Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Biên Hòa, Đồng Nai và đánh giá khả năng phân hủy của..

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Biên Hòa, Đồng Nai và đánh giá khả năng phân hủy của..

1. viÖn hµn l©m khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam viÖn c«ng nghÖ sinh häc PHẠM QUANG HUY NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ CHỦNG PHÂN LẬP Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 9 42 01 07 tãm t¾t luËn ¸n tiÕn sÜ sinh häc hµ néi - 2021
2. Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà Viện Công nghệ sinh học 2. TS. Nguyễn Kim Thoa Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án phiên chính thức tại Viện Công nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2021. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Công nghệ sinh học - Trang web của Bộ GD&ĐT
3. 1 MỞ ĐẦU Gần 50 năm sau chiến tranh, hơn 100 triệu lít thuốc diệt cỏ chứa 2,3,7,8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD là đồng phân dioxin độc nhất với độ độc tương đương là 1 đã phun rải và hiện vẫn còn tồn lưu ở miền nam Việt Nam ( Cecil, 1986). Hỗn hợp chất độc tại các khu vực ô nhiễm khiến môi trường tự nhiên bị phá hủy, sức khỏe di truyền của bệnh nhân phơi nhiễm bị ảnh hưởng qua nhiều thế hệ, hệ vi sinh vật (VSV) bị thay đổi mà vẫn chưa thể lượng giá được. Do đó, ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nói riêng và ô nhiễm các hợp chất hữu cơ khó phân hủy (POPs) nói chung cần phải được loại bỏ theo công ước Stockholm. Trong 20 năm trở lại đây, số lượng nghiên cứu liên quan tới khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi các VSV phân lập được, số lượng enzyme tham gia vào con đường chuyển hóa cũng như đa dạng VSV không thông qua nuôi cấy (sử dụng phương pháp đa hình cấu hình sợi đơn (Single-Strand Conformation Polymorphism - SSCP, điện di trên gel građient biến tính biến tính (denaturing gradient gel electrophoresis - DGGE, nhân gene theo thời gian thực (real time Polymerase Chain Reaction – RT PCR) tăng dần. Quy mô thử nghiệm và triển khai công nghệ xử lý khử độc bằng phân hủy sinh học (Bioremediation) tăng dần từ pilot 0,5 m 3 – 100 m3 ở sân bay Đà Nẵng tới quy mô hiện trường 3.384 m 3 ở sân bay Biên Hòa. Qua các công bố mới được cập nhật, các VSV có khả năng nuôi cấy chiếm tỷ lệ rất thấp chỉ từ 0,001 đến 0,1% cho thấy hạn chế của các phương pháp nghiên cứu truyền thống đã thực hiện trong các thập niên qua. Do đó, việc áp dụng các công cụ nghiên cứu hiện đại trở nên rất cần thiết để có thể từng bước hiểu rõ sự đa dạng và bản chất cấu trúc quần xã VSV để từ đó cải tiến quy trình công nghệ hiện có nhằm rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu suất xử lý ô nhiễm hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin vẫn còn tồn đọng ở Việt Nam và các loại chất hữu cơ khó phân hủy (POPs) khác trên thế giới. Giải trình tự và phân tích nguyên liệu di truyền bằng cách tách DNA trực tiếp từ mẫu đất ô nhiễm không thông qua nuôi cấy bằng hệ thống máy công năng cao thế hệ mới Hiseq Illumina và các phần mềm tin sinh chuyên dụng sẽ khắc phục được hạn chế của các phương pháp nghiên cứu truyền thống. Bởi vì kết quả thu được cung cấp thông tin chi tiết về sự đa dạng VSV từ ngành, lớp, bộ, họ, chi cho đến loài cùng hệ gene chức năng tồn tại cũng như đa dạng protein giả định và các con đường chuyển hóa trong metagenome của mẫu nghiên cứu. Vì vậy, tại thời điểm này sử dụng công cụ metagenomic với mẫu đất liên quan tới ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sẽ cung cấp bức tranh đầy đủ nhất về chủng loài và các mối quan hệ quần xã của vi sinh vật nhằm
4. 2 nâng cao hiệu suất xử lý khử độc bằng công nghệ phân hủy sinh học không chỉ áp dụng đối với ô nhiễm dioxin mà còn với các POPs khác. Với các lý do trên, luận án nghiên cứu sinh đã được thực hiện và đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ nghiên cứu hiện đại với đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa thuộc đối tượng đất đặc thù bởi thành phần hóa học phức tạp để tách và làm sạch được DNA đủ chất lượng đáp ứng yêu cầu của nghiên cứu. Mẫu ở 2 khu vực đã được chọn để nghiên cứu metagenome gồm: đất từ khu Tây Nam Biên Hòa bị ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin có độ độc trung bình 21.605 ng TEQ/kg và đất đã được xử lý làm sạch sau 60 tháng ở khu chôn lấp Z1 có độ độc trung bình 13,2 ng TEQ/kg. Tên luận án của nghiên cứu sinh là: ”Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Biên Hòa, Đồng Nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân lập”. Kết quả về sự đa dạng và các đặc điểm về cấu trúc quần xã và khả năng phân hủy dioxin của một số đại diện được trình bày trong luận án này là một phần số liệu thu được từ đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gene, enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin” do PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà chủ nhiệm và đã được nghiệm thu năm 2019. 1. Mục tiêu - Đánh giá đa dạng VSV trong (i) mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin và (ii) mẫu đất đã được xử lý làm sạch bằng công nghệ phân hủy sinh học ở các lô “Chôn lấp tích cực” sau 60 tháng ở sân bay Biên Hòa, Đồng Nai, Việt Nam bằng công cụ metagenomic; - Đánh giá khả năng phân hủy hiếu khí dioxin trong đất ô nhiễm nặng hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin bằng tổ hợp vi khuẩn và tổ hợp xạ khuẩn (XK) được phân lập và lựa chọn từ các mẫu đất nghiên cứu. 2. Nội dung nghiên cứu - Thu thập, bảo quản, phân tích thành phần cơ giới của mẫu đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa; - Tách chiết, tinh sạch DNA từ các mẫu nghiên cứu và xác định trình tự DNA bằng máy giải trình tự công năng cao thế hệ mới Illumina Hiseq 2500; - Phân tích, đánh giá đa dạng VSV, đa dạng gene chức năng giả định từ dữ liệu metagenome của các mẫu nghiên cứu; - Đánh giá khả năng phân hủy hiếu khí dioxin trong đất ô nhiễm nặng bằng tổ hợp vi khuẩn và xạ khuẩn được phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin.
5. 3 3. Những đóng góp mới của luận án - Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ metagenomic trong nghiên cứu đa dạng VSV trong đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin, đất đã được xử lý khử độc sạch ở sân bay quân sự Biên Hòa và phát hiện được sự rất đa dạng trong các quần xã vi khuẩn, vi khuẩn cổ ưa mặn, loại halogen với số lượng các gene chức năng mới như laccase và laccase-like tham gia vào phân hủy hợp chất xenobiotic cùng sự đa dạng của nấm sợi, nấm men và nấm đảm; - Bổ sung cơ sở khoa học giải thích sự thành công của công nghệ phân hủy sinh học đã thực hiện ở sân bay Biên Hòa và khả năng cải tiến qui trình công nghệ, nâng cao hiệu suất xử lý khử độc hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin có tổng độ độc rất cao cũng như một số loại hình ô nhiễm POPs khác. 4. Bố cục của luận án Luận án gồm 152 trang: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (23 trang, 5 hình); Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (12 trang, 5 hình); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (40 trang, 11 bảng, 22 hình); Chương 4: Bàn luận kết quả nghiên cứu (16 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh sách các công trình công bố (1 trang); Tóm tắt luận án bằng tiếng Anh (7 trang); Tài liệu tham khảo (12 trang với 7 tài liệu tiếng Việt, 101 tài liệu tiếng Anh). CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Dioxin và các hợp chất tương tự thuộc nhóm các chất hữu cơ khó phân hủy (POP) phải được loại bỏ hoàn toàn bởi độc tính và khả năng tồn tại bền vững của chúng trong môi trường; Lượng chất diệt cỏ/dioxin tồn lưu trong đất bởi chiến tranh hóa học do Mỹ gây ra rất lớn. Điểm nóng Đà Nẵng (Khu bắc sân bay – 361.000 ppt, khu Pacer Ivy – 20.600 ppt,) và Biên Hòa (Khu Z1 - 1.578 ppt, khu Tây nam – 110.000 ppt, khu Pacer Ivy – 11.400 ppt, khu Đông bắc – 1.300 ppt, khu Tây bắc – 477 ppt). Sự biến động VSV hiếu khí ở Đà Nẵng và Biên Hòa về số lượng cũng như đa dạng chủng loài dao động lớn. Quần xã VSV hay cá thể VSV thuần khiết được phân lập đã có thể phân hủy hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin và các chất đa vòng thơm chứa clo hay không, chứa khác ở điều kiện hiếu khí kị khí không bắt buộc hoặc kị khí hoàn toàn với hiệu suất khác nhau; Ở sân bay quân sự Đà Nẵng đã sử dụng phương pháp khử hấp thu nhiệt và lưu chứa để loại bỏ dioxin trong 45.000 m 3 bùn đất ô nhiễm. Biên Hòa đã thực hiện chôn lấp 90.000 m 3 đất ô nhiễm ở khu vực Z1 và trong đó đã xử lý thành công 3.384 m3 đất ô nhiễm trên 10.000 ngTEQ/kg bằng công nghệ phân hủy sinh học (bioremediation) tổng độ độc chỉ còn 13.2 ngTEQ/kg đất khô.
6. 4 Quá trình phân hủy sinh học có thể xảy ra theo 4 con đường chủ yếu trong đó ba con đường oxy hóa cắt vòng, loại clo các hợp chất hữu cơ thơm đã được mở vòng và xúc tác bởi các enzyme ngoại bào hay các chất xúc tác không có cấu trúc enzyme nhưng hoạt động như enzyme đều cần oxy và con đường thứ tư là loại khử clo đối với các chất hữu cơ đa vòng thơm (Hình 1.1). Tất cả các quá trình nêu trên được thực hiện bởi tập đoàn vi sinh vật bản địa trong các tầng đất của lô “Chôn lấp tích cực”. Các sản phẩn tạo ra theo các con đường khác rất phong phú ở mỗi giai đoạn và điều kiện môi trường luôn biến động tạo cơ hội cho các quần xã vi sinh vật hoạt động phân hủy, chuyển hóa và sản phẩm cuối cùng của 4 con đường trao đổi chất nói trên là các chất đi vào chu trình Krebs trước khi được khoáng hóa tới các axit hữu cơ, nước, CO2 và sinh khối vi sinh vật. Hình 1.1: Các con đường chuyển hóa, phân hủy, khoáng hóa hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin và các chất trao đổi chất bằng phương pháp sinh học. Nghiên cứu đa dạng VSV liên quan đến loại hình ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và khả năng phân hủy chúng bởi VSV bản địa mới chỉ dừng ở các phương pháp truyền thống và sinh học phân tử (SSCP và DGGE). Nghiên cứu đa dạng quần xã VSV hiện nay đã được hỗ trợ bởi các thiết bị giải trình tự công năng cao và các phần mềm chuyên dụng được cải tiến liên tục giúp khắc phục được các nhược điểm trong kỹ thuật nuôi cấy và đánh giá cấu trúc quần xã VSV trong môi trường ô nhiễm tạo cơ sở hướng đích tới công nghệ khử độc, làm sạch hỗn hợp ô nhiễm các chất đa vòng thơm trong đó có chất diệt cỏ/dioxin; Sự phát triển của các phần mềm tin sinh chuyên dụng kết hợp với phát triển, ứng dụng công cụ metagenomic nói riêng và các công cụ omics nói chung (metagenomic, metatranscriptomics, proteomics và metabolomics) giúp phát hiện và khai thác VSV trong các vùng ô nhiễm và trong quá trình xử lý; Nghiên cứu metagenome đa dạng hệ VSV kị khí trong mẫu làm giàu đất bùn ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Biên Hòa bước đầu được thực hiện (bằng hệ thống Miseq). Do sự đa dạng của hệ VSV hiếu khí lớn hơn rất nhiều so với kị khí nên kết quả thu được sẽ tạo nên bức tranh tổng thể về VSV vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và hệ enzyme tham gia cũng như con đường chuyển hóa giả định.
7. 5 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu - Đối tượng nghiên cứu: Đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu là mẫu C) ở khu Tây Nam sân bay Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai (10°58'14.3"N 106°48'19.3"E) và đất đã được xử lý sạch chất diệt cỏ/dioxin sau 60 tháng bằng công nghệ phân hủy sinh học trong các lô Chôn lấp tích cực (Bioremediation – ký hiệu là mẫu BHR) ở khu Z1 (Khu thực hiện dự án “Xử lý ô nhiễm dioxin tại các vùng nóng ở Việt Nam” do Bộ Quốc phòng thực hiện ở Đồng Nai (10°57'46.4"N 106°49'22.6"E)) được thu thập, bảo quản đảm bảo chất lượng để nghiên cứu tách DNA metagenome và phân lập vi sinh vật. - Hóa chất nghiên cứu: Đồng loại độc nhất trong các đồng phân của dioxin là 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) được cung cấp bởi Công ty BE- Basic (Hà Lan) từ phòng cung cấp hóa chất isotop chuẩn, Vương Quốc Anh. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 1. Thu thập và bảo quản mẫu đất để nghiên cứu metagenome theo phương pháp lấy mẫu đa điểm (MIS) 2. Phân tích thành phần cơ giới và nồng độ dioxin trong mẫu nghiên cứu tại Phòng Phân tích Dioxin và Độc chất, Trung tâm Quan trắc môi trường, Tổng cục Môi trường theo EPA 8280A và Phòng Phân tích trung tâm (CAL) thuộc Viện Thổ nhưỡng nông hóa (SFRI). 3. Phân lập, phân loại VSV từ nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 4. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme laccase, laccase-like (Childs và Bardsley, 1975). 5. Đánh giá phân hủy 2,3,7,8-TCDD trong đất ô nhiễm bởi hỗn hợp VSV 6. Phương pháp tách chiết DNA metagenome trực tiếp có cải tiến theo phương pháp của Bourrain, Zhou, Islam và tách chiết DNA sử dụng Kit thương mại chuyên dụng như PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc.) có cải tiến và Soil DNA Isolation Kit (Norgen Biotek Corp.), E.Z.N.A.® Soil DNA Kit (Omega Bio-tek) (Bourrain và cs., 1999; Zhou và cs., 1996; Islam và cs., 2012) 7. Xác định hàm lượng, độ tinh sạch của mẫu DNA metagenome bằng điện di gel agarose (Sambrook và Russell, 2001), đo độ hấp thụ của DNA tại bước sóng 260 nm (Wilfinger và cs., 1997; Adams, 2013) và định lượng DNA bằng nhuộm huỳnh quang (Bolger và cs, 1997). 8. Phân tích trình tự DNA metagenome của mẫu C và BHR sử dụng hệ thống Illumina Hiseq 2500 tại công ty Baseclear, Hà Lan và hệ thống MG-RAST
8. 6 Để thu được kết quả nghiên cứu phù hợp với mục tiêu đề ra, các bước thí nghiệm của luận án được thực hiện theo sơ đồ hình 2.1. Hình 2.1. Sơ đồ thực hiện nghiên cứu CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Mức độ đa dạng VSV trong metagenome của 2 mẫu đại diện được mô tả ở mức độ ngành, lớp, bộ, họ, chi và loài có liên quan trực tiếp đến phân hủy dioxin và các chất tương tự. Các chi được phát hiện rất mới trong ngành vi khuẩn, vi khuẩn cổ và sinh vật nhân thật có mặt trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Do số liệu thu được quá lớn nên nội dung luận án chỉ tập trung vào những kết quả quan trọng nhất. Vi sinh vật từ hai mẫu đất nghiên cứu nuôi cấy đã được chọn để trình bày đầu tiên trong phần đầu của chương kết quả nghiên cứu này để chứng minh vai trò của những nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn hiếu khí trong quá trình xử lý khử độc đất ô nhiễm hỗn hợp chất diệt cỏ /dioxin và các chất trao đổi chất khác. 3.1. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn quy mô phòng thí nghiệm 3.1.1. Vi khuẩn từ đất nhiễm dioxin phân lập được, định danh và khả năng phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn có tiềm năng Để đánh giá khả năng xử lý khử độc bởi VSV đối với chất diệt cỏ/dioxin, nội dung nghiên cứu khả năng phân hủy đã thực hiện độc lập trước khi sử dụng công cụ metagenomic và được đối chiếu lại với cơ sở metagenome của mẫu. Từ đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (C) và đất ở khu vực xử lý bằng phân hủy sinh học (BHR), 5 chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường MSM chứa dịch chiết đất đã được phân lập (Hình 3.1).
9. 7 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc 5 chủng vi khuẩn BHBi1, BHBi4, BHBi5, BHBi7 và BHO9 từ mẫu làm giàu trên môi trường MSM chứa dịch chiết đất Các chủng vi khuẩn phân lập được sử dụng trong nghiên cứu đều sinh trưởng tốt trên môi trường muối khoáng chứa chất độc. Dưới kính hiển vi điện tử quét có độ phóng đại từ 10.000 đến 50.000 lần, hình dáng và kích thước tế bào rất khác nhau được xác định thể hiện ở Hình 3.2. A B C D E Hình 3.2. Hình thái tế bào 5 chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét A: BHBi1; B: BHBi4; C: BHBi5; D: BHBi7; E: BHO9 Năm chủng vi khuẩn được định danh dựa vào trình tự gene 16S rRNA và đặt tên tương ứng Methylobacterium sp. BHBi1, Hydrocarboniphaga sp. BHBi4, Agrobacterium sp. BHBi5, Bosea sp. BHBi7, Microbacterium sp. BHO9 (Hình 3.3). Ba trong số 5 chủng từ kết quả giải trình tự metagenome của 3 mẫu nghiên cứu đã được phát hiện thấy ở mức độ chi trong metagenome của các mẫu nghiên cứu là Agrobacterium sp. BHBi5, Microbacterium sp. BHO9, Methylobacterium sp. BHBi1. Chi Agrobacterium có 3 đại diện xuất hiện ở trong cả 2 mẫu với tỷ lệ giảm dần là Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium vitis, Agrobacterium rhizogenes. Chi Methylobacterium cũng có các đại diện từ 2 mẫu gồm M. chloromethanicum, M. extorquens, M. nodulans, M. populi, M. radiotolerans, Methylobacterium sp. 4-46. Hai chủng Hydrocarboniphaga sp. BHBi4, Bosea sp. BHBi7 hiện không tìm thấy đại diện nào trong dữ liệu phân tích metagenome 2 mẫu.
10. 8 Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loại của 5 chủng vi khuẩn Khả năng phân hủy dioxin trong đất bởi tổ hợp vi khuẩn đã được phân tích đánh giá bằng GC/MS. Hỗn hợp 5 chủng vi khuẩn đã phân hủy 59,1% tương đương 1756,78 ngTEQ/kg sau 30 ngày nuôi lắc ở 30 oC với độ độc ban đầu cao >4.000 ngTEQ/kg. Nếu tính theo ngày thì hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD lên tới 84,58 ngTEQ/kg/ngày (Hình 3.4, Bảng 3.1) A B Hình 3.4. Khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp vi khuẩn A: Đối chứng (không có VSV); B: Tổ hợp 5 chủng vi khuẩn Bảng 3.1. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn Tổ hợp vi khuẩn Tổng độ độc (ngTEQ/kg đất khô) Phân hủy (%) Không có vi khuẩn 4.294,12 0 Hỗn hợp 5 chủng vi khuẩn 1.756,78 59,1 3.1.2. Xạ khuẩn từ đất nhiễm dioxin đã được phân lập, định danh và khả năng phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn tiềm năng Từ mẫu ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 5 chủng xạ khuẩn được phân lập và nuôi lắc 150v/ph ở 30oC trong môi trường chứa chất diệt cỏ/dioxin để tăng khả năng sử dụng chất độc của chúng mục đích làm giống cho các nghiên cứu tiếp theo (Hình 3.5).
11. 9 XKBHA3 XKBH4 XKBH28 XKBH921 XKBHA22 Hình 3.5. Hình thái khuẩn lạc 5 chủng xạ khuẩn trên môi trường Gause M chứa DCĐ Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loài của chủng xạ khuẩn XKBH921 Trong số 5 chủng nghiên cứu, chủng xạ khuẩn XKBH921 đã được phân loại và định danh dựa vào trình tự gene 16S rRNA và đặt tên là Streptomyces sp. XKBH921 (Hình 3.6). Cả 5 chủng đều thuộc chi Streptomyces và đã có mặt ở metagenome của các mẫu nghiên cứu. Năm chủng xạ khuẩn đều có khả năng sinh tổng hợp laccase-like với hoạt tính khác nhau. Chủng XKBHA3 sinh laccase cao nhất 167 U/L trong 4 ngày đầu và giảm dần sau 13 ngày còn 137 U/L. Chủng XKBH28 sinh trưởng nhanh và hoạt tính enzyme cũng đạt rất cao 360 U/L sau 3 ngày nuôi lắc và cũng giảm dần đến 288 U/L sau 13 ngày nuôi. Chủng XKBHA22 sinh laccase-like nhưng lại tăng dần theo thời gian, sau 3 ngày chỉ đo được 84 U/L và sau 13 ngày là 294 U/L và còn xu hướng tăng theo thời gian. Tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn trong đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin cũng xác định được laccase-like (Hình 3.7). Chủng XKBHA22 cũng đã được sử dụng để đánh giá khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD, sau 30 ngày nuôi cấy hiệu suất phân hủy TCDD kém hơn hẳn so với hỗn hợp 5 chủng xạ khuẩn (Hình 3.7 và Bảng 3.2).
12. 10 AB Hình 3.7. Khả năng sinh tổng hợp laccase- like của 5 chủng xạ khuẩn A: Đơn chủng; B: Hỗn hợp 5 chủng xạ khuẩn Hiệu suất phân hủy 2,3,7,8-TCDD bởi chủng XKBHA22 là 55,6% khi tổng độ độc ban đầu là 54 pgTEQ/ml được phân tích bằng DR-Calux và hoạt tính laccase-like đo được 294 U/L. Bảng 3.2. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm bởi chủng XKBHA22 Chủng xạ khuẩn Tổng độ độc (ngTEQ/kg đất khô) Phân hủy (%) Không có xạ khuẩn 54 0 Chủng XKBHA22 24 55,6 Sự khác biệt so với các công bố khác là sử dụng hỗn hợp các chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase-like trong môi trường đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong đất có tổng độ độc là 4294,12 ngTEQ/kg. Nếu tính theo ngày thì hiệu suất phân hủy đồng loại 2,3,7,8-TCDD lên tới 72.59 ngTEQ/kg đất/ngày (Hình 3.8). A B Hình 3.8. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp xạ khuẩn A: Đối chứng (không có VSV); B: Tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn Hỗn hợp 5 chủng xạ khuẩn trong nghiên cứu này phân hủy 50,7% 2,3,7,8-TCDD trong đất (2177,96 ngTEQ/kg) sau 30 ngày nuôi lắc ở 30 oC được xác đình bằng HRGC/HRMS (Bảng 3.3). Bảng 3.3. Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn Tổ hợp xạ khuẩn Tổng độ độc (ngTEQ/kg đất khô) Phân hủy% Không có xạ khuẩn 4.294,12 0 Hỗn hợp 5 chủng xạ khuẩn 2.116,16 50,7
13. 11 3.2. Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C và BHR 3.2.1. Thu nhận DNA metagenome từ mẫu C và BHR Cô đặc DNA metagenome và điện di kiểm tra sản phẩm sử dụng 3μl. Băng điện di rõ nét, có kích thước lớn hơn 10 kb và không có vệt. DNA metagenome được kiểm tra lần cuối bằng thiết bị Qubit Fluorometre để đảm bảo lượng DNA thu được đáp ứng yêu cầu khi giải trình tự bằng máy Illumina Hiseq 2500 (Hình 3.9). Lấy 2 µg DNA metagenome của mỗi mẫu để gửi đi giải trình tự toàn bộ trên hệ thống Illumina Hiseq 2500 tại công ty Baseclear, Hà Lan. Mẫu C (23,2 ng/µl) Mẫu BHR (14,1 ng/µl) Hình 3.9. Điện di đồ DNA mẫu nghiên cứu trên gel agarose 3.2.2. Trình tự, contig và gene chức năng từ metagenome mẫu C và BHR Trình tự dữ liệu sau phân tích thu được là rất lớn (15 Gb) và độ chính xác cao (99,9%). Các thông số chi tiết về 2 mẫu như số lượng contig, tổng số bp, tỷ lệ phần trăm GC, kích thước Contig lớn nhất, nhỏ nhất và trung bình cùng với các thông tin khác cũng được thống kê rõ (Bảng 3.4 và Bảng 3.5). Bảng 3.4. Trình tự read chất lượng cao Mẫu Số lượng reads Độ lớn của mẫu (Mb) Điểm chất lượng trung bình (Phred) C 64.339.446 15.635 37,83 BHR 61.600.474 15.522 33,98 Mặc dù số lượng read và độ lớn của 2 mẫu tương đương nhau nhưng số lượng contig mẫu C (12.133) thấp hơn 10 lần so với mẫu BHR (119.555). Bảng 3.5. Lắp ráp de novo trình tự DNA metagenome C, BHR Các đặc tính C BHR Số lượng Contig 12.133 119.555 Tổng số (bp) 61.478.000 215.533.770 GC (%) 65,10 58,72
14. 12 Kích thước Contig lớn nhất 1.070.898 261.394 Kích thước Contig nhỏ nhất 700 700 Kích thước trung bình của Contig 5.067 1.802 N25 104.014 5.218 N50 28.891 2.114 N75 4.081 1.142 Số lượng lỗi 8 0 Kích thước lỗi 74 0 Các contig được sắp xếp và phân tích bằng hệ thống máy chủ MG-RAST với mã số (MG-RAST ID) là 4730381.3 (C) và 4720115.3 (BHR) để nghiên cứu cấu trúc quần xã VSV và các nhóm gen chức năng tham gia vào các quá trình chuyển hóa của tế bào (Bảng 3.6). Bảng 3.6. Phân bố gene từ trình tự DNA metagenome C, BHR Phân bố của gene trong DNA metagenome C BHR Tổng số genes 59.225 218.327 Gene đã biết chức năng 36.247 93.222 Gene dự đoán trên GO 36.207 92.986 Số lượng gene trên CaZy 577 2.774 Gene chứa peptide tín hiệu 5.051 10.954 Khối lượng gene (gene/Mbp) 963 1.012 Tổng kích thước gene 49.330.702 145.153.973 Kích thước gene lớn nhất 17.244 21.804 Kích thước gene nhỏ nhất 65 70 Kích thước gene trung bình 832 664 3.2.3. Đa dạng VSV của metagenome C và BHR Trong tổng số 80.156 đoạn trình tự (OTU) của mẫu C và 268.768 OTU của mẫu BHR dự đoán được từ cơ sở dữ liệu RefSeq, các trình tự so sánh tương đồng với các trình tự có nguồn gốc từ vi khuẩn của 2 mẫu đều chiếm đa số (C đạt 79.508 (99,19%) và BHR 263.858 (98,17%)). Tương tự như vậy, các trình tự từ vi khuẩn cổ (vi khuẩn cổ – Archaea) tương ứng đạt 106 (0,13%) và 3.333 (1,24%), các trình tự từ sinh vật nhân thật (Eukaryota) đạt 189 (0,24%) và 1.330 (0,49%). Các trình tự chiếm tỷ lệ rất nhỏ là từ virus đạt 344 (0,43%) và 237 (0,09%), các trình tự chưa được phân loại của 2 mẫu chỉ chiếm 0,01% (Hình 3.10).
15. 13 Hình 3.10. Đa dạng ở các mức độ từ metagenome C và BHR so với cơ sở dữ liệu RefSeq
16. 14 Sự đa dạng ở các mức độ phân loại như ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài của 2 mẫu cũng được thống kê và số liệu được trình bày ở Bảng 3.7. Bảng 3.7. Đa dạng và mức độ chiếm ưu thế ở các mức độ phân loại của metagenome C và BHR Mẫu Ngành Lớp Bộ Họ Chi Loài C 45 87 161 301 622 674 BHR 52 110 208 375 786 1070 Tổng số 52 110 208 379 800 1264 3.2.3.1. Đa dạng vi khuẩn từ metagenome C và BHR ở các mức độ Ở mức độ ngành vi khuẩn có sự thay đổi rõ rệt về số lượng (Hình 3.11). Trong metagenome C có 27 ngành trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất lần lượt là Proteobacteria (86,05%) và Actinobacteria (11,98%), Firmicutes (0,83%), các ngành còn lại chiếm tỷ lệ rất nhỏ. Còn đối với BHR đã phát hiện 28 ngành, tỷ lệ tập trung vào 3 ngành chính là Proteobacteria (61,84%), Bacteroidetes (13,31%), Actinobacteria (8,51%). Một số ngành khác chiếm tỷ lệ nhỏ hơn như Firmicutes (3,83%), Acidobacteria (2,75%), Chloroflexi (2,33%), Cyanobacteria (1,35%), Nitrospirae (1,01%). Đa dạng vi khuẩn ở mức độ lớp chỉ ra rằng Betaproteobacteria chiếm 52,20% ở C nhưng chỉ chiếm 15,84% ở BHR. Một số lớp có tỷ lệ không có sự chênh lệch lớn ở cả C và BHR như Gammaproteobacteria 25,8% và 23,98%, Actinobateria 11,98% và 8,51%, Alphaproteobacteria 7,36% và 14,38% so với C và BHR. Trong khi metagenome của BHR có một số lớp chiếm tỷ lệ tương đối cao như Bacteroidia (5,71%), Deltaproteobacteria (7,27%), Sphingobacteria (3,32%), Clostridia (2,4%), Flavobacteria (2,31%) và còn lại các lớp khác chiếm tỷ lệ thấp hơn (Hình 3.11). Đây cũng chính là các nhóm ở C chiếm tỷ lệ rất thấp, đất bị ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin kéo dài dẫn tới thay đổi đa dạng VSV đất. Ở mức độ bộ vi khuẩn, bộ chiếm ưu thế trong metagenome C gồm Pseudomonadales, Burkholderiales, Actinomycetales, Xanthomonadales, Rhizobiales, Enterobacteriales với tỷ lệ lần lượt là 42,59%; 23,43%; 11,71%; 4,61%; 4,12% và 2,68%. Mẫu BHR có sự thay đổi lớn số lượng và tỷ lệ các bộ với sự chênh lệch không nhiều Burkholderiales (15,47%), Rhizobiales (9,93%), Actinomycetales (7,95%), Xanthomonadales (4,93%), Pseudomonadales (2,15%), Enterobacteriales (1,04%) và bộ chiếm tỷ lệ cao hơn rất nhiều so với mẫu C như Bacteroidales (5,7%), Myxococcales (4,4%), Chromatiales (3,41%), Sphingobacteriales (3,32%), Nitrosomonadales (2,58%), Rhodocyclales (2,3%), Flavobacteriales (2,25%) (Hình 3.11).
17. 15 Hình 3.11. Đa dạng vi khuẩn ở các mức độ khác nhau trong metagenome C và BHR Ở cấp họ vi khuẩn, chiếm ưu thế trong metagenome C là Alcaligenaceae 12,38%, Burkholderiaceae 8,16%, Enterobacteriaceae 2,68%, Comamonadaceae 2,16% và Buetenbergiaceae 1,32%. Với metagenome BHR họ chiếm ưu thế lần lượt là Comamonadaceae 5,13%, Bradyrhizobiaceae 4,19%, Burkholderiaceae 4,78%, Alcaligenaceae 4,11%, Bacteroidaceae 3,41%, Flavobacteriaceae 2,17%, Ectothiorhodospiraceae 1,91%, Cytophagaceae 1,58%, Chromatiaceae 1,42% (Hình 3.11).
18. 16 Sự khác biệt giữa hai metagenome của C, BHR thể hiện rõ nhất ở mức độ chi (Hình 3.11). Vi khuẩn Pseudomonas là chi chiếm tỷ lệ lớn nhất tới 40,54% tổng số trình tự thu được từ dữ liệu metagenone của đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (mẫu C). Thay đổi lớn nhất trong quần xã VSV là sự tăng số lượng vi khuẩn thuộc chi Cupriavidus, chi này chiếm hơn 1% ở metagenome C và 6,5% (vị trí thứ 2) trong metagenome BHR. Chi Cupriavidus được biết đến thông qua các minh chứng là nhiều chủng của chi này có khả năng phân hủy chất diệt cỏ như chủng Cupriavidus necator JMP134 có khả năng phân hủy đáng kinh ngạc các hợp chất vòng thơm. Kết quả khảo sát sơ bộ đến loài rất đáng ngạc nhiên là hai chi vi khuẩn kị khí có số lượng loài rất chênh lệch nhau. Ở chi Anaeromyxobacter chỉ có 3 loài, ngược lại ở Bacteroides có tới 36 loài. Còn ở VSV hiếu khí như Burkhodaria có 23 loài và xạ khuẩn Streptomyces có tới 33 loài, đối với vi khuẩn hiếu khí tùy tiện như Pseudomonas và Bacillus có lần lượt là 15 loài và 25 loài. Các chi đã được cộng đồng các nhà khoa học nghiên cứu rất nhiều và đã chứng minh có khả năng phân hủy dioxin và hàng loạt các chất đa vòng thơm khác như Dehalococcoides chỉ có 1 chi và có 5 chủng, Sphingomonas chỉ có 3 loài. 3.2.3.2. Đa dạng vi khuẩn cổ trong metagenome C và BHR Đa dạng vi khuẩn cổ trong metagenome C và BHR ở các mức độ phân loại khác nhau Phát hiện thấy có sự khác biệt về đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ ngành giữa metagenome của C và BHR (Hình 3.12). Đây có lẽ là kết quả khá mới trong lĩnh vực nghiên cứu VSV liên quan đến xenobiotic. Ngành Euryarchaeota chiếm tới 92,45% ở C nhưng chỉ chiếm 59,02% ở BHR. Ngành Crenarchaeota và Korarchaeota chiếm tỷ lệ tương đương nhau ở cả 2 mẫu lần lượt là 5,66%; 0,94% trong metagenome của C và 9,54%; 1,29% trong BHR. Riêng ngành Thaumarchaeota chiếm tỷ lệ rất nhỏ ở C (0,94%) nhưng lại chiếm tỷ lệ lớn ở BHR (30,15%). Đây là kết quả rất ngạc nhiên, để giải thích tỷ lệ chiến ưu thế trong metagenome của các mẫu nghiên cứu này cần thêm thời gian và những nghiên cứu sâu sắc tiếp theo. Ở mức độ lớp vi khuẩn cổ không có sự chênh lệch lớn như của vi khuẩn (Hình 3.12). Lớp chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả 2 mẫu là Methanomicrobia chiếm 50% trong metagenome của C và 24,57% của BHR. Các lớp khác như Archaeoglobi, Halobacteria, Methanobacteria, Methanococci, Methanopyri, Thermococci, Thermoprotei chiếm tỷ lệ thấp ở cả 2 mẫu. Rất đặc biệt, tỷ lệ quần xã vi khuẩn kị khí bắt buộc chưa được biết đến này trong hệ thống phân loại rất cao ở cả C và BHR lần lượt là 19,92% và 36,54%.
19. 17 Mức độ chi (Hình 3.12) cho thấy sự thay đổi tỷ lệ của các chi ở 2 mẫu là khác nhau. Mẫu C đa dạng tập trung lần lượt Methanosarcina (22,64%), Methanocella (12,26), Methanosaeta (6,6%), Methanococcus (5,66%) và các chi chưa được phân loại lên tới 16,04%. Vi khuẩn cổ của mẫu BHR cũng tập trung lần lượt Nitrosopumilus (23,97%), Methanosarcina (9,66%), Cenarchaeum (6,18%), Pyrococcus (3,63%), Thermococcus (3,6%) và chi chưa phân loại chiếm 4,35% ít hơn mẫu C rất nhiều. Đa dạng vi khuẩn cổ sinh metan trong metagenome của các mẫu nghiên cứu Nhóm vi khuẩn cổ sinh metan cũng có mặt trong metagenome chiếm tỷ lệ cao ở mẫu BHR (vì chôn lấp với thời gian và điều kiện xử lý đã mô tả chi tiết ở phần vật liệu và phương pháp. Đặc biệt và ở giai đoạn cuối của qui trình xử lý thì nước đã được bão hòa) và tổng độ độc của mẫu đã giảm xuống dưới mức cho phép thì sự có mặt của chúng cũng là hiện tượng dễ hiểu Hình 3.12. Đa dạng vi khuẩn cổ ở các mức độ trong metagenome C và BHR Đa dạng vi khuẩn cổ ưa mặn trong metagenome C và BHR Trong metagenome của 2 mẫu nghiên cứu cũng đã phát hiện thấy 10 chi vi khuẩn cổ (Archaea) thuộc chỉ ngành Euryarchaeota và đều thuộc họ Halobacteriaceae. Số lượng của mỗi chi trong metagenome mẫu BHR lớn hơn nhiều so với mẫu C (Hình 3.13 và Hình 3.14).
20. 18 Hình 3.13. Đa dạng vi khuẩn cổ sinh metan trong metagenome C và BHR Hình 3.14. Đa dạng vi khuẩn cổ ưa mặn trong metagenome C và BHR 3.2.3.3. Đa dạng nấm sợi và nấm đảm trong metagenome C và BHR Số lượng của nấm sợi và nấm đảm trong metagenome không cao và nấm sợi có số lượng và đa dạng hơn nhiều có tới 36 chi so với nấm đảm chỉ có 8 chi và nấm men 13 chi đã được phát hiện trong 2 mẫu nghiên cứu. Đã có nhiều công bố về khử độc chất diệt cỏ/dioxin bởi các chủng nấm sợi thuộc các chi khác nhau. Tuy nhiên với nấm men hiện vẫn chưa có công bố nào và đây là một phát hiện mới khi mà quần xã nấm men cũng có mặt trong metagenome của đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tuy số lượng không cao. Các chi rất quen thuộc với chúng ta đều có mặt như Candida, Saccharomyce, Pichia. Các chi còn lại đóng vai trò gì trong phân hủy chất diệt cỏ/dioxin thì còn là một ẩn số. Số lượng của nấm men ở BHR cao hơn hẳn ở metagenome của C. Đất ô nhiễm C
21. 19 có độ độc cao nhưng nấm men vẫn có mặt với số lượng rất thấp. Đây là những câu hỏi cần có lời giải và có thể các nghiên cứu tiếp theo nên phân lập nấm men, nấm sợi và nấm đảm. Nếu phân lập được ở dạng thuần khiết trên môi trường chứa hỗn hợp chất độc thì chúng sẽ là nguồn nguyên liệu di truyền quí giá để nghiên cứu con đường phân hủy chất độc bởi các VSV nhân thật này. 3.2.4. Mối liên hệ giữa một số chi vi khuẩn với tổng độ độc và các đặc tính lý hóa của đất Đối với các chi VSV có mặt ở mẫu nghiên cứu nhưng sự chênh lệch về tỷ lệ trong metagenome rất khác nhau. Ngoài ra các chi được so sánh ở đây đều là các chi có tỷ lệ cao hay đóng vai trò rất quan trọng trong hoạt động sinh lý ở các sinh thái tiêu biểu cho nghiên cứu này. Ví dụ 7 chi sau đây sẽ cung cấp cho chúng ta một bức tranh rất nhiều màu sắc về thế giới VSV liên quan đến 2 nhóm mẫu mà chúng tôi nghiên cứu metagenome (Hình 3.15). Chi Candidatus koribacter và Candidatus solibacter ở mẫu BHR chiếm tỷ lệ cao gấp 10 lần so với mẫu C. Chi Cupriavidus cũng là chi chiến ưu thế rất cao nhưng ở mỗi mẫu nghiên cứu có sự khác biệt rất rõ ràng. Hình 3.15. Các chi vi khuẩn có tỷ lệ chiếm ưu thế ít chênh lệch trong metagenome C và BHR 3.2.5. Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của metagenome C và BHR Phân tích sâu hơn cho thấy các gene liên quan đến các con đường trao đổi ngoại vi và trao đổi chất thông qua các hợp chất vòng thơm trung gian chiếm ưu thế trong cả 2 metagenome. Các gene liên quan đến hoạt động trao đổi chất các hợp chất vòng thơm trung gian hoạt động mạnh hơn trong mẫu C so với mẫu BHR (Hình 3.16). Một điểm đáng chú ý khác là các gene laccase được tìm thấy trong các metagenome này đều thuộc laccase của vi khuẩn. Trong khi laccases từ nấm đã được thông báo có khả năng phân hủy các hợp chất liên quan đến dioxin. Hiện nay vẫn chưa có minh chứng về laccase của vi khuẩn tham gia vào quá trình phân hủy dioxin
22. 20 trực tiếp. Có nhiều gene liên quan đến sự phân hủy các hợp chất thơm thông qua montoxypase cytochrome P450 thấp hơn đáng kể so với các nhóm khác, cho thấy xu hướng ưu tiên các con đường khoáng hóa hơn là tạo thành các chất trung gian độc hại, các chất chuyển hóa ngõ cụt và các liên hợp chịu trách nhiệm cho việc hình thành các dẫn chất PAH-DNA và các đột biến kích hoạt ung thư ở động vật (Bảng 3.8). Hình 3.16. Tương quan gene liên quan chuyển hóa xenobiotic giữa metagenome C và BHR. Do lịch sử cụ thể của các mẫu đất, nghiên cứu các gene chức năng liên quan đến các con đường phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T và các hợp chất có liên quan đến dioxin đã được tiến hành (Bảng 3.9). Bảng 3.8. Số lượng trình tự tương đồng cao với các gene chức năng trong tập dữ liệu chuẩn hóa Các gene chức năng C BHR Catechol 1,2-dioxygenase [EC 1.13.11.1] 25 13 catechol 2,3-dioxygenase [EC 1.13.11.2] 54 31 protocatechute 3,4-dioxygenase [EC 1.13.11.3] 59 8 protocatechute 4,5-dioxygenase [EC 1.13.11.8] 13 30 Cytochrome P450 4 5 Bảng 3.9. Số lượng trình tự liên quan đặc thù tới con đường phân 2,4-D và polychlorinated biphenyl (PCB) dựa trên cơ sở dữ liệu KEEG Enzyme C BHR Phân hủy alpha-ketoglutarate-dependent 2,4-dichlorophenoxyacetate 13 5 2,4-D dioxygenase [EC:1.14.11.-]
23. 21 2,4-dichlorophenol 6-monooxygenase [EC:1.14.13.20] 46 3 chlorocatechol 1,2-dioxygenase [EC:1.13.11.-] 4 0 biphenyl 2,3-dioxygenase [EC:1.14.12.18] 17 2 cis-2,3-dihydrobiphenyl-2,3-diol dehydrogenase [EC:1.3.1.56] 0 0 Phân hủy biphenyl-2,3-diol 1,2-dioxygenase [EC:1.13.11.39] 17 1 PCB 2,6-dioxo-6-phenylhexa-3-enoate hydrolase [EC:3.7.1.8] 4 3 2-keto-4-pentenoate hydratase [EC:4.2.1.80] 21 6 3.2.5. Nhóm gene mã hóa enzyme tham gia phân hủy, chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin: Đây là các gene chức năng thuộc nhóm oxidoreductase, laccase tham gia vào oxy hóa mở hay cắt vòng thơm hoạt động như là chất xúc tác mạnh. Nghiên cứu đã không phát hiện được peroxidase tuy nhiên có tới 18 và 21 gene mã hóa laccase đã được phát hiện từ metagenome C và BHR. 3.2.7. Gene tham gia vào phân hủy chuyển hóa xenobiotic từ metagenome đã được phát hiện Bằng các phần mềm chuyên dụng, các gene mã hóa laccase mới trong mẫu nghiên cứu được phát hiện và liệt kê (Bảng 3.10). Có tất cả 20/39 gene laccase mới được phát hiện với trình tự có độ tương đồng thấp hơn 85% so với các công bố trên CSDL Laccase - Laccase Database. Bảng 3.10. Danh sánh gene laccase mới trong hai metagenome C và BHR so sánh với các trình tự trên CSDL Laccase - Laccase Database Tương Độ dài Giá trị Trình tự Số đăng ký trên Mẫu Trình tự loài tương đồng đồng tương tương Genbank dự đoán (%) đồng đồng Prokka_26873 Pseudomonas kuykendallii 69 98 0 WP_090224340.1 Prokka_29204 Bradyrhizobium japonicum 70 99 0 WP_024341998.1 C Prokka_29254 Georgenia soli 77 95 0 PFG38115.1 (6 Propionibacteriaceae gene Prokka_36971 62 99 0 WP_094452554.1 bacterium NML 150081 mới) Prokka_42353 Microbacterium profundi 67 99 0 WP_033107198.1 Prokka_43501 Georgenia soli 79 94 0 PFG38115.1 Prokka_14662 Candidimonas 59 97 0.0 WP_088601715.1 BHR nitroreducens (14 Prokka_19245 Betaproteobacteria 69 99 0.0 KPK14192.1 gene bacterium SG8_41 mới) Prokka_49413 Elizabethkingia anophelis 71 99 0.0 WP_095439195.1
24. 22 Prokka_85327 Edaphobacter aggregans 69 97 0.0 WP_035356032.1 Prokka_87022 Emcibacter sp. ZYL 62 95 1e-155 WP_099473112.1 Prokka_88258 Candidatus Methanoperedens 64 98 5e-126 WP_096203677.1 nitroreducens Prokka_90273 Chitinophaga jiangningensis 64 97 0.0 SHL10102.1 Prokka_105664 Rhodanobacter sp. SCN 66-43 76 98 8e-159 ODU94729.1 Prokka_123396 Alphaproteobacteria 74 99 2E-178 OJU56834.1 bacterium 62-8 Prokka_130875 Nitrobacter sp. 62-23 77 99 0 OJV03616.1 Prokka_148241 Alphaproteobacteria 72 97 0 OJU56834.1 bacterium 62-8 Prokka_169983 Methylobacter 59 97 0 EGW23198.1 tundripaludum SV96 Prokka_192104 Alphaproteobacteria 76 99 0 OJU56834.1 bacterium 62-8 Prokka_196163 Vibrionimonas 72 94 0 WP_105469515.1 magnilacihabitans Các kết quả thu được trình bày ở trên có thể tóm tắt như sau: - Nồng độ DNA tổng số trực tiếp thu được của mẫu C và BHR tương ứng đạt 23,2 ng/µl và 14,1 ng/µl được xác định bằng máy đo Qubit Fluorometre đáp ứng yêu cầu cho giải trình tự bằng hệ thống Illumina Hiseq 2500. - Độ lớn của mẫu sau khi giải trình tự với dữ liệu thu được rất lớn và có độ chính xác cao (15Gb mỗi mẫu với độ chính xác 99,9%); - Bằng phần mềm tin sinh học dựa trên các cơ sở dữ liệu đã xác định được đa dạng VSV trong 2 metagenome ở các mức độ từ ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài và đa dạng gene chức năng tham gia vào phân hủy hợp chất xenobiotic; - Sự khác biệt trong đa dạng thể hiện rõ nhất ở mức độ chi trong đó chi Pseudomonas chiếm ưu thế ở mẫu ô nhiễm nặng (40,54%) còn ở mẫu đã làm sạch giảm còn (1,71%); - Đã xác định được đa dạng vi khuẩn cổ thuộc nhóm ưa mặn và sinh methan (Methanosarcina, Haloarcula chiếm ưu thế ở đất đã khử độc). Sinh vật nhân thật không nhiều nhưng phát hiện thấy nấm sợi, nấm đảm và nấm men như Candida, Saccharomyce, Pichia, Aspergillus, Penicillium, Coprinopsis; - Số lượng gene mã hóa cho enzyme tham gia vào phân hủy xenobiotic rất lớn. Sự có mặt của laccase và laccase-like trong 2 metagenome lên tới 39 gene, trong đó có 20/39 gene laccase mới.
25. 23 KẾT LUẬN 1. Vi khuẩn trong 2 metagenome nghiên cứu chiếm tỷ lệ rất cao 99,19% ở C và 98,17% ở BHR, vi khuẩn cổ tương ứng đạt 0,13% và 1,24%, vi sinh vật nhân thật (nấm sợi, nấm đảm, nấm men) chiếm tỷ lệ 0,24% và 0,49%, virus chiếm tương ứng 0,43% và 0,09%, các trình tự lỗi và chưa được phân loại nhỏ hơn 0,01%; - Trong metagenome C có 27 ngành, chiếm tỷ lệ cao nhất lần lượt là Proteobacteria (86,05%) và Actinobacteria (11,98%), Firmicutes (0,83%), các ngành còn lại chiếm tỷ lệ rất nhỏ. Còn đối với BHR đã phát hiện 28 ngành, tỷ lệ tập trung vào 3 ngành chính là Proteobacteria (61,84%), Bacteroidetes (13,31%), Actinobacteria (8,51%). Một số ngành khác chiếm tỷ lệ nhỏ hơn như Firmicutes (3,83%), Acidobacteria (2,75%), Chloroflexi (2,33%), Cyanobacteria (1,35%), Nitrospirae (1,01%); - Sự đa dạng của vi khuẩn ở 2 metagenome có sự khác biệt rõ rệt và thể hiện rõ nhất ở mức độ chi trong đó chi Pseudomonas chiếm ưu thế 40,54% ở C còn ở BHR giảm chỉ còn 1,71%; -Vi khuẩn cổ chiếm ưu thế là nhóm ưa mặn và sinh methan, hai chi Methanosarcina và Haloarcula chiếm ưu thế ở BHR; - Nấm men, nấm sợi và nấm đảm đã được phát hiện ở metagenome của BHR nhiều hơn gấp đôi (35 chi) so với ở C chỉ là 17 với số đại diện thấp. Các chi Aspergillus, Penicillium, Gibberella, Emericella (nấm sợi) có số lượng nhiều nhất ở BHR sau đó đến chi Candida, Schizosaccharomyces, Saccharomyce, Pichia (nấm men) và ít nhất là Coprinopsi (nấm đảm); 2. Số lượng nhóm gene tham gia vào quá trình xúc tác oxy hóa xenobiotic đã được phát hiện với số lượng rất lớn tới 39 gene laccase và laccase-like trong đó có 20 gene mới. Ngoài ra các gene mã hóa các enzyme khác như catechol 1,2-dioxygenase, catechol 2,3-dioxygenase, protocatechute 3,4-dioxygenase, protocatechute 4,5- dioxygenase, cytochrome P450 cũng được phát hiện với số lượng khác nhau ở 2 metagenome; 3. Đã phân lập và phân loại được 5 chủng vi khuẩn trong đó có 2 chủng mới là Hydrocarboniphaga sp. BHBi4, Bosea sp. BHBi7 và 5 xạ khuẩn sinh laccase-like (XKBHA3, XKBH4, XKBH28, XKBH921, XKBHA22) cũng đã được phân lập; Sau 30 ngày nuôi cấy, tổ hợp 5 vi khuẩn và 5 xạ khuẩn đã khử độc được 59,1% và 50,7% đồng loại dioxin 2,3,7,8-TCDD trong đất với độ độc ban đầu 4294,12 ng TEQ/kg. Nếu tính theo ngày thì khả năng phân hủy tương ứng đạt 84,58 ng TEQ/kg/ngày và 72,59 ng TEQ/kg đất/ngày. 4. Đã phát hiện thấy quần xã vi sinh vật tham gia vào 4 con đường chuyển hóa hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin và các chất trao đổi chất, trong đó vi sinh vật tham gia vào 3 con đường phân hủy hiếu khí chiếm tỷ lệ cao vượt trội so với kị khí. Trong đó
26. 24 quần xã vi sinh vật tham gia vào con đường oxy hóa cắt vòng và loại khử clo sau khi đã cắt vòng chiếm tỷ lệ cao hơn và lần lượt đến quần xã phân hủy theo con đường xúc tác; 5. Kết quả của nghiên cứu một lần nữa khẳng định công nghệ phân hủy sinh học có thể hoàn toàn hiệu quả khi tạo điều kiện phù hợp nhất cho các quần xã của vi sinh vật trong các môi trường khác nhau hoạt động phân hủy, chuyển hóa và khoáng hóa hỗn hợp chất ô nhiễm thuộc POPs với tổng độ độc trong đất rất cao. Tuy nhiên vẫn cần thêm rất nhiều nghiên cứu nữa mới có thể trả lời chi tiết về vai trò của từng quần xã trong chuyển hóa ô nhiễm ở điều kiện tự nhiên và xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học (Bioremediation). KIẾN NGHỊ Luận án mới chỉ dừng lại ở bước đánh giá đa dạng VSV ở các mức độ để thấy được sự thay đổi, khác biệt của tập đoàn VSV trong đất ô nhiễm nặng với đất đã được xử lý nhưng với bộ dữ liệu khổng lồ và sự phát triển không ngừng của các phần mềm tin sinh sẽ giúp khai thác sâu hơn dữ liệu thu được. Từ những lý do đó nghiên cứu sinh đề xuất 1 số kiến nghị gồm: 1. Dữ liệu của trình tự metagenome thu được là nguồn nguyên liệu di truyền có thể được khai thác không chỉ phục vụ nghiên cứu cơ bản mà còn rất hữu ích cho ứng dụng khử độc POP tại hiện trường ô nhiễm (bao gồm laccase, laccase-like); Kết hợp những kiến thức đã biết về các chất hóa học đã bị loại bỏ và các con đường trao đổi chất giả định cùng với phân tích các chỉ số môi trường của các metagenome liên quan đến chất diệt cỏ/dioxin khác nhau để tăng hiệu suất của công nghệ khử độc; 2. Rất cần tiếp tục phân lập mới vi sinh vật có khả năng phân hủy dioxin và các POP khác cùng các enzyme của chúng sinh tổng hợp được nhằm tạo chế phẩm cho các mục đích phân hủy tái tạo mà môi trường có thể kiểm soát được. NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 1. Phạm Quang Huy, Đặng Thị Cẩm Hà (2018). Khả năng phân hủy đồng loại dioxin 2,3,7,8-TCDD bởi tổ hợp xạ khuẩn phân lập từ đất ô nhiễm ở sân bay Biên Hòa, Đồng Nai. Kỷ yếu “Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2018”, p796-802. 2. Pham Quang Huy, Nguyen Kim Thoa, Đang Thi Cam Ha (2018). Degradation of 2,3,7,8-TCDD by a consortium of bacterial strains isolated from heavy herbicide/dioxin contaminated soil in BienHoa airbase. Journal of biotechnology, 16(4): 777-784. 3. Pham Quang Huy, Nguyen Kim Thoa, Dang Thi Cam Ha (2020). Diversity of reductive declorinating bacteria and archaea in herbicide/dioxin contaminated soils from Bien Hoa airbase using metagenomic approach. Journal of biotechnology, 18(4): 773-784.