker and sensory test. Can Tho University Journal of Science Vol 4. Page: 100- 103. 2016.
4. Chƣơng I. GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp, phần lớn diện tích đất canh tác là trồng lúa và Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) đƣợc xem là một trong những vựa lúa của cả nƣớc. Từ một nƣớc phải nhập khẩu lƣơng thực vào những năm 1980, đến nay Việt Nam là một trong ba quốc gia xuất khẩu gạo nhiều nhất thế giới với sản lƣợng tăng từ 1,99 triệu tấn năm 1995 lên mức 3,48 triệu tấn năm 2000 và 6,55 triệu tấn vào năm 2015 (Hiệp hội Lƣơng thực Việt Nam, 2015). Mặc dù sản lƣợng có tăng nhƣng thu nhập của ngƣời nông dân lại không tăng, mà kèm theo nguy cơ đất trồng bị suy thoái và ô nhiễm môi trƣờng. Việc quá chú trọng đến sản lƣợng dẫn đến chất lƣợng của lúa gạo Việt Nam trên thị trƣờng quốc tế thƣờng thấp hơn một số nƣớc khác nhƣ Ấn Độ và Thái Lan, đặc biệt có sự chênh lệch lớn giữa gạo đặc sản và gạo cao cấp. Nhìn vào thị trƣờng tiêu thụ lúa gạo hiện nay cần phải đầu tƣ hơn nữa trong việc nâng cao chất lƣợng gạo, thông qua nhiều con đƣờng để rút ngắn đƣợc thời gian và cung cấp kịp thời các giống cho sản xuất. Tuy nhiên, theo nhận định của một số nhà khoa học, gạo càng thơm thì khả năng nhiễm sâu bệnh càng cao, đặc biệt là rầy nâu, một loài côn trùng gây hại lớn nhất đối với cây lúa ở nƣớc ta cũng nhƣ các nƣớc trồng lúa ở Châu Á. Chúng chích hút gây bệnh cháy lá lúa và truyền virus gây bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá (Rice ragged stunt virus) làm giảm năng suất đến 70% hoặc làm mất trắng khi nhiễm rầy nặng và trên diện tích lớn (Lƣơng Minh Châu và ctv., 2006). Bên cạnh đó, độc tính của quần thể rầy nâu khác biệt nhau ở các khu vực có sự tách biệt về sinh thái và hiện tại rầy nâu đƣợc xác định là đang thay đổi độc tính. Điều này tiềm ẩn nguy cơ sẽ có nhiều đợt dịch mới xuất hiện, khó kiểm soát. Cho đến nay, các nhà khoa học đã ghi nhận có bốn loại hình sinh học rầy nâu đã đƣợc công bố, riêng ở Đồng bằng Sông Cửu Long, quần thể rầy nâu đã đƣợc ghi nhận có sự pha trộn giữa loại hình 2 và 3 (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2011). Các biện pháp hiện nay dùng để đối phó với dịch rầy nâu là sử dụng thuốc diệt rầy, luân canh và bón phân hợp lý. Mặc dù vậy, trong thực tế sử dụng thuốc diệt rầy đang đƣợc nông dân áp dụng nhiều nhất, việc lạm dụng thuốc trừ sâu hóa học đã làm giảm quần thể côn trùng có ích trên đồng ruộng, gây mất cân bằng sinh thái và phát triển các nòi rầy nâu kháng thuốc. Vì vậy, giải pháp cơ bản và lâu dài là sử dụng giống kháng. Việc sử dụng giống kháng, một mặt làm giảm thiệt hại năng suất, tiết kiệm chi phí phòng trừ, mặt khác hạn chế đƣợc việc dùng thuốc hóa học gây ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng trực tiếp đến sức khỏe của ngƣời dân. Tính bền vững về khả năng kháng rầy 1
5. nâu của các giống lúa kháng cũng đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Gallagher et al. (1994), Xu et al. (2002) đã xác định rằng các giống mang đa gen kháng có tính bền vững cao hơn các giống đơn gen kháng. Trƣớc đây, trong quá trình lai tạo, khả năng kháng rầy của các giống lúa đƣợc đánh giá dựa vào sự biểu hiện về kiểu hình và phải tiến hành qua nhiều vụ khác nhau. Việc làm này không những tốn kém về tiền bạc mà còn cả về thời gian. Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ sinh học đặc biệt là di truyền phân tử và kỹ thuật di truyền đã tạo điều kiện cho việc ứng dụng những phƣơng pháp mới trong chọn giống cây trồng nói chung và giống lúa nói riêng một cách nhanh chóng và hiệu quả hơn. Dấu phân tử đƣợc sử dụng nhƣ là một công cụ cho lai tạo và chọn lọc. Gen mong muốn ở các cá thể có thể xác định đƣợc từ thế hệ rất sớm, rút ngắn thời gian lai tạo. Dựa vào phân tích kiểu gen kiểm soát các tính trạng, các nhà chọn giống có thể chọn đƣợc giống mang nhiều tính trạng mong muốn trong cùng thời điểm. Ngoài việc chọn lọc giống lúa có khả năng kháng rầy nâu thì năng suất và chất lƣợng gạo cũng là mục tiêu quan trọng cần đƣợc quan tâm hàng đầu trong công tác tuyển chọn. Những giống lúa có ƣu thế về chất lƣợng gạo nhƣ hàm lƣợng amylose thấp, có mùi thơm, hạt gạo thon dài là những giống lúa cần đƣợc khai thác. Nhƣ vậy, việc chọn tạo các giống lúa vừa thơm, có chất lƣợng cao, vừa kháng rầy nâu ở giai đoạn hiện nay đƣợc xem là vấn đề cấp bách và mang ý nghĩa quan trọng về mặt chiến lƣợc. Xuất phát từ những lý do nêu trên, đề tài “ Nghiên cứu chọn tạo giống lúa thơm kháng rầy nâu (Nilaparvata lugenes Stal) bằng dấu phân tử SSR” đƣợc thực hiện. 1.2 Mục tiêu Lai tạo và chọn lọc một hoặc hai dòng lúa có triển vọng để phát triển thành giống lúa thơm mang gen kháng rầy nâu, phục vụ cho sản xuất lúa ở vùng ĐBSCL. 1.3 Những đóng góp mới của luận án Nghiên cứu đã tạo ra đƣợc sáu tổ hợp lai hồi giao từ hai giống lúa mang gen kháng rầy nâu và ba giống lúa thơm. Chọn tạo đƣợc 5 dòng lúa mang gen thơm và gen kháng rầy nâu bph4 + Bph10, 7 dòng lúa mang gen thơm và gen kháng rầy nâu bph4 + Bph18. Kết hợp đánh giá kiểu gen, kiểu hình và các đặc tính nông học đã chọn ra đƣợc 6/12 dòng lúa có một số đặc tính nông sinh học tốt để khảo nghiệm ngoài đồng. Kết quả khảo nghiệm đã chọn đƣợc hai dòng lúa đáp ứng với mục tiêu chọn tạo sẽ đƣợc tiếp tục khảo nghiệm ở các địa điểm khác ở ĐBSCL trong thời gian tới. 2
6. Chƣơng III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu Các mẫu giống lúa sử dụng làm vật liệu bao gồm: hai giống lúa mang gen kháng rầy nâu là OM4103 và OM10043, ba giống lúa mang gen thơm là ST5, ST20 và VD20, giống TN1 và PTB33 làm giống chuẩn nhiễm và chuẩn kháng rầy nâu. Dấu phân tử BADH2 sử dụng để nhận diện gen thơm đƣợc cung cấp bởi công ty CTGen dựa vào tên và trình tự mồi đã đƣợc công bố bởi Bradbury et al. (2005). Sáu cặp mồi SSR sử dụng để kiểm tra gen kháng rầy nâu đƣợc cung cấp bởi công ty sinh hóa Phù Sa dựa vào tên và trình tự mồi đƣợc công bố bởi Harini et al. (2010), Jairin et al. (2010), Kumari et al. (2010) và Jena et al. (2005). 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Nội dung 1: Lai các tổ hợp lai tạo dòng lúa mới theo mục tiêu Mục tiêu: Nghiên cứu đƣợc thực hiện với mục tiêu tạo ra con lai có mang gen thơm và gen kháng rầy nâu bph4, Bph10 và Bph18. Nội dung: Sử dụng các dòng, giống lúa thơm ST5, ST20 và VD20 (thể nhận) lai với giống mang gen kháng rầy nâu OM4103 và OM10043 (thể cho). Sau khi tạo ra con lai F1 sẽ đƣợc lai hồi giao hai lần với các giống lúa thơm và cho tự thụ phấn qua 3 lần để tạo đƣợc dòng thuần có mang gen thơm và gen kháng rầy nâu. 3.2.2 Nội dung 2: Sử dụng dấu phân tử để nhận diện gen thơm và kháng rầy từ các thế hệ phân ly kết hợp với đánh giá kiểu hình để chọn dòng lúa mới theo mục tiêu Mục tiêu: Xác định sự hiện diện của gen lặn thơm và gen kháng rầy nâu bph4, Bph10, Bph18 từ con lai F1 và con lai hồi giao. Nội dung: - Sử dụng dấu phân tử liên kết để chọn lọc các cá thể mang kiểu gen thơm và gen kháng rầy nâu từ thế hệ F1. - Đánh giá và chọn lọc theo mục tiêu đối với các dòng lúa mang kiểu gen thơm và kiểu gen kháng rầy nâu. 3.2.2.1 Sử dụng dấu phân tử để nhận diện gen thơm và kháng rầy nâu Sử dụng dấu phân tử đã đƣợc báo cáo có liên kết chặt với gen kháng rầy nâu và gen thơm trên lúa để kiểm tra tính đa hình cho việc phân biệt các giống lúa thơm, giống lúa nhiễm và kháng với rầy nâu ở thế hệ F1, BC1, BC2, BC3. 3
7. a. Ly trích ADN Thực hiện qui trình ly trích ADN đƣợc mô tả bởi Rogers và Bendich (1988) (qui trình CTAB) có hiệu chỉnh (Trần Nhân Dũng, 2011). b. Phản ứng PCR * Kiểm tra gen kháng rầy nâu Các giống lúa đƣợc kiểm tra gen kháng rầy nâu bằng các mồi chuyên biệt cho từng loại gen kháng. Thành phần hóa học cho phản ứng PCR trình bày ở Bảng 3.1 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR với các mồi kháng rầy Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ gốc Nồng độ sau cùng Nƣớc cất 2 lần 11 Dung dịch đệm có KCl 2.5 10X 1X MgCl2 3 25Mm 3mM dNTP 4 0.2mM mỗi loại 0,032mM Mồi xuôi 1 0.24μM 0,0096 μM Mồi ngƣợc 1 0.24μM 0,0096 μM BSA 0.25 0.1% 0,001 % Taq polymerase 0.25 5U/μL 0,05U/ μL ADN 2 100- 200ng 8-16ng Tổng cộng 25 * Kiểm tra gen qui định tính trạng mùi thơm Các giống lúa đƣợc kiểm tra tính trạng mùi thơm dựa vào dấu phân tử BADH2 với bốn mồi chuyên biệt là EPS, IFAP, INSP, EAP. Các thành phần phản ứng lần lƣợt cho vào tuýp PCR với thứ tự và liều lƣợng đƣợc trình bày ở Bảng 3.2. Bảng 3.2: Thành phần hóa chất phản ứng PCR với bốn mồi thơm Thành phần Thể tích (µl) Nồng độ gốc Nồng độ sau cùng Nƣớc cất 2 lần 5 Dung dịch đệm có KCl 2.5 10X 1X dNTP 4 0.2mM mỗi loại 0.032Mm MgCl2 3 25mM 3mM Mồi 1 ESP 2 0.24μM 0.0192 μM Mồi 2 EAP 2 0.24μM 0.0192 μM Mồi 3 IFAP 2 0.24μM 0.0192 μM Mồi 4 INSP 2 0.24μM 0.0192 μM BSA 0.25 0.1% 0.001% Taq polymerase 0.25 5U/μL 0.05U/ μL ADN 2 100- 200ng 8-16ng Tổng cộng 25 Sản phẩm của phản ứng PCR đƣợc kiểm tra trên gel điện di agarose 1,5% có bổ sung 2,0l/100ml thuốc nhuộm Safe View với hiệu điện thế 50V/60 phút trong dung dịch TE 1,0X. Sau đó chụp hình gel bằng máy BIORAD UV 2000. 4
8. c. Xử lý số liệu - Kiểm định sự phân ly kiểu gen trong quần thể F2 bằng phép kiểm định Chi bình phƣơng (χ2). - Số liệu đánh giá dòng đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel. 3.2.2.2 Đánh giá kiểu hình a. Bố trí thí nghiệm Các dòng lúa lai đƣợc gieo tuần tự không nhắc lại. Đối chứng là các giống lúa bố mẹ thơm và kháng rầy nâu. Phân đƣợc bón theo công thức 90-40-30 (kg N, P O , 2 5 K O/ha) và đƣợc chia thành 5 lần bón (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). 2 b. Đánh giá các chỉ tiêu: Dựa theo tiêu chuẩn “đánh giá nguồn gen cây lúa” của IRRI (2014 - tái bản lần 5). Mỗi giống/ dòng lúa chọn ngẫu nhiên 10 bụi để đánh giá các chỉ tiêu: thời gian sinh trƣởng, chiều cao cây, thành phần năng suất và năng suất. 3.2.3 Nội dung 3: Khảo nghiệm các dòng lúa lai ưu tú ở điều kiện đồng ruộng Mục tiêu: Chọn đƣợc 1 hoặc 2 dòng lai có một số đặc tính nông sinh học tốt, mang gen thơm và gen kháng rầy nâu. Nội dung: - Đánh giá mùi thơm các dòng lai ƣu tú bằng cảm quan, - Đánh giá khả năng kháng rầy nâu trong điều kiện nhân tạo, - Trồng thử nghiệm các dòng lai tại Long Phú – Sóc Trăng để đánh giá và chọn lọc theo mục tiêu đối với các dòng lúa mang kiểu gen thơm và gen kháng rầy nâu. 3.2.3.1 Bố trí thí nghiệm: Các dòng lai đƣợc bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên 3 lần lặp lại, diện tích mỗi lô là 5 m2 trên 1 lần lập lại, giống lúa bố mẹ (ST5, ST20, VD20, OM4103, OM10043) là giống lúa đối chứng. 3.2.3.2. Ghi nhận chỉ tiêu: a. Đánh giá và chọn lọc kiểu hình: Kiểu hình của các dòng lai đƣợc đánh giá và chọn lọc theo mục tiêu: thời gian sinh trƣởng ngắn ngày (90-105 ngày), có mùi thơm, năng suất từ 6 - 7 tấn/ha, hàm lƣợng amylose thấp (< 20%), có phản ứng kháng và hơi kháng với rầy nâu (cấp 1- 5) trong điều kiện nhà lƣới. b. Đánh giá chất lƣợng gạo: Lúa sau khi thu hoạch sẽ đƣợc đánh giá chất lƣợng gạo thông qua các chỉ tiêu: hình dạng hạt, tỷ lệ gạo nguyên, tỷ lệ bạc bụng, mùi thơm, hàm lƣợng amylose. 5
9. * Hình dạng hạt: chọn ngẫu nhiên 10 hạt cho mỗi lặp lại, dùng thƣớc đo chiều dài và chiều rộng hạt (mm) sau đó tính tỷ lệ dài/rộng. Phân loại hình dạng hạt theo tiêu chuẩn của FAO: Thon dài: > 3mm, Bầu: 2 – 3mm, Tròn: 20%. * Tỷ lệ gạo nguyên: xay xác 200g mẫu hạt độ ẩm 14% ở mỗi lặp lại, cân khối lƣợng gạo nguyên thu đƣợc. Tỷ lệ gạo nguyên đƣợc tính theo công thức: * Mùi thơm đƣợc đánh giá bằng cảm quan theo phƣơng pháp của Jewel et al. (2011). Mƣời hạt gạo của mỗi dòng đã đƣợc bốc vỏ và nghiền thành bột và cho vào ống nghiệm. Thêm 10ml KOH 1,7%, đậy kín ống nghiệm và sau đó để ở nhiệt độ phòng trong vòng 60 phút. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần cho mỗi dòng. Mùi thơm đƣợc đánh giá cảm quan theo 4 mức: 1 – không thơm, 2 – thơm nhẹ, 3 – thơm vừa, 4 – thơm (Jewel et al., 2011). * Hàm lƣợng amylose đƣợc phân tích theo phƣơng pháp của Graham (2002) và đƣợc phân loại theo IRRI (1996) theo tỷ lệ: 0-2%: nhóm nếp, 3-10%: rất thấp (gạo dẻo), 11-19%: thấp (gạo dẻo), 20-25%: trung bình (mềm cơm), >25%: cao (cứng cơm). * Khả năng chống chịu sâu bệnh trong điều kiện đồng ruộng nhƣ: sâu cuốn lá, rầy nâu và bệnh đạo ôn theo thang điểm của IRRI (1996). 3.2.3.3. Đánh giá khả năng kháng rầy nâu trong điều kiện nhân tạo Các dòng lai có triển vọng ở thế hệ BC3F4 sẽ đƣợc kiểm tra khả năng kháng rầy nâu bằng phƣơng pháp hộp mạ theo phƣơng pháp của IRRI (1996) có hiệu chỉnh: Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại. Dùng kẹp cấy hạt lúa vừa nảy mầm cho vào khay bùn mịn có phân lô, kẻ hàng. Theo chiều ngang khay bùn chia làm 3 lô, trên mỗi lô gồm 10 hàng cách nhau 2,0cm cho mỗi lặp lại của một giống. Theo chiều dài khay mỗi lặp lại là một hàng gồm 10 hạt/lô với số hàng là tổng số giống thử nghiệm cộng một giống chuẩn nhiễm TN1 và giống chuẩn kháng PTB33, tối thiểu mỗi hàng cách nhau 2,0cm. Khay bùn đƣợc đậy kín để giúp mầm lúa phát triển đều đạt chiều cao 2,0cm, cho khay vào hộp mạ. Khi mạ đƣợc 2-3 lá mầm (khoảng 7-10 ngày sau gieo) tiến hành thả rầy tuổi 1- 2 với mật độ 4- 6 con/cây và theo dõi đánh giá. * Chỉ tiêu theo dõi: Khi tất cả những cây của giống chuẩn nhiễm (TN1) vừa chết hết do rầy gây hại, tiến hành đánh giá tính kháng của các giống/dòng thử nghiệm. 6
10. Đếm số lƣợng các cây lúa bị rầy nâu gây hại và mức độ bị thiệt hại trên tất cả các ô trên mỗi lô thí nghiệm theo thang đánh giá của Standard Evaluation Stem for Rice (IRRI, 2002). Đánh giá sự gây hại của rầy nâu theo thang điểm chín cấp của IRRI (1996): - Cấp 0 (Rất kháng): Cây phát triển bình thƣờng, không bị hại. - Cấp 1 (Hơi kháng): Rất ít bị thiệt hại. - Cấp 3 (Hơi kháng): Lá thứ 1 và 2 của hầu hết các cây bị vàng một phần (nhƣớm vàng). - Cấp 5 (Hơi nhiễm): Vàng và lùn rõ rệt, 10- 25 % số cây đang héo hay chết, những cây còn lại còi cọc và kém phát triển. - Cấp 7 (Nhiễm): Trên 50 % đang héo (hoặc cây chết). - Cấp 9 (Rất nhiễm): 100 % cây chết. 3.2.3.4 Xử lý số liệu Dùng phần mềm SPSS 18.0 để xử lý các số liệu thu thập với các đặc số thống kê nhƣ: phân tích phƣơng sai, so sánh và kiểm định các dòng lai. Sử dụng phần mềm Excel để phân tích số liệu trong quá trình đánh giá chọn dòng . Chƣơng IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả lai tạo các tổ hợp lai trong chọn giống lúa thơm kháng rầy nâu. Công việc lai tạo để tạo ra các dòng mang gen mục tiêu đƣợc thực hiện từ tháng 6 năm 2013 đến tháng 6 năm 2015 tại nhà lƣới Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, trƣờng Đại học Cần Thơ. Hai giống mang gen kháng rầy nâu OM4103 và OM10043 đƣợc sử dụng làm vật liệu cho gen kháng. Đây là hai giống có khả năng kháng vừa với nguồn rầy nâu ở ĐBSCL với cấp kháng từ cấp 3-5 theo kết quả nghiên cứu của đề tài khoa học và công nghệ cấp bộ về sƣu tập, đánh giá và bảo tồn nguồn gen lúa kháng rầy nâu nhằm phục vụ công tác lai tạo của Trần Nhân Dũng và ctv. (2012). Ba giống lúa thơm ST5, ST20, VD20 làm vật liệu nhận gen kháng. Đây là ba giống lúa thơm có chất lƣợng cao đƣợc Hiệp hội Lƣơng thực Việt Nam (VAF) khuyến cáo đƣa vào sản xuất ở ĐBSCL, nhƣng lại có nhƣợc điểm là nhiễm nặng với rầy nâu. Do đó, nghiên cứu đã tiến hành lai tạo để chuyển gen kháng rầy nâu vào các giống lúa thơm. Tổng cộng có 6 tổ hợp lai đƣợc thực hiện qua 4 lần lai tạo hạt lai F1, BC1, BC2 và BC3. Hạt lai F1 và BC1 đƣợc tạo ra trong vụ Hè Thu 2013 và Đông Xuân 2014. Hạt lai BC2 và BC3 đƣợc tạo ra trong vụ Hè Thu 2014 và Đông Xuân 2015. Số bông đƣợc chọn cho mỗi tổ hợp lai là 10 bông, những bông này đã trổ khỏi bẹ khoảng 60%, sau đó tiến hành bỏ những hoa bên trên, bên dƣới và những hoa xấu, dị dạng sao cho mỗi bông chỉ để lại 20 hoa để khử đực và thụ phấn. Nhƣ vậy mỗi tổ hợp lai đều có 200 hạt lai đƣợc tạo ra ở thế hệ F1, BC1, BC2 và BC3. Qua 4 lần lai tạo đã thu đƣợc 2.573 cá thể. Ở 7
11. thế hệ F1 đã thu đƣợc 346 con lai, có 517 con lai thu đƣợc ở thế hệ lai hồi giao BC1, 755 con lai ở thế hệ hồi giao BC2 và 885 con lai đã đƣợc tạo ra ở thế hệ hồi giao BC3. 4.2 Sử dụng dấu phân tử để nhận diện gen thơm và gen kháng rầy nâu trên các dòng lai kết hợp với đánh giá kiểu hình Hạt lai F1 đƣợc gieo trồng trong nhà lƣới để đánh giá và chọn lọc những con lai sinh trƣởng tốt, có mang gen thơm fgr và có gen kháng với rầy nâu bph4, Bph10, Bph18. Với mục tiêu ban đầu là chuyển gen kháng rầy nâu vào các giống lúa thơm dƣới sự hổ trợ của dấu phân tử, con lai F1 sau khi tạo ra sẽ đƣợc lai hồi giao lại với gen thơm để duy trì nền di truyền của các giống thơm. Con lai ở mỗi thế hệ sau khi đƣợc xác định mang gen lặn thơm sẽ đƣợc tiếp tục xác định sự hiện diện của các gen kháng rầy nâu dựa vào dấu phân tử để có thể chọn đƣợc những cá thể mang gen mục tiêu từ những thế hệ sớm, nhằm rút ngắn thời gian lai tạo. Việc áp dụng chỉ thị phân tử để rút ngắn thời gian chọn giống đã đƣợc ứng dụng thành công giúp xác định đƣợc các cá thể mang gen mục tiêu ngay ở thế hệ rất sớm của quần thể chọn giống đang phân ly. Hầu hết các gen kháng chủ lực đã đƣợc chọn lọc thành công dựa vào dấu phân tử. Trong phạm vi nghiên cứu này, các con lai sẽ đƣợc xác định sự hiện diện của gen thơm bằng dấu phân tử BADH2 gồm 4 mồi ESP, IFAP, INSP và EAP. Các dấu phân tử RM586, RM225 đƣợc sử dụng để nhận diện gen kháng rầy nâu bph4, dấu phân tử RM260 và RM17 dùng để nhận diện gen kháng rầy nâu Bph10, để xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu Bph18 hai dấu phân tử RM3331 và RM7376 đã đƣợc sử dụng. 4.2.2 Xác định sự hiện diện của gen thơm trên các giống bố mẹ và con lai * Phân tích sự hiện diện của gen thơm trên các giống bố mẹ và con lai Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR với dấu phân tử BADH2 trên giống bố mẹ và con lai F1 MK – thang chuẩn 100bp, 1-OM4103, 2-OM10043, 3-ST5, 4-ST20, 5-VD20, 6-16: con lai F1 của tổ hợp A Kết quả từ Hình 4.2 cho thấy có sự đa hình giữa các giống cho và nhận gen kháng. Sản phẩm PCR của ba giống lúa thơm ST5, ST20 và VD20 (giống mẹ, nhận gen kháng) khuếch đại 2 băng với kích thƣớc là 577bp và 255bp, hai giống lúa kháng rầy nâu OM4103 và OM10043 (giống bố, cho gen kháng) khuếch đại 2 băng với kích thƣớc 577bp và 355bp, con lai F1 đều khuếch đại 3 băng với kích thƣớc 255bp, 355bp và 577bp thể hiện kiểu gen dị hợp không thơm. Dựa vào kết quả kiểm tra gen thơm bƣớc đầu có thể kết luận phép lai đã 8
12. đƣợc thực hiện thành công, tất cả con lai đều mang kiểu gen trung gian giữa bố và mẹ. Kết quả này cũng phù hợp với quy luật di truyền của Mendel khi lai cá thể mang gen lặn với cá thể mang gen trội thì con lai F1 có 100% kiểu gen dị hợp tử. Con lai F1 của các tổ hợp lai tiếp tục đƣợc sử dụng để lai hồi giao với dòng mẹ thơm để duy trì nền di truyền của dòng mẹ ở các thế hệ tiếp theo. * Phân tích sự hiện diện của gen thơm trên các con lai Kết quả điện di trên Hình 4.3 cho thấy ở tổ hợp lai ST5 x OM10043 có 17/28 (1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 25 và 27) con lai mang gen dị hợp không thơm, có 11/28 (3, 4, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 26 và 28) con lai mang gen lặn thơm. Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với 4 mồi ESP, IFAP, INSP và EAP trên dòng lai BC1F1 của tổ hợp lai ST5/OM10043 MK – thang chuẩn 100bp, B– giống lúa kháng rầy, M- giống lúa thơm,1-26: các dòng lai. Kết quả phân tích sự hiện diện của gen thơm trên sáu tổ hợp lai đƣợc trình bày trong Bảng 4.2. Ở tổ hợp lai ST5 x OM4103 ghi nhận có 21/54 cá thể mang gen lặn thơm, 33/54 cá thể mang gen dị hợp không thơm. Ở tổ hợp lai ST5 x OM10043 kết quả điện di cho thấy có 30/74 con lai mang kiểu gen đồng hợp lặn thơm, 44/74 con lai mang kiểu gen dị hợp không thơm. Ở tổ hợp lai ST20 x OM4103 ghi nhận có 11/27 con lai mang gen thơm đồng hợp lặn và 16/27 con lai mang kiểu gen dị hợp không thơm. Đối với tổ hợp lai ST20 x OM10043 đã chọn đƣợc 13/36 cá thể mang gen lặn thơm và 23/36 cá thể mang gen dị hợp không thơm. Kết quả nhận diện gen lặn thơm trên hai tổ hợp lai còn lại là VD20 x OM4103 và VD20 x OM10043 lần lƣợt là 18/43 và 10/24 cá thể. Sử dụng phƣơng pháp kiểm định χ2 giữa tỷ lệ phân ly kiểu gen theo lý thuyết và tỷ lệ phân ly kiểu gen thực tế đƣợc xác định bằng 4 mồi ESP, IFAP, INSP và EAP. 2 Kết quả phân tích ở Bảng 4.2 cho thấy giá trị χ tính đƣợc trên 6 tổ hợp lai nhỏ hơn giá trị χ2 bảng ở mức ý nghĩa 5%. Nhƣ vậy, tỷ lệ phân ly kiểu gen thơm fgr trên quần thể BC1 đƣa ra giá trị gần đúng với tỷ lệ phân ly theo lý thuyết (1:1). Các con lai mang gen lặn thơm ở thế hệ BC1F1 sẽ chọn để lai hồi giao lại với các giống lúa thơm để duy trì tính trạng thơm ở các thế hệ tiếp theo. Theo lý thuyết lai 1 tính trạng của Mendel, khi lai các cá thể BC1 mang gen lặn thơm với giống lúa thơm, các cá thể BC2 sẽ mang gen lặn thơm. Do đó, để kiểm tra gen thơm của con lai ở BC2, 32 dòng lai đã đƣợc chọn ngẫu nhiên để đánh giá với 4 mồi chuyên biệt ESP, IFAP, INSP và EAP. 9
13. 2 Bảng 4.2: Kết quả kiểm định χ tỷ lệ phân ly tính trạng mùi thơm ở thế hệ BC1 Số cây Kiểu gen thơm Giá trị STT Tên tổ hợp lai Probability đánh giá Fgrfgr fgrfgr χ2 1 ST5 x OM4103 54 33 21 2,24 0,10<P<0,25 2 ST5 x OM10043 74 44 30 0,34 0,25<P<0,50 3 ST20 x OM4103 27 16 11 0,59 0,50<P<0,75 4 ST20 x OM10043 36 23 13 2,25 0,10<P<0,25 5 VD20 x OM4103 43 25 18 0,84 0,25<P<0,50 6 VD20 x OM10043 24 14 10 0,38 0,50<P<0,75 χ2 bảng (df =1, p = 0,05) = 3,84 Kết quả Hình 4.4 cho thấy tất cả con lai BC2F1 đều khuếch đại 2 băng với kích thƣớc 257 bp và 577 bp, do đó có thể kết luận tất cả các dòng lai này đều mang gen lặn thơm và gen này sẽ ổn định ở các thế hệ sau khi tiến hành lai hồi giao lại với giống lúa thơm hay cho tự thụ để tạo dòng thuần. Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với 4 mồi ESP, IFAP, INSP và EAP trên dòng lai BC2F1. MK – thang chuẩn 100bp, 1-32: các cá thể lai. 4.2.3 Xác định sự hiện diện của gen kháng rầy nâu trên giống bố mẹ và con lai Mục tiêu của đề tài là chuyển thành công ba gen kháng rầy Bph18, Bph10 và bph4 từ hai giống lúa kháng rầy nâu vào ba giống lúa thơm ST5, ST20 và VD20 nhằm tạo ra các giống lúa vừa thơm vừa mang gen kháng rầy nâu. Để kiểm tra xem mục tiêu ban đầu có đạt đƣợc không, hai dấu phân tử nằm về hai phía của gen kháng rầy nâu đƣợc sử dụng để kiểm tra tính đa hình của gen kháng. Đối với gen kháng rầy nâu bph4 sử dụng hai cặp mồi RM586 và RM225, đối với gen kháng rầy nâu Bph10 sử dụng hai cặp mồi RM17 và RM260, đối với gen kháng rầy nâu Bph18 sử dụng hai cặp mồi RM3331 và RM737 để nhận diện sự có mặt của gen kháng rầy nâu trên quần thể lúa lai hồi giao. 4.2.3.1 Nhận diện gen kháng rầy nâu bph4 trên giống bố mẹ và các dòng lai hồi giao BC1, BC2 và BC3 Kết quả từ Hình 4.5 cho thấy có sự đa hình giữa các giống cho và nhận gen kháng. Sản phẩm PCR của ba giống lúa thơm ST5, ST20 và VD20 (giống mẹ, nhận gen kháng) khuếch đại băng với kích thƣớc là 122bp, hai giống lúa kháng rầy nâu OM4103 và OM10043 (giống bố, cho gen kháng) khuếch đại băng với kích thƣớc 151bp. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Sai et al. (2013), sản phẩm PCR của mồi RM225 để nhận diện gen kháng rầy nâu bph4 khuếch đại băng có kích thƣớc là 120bp – 155bp. Trong 11 cá thể BC1F1 đƣợc phân tích, có 5 dòng (11, 12, 10
14. 13, 14 và 15) cho kiểu gen dị hợp (sản phẩm PCR có 2 băng). Nhƣ vậy, gen kháng rầy nâu đã đƣợc chuyển vào các giống lúa thơm, các dòng này đƣợc chọn để lai hồi giao lại với giống lúa thơm để tạo ra dòng lúa thơm mang gen kháng rầy nâu. Hình 4.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi RM225 trên cây bố mẹ và cây lai hồi giao MK– thang chuẩn 100bp, 1-ST5, 2-ST20, 3-VD20, 4-OM4103, 5-OM10043, 6-16: cây F1 Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi RM586 trên cây bố mẹ và cây lai hồi giao MK– thang chuẩn 100bp, 1-ST5, 2-ST20, 3-VD20, 4-OM4103, 5-OM10043, 6-16: cây lai hồi giao Từ kết quả phân tích trên Hình 4.6 với dấu RM586 cho thấy các mẫu đều khuếch đại băng với 2 kích thƣớc khác nhau. Ba giống lúa thơm (ST5, ST20 và VD20) khuếch đại băng với kích thƣớc khoảng 300bp, hai giống lúa mang gen kháng rầy nâu (OM4103 và OM0043) có kích thƣớc băng khoảng 270bp. Trong 11 dòng BC1F1 đƣợc chọn để khảo sát có 4 dòng dị hợp (6, 11, 12, 13 và 14) khuếch đại 2 băng của giống thơm và giống kháng rầy, đây là những dòng mang gen kháng. Những dòng này sẽ đƣợc chọn để lai hồi giao trong các thế hệ tiếp theo. Bảng 4.4: Tỷ lệ phân ly kiểu gen kháng bph4 ở thế hệ BC1F1 của sáu tổ hợp lai đƣợc nhận diện bằng hai dấu phân tử RM225 và RM586 Dấu Số cây Kiểu gen kháng rầy Giá STT Tên tổ hợp lai 2 phân tử đánh giá Nhiễm Dị hợp kháng trị χ Probability RM225 20 11 9 0,05 0,75<P<0,90 1 ST5 x OM4103 RM586 20 13 7 1,25 0,25<P<0,50 RM225 30 18 12 0,83 0,50<P<0,75 2 ST5 x OM10043 RM586 30 19 11 1,63 0,10<P<0,25 RM225 11 7 4 0,36 0,25<P<0,50 3 ST20 x OM4103 RM586 11 8 3 1,45 0,10<P<0,25 RM225 11 7 4 0,36 0,25<P<0,50 4 ST20 x OM10043 RM586 11 8 3 1,45 0,10<P<0,25 RM225 18 11 7 0,50 0,25<P<0,50 5 VD20 x OM4103 RM586 18 12 6 1,39 0,25<P<0,50 RM225 10 6 4 0,10 0,75<P<0,90 6 VD20 x OM10043 RM586 10 7 3 0,90 0,25<P<0,50 χ2 bảng (df =1, p = 0,05) = 3,84 11
15. Gen kháng bph4 đƣợc nhận diện bằng hai dấu phân tử RM225 và RM586. Kết quả kiểm định tỷ lệ phân ly kiểu gen trên quần thể hồi giao BC1F1 của sáu tổ hợp lai ở bảng 4.4 cho thấy con lai có tỷ lệ phân ly gần đúng theo tỷ lệ 1:1 với giá trị χ2 của phép kiểm định dao động từ 0,27 đến 3,5 đều nhỏ hơn giá trị χ2 tra bảng (3,84). Nhƣ vậy, tỷ lệ phân ly kiểu gen của các dòng lai khi đƣợc nhận diện bằng hai dấu phân tử gần đúng với tỷ lệ phân ly theo lý thuyết của quy luật di truyền Mendel. Trên quần thể lai BC2 số cá thể mang kiểu gen dị hợp dao động từ 11 đến 13 cá thể trên sáu tổ hợp lai khi sử dụng dấu phân tử RM225 để kiểm tra. Dấu phân tử RM586 nhận diện đƣợc 9 – 13 cá thể lai mang kiểu gen dị hợp. Có 71/180 con lai đƣợc nhận diện có mang gen kháng rầy nâu bph4 ở trạng thái dị hợp bằng dấu phân tử RM225, 63/180 con lai dị hợp đƣợc nhận diện bằng dấu phân tử RM586. Trên quần thể lai BC3, dƣới sự hỗ trợ của dấu phân tử RM225 đã nhận diện đƣợc 64/180 con lai mang kiểu gen kháng ở trạng thái dị hợp tử, 56/180 con lai dị hợp tử đƣợc xác định bằng dấu phân tử RM586. 4.2.3.2 Nhận diện gen kháng rầy nâu Bph10 trên các giống bố mẹ và con lai hồi giao BC1, BC2 và BC3 Đối với gen Bph10, nghiên cứu đã sử dụng 2 dấu phân tử RM17 và RM260 để nhận diện sự hiện diện của gen kháng. Kết quả phổ diện điện di trên gel hình 4.7 cho thấy khi thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi RM17 thì đoạn ADN đƣợc khuếch đại có kích thƣớc khoảng 180 - 195 bp thể hiện với kiểu gen kháng (OM4103) và nhiễm (ST5, ST20 và VD20), có sự đa hình giữa các giống cho và nhận gen kháng. Sản phẩm PCR của ba giống lúa thơm ST5, ST20 và VD20 (giống mẹ, nhận gen kháng) khuếch đại băng với kích thƣớc là 180bp, giống lúa kháng rầy nâu OM4103 (giống bố, cho gen kháng) khuếch đại băng với kích thƣớc 195bp. Trong 11 cá thể BC1F1 đƣợc phân tích, có 5 dòng (6, 7, 8, 12 và 14) cho kiểu gen dị hợp (sản phẩm PCR có 2 băng). Nhƣ vậy, gen kháng rầy nâu đã đƣợc chuyển vào các giống lúa thơm, các dòng này đƣợc chọn để lai hồi giao lại với giống lúa thơm để tạo ra dòng lúa thơm mang gen kháng rầy nâu. Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi RM17 trên cây bố mẹ và cây lai hồi giao MK– thang chuẩn 100bp, 1-ST5, 2-ST20, 3-VD20, 4-OM4103, 5-OM10043, 6-16: cây lai hồi giao Dấu phân tử RM260 đã đƣợc sử dụng để nhận diện gen Bph10 để gia tăng tính chính xác trong quá trình xác dịnh gen kháng trên quần thể lai hồi giao. Từ kết quả 12
16. phân tích trên hình gel 4.8 cho thấy đoạn ADN thu đƣợc có kích thƣớc khoảng 110- 125bp. Những giống mang gen kháng rầy nâu (OM4103) sẽ liên kết với gen Bph10 thể hiện trên gel với băng khoảng 110 bp và những giống không mang gen kháng rầy nâu (ST5, ST20. VD20) sẽ thể hiện trên gel với băng 125 bp. Trong 10 dòng BC1F1 đƣợc chọn để khảo sát có 4 dòng mang kiểu gen dị hợp (6, 7, 10 và 13) khuếch đại 2 băng của giống thơm và giống kháng rầy, đây là những dòng mang gen kháng. Những dòng này sẽ đƣợc chọn để lai hồi giao trong các thế hệ tiếp theo. Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi RM260 trên cây bố mẹ và cây lai hồi giao MK– thang chuẩn 100bp, 1-ST5, 2-ST20, 3-VD20, 4-OM4103, 5-15: cây lai hồi giao Sử dụng phƣơng pháp kiểm định "Chi bình phƣơng" (χ2) để kiểm định kiểu gen kháng rầy nâu Bph10 đƣợc xác định bằng hai dấu phân tử RM17 và RM260 phân ly trong quần thể BC1. Kết quả trên Bảng 4.6 cho thấy tỷ lệ phân ly của con lai hồi giao gần đúng theo tỷ lệ 1:1 với giá trị χ2 của phép kiểm định dao động từ 0,27 đến 3,5 đều nhỏ hơn giá trị χ2 tra bảng (3,84). Nhƣ vậy, hai dấu phân tử trên đƣợc sử dụng để nhận diện gen kháng có độ tin cậy cao. Bảng 4.6: Tỷ lệ phân ly kiểu gen kháng Bph10 ở thế hệ BC1F1 của ba tổ hợp lai đƣợc nhận diện bằng hai dấu phân tử RM17 và RM260 Số cây Dấu Kiểu gen kháng rầy Giá trị STT Tên tổ hợp lai đánh Probability phân tử χ2 giá Nhiễm Dị hợp kháng RM17 20 11 9 0,05 0,90<P<0,95 1 ST5 x OM4103 RM260 20 12 8 0,45 0,50<P<0,75 RM17 11 7 4 0,36 0,50<P<0,75 2 ST20 x OM4103 RM260 11 8 3 1,45 0,10<P<0,25 RM17 18 11 7 0,5 0,25<P<0,50 3 VD20 x OM4103 RM260 18 12 6 1,39 0,10<P<0,25 χ2 bảng (df =1, p = 0,05) = 3,84 4.2.3.3 Nhận diện gen kháng rầy nâu Bph18 trên các giống bố mẹ và con lai hồi giao BC1, BC2 và BC3 Hình 4.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi RM7376 trên cây bố mẹ và cây lai hồi giao MK– thang chuẩn 100bp, 1-ST5, 2-ST20, 3-VD20, 4-OM10043, 5-16: cây lai hồi giao 13
17. Jena et al. (2005) đã kết luận gen Bph18 nằm trên cánh dài của NST 12 và có liên kết với các dấu phân tử RM3331, RM3276, RM6217, RM7376 và 7312.T4A. Nghiên cứu đã sử dụng 2 dấu phân tử RM7376 và RM3331 để xác định sự hiện diện của gen kháng. Hình 4.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi RM3331 trên cây bố mẹ và cây lai hồi giao MK– thang chuẩn 100bp, 1-ST5, 2-ST20, 3-VD20, 4-OM10043, 5-16: cây lai hồi giao Đối với dấu phân tử RM7376, kết quả từ hình 4.9 cho thấy có sự đa hình giữa các giống cho và nhận gen kháng. Sản phẩm PCR của ba giống lúa thơm ST5, ST20 và VD20 (giống mẹ, nhận gen kháng) xuất hiện băng có kích thƣớc khoảng 180 bp, giống lúa kháng rầy nâu OM10043 (giống bố, cho gen kháng) có kích thƣớc băng khoảng 195bp. Trong 11 cá thể F1 đƣợc phân tích, có 4 dòng (6, 10,14 và 15) cho kiểu gen dị hợp (sản phẩm điện di có 2 băng). Khi thực hiện phản ứng PCR với dấu phân tử RM3331 để kiểm tra gen kháng rầy nâu Bph18, những giống lúa mang gen kháng rầy nâu sẽ có vạch ADN với kích thƣớc khoảng 130bp và những giống lúa không mang gen kháng rầy nâu có kích thƣớc khoảng 110bp.Từ kết quả phân tích trên hình 4.10 cho thấy các mẫu đều khuếch đại băng với 2 kích thƣớc khác nhau. Ba giống lúa thơm (ST5, ST20 và VD20) khuếch đại băng với kích thƣớc khoảng 110bp, giống lúa mang gen kháng rầy nâu (OM10043) có kích thƣớc băng khoảng 130bp. Trong 11 giống F1 đƣợc chọn để khảo sát có 5 dòng dị hợp (7, 9, 13, 14 và 15) khuếch đại 2 băng của giống thơm và giống kháng rầy, đây là những dòng mang gen kháng. Những dòng này sẽ đƣợc chọn để lai hồi giao trong các thế hệ tiếp theo. Bảng 4.8: Tỷ lệ phân ly kiểu gen kháng Bph18 ở thế hệ BC1F1 của ba tổ hợp lai đƣợc nhận diện bằng hai dấu phân tử RM3331 và RM7376 Dấu phân Số cây Kiểu gen kháng rầy Giá trị STT Tên tổ hợp lai 2 Probability tử đánh giá Nhiễm Dị hợp kháng χ RM7376 30 17 13 0,17 0,50<P<0,75 1 ST5 x OM10043 RM3331 30 18 11 0,69 0,25<P<0,50 RM7376 11 3 8 0,67 0,25<P<0,50 2 ST20 x OM10043 RM3331 11 5 6 0,07 0,75<P<0,90 RM7376 10 3 7 0,46 0,25<P<0,50 3 VD20 x OM10043 RM3331 10 6 4 0,02 0,75<P<0,90 χ2 bảng (df =1, p = 0,05) = 3,84 Phƣơng pháp kiểm định "Chi bình phƣơng" (χ2) cũng đã đƣợc sử dụng để kiểm định tỷ lệ phân ly kiểu gen kháng rầy nâu Bph18 trên quần thể lai hồi giao BC1. Kết 14
18. quả kiểm tra đƣợc trình bày trong Bảng 4.8 nhƣ sau: gen kháng Bph18 đƣợc nhận diện bằng hai dấu phân tử RM7376 và RM3331 trên quần thể hồi giao BC1F1 của ba tổ hợp lai đƣa ra tỷ lệ phân ly gần đúng theo tỷ lệ 1:1 với giá trị χ2 của phép kiểm định dao động từ 0,20 đến 3,5 đều nhỏ hơn giá trị χ2 tra bảng (3,84). Nhƣ vậy, hai dấu phân tử trên đƣợc sử dụng để nhận diện gen kháng có độ tin cậy cao. Dựa vào sự liên kết của hai dấu phân tử RM3331 và RM7376 với gen kháng rầy nâu Bph18, nghiên cứu đã nhận diện đƣợc 28 dòng lai mang gen kháng rầy nâu ở trạng thái dị hợp khi đƣợc kiểm tra với dấu phân tử RM7376 và 22 dòng lai khi kiểm tra với dấu phân tử RM3331 ở quần thể BC2F1. Trên quần thể BC3F1 kết quả nhận diện gen dị hợp kháng là 32 và 28 cá thể lai khi kiểm tra với hai dấu phân tử RM7376 và RM3331. Bảng 4.10: Kết quả chọn cá thể mang gen mục tiêu trên quần thể BC3F1 của các tổ hợp lai trong vụ Hè Thu 2015 Số cá Chọn cá thể mang gen thơm kháng rầy nâu ở trạng Tên tổ hợp thể thái dị hợp tử chọn bph4 Bph10 Bph18 bph4 + Bph10 bph4 + Bph18 ST5 x OM4103 30 9 10 - 2 - ST5 x OM10043 30 9 - 11 - 2 ST20 x OM4103 30 11 10 - 3 - ST20 x OM10043 30 8 - 9 - 3 VD20 x OM4103 30 10 11 - 2 - VD20 x OM10043 30 9 - 8 - 2 Tổng cộng 180 56 33 28 7 7 Kết quả thống kê ở bảng 4.10 cho thấy ở thế hệ BC3F1 trong 180 cá thể đƣợc chọn có mang gen lặn thơm từ 6 tổ hợp lai có 56 cá thể mang gen bph4, 33 cá thể mang gen Bph10, 28 cá thể mang gen Bph18 ở trạng thái dị hợp tử. Trong 127 cá thể mang gen kháng có 7 cá thể mang hai gen bph4 + Bph10 và 7 cá thể mang hai gen bph4 + Bph18. 4.2.4 Kết quả đánh giá kiểu gen và kiểu hình con lai BC3F2 trong chọn lọc dòng lúa thơm kháng rầy nâu Mƣời bốn cá thể lai ở sáu tổ hợp sau khi xác định có mang gen lặn thơm và gen kháng rầy nâu ở trạng thái dị hợp đã đƣợc tự thụ để khảo sát sự phân ly kiểu gen và kiểu hình của con lai ở thế hệ BC3F2. Ở mỗi tổ hợp lai chọn ngẫu nhiên 100 cá thể gieo trồng tuần tự không nhắc lại trong vụ Hè Thu 2016 tại Tam Bình Vĩnh Long để khảo sát kiểu gen và kiểu hình. Đối với kiểu hình 60 cá thể của mỗi dòng lai đƣợc đánh dấu ngẫu nhiên để đánh giá mùi thơm, thời gian sinh trƣởng, chiều cao cây, các yếu tố cấu thành năng suất. Đối với kiểu gen: các dòng lai sau khi đƣợc chọn dựa vào các đặc tính tốt sẽ đƣợc kiểm tra kiểu gen với mục đích chọn ra các cá thể có kiểu gen kháng rầy nâu ở trạng thái đồng hợp tử cho các nghiên cứu tiếp theo. 15
19. 4.2.4.1. Đánh giá kiểu hình a. Phân tích mùi thơm trong hạt Trong thí nghiệm này sử dụng phƣơng pháp đánh giá mùi thơm trên hạt với chất kiềm của Jewel et al. (2011). Điểm đƣợc ghi nhận theo thang điểm 4 mức: không thơm (1 điểm), thơm nhẹ (2 điểm), thơm vừa (3 điểm), thơm (4 điểm). Kết quả đánh giá cảm quan cho thấy tất cả các cá thể lúa có kiểu gen thơm đồng hợp lặn (fgr/fgr) đều có mùi thơm với điểm đánh giá trung bình lớn hơn 1,5 điểm, nằm trong khoảng từ 1,50 điểm đến 3,96 điểm. b. Đánh giá đặc tính nông học của các dòng lúa lai Trong nghiên cứu này một số chỉ tiêu nông học nhƣ thời gian sinh trƣởng, chiều cao cây, số bông, số hạt chắc trên bông, năng suất hạt trên bụi, khả năng kháng bệnh ngoài đồng đƣợc theo dõi để chọn ra những dòng có đặc tính tốt. Thời gian sinh trưởng (ngày) TGST của cây lúa đƣợc tính từ khi gieo mạ đến khi có 85% lúa chín. Kết quả đánh giá TGST của các dòng lai dao động từ 98 ngày (D10) đến 120 ngày (E6). Dựa theo tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa của IRRI (1996), TGST của các dòng lúa đƣợc phân thành 2 nhóm: nhóm ngắn ngày (90-105 ngày) gồm có 3 dòng (B2, B3 và D10), nhóm trung ngày (106-120 ngày) gồm có 11 dòng (A9, A17, C12, C14, C23, D1, D23, E4, E6, F13 và F18). Nhƣ vậy, phần lớn TGST của các dòng lúa lai nằm trong nhóm trung ngày. Chiều cao cây (cm) Kết quả đánh giá chiều cao cây của các dòng lúa lai cho thấy chiều cao cây dao động trong khoảng 68 cm (F18-16) đến 135 cm (C12-52, C14-18, C14-57). Chiều cao cây của các dòng lai đƣợc phân nhóm nhƣ sau: Bảng 4.11: Phân nhóm chiều cao cây các dòng lai Cao cây (cm) Phân nhóm theo IRRI Số dòng lai Tỷ lệ (%) 125 Nhóm cao cây 16 1,9 Theo kết quả phân nhóm chiều cao cây của các dòng lai ở Bảng 4.11 cho thấy chiều cao cây đƣợc chia thành ba nhóm: nhóm thấp cây chiếm 6,8%, nhóm trung bình chiếm đa số với tỉ lệ 93,3% và chỉ có 16 cá thể thuộc nhóm cao cây với tỉ lệ 1,9%. Chiều cao cây tập trung chủ yếu thuộc nhóm có chiều cao trung bình và cùng nhóm với chiều cao cây của các giống bố mẹ. Kết quả so sánh chiều cao cây của các dòng lai cho thấy có sự khác biệt về chiều cao cây trung bình ở tổ hợp A, B, C, D và E qua kiểm định T-Test. Nghiên cứu đã chọn đƣợc 6 dòng có chiều cao trung bình lớn hơn các dòng còn lại là A9, B3, C12, C14, D10 và E4. 16
20. Số bông trên bụi Kết quả ghi nhận về số bông trên bụi đƣợc trình bày ở Phụ lục 8 cho thấy số bông dao động từ 2 bông (A9-21, A9-27, A9-52 , ) đến 20 bông (D23-60). Khi so sánh số bông trung bình của các dòng lai trong mỗi tổ cho thấy ở tổ hợp A, C, D và E đã ghi nhận đƣợc sự khác biệt có ý nghĩa qua phân tích thống kê số bông trung bình trong từng tổ hợp lai. Những dòng có số bông trên bụi cao đã đƣợc chọn cho các thí nghiệm tiếp theo là dòng A9, C14, D1 và D23. Số hạt chắc trên bông Số hạt chắc trên bông dao động từ 42 hạt (F13-42) đến 187 hạt (E6-11). Khi so sánh số hạt chắc trên bông trung bình của các dòng lai đã nhận thấy có sự khác biệt về số hạt chắc trên bông trung bình của các dòng lai qua kiểm định T-Test ở các tổ hơp lai ngoại trừ tổ hợp A. Nhƣ vậy, qua kết quả phân tích bƣớc đầu đã chọn đƣợc 6 dòng B3, C12, D1, D10, E4 và F18 có số hạt chắc trên bông trung bình cao cho các nghiên cứu tiếp theo. Năng suất hạt trên bụi (g/bụi) Kết quả khảo sát năng suất hạt trên bụi của các dòng lai dao động từ 2,34 g (C23- 10) đến 37,3 g (B3-52). Kết quả so sánh năng suất hạt trung bình của các dòng lai trên mỗi tổ hợp cho thấy không có sự khác biệt thống kê về năng suất hạt của hai dòng lai đƣợc khảo sát trên tổ hợp F, ở các tổ hợp còn lại đều ghi nhận đƣợc sự khác biệt qua phân tích thống kê. Nhƣ vậy, bƣớc đầu đã chọn đƣợc 7 dòng: A9, B3, C12, C14, D1, D10, E4 có năng suất hạt cao cho các nghiên cứu tiếp theo. Tóm lại, dựa vào kết quả đánh giá sơ khởi một số đặc tính nông học của 829 dòng lai ở 6 tổ hợp lai đã chọn đƣợc 6 dòng: A9, B3, C14, D10, E4 và F13 có đặc tính nông học tốt để khảo nghiệm ngoài đồng. 4.6.2.2 Kết quả sử dụng dấu phân tử trong chọn lọc dòng lúa thơm kháng rầy nâu Trong 60 cá thể ở mỗi dòng lai sẽ chọn ngẫu nhiên 30 cá thể với tiêu chí có số bông trên bụi, số hạt chắc trên bông, và năng suất hạt cao để kiểm tra và chọn lọc gen kháng rầy nâu đồng hợp tử. a. Nhận diện gen kháng rầy nâu bph4 Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR với dấu phân tử RM225 (A), RM586 (B) trên các dòng BC3F2 MK – thang chuẩn 100bp, 1: lúa kháng rầy OM4103, 2-lúa thơm ST5,3-16: các dòng BC3F2. Để nhận diện gen kháng rầy nâu bph4 của các dòng lúa lai hồi giao BC3F2, hai dấu phân tử RM225 và RM586 đã đƣợc sử dụng trong phản ứng PCR trên ADN thu 17
21. đƣợc từ 30 mẫu lá lúa. Kết quả đã chọn đƣợc 37 và 32 cá thể trong quần thể BC3F2 mang gen kháng rầy nâu ở trạng thái đồng hợp tử có kích thƣớc băng tƣơng ứng với kích thƣớc băng của giống lúa kháng rầy OM4103 (Hình 4.11). b. Nhận diện gen kháng rầy nâu Bph10 Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm PCR với dấu phân tử RM17 (A), RM260 (B) trên các dòng BC3F2 MK – thang chuẩn 100bp, 1: lúa kháng rầy OM4103, 2-lúa thơm ST5, 3-16: các dòng lai. Hai dấu phân tử RM17 và RM260 đã đƣợc sử dụng để nhận diện gen kháng rầy nâu Bph10. Kết quả các giống/ dòng lúa cho sản phẩm khuếch đại là 100% trên ba tổ hợp lai. Nghiên cứu đã chọn đƣợc 17 và 19 cá thể trong quần thể BC3F2 mang gen kháng rầy nâu ở trạng thái đồng hợp tử có kích thƣớc băng tƣơng ứng với kích thƣớc băng của giống lúa kháng rầy OM4103 dựa vào 2 dấu phân tử RM260 và RM17 (Hình 4.12). c. Nhận diện gen kháng rầy nâu Bph18 Hình 4.13. Kết quả điện di sản phẩm PCR với dấu phân tử RM7376 (A), RM3331 (B) trên các dòng BC3F2 MK – thang chuẩn 100bp, 1: lúa thơm ST5, 2: lúa kháng rầy OM10043, 3-16: các dòng lai. Bảng 4.16: Kết quả chọn cá thể mang gen mục tiêu trên quần thể BC3F2 của các tổ hợp lai trong vụ Hè Thu 2015 Số cá Chọn cá thể mang gen thơm kháng rầy nâu ở trạng thái Tên tổ hợp thể đồng hợp tử chọn bph4 Bph10 Bph18 bph4 + Bph10 bph4 + Bph18 ST5 x OM4103 30 4 4 - 1 - ST5 x OM10043 30 5 - 7 - 2 ST20 x OM4103 30 5 6 - 2 - ST20 x OM10043 30 6 - 9 - 3 VD20 x OM4103 30 5 7 - 2 - VD20 x OM10043 30 7 - 11 - 2 Tổng cộng 180 32 17 27 5 7 Hai dấu phân tử RM3331 và RM7376 đƣợc sử dụng để nhận diện gen kháng rầy nâu Bph18 trên ba tổ hợp lai B, D, F ở thế hệ BC3F2. Kết quả đã chọn đƣợc 14 và 19 cá thể trong quần thể BC3F2 mang gen kháng rầy nâu ở trạng thái đồng hợp tử có kích thƣớc băng tƣơng ứng với kích thƣớc băng của giống lúa kháng rầy OM10043 (Hình 4.13). 18
22. Tóm lại, ở thế hệ BC3F2 trong 180 cá thể đƣợc chọn có mang gen lặn thơm từ 6 tổ hợp lai có 32 cá thể mang gen bph4, 17 cá thể mang gen Bph10, 27 cá thể mang gen Bph18, có 5 cá thể mang gen bph4 + Bph10 và 7 cá thể mang gen bph4 + Bph18 (Bảng 4.16). Ở các thế hệ chọn lọc tiếp theo, gen mục tiêu luôn ở trạng thái đồng hợp tử nên nghiên cứu chỉ quan tâm đến chọn lọc kiểu hình theo mục tiêu: thời gian sinh trƣởng và các yếu tố cấu thành năng suất trên điều kiện đồng ruộng. 4.2.5 Kết quả đánh giá kiểu hình con lai ở quần thể BC3F3 Ở mỗi tổ hợp lai chọn ngẫu nhiên 100 cá thể gieo trồng tuần tự không nhắc lại trong vụ Đông Xuân 2016 tại Tam Bình Vĩnh Long để khảo sát sự phân ly kiểu hình. Thời gian sinh trưởng (ngày) Thời gian sinh trƣởng của các dòng lúa lai dao động từ 96 ngày (D10-17) đến 117 ngày (E6-16), thuộc trong nhóm trung ngày và thời gian sinh trƣởng của các dòng lai đều ngắn hơn TGST của ba giống lúa thơm (114-119 ngày), đây là một trong những đặc điểm có lợi cho công tác chọn tạo giống mà các nhà chọn tạo giống hƣớng tới. Chiều cao cây (cm) Chiều cao cây của các dòng lai ở thế hệ F3 dao động trong khoảng 95,11 cm (D1-6) đến 113,51 cm (C14-25). Chiều cao cây trung bình của các dòng lai đều thuộc nhóm có chiều cao trung bình và cùng nhóm với chiều cao cây của các giống bố mẹ. Số bông trên bụi Có khoảng biến động lớn về số bông trên bụi của các dòng lúa khảo nghiệm. Số bông trên bụi trung bình của con lai ở thế hệ dao động từ 5,8 bông (F18-21) đến 10,72 bông (E4-8). Số hạt chắc trên bông Số hạt chắc trên bông trung bình của các tổ hợp lai dao động từ 61,51 hạt (A9-22) đến 129,06 hạt (E4-8) và có sự khác biệt về thống kê qua kiểm định T-Test ở mỗi tổ hợp lai. Tóm lại, dựa vào các chỉ tiêu nông học đã đƣợc phân tích trên quần thể lai ở thế hệ BC3F3, mỗi tổ hợp lai sẽ chọn 1 dòng lai có những đặc tính nông học vƣợt trội cho thí nghiệm đánh giá sơ khởi các dòng lai ở điều kiện ngoài đồng. Các dòng lai đƣợc chọn là: A9-22, B2-21, C12-14, D1-6, E4-8, F13-13. 4.3 Khảo nghiệm các dòng lai ƣu tú tại Long Phú Sóc Trăng Sáu dòng lúa lai đã đƣợc chọn trong vụ Đông Xuân 2016 ở thế hệ BC3F4 đƣợc tiến hành đánh giá sơ bộ trong vụ Đông Xuân 2017. Các dòng này đƣợc gieo chung với các giống bố mẹ để so sánh và đánh giá với các tiêu chí: - Mùi thơm và khả năng kháng rầy trong điều kiện nhân tạo, - Đánh giá kiểu hình: thời gian sinh trƣởng, chiều cao cây, các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất, chất lƣợng gạo trên điều kiện đồng ruộng. 19
23. 4.3.1 Đánh giá mùi thơm và khả năng kháng rầy nâu trong điều kiện nhân tạo 4.3.1.1 Kết quả đánh giá cảm quan mùi thơm trên hạt Trong nghiên cứu này đánh giá mùi thơm bằng cảm quan sử dụng phƣơng pháp đánh giá mùi thơm trên hạt của Jewel et al. (2011). Điểm đƣợc ghi nhận theo thang điểm 4 mức: không thơm (1 điểm), thơm nhẹ (2 điểm), thơm vừa (3 điểm) và thơm (4 điểm). Bảng 4.20: Kết quả đánh giá mùi thơm của các giống/dòng khảo nghiệm. STT Tên giống/dòng Điểm trung bình Đánh giá 1 A9-22 3,2 Thơm vừa 2 B2-21 3,5 Thơm 3 C12-14 3,1 Thơm vừa 4 D1-6 3,3 Thơm vừa 5 E4-8 2,8 Thơm vừa 6 F13-13 2,6 Thơm vừa 7 ST5 (ĐC) 3,5 Thơm 8 ST20 (ĐC) 3,8 Thơm 9 VD20 (ĐC) 2,9 Thơm vừa 10 OM4103 (ĐC) 1,0 Không thơm 11 OM10043 (ĐC) 1,3 Không thơm Thí nghiệm sử dụng giống lúa thơm ST5, ST20 và VD20 làm đối chứng thơm và hai giống lúa kháng rầy (không có gen thơm) OM10043 và OM4103 làm đối chứng không thơm. Kết quả đánh giá cảm quan các dòng lúa thơm khảo nghiệm đƣợc trình bày trong Bảng 4.20. Thang điểm đánh giá mùi thơm của các dòng lúa dao động từ 1 (OM4103) đến 3,8 (ST20) với mức đánh giá từ không thơm đến thơm. Các dòng lai đều cho kết quả đánh giá từ thơm vừa đến thơm, dòng B3-56 có điểm đánh giá trung bình là 3,5 tƣơng ứng với giống mẹ ST5 và đƣợc ghi nhận là dòng thơm hơn so với các dòng còn lại. Nhƣ vậy, những dòng lúa đã đƣợc xác định có mang gen thơm bằng dấu phân tử ở thế hệ BC2 vẫn cho kiểu hình thơm ở thế hệ BC3F3. 4.3.2 Kết quả đánh giá khả năng kháng rầy nâu trong điều kiện nhân tạo Trong nghiên cứu này, đánh giá tính kháng rầy nâu trong điều kiện nhân tạo theo phƣơng pháp Hộp mạ của IRRI có cải tiến cho phù hợp với điều kiện tại Việt Nam. Kết quả đƣợc ghi nhận khi giống chuẩn nhiễm TN1 cháy rụi (cấp 9) theo thang điểm đánh giá 9 cấp của IRRI. Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại Bộ môn BVTV – Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long. Kết quả đánh giá đƣợc trình bày trong Bảng 4.21 cho thấy cấp gây hại trung bình dao động từ 3,7 (hơi kháng) đến 6,3 (hơi nhiễm). Giống chuẩn kháng PTB33 có phản ứng hơi kháng với nguồn rầy nâu đánh giá (cấp hại trung bình là 3,7). Hai giống bố mang gen kháng có phản ứng hơi kháng với rầy nâu với cấp gây hại trung bình là 4,3; 3 giống lúa thơm ST5, ST20, VD20 cho phản ứng nhiễm với rầy nâu với cấp gây hại trung bình từ 5,7 đến 6,3. Trong 6 dòng lai có mang gen kháng đƣợc khảo nghiệm có 3 dòng có biểu hiện hơi kháng 20
24. là B2-21 (cấp gây hại trung bình là 4,3), D1-6 (cấp gây hại trung bình l 4,3) và E4-8 (cấp gây hại trung bình l4,3), dòng A9-22 và dòng C12-14 hơi nhiễm với rầy nâu với cấp đánh giá là cấp 5, dòng F13-13 đƣợc đánh giá là nhiễm với rầy nâu với cấp đánh giá là 6,3. Nhƣ vậy, dựa vào kết quả đánh giá tính kháng rầy nâu trong giai đoạn mạ của các dòng lai đã chọn đƣợc 3 dòng cho phản ứng hơi kháng với rầy nâu tƣơng đƣơng với giống bố OM4103 và OM10043 là B2-21.3, D1-6 và E4-8. Bảng 4.21 : Phản ứng và cấp hại của rầy nâu trên các giống/dòng khảo nghiệm STT Tên giống/dòng Cấp hại trung bình Phản ứng 1 A9-22 5,0 Hơi nhiễm 2 B2-21 4,3 Hơi kháng 3 C12-14 5,0 Hơi nhiễm 4 D1-6 4,3 Hơi kháng 5 E4-8 4,3 Hơi kháng 6 F13-13 6,3 Nhiễm 7 ST5(ĐC) 5,7 Nhiễm 8 ST20 (ĐC) 6,3 Nhiễm 9 VD20 (ĐC) 6,3 Nhiễm 10 OM4103 (ĐC) 4,3 Hơi kháng 11 OM10043 (ĐC) 4,3 Hơi kháng TN1 (chuẩn nhiễm) 9,0 Rất nhiễm PTB33 (chuẩn kháng) 3,7 Hơi kháng 4.3.3 Kết quả đánh giá các chỉ tiêu nông học Mƣời một giống/dòng lúa khảo nghiệm bao gồm 6 dòng lai, 3 giống lúa thơm, 2 giống lúa kháng rầy đƣợc trồng để ghi nhận và đánh giá các chỉ tiêu về thời gian sinh trƣởng, chiều cao cây, các tính trạng thành phần năng suất và năng suất trong điều kiện ngoài đồng vụ Đông Xuân 2016-2017 tại huyện Long Phú tỉnh Sóc Trăng. 4.3.3.1 Các đặc tính sinh trƣởng Thời gian sinh trưởng (ngày) Kết quả đánh giá TGST các giống/dòng thí nghiệm đƣợc trình bày trong Bảng 4.22 cho thấy TGST sáu dòng lúa lai biến thiên từ 97 ngày (D1-6) đến 113 ngày (C12- 14). Dựa theo tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa của IRRI (1996), TGST của các dòng lúa đƣợc phân thành 2 nhóm: nhóm ngắn ngày (90-105 ngày) có 2 dòng D1-6 và B2- 21, nhóm trung ngày (106-113 ngày) gồm có 4 dòng (A9-22, C12-14, E4-8 và F13-13). Các dòng lai đều có TGST ngắn hơn so với giống lúa thơm từ 7 đến 15 ngày, điều này cho thấy con lai ngoài việc duy trì đƣợc tính thơm của giống mẹ còn nhận đƣợc gen kháng rầy nâu và đặc tính ngắn ngày của giống bố. Giống có TGST ngắn là một trong những đặc điểm có lợi cho công tác chọn giống mà các nhà chọn giống đang hƣớng tới, có thể giúp rút ngắn thời vụ, né tránh những bất lợi do thời tiết gây ra. 21
25. Thời gian trổ (ngày) Kết quả theo dõi thời gian trổ của 11 mẫu giống/ dòng lúa trong Bảng 4.22 cho thấy các dòng lúa lai có thời gian trổ tƣơng đối tập trung, dao động từ 4 – 6 ngày. Dòng B2-21 và D1-6 có thời gian trổ 4 ngày, dòng A9-22 và C12-14 có thời gian trổ 5 ngày, thời gian trổ của hai dòng E4.8-21 và F13-13 là 6 ngày. Bảng 4.22: Kết quả phân tích đặc tính sinh trƣởng của các giống/dòng lúa khảo nghiệm Thời gian sinh Thời gian trổ Chiều dài Chiều cao cây (cm) Giống/dòng trƣởng (TGST) (ngày) bông (cm) bcd A9-22 108 5 23,38 104,62 B2-21 103 4 23,33 107,38bc C12-14 113 5 20,20 110,40ab D1-6 97 4 21,50 101,07d E4-8 106 6 21,13 103,17cd F13-13 110 6 21,34 114,58a ST5 (ĐC) 120 9 23,35 109,25ab ST20 (ĐC) 115 7 21,21 106,70bcd VD20 (ĐC) 120 10 22,63 106,05bcd OM4103 (ĐC) 106 5 19,50 108,38bc OM10043 (ĐC) 95 4 18,97 108,83bc F 1,09ns 10,58 CV(%) 12.08 6,49 Ghi chú: các số có chữ cái giống nhau trong cùng một cột không khác biệt về thống kê ở mức ý nghĩa 5% qua kiểm định Duncan. Chiều cao cây (cm) Kết quả khảo sát chiều cao cây trong Bảng 4.22 cho thấy chiều cao cây của các giống bố mẹ dao động từ 106,05 cm (giống VD20) đến 109,25 cm (giống ST5), chiều cao cây của các dòng lai biến thiên từ 103,17 cm (E4-8) đến 114,58 cm (F13-13), Chiều cao cây của 11 giống/dòng khảo sát đƣợc xếp vào nhóm có chiều cao cây trung bình (90-125 cm), đặc điểm này giúp giống lúa vừa đảm bảo đƣợc năng suất vừa hạn chế đƣợc đổ ngã. Chiều dài bông (cm) Kết quả ghi nhận về chiều dài bông của các giống/dòng lúa khảo nghiệm ở Bảng 4.22 cho thấy chiều dài bông của năm giống bố mẹ dao động từ 18,97cm (OM10043) đến 23,35cm (ST5). Đối với sáu dòng lai chiều dài bông biến thiên từ 20,20cm (C12-14) đến 23,38cm (A9-22). Không có sự khác biệt thống kê về chiều dài bông của các giống/dòng khảo nghiệm qua kiểm định Duncan ở mức ý nghĩa 5%. 4.3.3.2. Các đặc tính nông học Số bông trên bụi Kết quả đánh giá đƣợc trình bày trong Bảng 4.23 cho thấy số bông trên bụi trung bình của các giống bố mẹ dao động từ 10 bông (giống VD20) đến 12,87 bông (giống OM4103). Số bông trên bụi trung bình của sáu dòng lai biến thiên từ 8,23 bông đến 22
26. 12,43 bông. Ba dòng A9-22, C12-14 và E4-8 có số bông trên bụi trung bình tƣơng đƣơng với giống đối chứng. Số hạt trên bông Kết quả so sánh số hạt trên bông của các dòng lai so với các giống bố mẹ trên Bảng 4.23 cho thấy số hạt trên bông trung bình của các giống bố mẹ dao động từ 96,11 hạt (OM10043) đến 127,76 hạt (VD20). Các dòng lai đƣợc đánh giá có số hạt trên bông trung bình dao động từ 85,62 hạt (D1-6) đến 145,6 hạt (F13-12.24). Hai dòng B2-21 và F13-13 có số hạt trên bông trung bình cao nhất (144,25 hạt và 144,53 hạt) so với các dòng lai còn lại và cao hơn giống đối chứng ST5. Bốn dòng A9-22, C12-14, D1-6, E4-8 có số hạt trên bông trung bình tƣơng đƣơng với giống đối chứng ST5, ST20 và VD20. Bảng 4.23: Kết quả phân tích các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các giống/dòng lúa khảo nghiệm Giống/dòng Số bông Số hạt Tỷ lệ Trọng Năng suất Năng suất trên bụi trên hạt lƣợng 1000 lý thuyết thực thu bông chắc hạt (g) (t/ha) (t/ha) A9-22 9,83bc 94,30c 75,03cd 27,18ab 6,24bc 5,47c B2-21 9,17c 144,25a 76,03bcd 28,37a 7,83a 7,16ab C12-14 11,40ab 94,23c 76,51bc 25,00d 6,75ab 6,43bc D1-6 12,43a 85,62c 74,53cd 25,70cd 6,67ab 6,48bc E4-8 9,37bc 109,94bc 64,62e 21,50f 5,40c 5,18d F13-13 8,2 3d 144,53a 75,82bcd 23,50e 7,03ab 6,39bc ST5 (ĐC) 11,71ab 98,09c 71,46d 28,31a 7,57ab 7,04b ST20 (ĐC) 11,33b 105,48bc 75,91bcd 25,93bcd 7,75a 7,39ab VD20 (ĐC) 10,00bc 127,76ab 82,17a 21,82f 7,52ab 5,84bc OM4103 (ĐC) 12,87a 89,68c 81,10abc 25,83bcd 7,91a 7,77a OM10043 (ĐC) 11,20b 96,11c 83,78a 26,50bc 7,85a 7,72a F 3,68* 5,58 6,79 28,29 3,75* 3,75* CV(%) 16,72 22,60 7,72 9,18 13,76 15,65 Ghi chú: các số có chữ cái giống nhau trong cùng một cột không khác biệt về thống kê ở mức ý nghĩa 5% qua kiểm định Duncan. Tỷ lệ hạt chắc (%) Kết quả đánh giá tỷ lệ hạt chắc ở Bảng 4.23 cho thấy tỷ lệ hạt chắc của 11 dòng/ giống khảo sát tƣơng đối thấp, điều này có thể giải thích là do trong giai đoạn trổ có mƣa nhiều nên ảnh hƣởng đến khả năng vào chắc của dòng/giống lúa thí nghiệm. Đối với các giống bố mẹ tỷ lệ hạt chắc biến thiên từ 71,46% (giống ST5) đến 83,78% (giống OM10043). Đối với các dòng lúa lai, dòng E4-8 có tỷ lệ hạt chắc dao động từ 51,6% -77,1%, trung bình là 64,62%, đây là dòng có tỷ lệ hạt chắc thấp nhất so với các dòng lai và giống đối chứng VD20. Các dòng còn lại không có sự dao động lớn về tỷ lệ hạt chắc, tỷ lệ này chỉ biến động từ 74,53% (D1-6) - 76,51% (C12-14). Khi so với các giống mẹ thì tỷ lệ hạt chắc của dòng B2 -21 thấp hơn giống mẹ là ST5 không ghi nhận đƣợc sự khác biệt về thống kê của các dòng còn lại với các giống lúa thơm ngoại trừ 23
27. dòng B2-21 và dòng F13-13. Nhƣ vậy, các dòng đƣợc chọn sẽ là những dòng có tỷ lệ hạt chắc tƣơng đƣơng với các giống lúa thơm (ST5, ST20 và VD20). Năng suất thực thu (t/ha) Trong nghiên cứu này, kết quả ghi nhận trên Bảng 4.23 cho thấy năng suất thực thu của các giống bố mẹ dao động từ 5,84 t/ha (VD20) đến 7,77 t/ha (OM4103). Năng suất thực thu của sáu dòng lai dao động từ 5,18 – 7,16 t/ha. Dòng E4-8 có năng suất thấp nhất (5,18 t/ha), dòng B2-21 có năng suất cao nhất (7,16 t/ha). Khi so sánh năng suất hạt của các dòng lai với bố mẹ cho kết quả nhƣ sau: dòng A9-22 có năng suất thấp hơn giống ST5 và OM4103 (5,47t/ha so với 7,04t/ha và 7,77t/ha), dòng B2-21 có năng suất tƣơng đƣơng với ST5 và OM10043, dòng C12-14 có năng suất tƣơng đƣơng với giống ST5 nhƣng thấp hơn so với OM4103, dòng D1-6 có năng suất tƣơng đƣơng với giống ST20 và thấp hơn giống OM10043, dòng E4-8 có năng suất thấp hơn giống VD20 và OM4103 (5,18 t/ha so với 5,84 t/ha và 7,77 t/ha), dòng F13-13 có năng suất tƣơng đƣơng giống lúa VD20 và thấp hơn giống lúa OM10043. Kết quả phân tích sự tƣơng quan của sáu dòng lai ở Bảng 4.24 cho thấy năng suất có tƣơng quan thuận với số bông (r = 0,175), chiều dài bông (r = 0,184), số hạt trên bông (r = 0,416), số hạt chắc trên bông (r = 0,389) và trọng lƣợng 1000 hạt (r = 0,231). Nhƣ vậy, để tạo đƣợc giống lúa có năng suất cao thì trong quá trình chọn lọc nên chọn những con lai có số bông, số hạt trên bông, chiều dài bông, số hạt chắc trên bông và trọng lƣợng 1000 hạt lớn. 4.3.3.3 Các chỉ tiêu chất lƣợng Hàm lượng amylose Kết quả đánh giá hàm lƣợng amylose của các giống/dòng trong nghiên cứu đƣợc trình bày trong Bảng 4.25 cho thấy hàm lƣợng amylose của năm giống bố mẹ dao động từ 15,61% (ST20) đến 25,28% (OM4103). Hàm lƣợng amylose trung bình của các dòng lai biến thiên từ 16,42% (B2-21) đến 23,47% (A9-22). Kết quả so sánh cũng chỉ ra có ba dòng (B2-21, C12-14, D1-6) có hàm lƣợng amylase thấp ( 20%). Tỷ lệ xay chà Kết quả đánh giá ở Bảng 4.25 cho thấy tỷ lệ gạo trắng của các giống bố mẹ là khá cao, đƣợc xếp vào nhóm rất tốt (>70%) theo tiêu chuẩn đánh giá của IRRI (1996). Tỷ lệ gạo trắng của các dòng lai khá thấp ngoại trừ dòng A9-22. Hai dòng C12-14 và F13-13 có 24
28. tỷ lệ gạo trắng đƣợc xếp vào nhóm kém ( 46%). Đối với sáu dòng lai, có hai dòng C12-14 và D1-6 có tỷ lệ gạo nguyên thấp (30%-38,9%), có một dòng F13-13 đƣợc xếp vào nhóm có tỷ lệ gạo nguyên trug bình, ba dòng còn lại có tỷ lệ gạo nguyên cao (46- 56,9%). Bảng 4.25: Kết quả phân tích một số chỉ tiêu chất lƣợng hạt gạo Amylose Tỉ lệ gạo Tỉ lệ gạo Tỉ lệ gạo Tổng tỉ lệ bạc Hình dạng Giống/dòng (%) lức (%) trắng (%) nguyên (%) bụng (%) hạt gạo A9-22 23,47ab 75,92c 69,68c 64,21b 17,00b Thon dài B2-21 16,42d 74,55cd 61,53de 46,42f 3,33e Thon dài C12-14 19,93c 71,87e 58,22f 33,50h 4,33e Thon dài D1-6 17,39d 68,00f 62,93d 33,56g 6,00de Thon dài E4-8 23,96ab 73,43d 64,05d 57,48d 23,30a Trung bình F13-13 23,01b 72,88de 50,13ef 44,27f 12,00f Thon dài ST5 15,9d 76,38b 75,61a 70,32a 5,70de Thon dài ST20 15,61d 75,89bc 70,57c 53,88e 4,00e Thon dài VD20 19,38c 76,03bc 72,09bc 60,87c 5,00e Trung bình OM4103 25,28a 76,64bc 73,98ab 61,73bc 6,00de Thon dài OM10043 20,53c 82,6a 71,53bc 53,41e 10,00cd Thon dài F 34,10 7,59 50,52 167,65 18,38 CV (%) 17,31 8,84 8,91 20,58 74,00 Ghi chú: các số có chữ cái giống nhau trong cùng một cột không khác biệt về thống kê ở mức ý nghĩa 5% qua kiểm định Duncan. Hình dạng hạt gạo Kết quả đánh giá hình dạng hạt gạo cho thấy tất cả các dòng lai đều có dạng hạt gạo thon dài tƣơng tự nhƣ hình dạng hạt gạo của các giống bố mẹ, chỉ có dòng E6-18 có dạng hạt gạo trung bình (Bảng 4.25). Nhƣ vậy, kết quả đánh giá này cho thấy hầu hết các dòng lai đều đáp ứng phần lớn thị hiếu của ngƣời tiêu dùng trên thị trƣờng trong nƣớc và xuất khẩu. Bảng 4.26: Thông số các dòng lai đƣợc chọn Tiêu chuẩn chính Mục tiêu Dòng B2-21 Dòng D1-6 TGST(ngày) 90-105 103 97 Năng suất 6-7 t/ha 7,16 6,48 Chất lƣợng Hàm lƣợng amylose < 20% 16,42 17,39 Chống chịu sâu bệnh Kháng với rầy nâu Hơi kháng Hơi kháng Nhƣ vậy, qua các kết quả đánh giá về tính kháng rầy nâu, các chỉ tiêu nông học và chất lƣợng gạo chọn đƣợc hai dòng B2-21 và D1-6 thỏa các điều kiện chọn tạo ban đầu đƣa ra, là hai dòng lúa thơm, có hàm lƣợng amylose thấp, phản ứng hơi kháng với rầy nâu. Tuy năng suất có thấp hơn so với giống cho gen kháng rầy nâu, nhƣng tƣơng đƣơng với giống ST5 và ST20.Kết quả này chỉ mới đƣợc thực hiện một vụ Đông Xuân tại 1 địa điểm, nên cần đƣợc đánh 25
29. giá ở nhiều địa điểm và mùa vụ khác nhau để có kết quả chính xác hơn. Ngoài ra các dòng đƣợc chọn trong nghiên cứu này ở thế hệ BC3F4 nên có độ đồng đều chƣa cao, cần tiến hành chọn dòng ở các thế hệ tiếp theo. Chƣơng V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Kết quả lai tạo đƣợc sáu tổ hợp lai hồi giao để tạo nguồn vật liệu mới từ năm giống bố mẹ ban đầu. Các phép lai có định hƣớng chọn lọc các dòng lúa thơm (mang gen fgr), kháng với rầy nâu (con lai mang hai gen kháng rầy nâu trong ba gen bph4, Bph10 và Bph18). Xác định đƣợc các dấu phân tử RM225 và RM586 nhận diện gen kháng bph4, dấu phân tử RM17 và RM260 nhận diện gen Bph10, dấu phân tử RM7376 và RM3331 nhận diện gen Bph18 có độ tin cây cao. Kết quả đánh giá kiểu gen đã chọn đƣợc năm con lai mang gen lặn thơm và hai gen kháng rầy nâu bph4 và Bph10, bảy con lai mang gen thơm và hai gen kháng rầy nâu bph4 và Bph18 từ 180 con lai ở quần thể BC3F2 của sáu tổ hợp lúa lai hồi giao. Kết quả đánh giá kiểu hình và các đặc tính nông học đã chọn ra đƣợc 6/14 dòng mang gen lặn thơm và hai gen kháng rầy nâu có một số đặc tính nông sinh học tốt để khảo nghiệm ngoài đồng ở thế hệ BC3F4. Kết quả khảo nghiệm ngoài đồng tại Long Phú Sóc Trăng vụ Đông Xuân 2016-2017 đã chọn đƣợc hai dòng B2-21 và D1-6 đáp ứng với mục tiêu đề ra, có thời gian sinh trƣởng là 103 và 97 ngày, năng suất đạt 7,16t/ha và 6,48t/ha, hàm lƣợng amylose thấp hơn 20% (16,42% và 17,39%), có phản ứng hơi kháng với rầy nâu trong điều kiện nhà lƣới (cấp kháng trung bình là 4,3). 5.2 Đề xuất Tiếp tục trồng 12 dòng lai đƣợc đánh giá là mang gen thơm và 2 gen kháng rầy nâu để chọn ra những dòng lai ƣu tú. Khảo nghiệm 2 dòng lai đƣợc chọn ở nhiều địa điểm và mùa vụ khác nhau ở các tỉnh ĐBSCL để đánh giá tiềm năng của hai dòng này với tính kháng các nguồn rầy nâu khác nhau. 26