Nghiên cứu hệ gen phiên mã (transcriptome) của tôm sú (Penaeus monodon) nhằm sàng lọc các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn..

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu hệ gen phiên mã (transcriptome) của tôm sú (Penaeus monodon) nhằm sàng lọc các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn..

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN GIANG THU NGHIÊN CỨU HỆ GEN PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTOME) CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) NHẰM SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 94 20 20 1 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2018
2. Công trình được hoàn thành tại: Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Đinh Duy Kháng 2. PGS.TS. Nguyễn Hữu Ninh Phản biện 1: Phản biện 2: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hôi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
3. MỞ ĐẦU Tôm sú (Penaeus monodon) là một trong những đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao và được nuôi phổ biến ở hơn 22 quốc gia trên thế giới như Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ Tại Việt Nam, nghề nuôi tôm sú phát triển mạnh mẽ, với trên 600.000 ha diện tích nuôi, sản lượng mỗi năm đạt khoảng 300.000 tấn. Theo thông tin của Hiệp hội Chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), xuất khẩu tôm tăng trưởng mạnh trong năm 2017, kim ngạch đạt 3,85 tỷ USD, tăng 22,3% so với năm 2016. Ở Việt Nam, tôm sú là đối tượng quan trọng thứ hai sau tôm thẻ chân trắng, với kim ngạch xuất khẩu chiếm khoảng 1/3 kim ngạch xuất khẩu về tôm nước lợ. Nghề nuôi tôm sú có ưu thế lớn là nguồn tài nguyên bản địa có thể nuôi và khai thác lâu dài, đóng góp quan trọng vào vấn đề an toàn lương thực, xóa đói giảm nghèo và phát triển kinh tế xã hội của mỗi nước nhưng đang đối mặt với nhiều thách thức và có xu hướng giảm dần. Nguyên nhân chính của hiện tượng này là không chủ động được tôm bố mẹ do khai thác từ tự nhiên và các loại dịch bệnh tràn lan gây chết tôm hàng loạt. Nếu như trước năm 2003, đối tượng tôm nuôi chủ yếu ở châu Á là tôm sú, chiếm tới 80% thị phần trên toàn thể giới, thì từ năm 2004, tôm thẻ chân trắng từ châu Mỹ tràn sang với lợi thế là chủ động được tôm bố mẹ, tạo được đàn tôm giống sạch bệnh đã lấn át dần tôm sú. Tại Thái Lan, tỷ lệ phần trăm giữa tôm sú/tôm thẻ chân trắng năm 2003 là 60/40, thì đến nay chỉ còn khoảng 1/99. Chiến lược phát triển lâu dài của các nước còn diện tích nuôi tôm sú trong đó có Việt Nam là có được ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế tối thiểu các tác động tiêu cực đến môi trường sinh thái. Nền tảng cho chiến lược phát triển này là phát triển nguồn tôm bản địa với các chương trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trưởng. Để đạt được mục đích này, việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ hệ gen tôm sú là một vấn đề khoa học cơ bản có định hướng ứng dụng hết sức quan trọng.
4. Nghiên cứu hệ gen tôm sú sẽ cung cấp thông tin chính xác cho việc xác định các tính trạng quan trọng như: tính trạng tăng trưởng, tính kháng bệnh, tính chống chịu với điều kiện môi trường, các tính trạng liên quan đến chất lượng tôm. Do kích thước hệ gen tôm sú khá lớn, ước tính khoảng 2,17 Gb, nên việc giải mã toàn bộ hệ gen tôm sú đòi hỏi thời gian và tốn nhiều kinh phí. Vì vậy, để có thể từng bước khai thác các thông tin cần thiết từ hệ gen tôm sú, đặc biệt là khai thác các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống thì việc giải trình tự và phân tích hệ gen phiên mãvới phương pháp xác định trình tự gen thế hệ mới NGS (Next generation sequencing), chú giải chức năng gen và sàng lọc các chỉ thị phân tử liên quan tới các tính trạng quan trọng như tăng trưởng nhanh, chống chịu bệnh tốt để phục vụ công tác chọn giốnglà cách tiếp cận hợp lý và khả thi. Với những luận cứ nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu hệ gen phiên mã (Transcriptome) của tôm sú (Penaeus monodon) nhằm sàng lọc các chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống”. Đề tài được thực hiện tại Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Mục tiêu chung: Nghiên cứu phân tích hệ gen phiên mã của tôm sú (Penaeus monodon) nhằm sàng lọc chỉ thị phân tử phục vụ công tác chọn giống. Mục tiêu cụ thể: - Giải mã hệ gen phiên mã (transcriptome) từ 4 mô (mô cơ, môt tim, mô gan tụy, mô gốc mắt) của tôm sú (Penaeus monodon), thiết lập cơ sở dữ liệu hệ phiên mã phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. - Sàng lọc các gen giả định liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú. - Xác định các SNP và microsatellite từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã. - Xác định bộ SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú. PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Thu nhận mẫu tôm sú gia hóa và tôm sú tự nhiên từ vùng biển Việt Nam. 2
5. - Kiểm tra, đánh giá, sàng lọc để lựa chọn các mẫu tôm sú không bị nhiễm một số bệnh nguy hiểm theo tổ chức sức khỏe động vật thế giới (World Organisation for Animal health – OIE) như bệnh đốm trắng (WSSV), hoại tử gan tụy cấp (IHHNV), đầu vàng (YHV), bệnh còi (MBV) và bệnh taura(TSV). - Tách chiết RNA tổng số, tinh sạch mRNA và tạo thư viện cDNA cho 4 mô (gan tụy, tim, cơ và gốc mắt). - Giải trình tự gen hệ phiên mã transcriptome từ 4 mô của tôm sú, phân tích và đánh giá chất lượng dữ liệu thu nhận được. - Xây dựng cơ sở dữ liệu transcriptome tôm sú Việt Nam. - Sàng lọc các gen giả định từ hệ phiên mã liên quan đến tính trạng tăng trưởng. - Xác định các SNP và microsatellite từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã. - Xác định các SNP từ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã liên quan đến tính trạng tăng trưởng. - Xác định các SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Lần đầu tiên ở Việt Nam xây dựng được Cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã tôm sú tự nhiên ( ên cơ cở giải mã và phân tích 04 mô (cơ, gan tụy, tim và gốc mắt). Đây là cơ sở dữ liệu quan trọng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo ở tôm sú nuôi và tôm sú tự nhiên thu tại vùng biển Việt Nam. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Ý nghĩa khoa học Các thông tin khoa học về hệ gen phiên mã tôm sú tự nhiên thu tại vùng biển Việt Nam có nghĩa khoa học lớn đối với các nghiên cứu tiếp theo về tôm sú. Kết quả khoa học nghiên cứu này (bài báo đăng trên tạp chí quốc tế 3
6. Aquaculture) đã được hàng trăm công trình đọc, trích dẫn và các tác giả đã được mời báo cáo tham luận tại các hội nghị quốc tế về nuôi trồng thủy sản. Ý nghĩa thực tiễn Luận án tạo được cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã ở tôm sú tự nhiên và bước đầu phân tích hệ gen phiên mã tôm sú tăng trưởng nhanh và chậm, tìm kiếm các chỉ thị phân tử SNP chỉ có ở tôm tăng trưởng nhanh với mục tiêu có được bộ chỉ thị phân tử chất lượng để phát triển các chip sử dụng trong nghiên cứu tạo giống tôm sú bố mẹ sạch bệnh, sức sinh sản cao, tăng trưởng tốt bằng công nghệ “Nghiên cứu tương quan toàn phần hệ gen” (GWAS, Genome Wide Association Study). 4
7. CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÔM SÚ VÀ TÌNH HÌNH NUÔI TÔM SÚ Ở VIỆT NAM 1.1.1. Giới thiệu về tôm sú 1.1.2. Tình hình nuôi tôm sú trên thế giới và Việt Nam 1.1.2.1. Tình hình nuôi tôm sú trên thế giới 1.1.2.2. Tình hình nuôi tôm sú ở Việt Nam 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HỆ GEN VÀ HỆ PHIÊN MÃ CỦA TÔM SÚ TRÊN THẾ GIỚI 1.2.1. Công trình nghiên cứu đầu tiên liên quan tới hệ phiên mã của tôm 1.2.2. Xác định các gen liên quan tới hệ miễn dịch của tôm thông qua việc phân tích hệ phiên mã 1.2.3. Xác định các gen có liên quan tới khả năng sinh sản của tôm 1.2.4. Xác định các gen có liên quan tới giới tính của tôm sú 1.2.5. Nghiên cứu giải trình tự hệ gen và hệ phiên mã tôm sú ở Thái Lan 1.2.6. Nghiên cứu lập bản đồ gen tôm sú ở Đài Loan 1.2.7. Nghiên cứu giải mã hệ gen và hệ phiên mã tôm sú ở Việt Nam 1.3. CHỈ THỊ PHÂN TỬ SNP VÀ MICROSATELLITE 1.3.1. Chỉ thị phân tử SNP 1.3.2. Chỉ thị phân tử Microsatellite 1.4. TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG VÀ MỘT SỐ GEN DỰ ĐOÁN LIÊN QUAN Ở ĐỘNG VẬT GIÁP XÁC 1.4.1. Tính trạng tăng trưởng 1.4.2. Các nhóm gen ứng viên liên quan đến tính trạng tăng trưởng đã được công bố trong nhóm giáp xác - Nhóm gen 5-Hydroxytryptamine receptor - Gen alpha-amylase (α AMY) - Nhóm gen Cathepsin L 5
8. - Nhóm gen Cyclophilin - Nhóm gen Fatty acid-binding protein - Gen Fibrillarin - Gen Glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) - Nhóm gen mã hóa hormone tăng trưởng và nhân tố tăng trưởng giống insulin (growth hormoneand insulin-like growth factor genes) - Nhóm gen mã hóa Myostatin và nhân tố biệt hóa tăng trưởng (growth diferrentiation factor 8/11) - Gen mã hóa yếu tố truyền tín hiệu (signal transducer) và hoạt hóa phiên mã (activator of transcription) (STAT gene) - Gen mã hóa protein tiết có tính acid và giàu cysteine (secreted protein acidic and rich in cysteine gene) - Nhóm gen mã hóa yếu tố X liên kết translin (translin-associated factor X gene) 1.4.3. Các nhóm gen ứng viên trong quá trình lột xác - Nhóm gen ecdysteroid - Nhóm gen crustacean hyperglycaemic hormone - Các gen moult inhibiting hormone - Nhóm gen actin 1.4.4. Các gen phân giải và phát triển hệ cơ trong quá trình lột xác - Nhóm gen methyl farnesoate và farneosoic acid-o-methyltransferase - Nhóm gen mã hóa chuỗi nặng của myosin (Myosin heavy chain genes) - Nhóm gen tropomyosin và troponin - Các nhóm gen khác đóng vai trò quan trọng với sự phát triển hệ cơ 1.5. SƠ LƯỢC CÁC PHẦN MỀM LẮP RÁP SỬ DỤNG CHO CÔNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI 1.5.1. Phân loại các phần mềm lắp ráp 1.5.2. Các phần mềm lắp ráp cho hệ gen 1.5.3. Các phần mềm lắp ráp cho hệ phiên mã 6
9. CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Thời gian nghiên cứu: 40 tháng, từ 05/2014 đến tháng 09/2017 2.3. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Thu mẫu tôm sú (Penaeus monodon) tự nhiên từ vùng biển Việt Nam: Với mục tiêu giải trình tự và phân tích hệ gen phiên mã tôm sú tự nhiên thu từ vùng biển Việt Nam để xây dựng cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã tôm sú tham chiếu cho các nghiên cứu tiếp theo, tôm sú được thu ngẫu nhiên từ vùng biển Nghệ An – Hà Tĩnh theo phương thức: đặt ngư dân thu mẫu ngẫu nhiên. Mỗi lần thu được mẫu, ngư dân đánh dấu định vị, bảo quản tôm sống trên tàu và giao lại cho người nghiên cứu theo hợp đồng. Ba mươi (30) con tôm sú, thu nhận từ các vùng biển khác nhau của Nghệ An – Hà Tĩnh. - Mười (10) mẫu tôm tăng trưởng nhanh (EBV cao) và 10 mẫu tôm tăng trưởng chậm (EBV thấp) thuộc 5 gia đình thế hệ G1 đã được chọn lọc bằng di truyền số lượng qua 02 thê hệ G0 và G1, được Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 2 (RIA2) cung cấp. 2.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã (transcripotme) tôm sú (Penaeus monodon) thu từ tự nhiên. - Sàng lọc các gen giả định (unigene) liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú (Penaeus monodon). - Sàng lọc các SNPs liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú (Penaeus monodon) từ dữ liệu hệ gen phiên mã. - Sàng lọc các SNPs liên quan đến tính trạng tăng trưởng từ nhóm tôm sú gia hóa tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. 7
10. 2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để thực hiện luận án này, tiến trình nghiên cứu được thể hiện ở sơđồ hình 2.1, với các phương pháp được trình bày chi tiết dưới đây. Mẫu tôm sú tự Mẫu tôm sú gia nhiên hóa Tách chiết RNA tổng số Tách chiết và tinh sạch mRNA Chuẩn bị thư viện cDNA Giải trình tự hệ phiên mã bằng máy giải trình tự gen Sàng lọc các Sàng lọc các SNPs thế hệ mới Illumina Mi-Seq unigene liên quan liên quan đến tính đến tính trạng tăng trạng tăng trưởng trưởng Đánh giá và tiền xử lý dữ liệu đọc trình tự thô Unigene SNP Lắp ráp và chú giải chức Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã năng hệ gen phiên mã (transcriptome) tôm sú Penaeus monodon Hình 2. 1. Sơ đồ nghiên cứu - Phương pháp tách riêng rẽ các mô nghiên cứu - Tách chiết RNA tổng số từ mô tôm bằng Trizol - Tách và tinh sạch mRNA - Thiết lập thư viện cDNA - Phương pháp tiền xử lý dữ liệu - Phương pháp lắp ráp de novo hệ phiên mã - Phương pháp đánh giá chất lượng lắp ráp hệ phiên mã - Phương pháp chú giải chức năng của unigen trong hệ phiên mã - Phương pháp phân tích biểu hiện hệ phiên mã - Xác định các SNP trong ngân hàng unigene - Xác định các microsatellite trong ngân hàng unigene - Phát hiện SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng - Phương pháp định lượng Real-time PCR (qPCR) 8
11. CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. XÂY DỰNG BỘ CƠ SỞ DỮ LIỆU HỆ PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTOME) TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) 3.1.1. Sàng lọc mẫu tôm sạch bệnh Để chuẩn bị cho việc giải trình tự hệ phiên mã tôm sú Penaeus monodon, các mẫu tôm đều được xác định đảm bảo không nhiễm bất kỳ bệnh nào, để đánh giá mức độ biểu hiện thực của các gen, nhằm sàng lọc được các gen mang tính trạng tốt như tăng trưởng nhanh, sức sinh sản cao, kháng bệnh Kết quả cho thấy, cả 30 con tôm sú được thu thập tại vùng biển Việt Nam đều không mang các bệnh chủ yếu trên tôm (đốm trắng (WSSV), bệnh cời (MBV), taura (TSV), đầu vàng (YHV) và IHHNV), đảm bảo là nguồn nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2. Chuẩn bị thư viện cDNA Mẫu tôm sú sau khi thu thập tại vùng biển Việt Nam được kiểm tra một số mầm bệnh đối MBV, WSSV, IHHNV, YHV và TSV bằng kỹ thuật PCR. Với mục tiêu là sàng lọc được các gen giả định (unigene) và các chỉ thị phân tử (SNPs) liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở tôm sú, các gen có thể được biểu hiện ở các cơ quan khác nhau, trong đó thường được biểu hiện ở mô cơ và mô gan tụy (Jung et al., 2013). Vì vậy, đề tài tập trung nghiên cứu 4 mô tim, mô cơ, mô gan tụy và mô gốc mắt để có thể thu được kết quả phong phú, xây dựng cơ sở dữ liệu transcriptome tôm sú tham chiếu cho các nghiên cứu khác.Theo khuyến cáo của Illumina ( ep_kit_v2/input_req.html), RNA tổng số cần có nồng độ từ 0,1 – 4 µg, thấy rõ 2 phổ cho 18S và 28S trên kết quả đo bằng Bioanalyzervới kích thước tương ứng là 4,5 kb và 1,9 kb,chỉ số RIN≥ 8.Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, nghiên cứu đã thu nhận được mRNA từ các mô dao động từ 200 - 300 ng, nồng độ cDNA trung bình 95 nmol/l, đạt yêu cầu của Illumina, kích thước tập trung chủ yếu 9
12. 300-400 bp. Các mẫu này được đánh giá là đủ để giải trình tự bằng Illumina MiSeq platform. 3.1.3. Giải trình tự, đánh giá và tiền xử lý dữ liệu đọc trình tự thô Kết thúc quá trình giải trình tựđã thu được dưới dạng bộ dữ liệu gồm 8 file fastq khác nhau, mỗi mô có 2 file dữ liệu, trong đó file read_1 tương ứng với forward và file read_2 tương ứng với reverse, có dung lượng thể hiện trong bảng 3.3. Kết quả cho thấy, dữ liệu của mô tim có dung lượng lớn nhất (8,9 Gb), tiếp theo là mô gốc mắt (7,7 Gb), mô gan tụy (6,9 Gb) và mô cơ (5,6 Gb). So sánh kết quả thống kê dữ liệu trước tinh sạch và sau tinh sạch (Bảng 3.1) cho thấy 79,32% dữ liệu thô được giữ lại trong dữ liệu tinh sạch với độ dài dao động từ 70 đến 151 bp và dữ liệu trình tự đọc tinh sạch có toàn bộ các base có QC ≥ 30. Với kết quả đánh giá chất lượng và tinh sạch như trên thì dữ liệu trình tự đọc trong hệ phiên mã từ các mô tôm sú đủ điều kiện để thực hiện các phân tích tiếp theo. Bảng 3.1: Thống kê số lượng, độ dài trình tự đọc theo từng mô Trước tiền Sau tiền Phần trăm Mô Thông số xử lý xử lý tiền xử lý (%) Số lượng 22.531.716 18.113.880 Tim trình tự đọc 80,39 Độ dài 35-200 70-200 Số lượng 12.312.819 8.533.944 Cơ trình tự đọc 69,31 Độ dài 35-251 70-251 Số lượng 20.512.979 17.964.211 Gan tụy trình tự đọc 87,57 Độ dài 35-151 70-151 Số lượng 23.217.832 17.715.691 Gốc mắt trình tự đọc 76,30 Độ dài 35-151 70-151 Tổng số trình tự đọc 62.327.726 (79,32%) chất lượng cao 10
13. 3.1.4. Lắp ráp và chú giải chức năng hệ phiên mã Kết quả cho thấy, hệ phiên mã thô bao gồm 239.135 transcript, trải qua 2 bước loại bỏ những transcript lắp ráp kém chất lượng hay những transcript giống nhau, thu được hệ phiên mã sau xử lý với 69.089 unigene (độ dài nhỏ nhất là 201 bp, độ dài lớn nhất là 13.578 bp) với chỉ số N50 là 481 bp và độ dài trung bình là 447,89 bp, tỷ lệ % trình tự đọc tinh sạch ánh xạ ngược trở lại hệ phiên mã thô và hệ phiên mã tinh sạch lần lượt là 82,45 % và 79,02 %) (Bảng 3.2) Phân bố độ dài unigene trong hệ phiên mã tinh sạch được thể hiện như trong Hình 3.1, chiếm phần lớn là độ dài dưới 500 bp (79,6 % tổng số unigene). Từ 3 tiêu chí là N50, số lượng trình tự đọc sử dụng cho lắp ráp hệ phiên mã và phân bố độ dài unigene trong hệ phiên mã tinh sạch cho thấy chất lượng lắp ráp de novo là tương đối tốt. Bảng 3.2: Thống kê kết quả lắp ráp hệ phiên mã tinh sạchtừ các mô tôm sú Penaeus monodon Hệ phiên mã sau Các thông số của thống kê Hệ phiên mã thô xử lý Số lượng 239.135 transcript 69.089 unigene Kích thước hệ phiên mã (bp) 90.394.619 30.944.348 N50 (bp) 360 481 Độ dài trung bình các trình tự (bp) 378,01 447,89 Số đoạn trình tự đọc tinh sạch ánh 82,45 79,02 xạ ngược trở lại hệ phiên mã (%) Độ dài trình tự ngắn nhất (bp) 201 201 Độ dài trình tự dài nhất (bp) 13.578 13.578 11
14. Hình 3.1: Phân bố độ dài toàn bộ unigene trên hệ phiên mã tinh sạch Quá trình chú giải chức năng bằng BLASTXđã được thực hiện trên các cơ sở dữ liệu như NR-NCBI, Swiss-Prot, KEGG, COG và Gene Ontology. T ổng cộng 12.321 unigene (chiếm 17,83% tổng số unigene) được chú giải chức năng trên cả 5 ngân hàng cơ sở dữ liệu (Bảng 3.3), như vậy còn lại đến 56.768 unigene không tìm thấy kết quả trên bất kỳ cơ sở dữ liệu chung nào của thế giới. Bảng 3.3: Thống kê kết quả chú giải chức năng tôm sú P.monodon Cơ sở dữ liệu Số lượng unigene NR-NCBI 9.068 Swiss-Prot 7.466 KEGG 3.125 COG 7.101 GO 5.686 Tổng số unigene được chú giải 12.321 Tổng số unigene 69.089 Tỷ lệ phần trăm chú giải chức năng 17,83% Trong Bảng 3.3, số lượng unigene được chú giải trên ngân hàng NR-NCBI là 9.068 unigene và trên ngân hàng Swiss-Prot là 7.466 unigene. Phân bố E- value của các top-hit trong kết quả chú giải chức năng NR-NCBI cho thấy 58,81% có giá trị trong khoảng 0 –> 1.0e-30 và 43,71% số lượng trình tự 12
15. unigene có điểm số E-value cao và tin cậy (E-value < 10-45) (Hình 3.2A). Kết quả phân bố E-value phản ánh độ giá trị và tin tưởng của kết quả lắp ráp de novo hệ phiên mã. Bên cạnh đó, phần lớn những trình tự unigene được chú giải trên NR-NCBI (71,86%) có độ tương đồng (similarity) lớn hớn 60%, và 24,05% số lượng trình tự có độ tương đồng lớn hơn 80% (Hình 3.2B). Hình 3.2: Thống kê kết quả chú giải BLASTX trên cơ sở dữ liệu NR-NCBI, A: Thống kê phân bố giá trị E-value, B: Thống kê phân bố độ tương đồng, C: Thống kê phân bố loài trong bộ kết quả tin cậy nhất (E-value thấp nhất) Sau khi tìm kiếm tương đồng bằng BLASTX, so sánh trình tự unigen sau khi lắp ráp xuất hiện trong những loài khác trên cơ sở dữ liệu và thống kê phân bố loài trong bộ kết quả đáng tin cậy nhất (E-value thấp nhất). Kết quả cho thấy có 1.071 (11,81%) unigenes cho kết quả chú giải tương đồng với loài Zootermopsis nevadensis, trong đó 807 (8,90%), 373 (4,11%), 354 (3,90%), 256 13
16. (2,82%), 214 (2,36%), 201 (2,22%) unigene cho kết quả tương đồng với loài Daphnia pulex, Stegodyphus mimosarum, Tribolium castaneum, Penaeus monodon, Litopenaeus vannamei,và Pediculus humanus (Hình 3.2C). Dựa trên độ tương đồng của trình tự unigene, phân tích Gene Ontology đã phân loại chức năng của 5.686 (8,23%) unigene trong hệ phiên mã tôm sú vào 58 nhóm chức năng khác nhau (Hình 3.3). Trong nhóm Biological Processes, cellular process (3.363, 59,15%), metabolic process (3.264, 57,40%), biological regulation (1.597, 28,09%), pigmentation (1.429, 25,13%), và localization (1.012, 17,80%) là những nhóm chức năng chiếm ưu thế. Trong nhóm Cellular Component, cell (3.163, 55,63%), organelle (2.076, 36,51%) và macromolecular complex (1.243, 21,86%) lại là những nhóm chức năng điển hình. Và cuối cùng ở trong nhóm Molecular Function, catalytic activity (2.776, 48,82%), binding (2.860, 50,30%), và transporter activity (376, 6,61%) là những nhóm chức năng nổi bật. Những thông tin chú giải trên ngân hàng Gene Ontology này là những nguồn dữ liệu quan trọng liên quan đến chức năng của unigene được lắp ráp bằng phương pháp de novo của tôm sú. Hình 3.3: Thống kê thông tin chú giải chức năng trên ngân hàng Gene Ontology. 14
17. Hình 3.4: Thống kê thông tin chú giải chức năng trên ngân hàng COG Ngân hàng dữ liệu chức năng COG được tạo ra và phát triển nhằm mục đích phân loại protein dựa theo hệ thống phát sinh loài của các hệ gen đã được giải mã hoàn chỉnh. Trong tổng số 69.089 unigene, đã chú giải được 7.101 (10,28%) unigene và phân loại chúng vào 25 nhóm chức năng khác nhau của ngân hàng COG (Hình 3.4). Tỷ lệ chú giải trên ngân hàng COG trong nghiên cứu này là thấp hơn so với tỷ lệ chú giải ngân hàng COG trong 2 nghiên cứu về tôm Litopenaeus vannamei và Fenneropenaeus chinensis. Trong số các trình tự được ánh xạ vào ngân hàng COG thì nhóm ribosomal structure and biogenesis là nhóm chứa nhiều trình tự nhất (2.644, 37,23%), theo sau là nhóm general function prediction only (1.005, 14,15%), carbohydrate transport and metabolism (454, 6,39%), post-translational modification, protein turnover and chaperones (453, 6,39%), replication, recombination and repair (387, 5,45%), transcription (357, 5,03%) và amino acid transport and metabolism (334, 4,70%). Thêm nữa, 313 unigenes được ánh xạ vào nhóm ‘unknown function’. Nhóm nuclear structure và extracellular structure với số lượng unigene là 2 15
18. (0,03%) và 3 (0,04%) unigenes; đây là 2 nhóm có số lượng unigene ít nhất (Hình 3.4). Ngân hàng KEGG là ngân hàng chứa toàn bộ các sơ đồ con đường trao đổi chất theo hệ thống lớn nhất hiện nay. Tổng cộng đã có 3.125 unigene của tôm sú được chú giải trên ngân hàng KEGG và được phân loại vào 341 con đường trao đổi chất khác nhau. Con đường trao đổi chất có số lượng unigene nhiều nhất là metabolic pathways (ko01100; 509 unigenes, 16,29%), theo sau là biosynthesis of secondary metabolites (ko01110; 151 members, 4,83%), biosynthesis of antibiotics (ko01130; 114 members, 3,65%), ribosomes (ko03010; 111 members, 3,55%), Huntington’s disease (ko05016; 100 members, 3,20%), microbial metabolism in diverse environments (ko01120; 96 members, 3,07%), oxidative phosphorylation (ko00190; 93 members, 2,98%) và the spliceosome (ko03040; 88 members, 2,82%) (Hình 3.5). Hình 3.5: Thống kê 10 con đường chuyển hóa có số lượng unigene tham gia nhiều nhất 16
19. 3.1.5. Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã(transcriptome) tôm sú (Penaeus monodon) Sau khi sàng lọc dữ liệu để khai phá SNP với những tham số đã nêu trong phần phương pháp, nghiên cứu đã xác định được 42.663 chỉ thị phân tử SNP trong tổng số 21.303 unigene. Trong đó, số lượng SNP được tìm thấy trong mô cơ chiếm tỷ lệ cao nhất (28.171, 66,03%), tiếp theo là mô tim (17.395, 40,77%), mô gốc mắt (9.144, 21,43%) và mô gan tụy (6.577, 15,42%). Hình 3.6: Số lượng SNP ở các mô Thống kê chi tiết kết quả SNP cho thấy số lượng SNP dạng transition chiếm phần lớn, chi tiết trên các mô được thể hiện ở hình 3.6. Sự biến đổi SNP transition (Purin thành Purin, Pyrimidine thành Pyrimidine) chiếm tỷ lệ lớn (A G:32,32%, C T: 29,84%), biến đổi transversion (Purin thành Pyrimidine và ngược lại) (A C, A T, C G, G T) chiếm tỷ lệ thấp hơn từ 6,64% - 9,46%. Biến đổi SNP transition cao hơn nhiều lần so với biến đổi tranversion, và ở trong tự nhiên cũng luôn xảy ra hiện tượng này bởi vì các biến đổi transition (vòng purin) có sự tương đồng về mã protein và đây chính là kết quả của việc bảo tồn cấu trúc protein. 17
20. Hình 3.7: Sự phân bố SNP trong các mô từ bộ cơ sở dữ liệu transcriptome Motif lặp xuất hiện nhiều nhất trong nhóm dinucleotide là AG/CT (3.551, 27,81%) và AC/GT (2.805, 21,97%), theo sau là AT/AT (1.556, 12,19%) và CG/CG (29, 0,23%) (Bảng 3.4). Motif lặp xuất hiện nhiều nhất trong nhóm trinucleotide là AAT/ATT (929, 7,28%), AGG/CCT (671, 5,26%), AAG/CTT (640, 5,01%), và AAC/GTT (540, 4,23%) (Bảng 3.5). Sử dụng công cụ MISA được viết bằng ngôn ngữ Perl, đã tiến hành sàng lọc các chỉ thị phân tử microsatellite có trong unigene của tôm sú vừa lắp ráp. Kết quả thu được như sau: từ 69.089 unigene đã được lắp ráp de novo thu được 11.173 (16,17%) unigene chứa 12.768 chỉ thị phân tử microsatellite tiềm năng, trong đó có 1.313 unigene có nhiều hơn một SSR trong trình tự và 769 SSR nằm ở dạng phức. Tỷ lệ SSR trung bình trong tôm sú Việt Nam là 18,48% và cứ một SSR xuất hiện sau mỗi 2,423 kb. Dinucleotide SSRs (7.941, 62,19%) chiếm số lượng nhiều nhất, theo sau là trinucleotide SSRs (3.841, 30,08%), trong khi đó tetranucleotide (567, 4,44%), pentanucleotide (334, 2,62%), và hexanucleotide (85, 0,67%) có số lượng không nhiều (Bảng 3.4). 18
21. Bảng 3.4: Thống kê kết quả các microsatellite trong hệ phiên mã tôm sú P.monodon. Chỉ số thống kê Số lượng Tổng số unigene được sàng lọc 69.089 Kích thước hệ phiên mã (bp) 30.944.348 Tổng số SSR tìm thấy trong hệ phiên mã 12.768 Số lượng trình tự unigene chứa SSR 11.173 Số lượng trình tự unigene chứa nhiều hơn một SSR 1.313 Số lượng SSR ở dạng phức 769 Số lượng SSR dạng dinucleotide 7.941 Số lượng SSR dạng trinucleotide 3.841 Số lượng SSR dạng tetranucleotide 567 Số lượng SSR dạng pentanucleotide 334 Số lượng SSR dạng hexanucleotide 85 Bảng 3.5: Thống kê miền lặp củacác microsatellite trong hệ phiên mã tôm sú. Tổng Miền lặp 5 6 7 8 9 10 >10 % số AC/GT - 971 652 500 420 218 44 2,805 21,97 AG/CT - 1,336 807 588 540 238 42 3,551 27,81 AT/AT - 584 288 247 244 167 26 1,556 12,19 CG/CG - 16 7 2 2 2 0 29 0,23 AAC/GTT 358 134 45 2 1 540 4,23 AAG/CTT 410 182 46 1 1 640 5,01 AAT/ATT 530 310 89 0 929 7,28 ACC/GGT 110 47 16 3 0 176 1,38 ACG/CGT 31 21 14 3 0 69 0,54 ACT/AGT 49 35 23 0 107 0,84 AGC/CTG 110 57 40 2 1 0 210 1,64 AGG/CCT 388 195 83 5 0 671 5,26 ATC/ATG 182 78 37 0 297 2,33 CCG/CGG 97 62 39 3 420 218 1 202 1,58 19
22. 3.2. SÀNG LỌC CÁC GEN GIẢ ĐỊNH(UNIGENE) LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) 3.2.1. Sàng lọc các unigene Với 4 cơ sở dữ liệu từ 4 mô (tim, gan tụy, cơ và gốc mắt), nhóm nghiên cứu đã tìm ra được 165 unigene phân bố trong 24 nhóm gen/gen giả định liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú, trong đó nhóm có số lượng unigene nhiều nhất là myosin heavy chain (42 unigenes) và nhóm có số lượng unigene ít nhất với 1 unigene là những nhóm: (GAPDH), myostatin and growth differentiation factor 8/11, signal transducer and activator of transcription, and TRAX. Mười nhóm gen đã được nghiên cứu trước đó đóng vai trò trong sự tăng trưởng của loài giáp xác được tìm thấy trong dữ liệu transcriptome của nghiên cứu này, gồm 5-Hydroxytryptamine receptor, Cathepsin L, Myostatin and growth differentiation factor 8/11, Cyclophilin, Fibrillarin, Secreted protein acidic and rich in cysteine(SPARC), Alpha-amylase, Fatty acid binding protein, Glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase, Growth hormone and insulin-like growth factor, Signal transducer and activator of transcription, and Translin- associated factor X (TRAX). Tám nhóm gen liên quan đến sự tạo cơ trong quá trình lột xác gồm Actin, Profilin, Myosin, Alpha skeletal muscle, Calponin/calponin transgelin, Tropomyosin, Muscle lim protein and Lim domain binding. Trong quá trình lột xác, dự tái tạo mô cơ và tích lũy năng lượng gồm glycogen và lipid được làm giàu trong huyết tương và dạ dày. Bốn nhóm gen liên quan đến quá trình lột xác của động vật giáp xác như Crustacean hyperglycemic hormone (CHH) Molt-inhibiting hormone (MIH), Methyl farnesoate and farnesoic acid O-methyltransferase, Ecdysteroid. 3.2.2. Phân tích sự biểu hiện khác nhau của hệ gen phiên mã tôm sú (Penaeus monodon) So sánh hệ phiên mã của 4 mô nhận thấy rằng 14.229 gen được biểu hiện khác nhau, trong đó chỉ 7.682 gen có thể được chú giải. Những gen còn lại có 20
23. thể là những gen mới hoặc chưa có trong ngân hàng dữ liệu phân tích. Gen được biểu hiện khác biệt lớn nhất qua việc so sánh này là giữa mô cơ và mô gốc mắt (7.902 unigene). Bảng 3.6:Sự biểu hiện của hệ phiên mã tôm sú Muscle Heart Hepatopancreas Eyestalk up- up- up-regulated up- regulated regulated regulated Muscle 3,836 1,408 7,381 down-regulated Heart 2,019 1,286 1,718 down-regulated Hepatopancreas 3,327 1,531 2,158 down-regulated Eyestalk 521 2,229 1,534 down-regulated Mức độ biểu hiện được thể hiện qua màu sắc thể hiện trong phần mềm phân tích, trong đó màu đỏ thể hiện sự biểu hiện mạnh nhất. Trong 165 unigene liên quan đến tính trạng tăng trưởng được xác định thì có 125 unigene được biểu hiện. Sử dụng phần mềm Heatmap đánh giá mức độ biểu hiện của 125 unigene cho thấy, gen beta – actin được biểu hiện mạnh nhất ở mô tim và mô gan tụy (màu đỏ), tuy nhiên, mức độ biểu hiện trung bình thể hiện nhiều nhất ở mô gốc mắt (khoảng 100 unigene), tiếp theo là mô tim, mô cơ và cuối cùng là mô gan tụy. Để đánh giá kết quả phân tích mức độ biểu hiện của các unigene trên, nghiên cứuđã chọn 4 unigene mã hóa cho alpha-amylase, cathepsin L, ecdysteroid and myosin-heavy chain để thực hiện thí nghiệm qPCR. Kết quả hình 3.9thấy rằng, sự biểu hiện của hệ phiên mã và qPCR là phù hợp. Unigene comp200235_c1_seq1, comp123524_c1_seq2 và comp93369_c1_seq1 được chú giải tương ứng là Alpha-amylase, Cathepsin L và Ecdysteroid được biểu hiện cao trong mô gan tụy, tiếp theo là mô cơ, mô tim và mô gốc mắt (chỉ có comp200235_c1_seq1 được biểu hiện). Unigen comp123891_c2_seq2 được chú 21
24. giải là Myosin-heavy chainbiểu hiện cao trong mô cơ, sau là mô gốc mắt, mô tim và hầu như không được biểu hiện ở mô gan tụy. 1 2 3 4 Hình 3.8. Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của 125 unigene liên quan đến tính trạng tăng trưởng trên từng mô. (1. Mô tim; 2. Mô cơ; 3. Mô gan tụy; 4. Mô gốc mắt). 22
25. Hình 3. 9: Đánh giá mức độ biểu hiện của unigen bằng qPCR 3.3. SÀNG LỌC CÁC SNP LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) TỪ DỮ LIỆU HỆ PHIÊN MÃ SNPs là chỉ thị phân tử tiềm năng, được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu liên quan đến bản đồ hệ gen bởi sự phân bố rộng và tính đa hình cao. SNPs phù hợp với chỉ thị phân tử tiềm năng với loài chưa biết, không có trình tự gen được chú giải. Từ cơ sở dữ liệu thiết lập được, trong tổng số 42.663 SNP tìm thấy đã sàng lọc được 484 SNP (1,13%) liên quan tới tính trạng tăng trưởng. Số lượng SNP này thuộc 302 unigene đã chú giải liên quan tới tính tăng trưởng. Trong số các nhóm gen ứng viên được chú giải, Myosin heavy chain (MHC), Growth hormone and insulin-like growth factor và Secreted protein acidic and rich in cysteine chiếm tỷ lệ cao nhất. Myosin heavy chain được biểu hiện ở khắp nơi trong tế bào sinh vật nhân chuẩn và là protein quan trọng trong cơ xương. Mức độ biểu hiện gen myosin cung cấp chỉ thị phân tử tiềm năng cho sự phát triển của cá thể và kết quả này cũng được tìm thấy ở Atlantic pink shrimp Farfantepenaeus paulensis. 23
26. 3.4. SÀNG LỌC CÁC SNP LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG TỪ NHÓM TÔM SÚ GIA HÓA TĂNG TRƯỞNG NHANH VÀ TĂNG TRƯỞNG CHẬM Đã xác định được 2650 SNP, trong đó có 1832 SNP chỉ xuất hiện ở nhóm lớn nhanh và 64 SNP chỉ xuất hiện ở nhóm lớn chậm, 754 SNP xuất hiện chung ở cả 2 nhóm. Hình 3.10: Số lượng SNP trong nhóm tôm tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm. Với số lượng dữ liệu còn hạn chế, nghiên cứu vẫn đang tiếp tục thực hiện lại thí nghiệm với mẫu tôm thu nhận mới, được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 2. Đây là hướng nghiên cứu mới đối với Việt Nam, do đó những khó khăn ban đầu sẽ là kinh nghiệm cho các nghiên cứu tiếp theo. 24
27. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Đã xây dựng được bộ cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã (transcriptome) tôm sú Penaeus monodon ( dựa trên cơ sở dữ liệu của 4 mô (mô cơ, mô tim, mô gan tụy và mô gốc mắt), với dung lượng hệ phiên mã là 30,9 Mb và chỉ số N50 là 481 bp. 2. Đã lắp ráp de novo và chú giải được 12.321/69.089 unigene trên 5 ngân hàng cơ sở dữ liệu gen thế giới, trong đó có 165 unigene tiềm năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú. 3. Sử dụng phần mềm Heatmap để đánh giá mức độ biểu hiện của 165 unigene tiềm năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú, chỉ có 125 gen biểu hiện, trong đó số lượng gen có mức độ biểu hiện mạnh nhất là ở mô gốc mắt, sau đó là mô tim, tiếp theo là mô cơ và cuối cùng là mô gan tụy. Gen beta-actin luôn được biểu hiện mạnh nhất ở mô tim. 4. Đã xác định được 42.663 SNP nằm trong 21.303 unigene, với phần lớn các SNP nằm ở dạng transition, trong đó 484 SNP có mặt trong các gen tiềm năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng của tôm sú. 5. Đã xác định được 12.768 microsatellite trong 11.173 unigene. Tỷ lệ SSR trung bình là 18,48% và sau 2,423 kb xuất hiện một SSR. Dinucleotide SSR chiếm số lượng nhiều nhất (7.941, 62,19%). 6. Đã xác định được 2650 SNP, trong đó có 1832 SNP xuất hiện ở nhóm lớn nhanh và 64 SNP xuất hiện ở nhóm lớn chậm, 754 SNP xuất hiện chung ở cả hai nhóm. KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu và giải mã hệ phiên mã trên các mô khác nhau của tôm sú gia hóa các thế hệ tiếp theo (G2, G3 và G4). 2. Tiếp tục nghiên cứu và tìm các chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở các thế hệ gia hóa khác nhau để bổ sung vào bộ chỉ thị phân tử liên quan tới tính trạng tăng trưởng nhằm phát triển các SNP array dùng trong phân tích tính trạng tăng trưởng bằng công nghệ “Nghiên cứu tương quan toàn bộ hệ gen”-Genome wide association study (GWAS). 25
28. DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ (1) Cuong Nguyen, Thu Giang Nguyen, Lam Van Nguyen, Huy Quang Pham, Trieu Hai Nguyen, Hoa Thi Pham, Hoa Thi Nguyen, Thu Thi Ha, Tung Huy Dau, Hien Thi Vu, Duy Dinh Nguyen, Nhung Tuyet Thi Nguyen, Ninh Huu Nguyen, Quyen Van Dong, Ha Hoang Chu, Khang Dinh Duy(2016) De novo assembly and transcriptome characterzation of major growth-related genes in various tissues of Penaeus monodon, Aquaculture 464: 545–553. (2) Nguyễn Giang Thu, Nguyễn Cường, Nguyễn Hải Triều, Phạm Thị Hoa, Nguyễn Thị Hoa, Hà Thị Thu, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Phạm Quang Huy, Nguyễn Văn Lâm, Nguyễn Hữu Ninh, Nguyễn Lê Anh, Trần Quốc Quân, Cao Tiến Dũng Đồng Văn Quyền, Chu Hoàng Hà, Đinh Duy Kháng (2015) Giải trình tự và lắp ráp de Novo hệ phiên mã tôm sú (Penaeus monodon), Tạp chí Công nghệ sinh học, 13(2A): 417-422. (3) Nguyễn Giang Thu, Phạm Thị Hoa, Nguyễn Hải Triều, Nguyễn Thị Hoa, Hà Thị Thu, Đậu Huy Tùng, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Đồng Văn Quyền, Đinh Duy Kháng (2015) Sử dụng kỹ thuật Nested-PCR đánh giá mức độ nhiễm WSSV và MBV trên các mẫu tôm sú thu nhận từ một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, Tạp chí Công nghệ sinh học, 13(2A): 423-428. (4) Nguyễn Hải Bằng, Phạm Quang Huy, Trần Xuân Thạch, Nguyễn Giang Thu, Nguyễn Thị Minh Thanh, Nguyễn Thị Hoa, Hà Thị Thu, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Cường, Nguyễn Hữu Ninh, Đồng Văn Quyền, Chu Hoàng Hà, Đinh Duy Kháng (2017) Phân tích hệ phiên mã và sàng lọc một số gen giả định liên quan tới tính trạng tăng trưởng ở tôm sú (Penaeus monodon), Tạp chí Công nghệ sinh học, 15(2): 1-10. 26