Nghiên cứu đa dạng và đặc điểm sinh học của nấm túi họ Xylariaceae ở Mường Phăng - Điện Biên và Cúc Phương – Ninh Bình

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu đa dạng và đặc điểm sinh học của nấm túi họ Xylariaceae ở Mường Phăng - Điện Biên và Cúc Phương – Ninh Bình

1. 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam có hệ thực vật, động vật vô cùng phong phú, đa dạng và độc đáo. Do tác động của tự nhiên cũng như của con người nên hệ động, thực vật luôn có sự biến đổi theo thời gian. Vì vậy, nghiên cứu cơ bản về đa dạng sinh học là cơ sở khoa học cho các lĩnh vực khoa học khác như Sinh thái, Sinh lý thực vật, Địa lý thực vật, Tài nguyên thực vật, công nghệ sinh học, Hóa học, Y học, Dược học. Nấm là một giới sinh vật quan trọng trên trái đất không chỉ vì vai trò của chúng trong các hệ sinh thái mà còn bởi vai trò to lớn của chúng đối với đời sống con người. Các nhà khoa học ước tính có khoảng 1.5 triệu loài nấm trên trái đất, tuy nhiên số lượng loài thực tế mà chúng ta đã tìm thấy khoảng 100.000 loài, đạt gần 6,7% so với số loài ước tính. Xylariaceae là họ có số lượng loài lớn nhất trong ngành nấm túi. Cho đến nay, các nhà khoa học đã xác định được 95 chi với 1354 loài được công bố trên toàn thế giới. Riêng ở khu vực Đông Nam Á đã ghi nhận được 154 loài thuộc 23 chi đã ở Thái Lan, 136 loài thuộc 17 chi ở Đài Loan. Tuy nhiên, ở nước ta vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu đầy đủ về họ này mà mới chỉ thống kê được 69 loài thuộc 13 chi. Con số này còn rất khiêm tốn so với đặc điểm khí hậu nhiệt đới, thuận lợi cho nấm phát triển ở Việt Nam. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy nấm túi họ Xylariaceae là nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất mới có hoạt tính sinh học rất hữu ích như hoạt chất chống ung thư, chống nấm, chống virut, chống viêm. Rừng nguyên sinh Mường Phăng – Điện Biên và Vườn quốc gia Cúc Phương – Ninh Bình là 2 khu rừng được bảo tồn rất nghiêm ngặt. Mặc dù cùng nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nhưng do dãy Hoàng Liên Sơn ngăn cách nên giữa Mường Phăng và Cúc Phương có sự khác biệt khá lớn không chỉ về khí hậu mà cả địa chất. Tuy mức độ đa dạng nấm cao nhưng có rất ít các công bố về đa dạng nấm túi họ Xylariaceae ở đây. Những kết quả thu được vẫn chưa thể hiện được sự đa dạng cũng như ý nghĩa của nấm túi họ Xylariaceae tại 2 vùng trên.
2. 2 Từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đa dạng và đặc điểm sinh học của nấm túi họ Xylariaceae ở Mường Phăng - Điện Biên và Cúc Phương – Ninh Bình”. Việc nghiên cứu sẽ góp phần bổ sung danh lục các loài nấm ở Việt Nam cũng như gợi ra hướng nghiên cứu ứng dụng của nấm túi họ Xylariaceae ở Việt Nam. 2. Mục đích của đề tài Xác định được thành phần loài và đánh giá đa dạng sinh học của nấm túi họ Xylariaceae tại khu vực nghiên cứu. Nghiên cứu được một số đặc điểm sinh học của nấm túi họ Xylariaceae tại khu vực nghiên cứu. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Xác định thành phần loài nấm túi họ Xylariaceae tại khu vực nghiên cứu 3.2. Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của nấm túi họ Xylariaceae tại khu vực nghiên cứu 3.3. Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của các chi, các loài nấm túi họ Xylariaceae tại khu vực nghiên cứu 3.4. Nghiên cứu thành phần hóa học của một số loài nấm và hoạt tính sinh học của chúng 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng: Các loài nấm túi họ Xylariaceae. - Phạm vi nghiên cứu: rừng nguyên sinh Mường Phăng – Điện Biên và vườn quốc gia Cúc Phương – Ninh Bình. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5.1. Ý nghĩa khoa học Đề tài cung cấp chính xác và đầy đủ danh lục các loài nấm túi họ Xylariaceae cũng như các đặc điểm định loại và phân bố của chúng ở khu vực nghiên cứu, từ đó góp phần bổ sung thêm kiến thức cho ngành phân loại nấm, tạo sự hiểu biết sâu sắc hơn về phân loại nấm túi họ Xylariaceae ở Việt Nam. Cung cấp các dữ liệu về trình tự ADN cho khoa học, đồng thời bổ sung các loài nấm mới ghi nhận cho khu hệ nấm ở Việt Nam.
3. 3 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở khoa học phục vụ cho các ngành hóa học, y – dược, sinh thái, tài nguyên sinh vật và đa dạng sinh học. Cung cấp những dữ liệu về đặc điểm hình thái, tính đa dạng sinh học khóa định loại các loài nấm túi họ Xylariaceae sẽ phục vụ cho công tác giảng dạy, nghiên cứu và bảo tồn nguồn gen sinh vật ở Việt Nam. 6. Những đóng góp mới - Đây là luận án đầu tiên nghiên cứu có tính hệ thống về nấm túi họ Xylariaceae ở Việt Nam. Số lượng các chi, các loài mới ghi nhận cho khu hệ nấm sẽ góp phần hoàn thiện hơn danh lục các loài nấm túi họ Xylariaceae nói riêng và nấm nói chung ở Việt Nam. - Bổ sung 4 chi, 100 taxon mới ghi nhận cho khu hệ nấm Việt Nam. Trong 49 taxon được phân tích trình tự ADN có 5 taxon có trình tự lần đầu tiên công bố cho khoa học. - Xây dựng 01 khóa định loại đến chi và 7 khóa định loại đến loài, mô tả chi tiết 114 taxon ở khu vực nghiên cứu, có ảnh, mẫu lưu kèm theo. - Lần đầu tiên xây dựng mối quan hệ di truyền cho 49 taxon thuộc 8 chi của nấm túi họ Xylariaceae ở Việt Nam. - Tách chiết và xác định được 13 hợp chất từ 4 taxon nấm túi họ Xylariaceae là: B. philippinensis MP136, D. concentrica CP002, X. atrosphaerica CP257, X. schweinitzii CP613 trong đó có 1 hợp chất mới cho khoa học và 12 hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong các loài thuộc họ Xylariaceae thu được ở Việt Nam. - Bước đầu thử hoạt tính sinh học của 3 hợp chất tách chiết từ loài D. concentrica CP002có khả năng ức chế 4 dòng tế bào ưng thư ở người (ung thư biểu bì, ung thư vú, ung thư phổi, ung thư gan). Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu đa dạng nấm túi họ Xylariaceae trên thế giới 1.1.1. Đa dạng về thành phần loài Nấm túi Xylariaceae là họ có số lượng loài lớn nhất trong ngành nấm túi Ascomycota với 95 chi và 1354 loài được chấp nhận. Những nghiên
4. 4 cứu trên thế giới không chỉ dừng lại ở việc đánh giá đa dạng sinh học mà còn nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của nấm túi Xylariaceae đối với đời sống của con người. Các nghiên cứu về thành phần loài nấm túi họ Xylariaceae đã được thực hiện ở nhiều quốc gia và lãnh thổ trên toàn thế giới. Nam Mỹ và Đông Nam Á là khu vực có các khu rừng nhiệt đới rậm rạp với mức độ đa dạng sinh học rất cao. Các kết quả nghiên cứu ở đây đã chứng minh nấm túi họ Xylariaceae có độ đa dạng cao về thành phần loài cũng như mật độ các cá thể thu được. Ngoài ra từ kết quả nghiên cứu các nhà khoa học đã xác định được chi Xylaria chiếm ưu thế với số lượng loài cao nhất, tiếp đến là chi Hypoxylon và chi Annulohypoxylon. Khu vực Châu Âu hay Châu Phi do điều kiện khắc nghiệt. Các nghiên cứu ở đây cũng đã xác định mức độ đa dạng loài nấm túi họ Xylariaceae là thấp. Đặc biệt cấu trúc thành phần loài cũng có sự khác biệt so với vùng nhiệt đới, trong đó là chi Hypoxylon có số lượng loài cao nhất, tiếp đến là chi Xylaria và Annulohypoxylon. Bảng 1.1. Thành phần loài họ Xylariaceae và các tác giả nghiên cứu trên thế giới Số lượng STT Quốc Gia Tác giả Loài Chi 1 Đài Loan 136 17 Ju (1996. 1997, 2005) Kwang (2008) Thienhirun (1997), Fournier (2010), 2 Thái Lan 154 23 Whalley (2012) 3 Trung Quốc 90 8 Ma (2011) 4 Indonexia 60 7 Roger (1987) 5 Brazil 210 21 Maia (2010) 7 Venezuela 125 8 Miller (1934) 8 Papua New Guinea 94 7 Van der Gucht (1996) 10 Hawai 100 13 Rogers (2012) 11 Ba Lan 51 16 Chlebicki (2008) Như vậy, nghiên cứu thành phần loài và đánh giá đa dạng sinh học đã đạt được những bước tiến vượt bậc trong những năm gần đây, các khu hệ, các vùng có đa dạng sinh học cao đã được nghiên cứu và công bố. Hầu hết các chi có số lượng loài lớn, độ đa dạng cao đã được mô tả và xây
5. 5 dựng khóa định loại đến loài. Các kết quả nghiên cứu từ trước tới nay là nền tảng cho các nhà khoa học hiện tại và tương lai có những định hướng nghiên cứu cơ bản và ứng dụng tiếp theo về đối tượng nấm túi họ Xylariaceae ở các vùng địa lý khác nhau, góp phần làm giàu sự hiểu biết của con người về giới nấm nói chung và họ Xylariaceae nói riêng. 1.2. Ở Việt Nam Đến nay, hầu hết các nghiên cứu về nấm ở Việt Nam chỉ tập trung vào nghiên cứu, đánh giá, phân tích đa dạng sinh học các khu hệ nấm lớn, không chú trọng vào một đối tượng cụ thể. Tuy nhiên những công bố về nấm lớn bước đầu đã xác định được một số chi, loài thuộc họ Xylariaceae. Ngô Anh và cs đã nghiên cứu khu hệ nấm lớn ở Thừa Thiên Huế 2010 và xác định được 465 loài nấm lớn thuộc 140 chi, 56 họ, 28 bộ, 4 lớp, 3 ngành, trong đó có 9 loài nấm túi họ Xylariaceae; khu hệ nấm lớn ở huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu (2011) đã xác định được 14 loài thuộc họ Xylariaceae, trong đó bổ sung 8 loài cho khu hệ nấm Việt Nam trên tổng số 202 loài nấm lớn thuộc 70 chi, 34 họ, 22 bộ, 3 lớp, 3 ngành thu được ở đây; khu hệ nấm lớn ở vùng lõi vườn quốc gia Phong Nha – Kẻ Bàng, tác giả đã xác định 9 loài thuộc 3 chi trong họ Xylariaceae trên 173 loài nấm lớn thuộc 53 chi, 26 họ, 17 bộ, 3 lớp, 3 ngành. Trong 9 loài ấy có đến 7 loài lần đầu tiên được tìm thấy ở khu hệ nấm lớn Việt Nam. Năm 2009, Dương Minh Lam và cs bổ sung 3 loài trong đó có 2 loài thuộc chi Annulohypoxylon và 1 loài thuộc chi Hypoxylon. Gần đây nhất, trong cuốn“ Nấm lớn ở Việt Nam” tập 2 năm 2012, Trịnh Tam Kiệt đã thống kê họ Xylariaceae có 69 loài thuộc 13 chi thuộc họ Xylariaceae. Chương 2: ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm, thời gian và vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Các mẫu nghiên cứu được thu tại vườn quốc gia Cúc Phương, tỉnh Ninh Bình và rừng nguyên sinh Mường Phăng, tỉnh Điện Biên, 2.1.2. Thời gian nghiên cứu
6. 6 Chúng tôi tiến hành thu mẫu từ năm 2009 đến năm 2012 với 12 đợt đi thu mẫu tại 2 khu vực nghiên cứu. 2.1.3. Vật liệu nghiên cứu Tổng cộng đã có 830 mẫu được thu thập từ 02 khu vực nghiên cứu, trong đó có 526 mẫu đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu định loại. Các dòng tế bào ung thư ở người và VSV kiểm định sử dụng tại phòng thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa học. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị được sử dụng tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Vi sinh – Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vi sinh - Thu thập và xử lý mẫu - Phương pháp phân lập nấm -.Phương pháp phân tích đặc điểm hình thái, định loại mẫu phân tích theo các khóa định loại và tài liệu đáng tin cậy đã được công bố trên thế giới. - Hoạt tính kháng tế bào ung thư và kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất hóa học tách từ thể quả theo các phương pháp của Scudiero và cs (1988). 2.2.2. Sinh học phân tử - Tách chiết ADN theo phương pháp biến đổi của Doyle và cs (1987). - Phân tích trình tự ADN giải trình tự ADN được thực hiện bởi công ty Bioneer, Hàn Quốc. Phân tích trình tự gen sẽ được thực hiện trong phần mềm PAUP (Swofford, 2004), chương trình chạy phân tích theo mô hình tiến hóa mặc định (Cladistics), cây tiến hóa được phân tích bootstrap 1000 lần lặp lại. 2.2.3. Phương pháp hóa sinh - Phương pháp tách chiết các chất và phương pháp xác định cấu trúc theo Scudiero và cs (1988). 2.2.4. Phương pháp toán học - Độ phong phú loài, chỉ số đa dạng sinh học loài H’ (Shannon and Weiner’s Index), chỉ số mức độ chiếm ưu thế hay còn gọi là chỉ số Simpson, (Concentration of Dominance-Cd), chỉ số tương đồng (Index of similarity hay Sorensen’s Index- SI theo Seephueak (2011).
7. 7 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần loài của nấm túi họ Xylariaceae ở khu vực nghiên cứu 3.1.1. Đặc điểm hình thái và cấu trúc hiển vi của nấm túi họ Xylariaceae ở khu vực nghiên cứu Trong quá trình thu thập và phân tích mẫu chúng tôi nhận thấy nấm túi họ Xylariaceae ở khu vực nghiên cứu có các đặc điểm hình thái và cấu trúc hiển vi đặc trưng ở vùng khí hậu nhiệt đới. 3.1.1.1. Chất nền Hình 3.1: Một số hình dạng và màu sắc của chất nền trong họ Xylariaceae a b c a. Daldinia eschscholzii, b. Biscogniauxia capnodes, c. Annulohypoxylon moriforme, d. Kretzschmaria deusta, e. Hypoxylon haematostroma, f. Camillea tinctor. g. Xylaria f edcubensis. h. Theissinia sp, i. Rosellinia sp,. Kích thước: a, b, c, g = 1 cm; d, e, f = 5 mm. i h g 3.1.1.2. Thể quả Hình 3.2: Một số hình dạng thể quả trong họ Xylariaceae a. Annulohypoxylon moriforme; a b c b. Nemania diffusa; c. Daldinia eschscholzii; d. Hypoxylon haematostroma; e. Biscogniauxia uniapiculata; d e f f. Kretzschimania sp.; g. K. sandvicensis; h. Rosellinia arcuata; i. Xylaria. moelleroclavus; Tỉ lệ: 1000 μm g h i
8. 8 3.1.1.3. Lỗ miệng Hình 3.3: Một số dạng lỗ miệng trong họ Xylariaceae a. Annulohypoxylon stygium; a b c b. Biscogniauxia capnodes; c. Biscogniauxia uniapiculata; d. Daldinia eschscholzii; e. Hypoxylon tinctor; d f. Hypoxylon fendleri; e f g. Kretzschmaria deusta; h. Nemania bipapillata; i. Rosellinia arcuata; Tỉ lệ: 1000 μm. g h i 3.1.1.4. Túi bào tử, bào tử và đỉnh túi bào tử Hình 3.4: Hình dạng túi bào tử và đỉnh túi bào tử trong họ Xylariaceae c a. Rosellinia sp. CP531; d b. Biscogniauxia uniapiculata; c. Hypoxylon haematostroma; d. Xylaria schweinitzii; e. Rosellinia. sp. CP247; a b f e f. Kretzschmaria cetrarioides. Tỉ lệ a: 15 μm; b: 10 μm, c, d: 5 μm; e, f: 8 μm Nhìn chung, đặc điểm hình thái và cấu trúc hiển vi của nấm túi họ Xylariaceae thu được ở khu vực nghiên cứu là khá đặc trưng và phù hợp với điều kiện khí hậu, địa chất, địa hình ở miền Bắc Việt Nam cũng như vùng nhiệt đới châu Á. Một số loài có những đặc điểm khác biệt nhỏ về hình thái bên ngoài nhưng các đặc điểm hiển vi thường không thay đổi so với các loài chuẩn. 3.1.2. Danh lục các loài trong họ Xylariaceae ở khu vực nghiên cứu Bảng 3.1: Danh lục các loài nấm túi họ Xylariaceae ở khu vực nghiên cứu Taxon mới Cúc Mường STT Tên taxon ghi nhận ở Phương Phăng Việt Nam Chi Annulohypoxylon Y.M. Ju, J.D. Rogers & H.M. Hsieh 2005 1. A. annulatum (Schwein.) Y.M. Ju, J.D. x x
9. 9 Taxon mới Cúc Mường STT Tên taxon ghi nhận ở Phương Phăng Việt Nam Rogers & H.M. Hsieh 2005 2. A. atroroseum (J.D. Rogers) Y.M. Ju, J.D. x x x Rogers & H.M. Hsieh 2005 3. A. bovei var. microspora (J.H. Mill.) Y.M. x x Ju, J.D. Rogers & H.M. Hsieh 2005 4. A. moriforme (Henn.) Y.M. Ju, J.D. Rogers x & H.M. Hsieh 2005 5. A. moriforme var. microdiscus Y.M. Ju, J.D. x x x Rogers & H.M. Hsieh 2005 6. A. nitens (Y.M. Ju & J.D. Rogers) Y.M. Ju, x x x J.D. Rogers & H.M. Hsieh 2005 7. A. purpureonitens (Y.M. Ju & J.D. Rogers) x x Y.M. Ju, J.D. Rogers & H.M. Hsieh 2005 8. A. pseudostipitatum (Y.M. Ju & J.D. Rogers) x x Y.M. Ju, J.D. Rogers & H.M. Hsieh 2005 9. A. stygium (Lév.) Y.M. Ju, J.D. Rogers & x x x H.M. Hsieh 2005 10. A. stygium var. anulatum (Rehm) Y.M. Ju, x x J.D. Rogers & H.M. Hsieh 2005, 11. A. truncatum (Schwein.) Y.M. Ju, J.D. x x Rogers & H.M. Hsieh 2005, 12. A. urceolatum Y.M. Ju, J.D. Rogers & H.M. x x x Hsieh 2005 13. Annulohypoxylon sp. MP0257 x x 14. Annulohypoxylon sp. MP0713 x x 15. Annulohypoxylon sp. MP0760 x x 16. Annulohypoxylon sp. CP0602 x x 17. Annulohypoxylon sp. CP0836 x x Chi Biscogniauxia Kuntze 1891 18. B. capnodes (Berk.) Y.M. Ju & J.D. Rogers 1998 x x x 19. B. citriformis (Whalley, Hammelev, & x x x Taligoola) Van der Gucht & Whalley, 1992 20. B. communapertura Y.-M. Ju & J. D. Rogers, 1998. x x x 21. B. latirima Y.M. Ju & J.D. Rogers, 2001 x x 22. B. nummularia (Bull.) Kuntze, (1891) x x 23. B. philippinensis (Ricker) Whalley & Læssøe 1990 x x x 24. B. philippinensis var. microspora Y.-M. Ju x x & J. D. Rogers 1998
10. 10 Taxon mới Cúc Mường STT Tên taxon ghi nhận ở Phương Phăng Việt Nam 25. B. uniapiculata (Penz. & Sacc.) Whalley & x x x Læssøe 1990; 26. Biscogniauxia sp CP0724 x x 27. Biscogniauxia sp MP0914 x x Chi Camillea Fr. 1849 28. C. tinctor (Berk.) Laessøe, J.D. Rogers & x x Whalley, 1989. Chi Daldinia Ces. & De Not. 1863 29. D. concentrica (Bolton) Ces. & De Not. 1863 x x 30. D. eschscholzii (Ehrenb.) Rehm 1904 x x x Chi Hypoxylon Bull. 1791 31. H. anthochroum Berk. & Broome. 1873 x x 32. H. brevisporum Y.-M. Ju & J. D. Rogers. 1996 x x 33. H. carneum Petch. 1924 x x 34. H. dieckmanii Theiss. 1908 x x x 35. H. erythrostroma J.H. Mill. 1933 x x 36. H. fendleri Berk. ex Cooke. 1883 x x 37. H. haematostroma Mont. 1845 x 38. H. hypomiltum Mont. 1840 x x 39. H. investiens(Schwein.) M.A. Curtis. 1867 x x x 40. H. jecorinum Berk. & Ravenel. 1875 x x 41. H. lenormandii Berk. & M.A. Curtis. 1868 x x 42. H. monticulosum Mont. 1856 x x x 43. H. munkii Whalley, Hammelev & Talig. 1988 x x 44. H. papillatum Ellis & Everh. apud C. L. x x Smith, Bull. 1893 45. H. perforatum (Schwein.) Fr. 1849 x x x 46. H. rickii Y.-M. Ju & J. D. Rogers. 1996 x x 47. H. rubiginosum (Pers.) Fr. 1849 x 48. H. shearii Y.M. Ju & J.D. Rogers. 1996 x x 49. H. subgilvum Berk. & Broome. 1873 x x 50. H. trugodes Berk. & Broome. 1873 x x 51. H. vinosopurpureum Ellis & Everh. x x x 52. Hypoxylon sp. CP0847 x x 53. Hypoxylon sp. MP0778 x x 54. Hypoxylon sp. CP0701 x x Chi Kretzschmaria Fr. 1849
11. 11 Taxon mới Cúc Mường STT Tên taxon ghi nhận ở Phương Phăng Việt Nam 55. K. cetrarioides (Welw. & Curr.) Sacc. 1883 x x 56. K. deusta (Hoffm.) P.M.D. Martin. 1970 x 57. K. macrosperma (Mont.) J.D. Rogers & x x x Y.M. Ju 1998 58. K. micropus (Fr.) Sacc. 1882 x x 59. K. pavimentosa (Ces.) P. Martin. 1976. x x 60. K. sandvicensis (Reichardt) Rogers & Ju x x x 61. Kretzschmaria sp. MP0102 x x Chi Nemania Gray 1821 62. N. bipapillata Pouzar. 1985. x x x 63. N. diffusa (Sowerby) Gray. 1821. x x x 64. N. flavitextura Y.M. Ju, H.M. Hsieh & J.D. x x Rogers. 2005 65. Nemania sp. MP0763 x x 66. Nemania sp. MP0770 x x Chi Podosordaria Ellis & Holw. 1897 67. P. nigripes (Klotzsch) Martin. 1976 x Chi Rosellinia De Not. 1844 68. R. arcuata Petch. 1916 x x 69. R. hughesii L.E. Petrini. 2003 x x 70. R. nothofagi L.E. Petrini. 2003 x x 71. Rosellinia sp. CP0531 x x 72. Rosellinia sp. CP0247 x x Chi Theissenia Maubl. 1914 73. Theissenia sp. MP0702 x x Chi Xylaria Hill ex Schrank 1789 74. X. acuta Peck. 1872 x x 75. X. adscendens (Fr.) Fr. 1851 x x x 76. X. allantoidea (Berk.) Fr., 1851 x x 77. X. anisopleura (Mont.) Fr. 1851 x x 78. X. apoda (Berk. & Br.) Rogers & Ju. 1998 x x x 79. X. arbuscula Sacc. 1878 x 80. X. atrosphaerica (Cooke & Massee) Callan x x x & J.D. Rogers. 1990 81. X. brachiata Sacc. 1906 x x x 82. X. brevipes Sacc. & Fairm. 1906 x x x 83. X. corniculata Sacc. 1906 x x 84. X. claviceps F.S.M. González & J.D. Rogers. 1989 x x
12. 12 Taxon mới Cúc Mường STT Tên taxon ghi nhận ở Phương Phăng Việt Nam 85. X. cubensis (Mont.) Fr. 1851 x x x 86. X. curta San Martin & Rogers. 1851 x x x 87. X. dealbata Berk & M.A. Curtis. 1853 x 88. X. escharoidea (Berk.) Sacc. 1882 x 89. X. euphorbiicola Rehm. 1901 x x 90. X. feejeensis (Berk.) Fr. 1851 x x x 91. X. fissilis Ces. 1879 x 92. X. fraseri MA Whalley, Ju, Rogers & AJS x x Whalley. 2000 93. X. gracillima (Fr.) Fr. 1851 x x 94. X. grammica (Mont.) Mont. 1851 x x x 95. X. grandis Peck. 1874 x x 96. X. haemorrhoidalis Berk. & Broome. 1873 x x x 97. X. heliscus J.D. Rogers & Y.M. Ju. 1998 x x x 98. X. kretzschmarioidea J.D. Rogers & x x Rossman. 1988 99. X. laevis Lloyd. 1918 x x x 100. X. leprosa Speg. 1889 x x 101. X. lutea Beeli. 1926 x x 102. X. mellisii var. nuda D. Hawksw. 1973 x x 103. X. moelleroclavus J.D. Rogers, Y.M. Ju & x x x Hemmes. 1997 104. X. montagnei Hamme & Guerrero. 1997 x x x 105. X. multiplex ((Kunze) Fr. 1851 x x 106. X. nigrescens Sacc.) Lloyd. 1918 x x 107. X. oligotoma Sacc. & Paol. 1888 x x 108. X. pseudoapiculata Hamme. 1997 x x 109. X. rhizomorpha (Mont.) Mont. 1855 x x 110. X. scruposa (Fr.) Berk. 1851 x 111. X. schweinitzii Berk. & M.A. Curtis. 1854 x x 112. Xylaria sp. CP0756 x x 113. Xylaria sp. CP0843 x x 114. Xylaria sp. MP0722 x x Tổng số taxon 73 79 100
13. 13 3.1.3. Ghi nhận mới cho khu hệ nấm Việt Nam Tính đến năm 2012, các nhà khoa học đã xác định được 13 chi nấm túi họ Xylariaceae ở Việt Nam. Trong nghiên cứu này, chúng tôi ghi nhận thêm 4 chi lần đầu tiên được tìm thấy ở Việt Nam là Camillea, Biscogniauxia, Nemania và Theissenia. Kết quả đó đã đưa tổng số chi trong họ Xylariaceae được tìm thấy ở Việt Nam lên 17 chi. Cùng với 4 chi mới được bổ sung, chúng tôi đã xác định thêm 100 taxon mới ghi nhận cho khu hệ nấm ở Việt Nam, đưa tổng số từ 69 taxon trước đây lên 169 taxon thuộc họ Xylariaceae hiện biết ở Việt Nam. Ngoài các ghi nhận mới cho khu hệ nấm Việt Nam chúng tôi còn xác định được 5 taxon có trình tự lần đầu tiên được công bố cho khoa học. Kết quả này giúp hoàn thiện hơn những loài đã được định tên bằng hình thái nhưng chưa được phân tích trình tự ADN đồng thời hỗ trợ các nhà khoa học thuộc lĩnh vực khác dễ dàng tra tên loài trên GenBank. Trình tự đầy đủ các đoạn ITS được công bố trên GenBank với mã số KJ154951 của loài Xylaria moelleroclavus CP711 CGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTAAAGAGTTTTATAACTCCCAAACCCATGTGAACATACCGT ACGTTGCCTCGGCAGGCCGCCTACCCTGTAGTGCCCTGCCGGCGGCCCATTTAACGCTGTTTATTATTGAATTCTGAGGTTATTATAAA TAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAAT TTAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGC CCCTGTTGCTTAGTGTTGGGAGCCTACGGCAGCGTAGCTCCTCAAAATTAGTGGCGGAGTCGGTTCACACTCTAGACGTAGTAAATTC TATCTCGCCTGTGAGTTGGACCGGTCCCTTGCCGTAAAACCCCCCCTATTTTAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTG AACTTAAGCATATCAATAA Trình tự đầy đủ các đoạn ITS được công bố trên GenBank với mã số KJ154952 của loài Xylaria brevipes MP748 GTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTAAAGAGTTTTGATAACTCCCAAACCCATGTGAACTTACCTT TTGTTGCCTCGGCAGGTCGTGTCTATCTTGCGGCCTCCTACCCTGTAGGAGACTGCCCGGTAGTCACGGGTCTACCTGTCAGTGGCCCG TTAAACTCTGTTAATCATACGCCATTCTGAATTATCAAGTAAATAAGTTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGAT GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGT ATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCCCCTGTTGCTTAGTGTTGGGAGCCTACGGCCTTCTGTAGCTCC CTAAAGTTAGTGGCGGAGTCGGTTTACACTCTAGACGTAGTGGATTCTTTATCTCGTCTGTAGTTGGGCCGGTCTCTTGCCGTAAAACC CCCCCGATCTTTTTTTTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCT Trình tự đầy đủ các đoạn ITS được công bố trên GenBank với mã số KJ154953 của loài Xylaria fraseri M701 CATTATAGAGTGATTACCACTCCCAAACCCATGTGAACGTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGGTCGCGGTTACCCTGTAAGACCCT ACCCTGTAAGACCCTACCCTGTAAGACCCTACCCTGTAGGACCCTACCCGGTAGGACCTTACCCGGAAGGACCTTACCCGGTACTCGCGG CGTAAGCCTGCCGGTGGCCTATGAAATTCTGTTACTATGTATGTGTTATTCTGAATAGTGGAAAAAAAAAATAAGTTAAAACTTTCAACA ACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTT TGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCCTTAAGCCTTTGTTGCTTAGTGTTGGGA GCCTACTGTGGTAGCTCCTTAAAGTGAGTGGCGGAGTCGGTTCACACTCTAGGCGTAGTAGATTCTATCTCGTCTATAGATGGGCCGGTC CCCTGCCGTAAAACCCCCTAATTGTTAAAA Trình tự đầy đủ các đoạn ITS được công bố trên GenBank với mã số KJ154954 của loài Xylaria dealbata MP708 TAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTATAGAGTTATTACAACTCCCCAACCCATGTGAACCTACCTTCT
14. 14 GTTGCCTCGGCAGGTCGCGGTTACCCAGTAGGGCCCTACCCTGTGAGACCTTACCCTGTAAGGCCTTACCCGGAAAGGACCTACCCGG TACCCGCGGCATAGCCTGCCGGTGGCCTGTACCCATTCTGTTTTAGTATGTTATCTCTGATTGTATTACTGAATACGTTAAAACTTTCA ACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGA ATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCCCTGTTGCTTAGCG TTGGGAGCCTACGGTTTCCGTAGCTCCCCAAATGTAGTGGCGGAGTCGGTTCACCCTCTAGACGTAGTAGATTCTATCTCGCCTATAGA TGAGCCGGTCCCTTGCCGTAAAACCCCCCTAATCTTACAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATAT Trình tự đầy đủ các đoạn ITS được công bố trên GenBank với mã số KJ154955 của loài Kretzschmaria micropus CP601 TAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTAAAGAGTTTAAACAACTCCCAAACCCATGTGAACTTACCTTC TGTTGCCTCGGCAGGTCGCCTTCGACTACCCCGCGAGAGCCTACCCGGTAGGACCTCCCTTTCCCGGTAAGAGATTACCTGGTAAAGG GCCTACCCTGGAGACCCTCACCCGGTAAGAGAGGCGGTGCAAGCCTGCCGGTGGCCCATACACCAAAATTCTGTCTAACGTGGTTATT CTGAAAATGGTTATAACGAAATGAGTTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAT AAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCG AGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTCTGTCGCTTAGTGTTGGGAGCCTACTTACGGCCTTTGGCCTTGTAGCTCCTCAAAGTTAGTGGCG GAGTCGGCTTTCATACTCTAGACGTAGTAGATTCTATCTCGCCTATAGATGAGCCGGCCTCTCGCCGTAAAACCCCCTTTATCTTTTTA TAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCA Các trình tự mới trong nghiên cứu này sẽ góp phần làm đa dạng và đầy đủ hơn dữ liệu trình tự ITS của Xylariaceae trong ngân hàng gen, cung cấp tư liệu cho các nhà nghiên cứu sau này trên toàn thế giới. 3.2. Đa dạng sinh học nấm túi họ Xylariaceae ở khu vực nghiên cứu 3.2.1. Đa dạng về thành phần loài Tại khu vực nghiên cứu, chúng tôi đã xác định có 3 chi đơn loài là chi Camillea, Podosordaria và Theissenia, chiếm 20%, các chi còn lại là đa loài chiếm 80% số lượng chi thu được. Chi có số lượng loài nhiều nhất là chi Xylaria với 41/114 taxon chiếm 35.9 %. Tiếp đến là chi Hypoxylon có 24/114 taxon chiếm 21.1% và chi Annulohypoxylon có 17/114 taxon chiếm 14.9%. Ở Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về đa dạng nấm ở các khu vực địa lý khác nhau. Ở Thừa Thiên Huế Ngô Anh (2003) đã xác định được 9 loài họ Xylariaceae trên tổng số 346 loài nấm lớn. Ở Huyện Mộc Xuyên, Bà Rịa – Vũng Tầu, Ngô Anh và cs (2011) đã xác định được 14 loài Xylariaceae trong 202 loài nấm lớn. vườn quốc gia Phong Nha – Kẻ Bàng, Ngô Anh và cs (2011) đã xác định được 9 loài trong 173 loài nấm lớn. Đặc biệt là tại Cúc Phương Trần Văn Mão và cs (2005) đã xác định được 7 loài trong tổng số hơn 200 loài nấm lớn thu được. Tuy nhiên, các nghiên cứu trên chỉ tập trung nghiên cứu các khu hệ nấm lớn nói chung mà không chú trọng vào một họ cụ thể. Vì vậy, nghiên cứu của chúng tôi là công trình đầu tiên có tính hệ thống và chi tiết về một họ nấm ở Việt Nam. Đồng thời kết quả nghiên cứu đã cho thấy mức độ đa dạng thành phần loài của họ Xylariaceae ở khu vực nghiên cứu là rất cao. So sánh với các nghiên cứu họ Xylariaceae tại một số vùng trong khu
15. 15 vực Đông Nam Á và trên thế giới có điều kiện khí hậu, địa hình tương đồng với khu vực nghiên cứu. Chúng tôi nhận thấy thành phần loài và mức độ đa dạng tại khu vực nghiên cứu tương đồng với các khu vực Đông Nam Á và các vùng nhiệt đới trên thế giới. Kết quả thu được đã phản ánh khả năng thích nghi của các loài nấm túi họ Xylariaceae ở điều kiện khí hậu, địa chất và đa dạng sinh học tại vùng nhiệt đới châu Á. 3.2.2. Đa dạng sinh học loài Chỉ số đa dạng sinh học là chỉ số thống kê định lượng có sự tổ hợp của cả 2 yếu tố là thành phần số lượng loài và tần số xuất hiện của các cá thể trong mỗi loài. Trong nghiên cứu này chúng tôi đánh giá chỉ số đa dạng sinh học loài (H’) và chỉ số mức độ chiếm ưu thế (Cd). Từ kết quả thu được chúng tôi nhận thấy chỉ số (H’) của chi Xylaria bằng 1.3 là cao nhất, còn chi Annulohypoxylon là 0.93, tiếp đến chi Hypoxylon là 0.78, ngược lại chỉ số (H’) thấp nhất là chi Theissenia 0.01. Chỉ số mức độ chiếm ưu thế (Cd) đã xác định chi Annulohypoxylon có chỉ số cao nhất 0.015, đứng thứ 2 là chi Hypoxylon 0.0079 và tiếp đến là chi Xylaria 0.004336, chi Theissenia cho kết quả thấp nhất 0.000004. Như vậy, kết quả đa dạng sinh học tại cũng phù hợp với mức độ đa dạng trong các công bố ở Thái Lan, Châu Mỹ hay ở Đài Loan. Ngoài ra, kết quả này một lần nữa khẳng định về khả năng phân bố rộng của các loài thuộc chi Annulohypoxylon, Biscogniauxia, Daldinia, Hypoxylon, Xylaria và khả năng phân bố hẹp của các chi Theissenia, Rosellinia ở khu vực nghiên cứu. 3.2.3. Đa dạng sinh học theo khu vực nghiên cứu So sánh chỉ số (H’) tại 2 điểm thu mẫu chúng tôi nhận thấy chỉ số đa dạng sinh học loài (H’) ở tất cả các chi tại RNS Mường Phăng cao hơn (H’= 2.46) so với VQG Cúc Phương (H’ = 1.72). Chỉ số (Cd) của các chi thu được tại RNS Mường Phăng là 0.018681 cao hơn hẳn so với VQG Cúc Phương là 0.002421. Với kết quả trên chúng ta hoàn toàn có thể khẳng định RNS Mường Phăng có độ đa dạng sinh học cao hơn so với VQG Cúc Phương. 3.2.4. Đa dạng theo mùa Trong nghiên cứu đa dạng sinh học nấm, độ ẩm và nhiệt độ là 2 yếu tố quan trọng nhất dẫn đến sự khác biệt về thành phần loài tại khu vực nghiên
16. 16 cứu. Vì vậy, chúng tôi chỉ đánh giá mức độ đa dạng ở 2 mùa là mùa khô từ tháng 11 năm trước đến tháng 4 năm sau và mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10 theo sự phân chia tại khu vực nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu cho thấy số lượng loài thu được trong mùa mưa là áp đảo với 114 taxon, ngược lại mùa khô chỉ thu được 1 loài là Daldinia concentrica - loài phân bố toàn cầu, được tìm thấy ở cả những vùng có điều kiện khí hậu khô hạn như Nam Phi hay các vùng ôn đới như Châu Âu. Như vậy, nấm túi họ Xylariaceae có mật độ cá thể cũng như số lượng loài cao nhất vào tháng 6 đến tháng 10, còn vào mùa khô lạnh từ tháng 11 đến tháng 4 giai đoạn sinh sản hữu tính hầu như không xuất hiện. Vì vậy, chúng ta cần chú ý đến thời gian thu mẫu để có thể đánh giá độ đa dạng sinh học một cách khách quan và chính xác nhất đối với nhóm nấm này. 3.2.5. Đa dạng về các yếu tố địa lý của nấm họ Xylariaceae ở khu vực nghiên cứu Trong 114 taxon thu được tại khu vực nghiên cứu, chúng tôi so sánh nguồn gốc của các loài từ các tài liệu đã công bố. Kết quả xác định được có 108 taxon phân bố ở vùng nhiệt đới, 5 taxon phân bố toàn cầu, 1 taxon phân bố ở vùng ôn đới, các nhà khoa học thường gọi là loài nhiệt đới, loài toàn cầu và loài ôn đới. Thành phần loài ở khu vực nghiên cứu khá đa dạng xuất phát từ sự đa dạng về các yếu tố địa lý. Trong 3 nhóm thì nhóm loài nhiệt đới chiếm tỉ lệ nhiều nhất với 108 taxon chiếm 94.74%, tiếp đến là nhóm loài phân bố toàn cầu với 5 taxon chiếm 4.38% và ít nhất là nhóm loài ôn đới chỉ có 1 taxon chiếm 0.88%. Do các điều kiện địa hình, khí hậu, thổ nhưỡng thảm thực vật ở VQG Cúc Phương và RNS Mường Phăng rất đa dạng nên thành phần loài nấm tại khu vực nghiên cứu cũng rất đa dạng, gồm nhiều nhóm loài địa lý khác nhau. Điều này chứng tỏ sự thích nghi của loài ở nhiều vùng khí hậu khác nhau của nấm túi họ Xylariaceae. 3.2.6. Phương thức sống của nấm túi họ Xylariaceae ở khu vực nghiên cứu Trong 114 taxon chúng tôi thu được tại khu vực nghiên cứu, chủ yếu các loài thuộc nhóm hoại sinh trên gỗ với 110 taxon chiếm 96.5% tổng số loài thu được. Ngoài ra, họ Xylariaceae có một số loài mọc trên tổ mối, kết quả nghiên cứu chúng tôi đã xác định được 4 loài là X. escharoidea, X.
17. 17 euphorbiicola, X. rhizomorpha và Podordaria nigripes chiếm 3.5% tổng số loài thu được ở khu vực nghiên cứu. 3.3. Mối quan hệ di truyền của nấm túi họ Xylariaceae ở khu vực nghiên cứu Trong 526 mẫu thu được tại khu vực nghiên cứu, chúng tôi đã phân lập thành công được 214 chủng nấm và giải trình tự ADN của 121 chủng thuộc 49 taxon. Trình tự ADN đoạn ITS đầy đủ của các loài được thể hiện trong phụ lục 2. Dựa vào phân tích trình tự ADN, mối quan hệ di truyền của các chi, loài nghiên cứu đã được xác định tại hình 3.5 chúng tôi nhận thấy mối quan hệ di truyền giữa các chi đã được chia thành 2 nhóm riêng biệt. 100 MP728 A. bovei var. microsporum 99 MP713 Annulohypoxylon sp MP339 A. moriforme 86 CP749 H. erythrostroma 98 CP702 H. munkii 93 CP847 Hypoxylon sp MP252 H. haematostroma CP768 H. monticulosum 80 CP701 Hypoxylon sp MP389 H. trugodes 54 CP740 A. moriforme var. microdiscus I MP353 H. fendleri MP185 D. echscholzii CP781 A. atroroseum 76 CP836 Annulohypoxylon sp 100 CP784 A. urceolatum 83 MP712 A. stygium MP760 Annulohypoxylon sp 100 CP602 Annulohypoxylon sp MP779 A. nitens MP778 Hypoxylon sp 100 CP807 B. capnodes 99 CP724 Biscogniauxia sp 96 MP811 B. latirima CP747 B. philippinensis var. microspora MP722 Xylaria sp 80 MP102 Kretzschmaria sp 54 MP701 X. fraseri MP762 X. apoda CP622 X. curta CP745 X. laevis 80 CP814 X. allantoidea 99 MP782 N. diffusa 60 81 MP763 Nemania sp MP770 Nemania sp 99 CP711 X. moelleroclavus CP843 Xylaria sp 97 CP601 K. micropus 57 MP708 X. dealbata 81 MP735 X. arbuscula II 98 CP816 X. grammica 100 MP748 X. brevipes MP765 X. brachiata 96 CP628 X. adscendens 52 MP731 N. bipapillata CP247 Rosellinia sp 100 CP792 X. schweinitzii MP797 X. haemorrhoidalis 96 CP756 Xylaria sp HM581945 Eutypella australiens 0.1 Hình 3.5 (Hình 3.7 L.A): Mối quan hệ di truyền của 49 taxon trong họ Xylariaceae ở khu vực nghiên cứu dựa trên trình tự ITS rADN.
18. 18 Nhóm I gồm các taxon thuộc chi Annulohypoxylon, Hypoxylon, Biscogniauxia và Daldinia. Chi Annulohypoxylon trước đây là nhóm Annulata và được xếp vào chi Hypoxylon. Năm 2005, Hsieh và cs đã tách chúng thành chi riêng bởi sự khác biệt về 2 đặc điểm hình thái là lỗ miệng và vỏ bào tử. Tuy nhiên, trong phân tích trình tự đoạn ITS 5.8s rADN, 2 chi này vẫn không tách biệt mà một số taxon vẫn có mối quan hệ di truyền gần gũi với nhau như A. moriforme var. microdiscus CP740 lại nằm trong nhánh của chi Hypoxylon. Ngoài ra, Daldinia echscholzii MP185 có mối quan hệ gần với chi Annulohypoxylon và Hypoxylon. Các nghiên cứu của Hsieh và cs (2005), Peláez và cs (2008) cũng đã xác định các mối quan hệ này. Trong nhóm I có 4 taxon thuộc chi Biscogniauxia tách riêng đứng thành 1 nhánh chính, trong đó B. capnodes CP807 và Biscogniauxia sp. CP724 có mối quan hệ di truyền gần gũi hơn, tỉ lệ bootstrap là 100% còn B. latirima MP811 và B. philippinensis var. microspora CP747 có mối quan hệ di truyền gần nhau, tỉ lệ bootstrap là 96%. Ngoài ra, kết quả tại (Hình 3.5) cho thấy chi Biscogniauxia vừa có quan hệ di truyền gần với chi Hypoxylon, Annulohypoxylon và Daldinia, vừa có quan hệ gần với một số taxon thuộc chi Xylaria. Kết quả này hoàn toàn trùng khớp với các nghiên cứu của Peláez và cs (2008) và Suwannasai (2005). Điểm đặc biệt, trong nhóm I còn có taxon Xylaria sp. MP722 tách ra đứng riêng thành một nhánh. Đặc điểm hình thái taxon này có nhiều điểm gần với chi Kretzschmaria, tuy nhiên những nghiên cứu về di truyền lại cho thấy mối quan hệ gần gũi với chi Biscogniauxia. Nhóm II gồm các taxon thuộc chi Xylaria, Nemania, Rosellinia và Kretzschmaria. Về đặc điểm hình thái ngoài, hầu hết các chi này đều có sự khác khác biệt rõ ràng, tuy nhiên về cấu trúc hiển vi và đặc biệt là các cơ quan sinh sản như đỉnh túi bào tử, bào tử, rãnh mầm bào tử thì chúng lại rất giống nhau. Kết quả nghiên cứu mối quan hệ của nhóm này cũng phù hợp với các nghiên cứu của Suwannasai (2005), Peláez và cs (2008), Tang và cs (2009). Chi Nemania được tách thành 2 nhánh, trong đó N. bipapillata MP731 và Rosellinia sp. CP247 đứng thành nhánh riêng biệt. Nhánh thứ 2 gồm N.
19. 19 diffusa MP782, Nemania sp. MP763, Nemania sp. MP770 có mối quan hệ di truyền gần với các taxon thuộc chi Xylaria. Mặc dù về hình thái đây là 2 chi có đặc điểm khác xa nhau nhưng các đặc điểm hiển vi lại có nhiều điểm tương đồng như đỉnh túi bào tử, kiểu tách vỏ, hình dáng và mầu sắc bào tử. Các nghiên cứu của Hsieh và cs (2005), Peláez và cs (2008) đã xác định mối quan hệ giữa chi Nemania với X. curta, X. laevis là 1 nhóm. Chi Kretzschmaria gồm có 2 taxon đều nằm trong một nhánh của chi Xylaria, theo quan điểm của Roger về hình thái thì Kretzschmaria có nguồn gốc từ Xylaria. Đến nay, những dẫn chứng về sinh học phân tử càng khẳng định rõ hơn điều này. Những kết quả nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn trùng khớp với các nghiên cứu trước đây về chi Kretzschmaria. Chi Xylaria là một chi có số lượng taxon lớn và nhiều đặc điểm khác biệt so với các nhóm khác. Kết quả từ (Hình 3.5) đã cho thấy mối quan hệ di truyền rất phức tạp giữa các taxon trong chi và với các taxon thuộc chi khác. Nhánh 1 gồm 3 taxon là X. schweinitzii CP792, X. haemorrhoidalis MP797 và Xylaria sp CP756, trong đó X. schweinitzii CP792 và X. haemorrhoidalis MP797 có quan hệ di truyền gần gũi, tỉ lệ bootstrap là 100%. Nhánh 2 gồm 6 taxon thuộc chi Xylaria (X. brevipes MP748, X. brachiata MP765, X. adscendens CP628, X. grammica CP816, X. arbuscula MP735, X. dealbata MP708) và 1 taxon thuộc chi Kretzschmaria (K. micropus CP601), trong đó K. micropus CP601 có mối quan hệ di truyền gần với X. dealbata MP708, tỉ lệ bootstrap là 97%. Xét về hình thái, K. micropus CP601 có nhiều đặc điểm gần gũi với các loài Xylaria như chất nền hình trụ, thể quả hình cầu, đỉnh túi bào tử hình trụ. Nhánh 3 bao gồm 7 taxon X. moelleroclavus CP711, Xylaria sp. CP843, X. allantoidea CP814, X. laevis CP745, X. curta CP622, X. apoda MP762 và X. fraseri MP701. Các taxon này lại có mối quan hệ gần gũi với các taxon thuộc chi Nemania. Ngoài ra, nhánh 3 này còn có mối quan hệ với Kretzschmaria sp. MP002. Như vậy, mối qua hệ di truyền của các taxon trong họ Xylariaceae nói chung và các taxon thu được tại khu vực nghiên cứu nói riêng đã cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa chi Daldinia với chi Annulohypoxylon và chi Hypoxylon
20. 20 đồng thời cũng xác định chi Xylaria, Kretzschmaria, Nemania và Rosellinia có mối quan hệ gần gũi. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu một lần nữa đã minh chứng sự đa dạng và phức tạp của chi Xylaria trong mối quan hệ di truyền. 3.4. Cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất được tách từ thể quả ở một số loài nấm túi họ Xylariaceae 3.4.1. Cấu trúc hóa học một số hợp chất thu được từ thể quả nấm túi họ Xylariaceae Căn cứ vào số lượng thể quả của 1 loài (thường lớn hơn 10g) thu được từ khu vực nghiên cứu. Ngoài ra chúng tôi cũng còn căn cứ vào những loài có tiềm năng ứng dụng trong y học như loài Daldinia concentrica, các loài thuộc chi Xylaria. Đặc biệt là các loài thuộc chi Biscogniauxia, đây là chi có rất ít các nghiên cứu về hóa chất, hứa hẹn sẽ có những ghi nhận mới về nhóm này. Từ 2 căn cứ trên chúng tôi tiến hành tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ 4 loài là B. philippinensis MP136, D. concentrica CP002, X. atrosphaerica CP257, X. Schweinitzii CP613, trong đó: Loài Biscogniauxia philippinensis MP136 sau khi tinh sạch chúng tôi xác định được 3 hợp chất. Loài Daldinia concentrica CP002 xác định được 3 hợp chất. Loài Xylaria atrosphaerica CP257 xác định được 3 hợp chất. Loài Xylaria schweinitzii CP613 xác định được 4 hợp chất. Như vậy, từ thể quả của 4 loài nấm túi họ Xylariaceae được lựa chọn, chúng tôi đã tách được 13 hợp chất trong đó có 1 hợp chất mới cho khoa học là 5-(4,5,8-trihidroxynaphtalen-1-yl)naphtalen-1,4,8-triol từ loài B. Philippinensis MP136 và 12 hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong các loài thuộc họ Xylariaceae thu được ở Việt Nam. 3.4.2. Hoạt tính sinh học các chất hóa học tách từ thể quả 3.4.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào Từ 3 hợp chất tách chiết từ loài D. concentrica CP002 chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào tại Phòng thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa học trên 4 dòng tế bào ung thư ở người là: KB (tế bào ung thư biểu bì); MCF7 (tế bào ung thư vú); SK-LU-1 (tế bào ung thư phổi) và
21. 21 HepG2 (tế bào ung thư gan). Kết quả được thể hiện tại bảng 3.2. Bảng 3.2 (Bảng 3.9 L.A): Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất từ loài D. concentrica CP002 -1 Tế bào IC50 (µg ml ) Hợp chất KB MCF7 SK-LU-1 HepG2 1 37.76 95.96 62.60 26.52 2 12.12 34.08 65.91 27.55 3 12.68 14.50 18.39 22.60 ĐC 0.62–1.25 0.62–1.25 0.62–1.25 0.62–1.25 Ghi chú: IC50 là nồng độ ức chế 50% đối tượng thử; KB: là dòng tế bào ung thư biểu bì ở người; MCF7: là dòng tế bào ung thư vú ở người; SK-LU-1: là dòng tế bào ung thư phổi ở người; HepG2: là dòng tế bào ung thư gan ở người; ĐC: Đối chứng chất ellipticin Từ kết quả thực nghiệm đã cho thấy 3 hợp chất được tách từ loài D. concentrica CP002 có tác dụng ức chế vừa phải đối với các dòng tế bào ung thư so với chất ellipticin đối chứng. Trong các hợp chất được tách chiết và tinh sạch thì hợp chất 3 có khả năng ức chế mạnh nhất các dòng tế bào ung thư biểu bì, ung thư vú, ung thư phổi, ung thư gan. Đặc biệt hợp chất 2 và hợp chất 3 có tác dụng mạnh nhất với dòng tế bào ung thư biểu bì (KB). So với kết quả nghiên cứu của Benie và cs (2008) về khả năng ức chế tế bào ung thư vú ở người của loài D. concentrica thu được từ Châu Phi thì các hợp chất thu được tại nghiên cứu này có khả năng ức chế tế bào ung thư vú mạnh hơn. Ngoài ra so với các nghiên cứu gây độc với 4 dòng tế bào ung thư của các hợp chất được tách từ thực vật như 6 hợp chất (Roemerin (FA5); Pronuciferin (FA7); Astilbin (FR1); Engeletin (FR2); Quercetin 3-O-β-D-arabinopyanosit (FB5) và Tilirosid (FB6)) tách từ cây cách thư nhọn (Fissistigma acuminatissima); lãnh công gân hoe (Fissistigma rufinerve) và cách thư balansa (Fissistigma balansae) thì kết quả kháng 4 dòng tế bào ung thư của loài D. concentrica CP002 cao hơn rõ rệt. 3.4.2.2. Hoạt tính kháng khuẩn Ngoài các thử nghiệm trên 4 dòng tế bào ung thư ở người chúng tôi tiếp tục thử nghiệm 3 hợp chất tách chiết được từ loài D. concentrica CP002 với hoạt tính kháng khuẩn các vi sinh vật kiểm định như:
22. 22 Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli. Kết quả được thể hiện bảng 3.3: Bảng 3.3 (Bảng 3.10 L.A): Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất từ loài D. concentrica CP002 -1 VSV IC50 (µg ml ) S. aureus B. C. P. E. coli Hợp chất subtilis albicans aeruginosa (1) 87.81 >128 >128 >128 >128 (2) >128 >128 >128 >128 >128 (3) >128 >128 >128 >128 >128 Chất đối chứng 0,05 - 2 0,05 - 2 0,05 - 2 0,05 - 2 0,05 - 2 (Ampicilin) Ghi chú: (1), (2), (3) là các hợp chất từ thể quả loài D. concentrica CP002 Kết quả bảng trên cho thấy chỉ có hợp chất (1) có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất tại giá trị nồng độ 87.81 µg ml-1 đối với S. aureus nhưng lại không có hoạt tính kháng khuẩn đối với B. subtilis, C. albicans, P. aeruginosa và E. coli. Hợp chất (2), (3) không có hoạt tính kháng khuẩn với các VSV kiểm định. So với các nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính kháng khuẩn của Quang DN và cs (2006), 3 hợp chất thu được từ loài D. concentrica CP002 thu được ở Việt Nam là thấp hơn nhiều. Từ kết quả trên cho thấy thể quả nấm túi họ Xylariaceae ở khu vực nghiên cứu khá đa dạng về các thành phần hóa học, đồng thời có các hoạt tính sinh học như ức chế sự phát triển tế bào ung thư, ức chế một số VSV kiểm định. Những nghiên cứu này sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về vai trò của nấm túi họ Xylariaceae đối với đời sống con người.
23. 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết quả nghiên cứu trên chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1. Phát hiện được 114 taxon thuộc 11 chi nấm túi họ Xylariaceae tại khu vực nghiên cứu, trong đó chi Xylaria có số lượng nhiều nhất với 41 taxon chiếm 36,8 %, Hypoxylon 24 taxon chiếm 21%, Annulohypoxylon 17 taxon chiếm 14,9%. Các chi có số lượng ít hơn là Bigcosniauxia 10 taxon, Kretzschmaria 7 taxon, Nemania 5 taxon, Rosellinia 5 taxon, Daldinia 2 taxon. Đặc biệt, 3 chi Camillea, Podosordaria và Theissenia chỉ có 1 taxon chiếm 0,88 %. 2. Bổ sung 4 chi (Camillea, Biscogniauxia, Nemania và Theisseniai), 100 taxon mới ghi nhận cho khu hệ nấm Việt Nam đồng thời xây dựng 01 khóa định loại đến chi và 7 khóa định loại đến loài, mô tả chi tiết 114 taxon có ảnh và mẫu lưu kèm theo. 3. Rừng nguyên sinh Mường Phăng có đa dạng sinh học nấm túi họ Xylariaceae cao hơn so với vườn quốc gia Cúc Phương. Số lượng loài ở Mường Phăng so với Cúc Phương là 79/ 73 taxon. Chỉ số (H’) các chi ở Mường Phăng là 2,46, trong khi đó, chỉ số (H’) các chi ở Cúc Phương là 1,72. Chỉ số mức độ chiếm ưu thế (Cd) các chi ở Mường Phăng là 0,018681 còn ở Cúc Phương là 0,002421. 4. Hầu hết các loài nấm túi họ Xylariaceae đều thu được vào mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11, chỉ duy nhất loài Daldinia concentrica có khả năng thích nghi vào mùa khô. Có tới 110 taxon sống hoại sinh trên gỗ chiếm 96.5%, và 4 taxon sống liên kết với tổ mối chiếm 3,5%. Tại khu vực nghiên cứu loài nhiệt đới có vai trò chủ đạo chiếm 94,74%, tiếp đến là loài toàn cầu 4,38% và cuối cùng là loài ôn đới 0,88%. 5. Đã xây dựng mối quan hệ di truyền của 49 taxon thuộc 8 chi thu được tại khu vực nghiên cứu. Trong 49 taxon được phân tích trình tự ADN có 5 taxon (Kretzschmaria micropus CP601, Xylaria brevipes MP748, X. dealbata MP708, X. moelleroclavus CP711, X. fraseri M701) có trình tự lần đầu tiên công bố cho khoa học. 6. Từ thể quả 4 loài họ Xylariaceae là B. philippinensis, D. concentrica, X.
24. 24 atrosphaerica, X. Schweinitzii đã tách chiết và xác định được 13 hợp chất, trong đó có 1 hợp chất mới cho khoa học là 5-(4,5,8- trihidroxynaphtalen-1-yl)naphtalen-1,4,8-triol từ loài B. philippinensis và 12 hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong các loài thuộc họ Xylariaceae thu được ở Việt Nam. 7. Bước đầu thử hoạt tính sinh học của 3 hợp chất tách chiết từ loài D. concentrica có khả năng ức chế 4 dòng tế bào ung thư ở người (ung thư biểu bì, ung thư vú, ung thư phổi, ung thư gan). Ngoài ra, hợp chất (1) 6,8-dihydroxy-3-methyl-3,4-dihydroisocoumarin còn có hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus ở nồng độ 87,81 µg/ ml. KIẾN NGHỊ Những kết quả thu được cho thấy tiềm năng nghiên cứu cũng như ứng dụng của nấm túi họ Xylariaceae ở Việt Nam là rất lớn. Để có thể đánh giá một cách tổng quát hơn về nấm túi họ Xylariaceae ở Việt Nam chúng tôi đề xuất một số kiến nghị sau. 1. Tiếp tục nghiên cứu đa dạng và đặc điểm sinh học của nấm túi họ Xylariaceae ở khu vực miền Trung và miền Nam, Việt Nam. 2. Nghiên cứu thêm về các thành phần hóa học và hoạt tính sinh học từ thể quả và sinh khối của nấm túi họ Xylariaceae ở Việt Nam.