Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại..

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại..

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÊ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ NHÂN GIỐNG LOÀI THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (Huperzia serrata (THUNB. EX MURRAY) TREVIS) THU TẠI LÀO CAI VÀ LÂM ĐỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2021
2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÊ THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ NHÂN GIỐNG LOÀI THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (Huperzia serrata (THUNB. EX MURRAY) TREVIS) THU TẠI LÀO CAI VÀ LÂM ĐỒNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Lê Thị Bích Thủy 2. GS. TS. Nguyễn Đức Thành Hà Nội – 2021
3. i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với một số cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành, các hội nghị trong nước và quốc tế với sự đồng ý sử dụng số liệu của các đồng tác giả. Những kết quả còn lại trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh Lê Thị Lan Anh
4. ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất của mình đến GS. TS. Nguyễn Đức Thành và TS. Lê Thị Bích Thủy, phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người thầy đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi, hướng dẫn khoa học và định hướng nghiên cứu cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy, Cô tại Viện Công nghệ sinh học đã giảng dạy, cung cấp kiến thức mới để tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các nội dung trong chương trình đào tạo. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Ngô Văn Vụ - Hiệu trưởng trường Cao Đẳng Sư Phạm Hà Tây, các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô trong các Khoa, Phòng, Ban nơi tôi công tác đã tạo mọi điều kiện tốt nhất, hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành nhiệm vụ chuyên môn tại trường trong suốt thời gian tôi đi học. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công Nghệ sinh học, tập thể các cán bộ thuộc Vườn Quốc gia Hoàng Liên và Viện Sinh học Tây Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, hỗ trợ, giúp đỡ và chia sẻ kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo ở Viện Công nghệ sinh học và Chuyên viên Nguyễn Thị Minh Tâm ở Học viện Khoa học và Công nghệ đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành các hồ sơ trong quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong khuôn khổ đề tài Quỹ gen - Bộ Khoa học và Công nghệ: “Khai thác và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trev.) tại Sapa và Đà Lạt”. Cuối cùng, với tất cả lòng biết ơn tôi xin gửi đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn tin tưởng, thông cảm, quan tâm, hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian qua để tôi có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập và công tác chuyên môn. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Nghiên cứu sinh Lê Thị Lan Anh
5. iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài 2 2.1. Mục tiêu nghiên cứu 2 2.2. Nội dung nghiên cứu 2 3. Những đóng góp mới của đề tài 3 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 4.1. Ý nghĩa khoa học 3 4.2. Ý nghĩa thực tiễn 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Đặc điểm loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) 5 1.1.1. Phân loại 5 1.1.2. Đặc điểm hình thái học của Thạch tùng răng cưa 6 1.1.3. Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch tùng răng cưa 7 1.1.4. Đặc điểm sinh sản 10 1.1.5. Đặc điểm hóa sinh 11 1.1.6. Các nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Thạch tùng răng cưa 14 1.2. Huperzine A, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa 15 1.2.1. Các nguồn tự nhiên có chứa HupA 15 1.2.2. Thành phần, cấu tạo và tính chất vật lý, hóa học của HupA 18 1.2.3. Các nghiên cứu về tách chiết và xác định hàm lượng HupA 20 1.2.4. Vai trò của HupA trong y học 22 1.2.5. Dược động học của HupA 23 1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới và ở Việt Nam 25
6. iv 1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới 25 1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam 30 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Vật liệu nghiên cứu 31 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 31 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 32 2.1.3. Môi trường nuôi cấy 33 2.1.4. Thời gian và địa điểm thí nghiệm 33 2.2. Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa 34 2.2.2. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa 39 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46 3.1. Đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa 46 3.1.1. Đánh giá đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cưa 46 3.1.2. Đánh giá đặc điểm vi phẫu Thạch tùng răng cưa 49 3.1.3. Đánh giá đặc điểm sinh thái học của Thạch tùng răng cưa 51 3.1.4. Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của Thạch tùng răng cưa bằng chỉ thị phân tử RAPD 53 3.1.5. Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng. 59 3.2. Nhân giống Thạch tùng răng cưa 68 3.2.1. Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng giâm hom thân 68 3.2.2. Nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy mô 88 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 107 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ 109 TÀI LIỆU THAM KHẢO 110 PHỤ LỤC
7. v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACh Acetylcholine Axetylcholin AChE Acetylcholinesterase Enzym acetylcholinesteraza AD Alzheimer’s disease Bệnh Alzheimer AFLP Amplified fragment length Đa hình chiều dài của đoạn polymorphism được khuếch đại. BA 6-benzyladenin 6-benzyladenin BuChE Butyrylcholinesterase Enzym butyrylcholinesteraza CTAB Cetyltrimethyl Xetyltrimethyl amoniumbromit amoniumbromide CYP Cytochrome P450 Xytochrom P450 DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic dNTP Deoxyribonucleoside Deoxyribonucleosit triphosphat triphosphate EDTA Ethylene diamin tetra acetate Ethylene diamin tetra axetat HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography HupA Huperzine A Huperzin A H. serrata Huperzia serrata Thạch tùng răng cưa IAA β-indole acetic acid Axit β-indole acetic IBA Indole-3-butyric acid Axit indole-3-butyric IC50 The half maximal inhibitory Nồng độ ức chế tối đa một nửa concentration Kb Kilobase Kilo bazơ LC-MS Liquid chromatography-mass Sắc ký lỏng khối phổ spectrometry MS Murashige and Skoog medium Môi trường Murashige và Skoog NAA Naphthaleneacetic acid Axit naphthaleneacetic
8. vi Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymeraza Phy Physostigmine Physostigmin RAPD Random amplified Đa hình phân đoạn DNA được polymorphic DNA nhân bản ngẫu nhiên Rf Rentention factor Hệ số di chuyển RNase Ribonuclease Enzim ribonucleaza SD Standard deviation Độ lệch tiêu chuẩn TE Tris EDTA Tris EDTA THA Tetrahydroaminoacridine Tetrahydroaminoacridin TLC Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng UPLC - MS Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu áp ghép đầu chromatography - mass dò khối phổ Spectrometry UPLC-PDA Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu áp với đầu dò chromatography- photodiode PDA array UPLC-Q/TOF/ Ultra performance liquid Sắc ký lỏng siêu áp/ phương MS chromatography/ quadrupole pháp quang phổi khối thời gian time of flight/ mass chạy tứ cực spectrometry UV Ultra violet Tia tử ngoại
9. vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Địa điểm lấy mẫu sử dụng trong nghiên cứu 32 Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 16 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu 36 Bảng 2.3. Các môi trường nuôi cấy mô sẹo 43 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu ở Lâm Đồng và Lào Cai 4 6 Bảng 3.2. Tổng hợp kết quả phân tích 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với 16 mồi RAPD 55 Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa . 56 Bảng 3.4. Kết quả xác định hàm lượng HupA từ toàn bộ cây của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa thu hái vào tháng 9 (mùa thu). 64 Bảng 3.5. Hàm lượng HupA của rễ, thân và lá Thạch tùng răng cưa . 66 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chiều dài hom thân đến sự sinh trưởng của cây con Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai sau 4 tháng giâm hom 69 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến sự sinh trưởng của cây con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm tại Lâm Đồng và Lào Cai . 71 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của cây con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm hom thân tại Lâm Đồng 74 Bảng 3.9. Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của cây con Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng giâm hom thân tại Lào Cai . 76 Bảng 3.10. So sánh hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát triển của hom thân Thạch tùng răng cưa ở hai vùng nghiên cứu 7 8 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của độ sâu hom thân giâm đến sinh trưởng cây con Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai sau 4 tháng . 80 Bảng 3.12. So sánh hiệu quả giâm hom thân Thạch tùng răng cưa tại Lào Cai và Lâm Đồng sau 4 tháng 81 Bảng 3.13. Sự sinh trưởng của cây con sau 2 tháng bón phân tại Lâm Đồng . 83 Bảng 3.14. Sự tăng trưởng của cây con trong bầu ươm ở các thời gian khác nhau . 84
10. viii Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời gian ra ngôi đến sinh trưởng cây con Thạch tùng răng cưa . 85 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của các chất khử trùng đến mẫu Thạch tùng răng cưa sau 30 ngày nuôi cấy . 89 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của môi trường khoáng đến nuôi cấy chồi Thạch tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy 91 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của BA đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy 9 3 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của Kinetin đến tạo cụm chồi gốc Thạch tùng răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy 9 4 Bảng 3.20. So sánh hiệu quả của BA và kinetin đến tạo cụm chồi Thạch tùng răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy 9 5 Bảng 3.21. Ảnh hưởng của IBA đến sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy . 9 6 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của α - NAA đến sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy. 9 7 Bảng 3.23. So sánh hiệu qủa của α - NAA và IBA đến sự phát triển rễ sau 60 ngày nuôi cấy 97 Bảng 3.24. Kết quả nuôi cấy mô sẹo Thạch tùng răng cưa sau 4 tháng 100 Bảng 3.25. Tạo đa chồi mô sẹo Thạch tùng răng cưa trên môi trường ¼ MS + 1 mg/l kinetin sau 4 tháng 10 2
11. ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây Thạch tùng răng cưa H. serrata 6 Hình 1.2. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa trên thế giới . 7 Hình 1.3. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa tại Việt Nam 8 Hình 1.4. Hình thái của cây mầm ở các độ tuổi khác nhau 10 Hình 1.5. Đại diện cho 4 nhóm hợp chất chính của lycopodium alkaloid thu từ loài Thạch tùng răng cưa 1 2 Hình 1.6. Các hợp chất khác từ loài Thạch tùng răng cưa . 1 3 Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của hai hợp chất HSE-1 (a) và HSE-2 (b) . 1 3 Hình 1.8. Con đường sinh tổng hợp của HupA 18 Hình 1.9. Các đồng phân quang học của HupA 1. 8 Hình 1.10. Cấu trúc tương tự của HupA và acetylcholine (ACh) 1 9 Hình 1.11. Cấu trúc phân tử HupA 1 9 Hình 1.12. Các tương tác chính giữa AchE và phân tử HupA . 20 Hình 2.1. Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Lào Cai 3 1 Hình 2.2. Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Lâm Đồng . 3 1 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 3 4 Hình 3.1. Hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng . 47 Hình 3.2. Một số hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai 47 Hình 3.3. Cây Thạch tùng răng cưa trong rừng tại Lâm Đồng 48 Hình 3.4. Đế mầm trên cây Thạch tùng răng cưa mẹ 49 Hình 3.5. Vi phẫu thân Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai . 50 Hình 3.6. Vi phẫu thân Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng 50 Hình 3.7. Vi phẫu lá Thạch tùng răng cưa 51 Hình 3.8. Thạch tùng răng cưa trên bờ suối tại Nam Ban, Lâm Đồng 51 Hình 3.9. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC5. 5 4 Hình 3.10. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPC13 54 Hình 3.11. Sản phẩm PCR của DNA genome 8 mẫu Thạch tùng răng cưa với mồi OPB13 54 Hình 3.12. Sơ đồ quan hệ di truyền của 8 mẫu Thạch tùng răng cưa 56 Hình 3.13. Hình ảnh chạy TLC HupA từ 8 mẫu Thạch tùng răng cưa . 60 Hình 3.14. Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại DL1 61
12. x Hình 3.15. Hình ảnh chạy TLC HupA từ Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai 62 Hình 3.16. Sắc ký đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết lá Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai 6 2 Hình 3.17. Sắc kí đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết lá cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng 63 Hình 3.18. Phổ ESI - MS Positive và peak ion phân tử 243,0 63 Hình 3.19. Cây con Thạch tùng răng cưa trong vườn ươm . 81 Hình 3.20. Cây Thạch tùng răng cưa ngoài vườn ươm tại Lâm Đồng . 85 Hình 3.21. Sơ đồ một số khâu cơ bản trong quy trình nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng giâm hom thân 86 Hình 3.22. Mẫu Thạch tùng răng cưa sau 30 ngày nuôi cấy in vitro trên môi trường MS . 90 Hình 3.23. Chồi Thạch tùng răng cưa nuôi cấy trên môi trường ¼ MS 9 2 Hình 3.24. Cụm chồi Thạch tùng răng cưa nuôi cấy trên môi trường ¼ MS có bổ sung 1 mg/l kinetin . 9 5 Hình 3.25. Thạch tùng răng cưa sau 60 ngày nuôi cấy trong môi trường 1/4 MS có bổ sung 1 mg/l IBA 9 8 Hình 3.26. Cây Thạch tùng răng cưa sau 120 ngày nuôi cấy trong nhà kính . 98 Hình 3.27. Nuôi cấy mô sẹo đỉnh chồi Thạch tùng răng cưa trên môi trường ¼ MS + 0,015 mg/l IBA + 0,3 mg/l kinetin + 3 mg/l glutamin 101 Hình 3.28. Đa chồi hình thành từ mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường ¼ MS 1 01 Hình 3.29. Cụm chồi Thạch tùng răng cưa được hình thành từ mô sẹo sau 4 tháng nuôi cấy 103 Hình 3.30. Cây Thạch tùng răng cưa in vitro nuôi cấy trên môi trường 1/4 MS + 1 mg/l IBA . 103 Hình 3.31. Sắc ký đồ HPLC (UV 310 nm) phát hiện HupA trong dịch chiết toàn bộ cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô năm 2019 10. 5
13. 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, trước những tác động lớn của biến đổi khí hậu, dịch bệnh và sự khai thác quá mức của con người, vấn đề nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen các loài cây trồng nói chung, trong đó có các loại cây dược liệu đang là vấn đề được khoa học và xã hội quan tâm. Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) là loại cây dược liệu quý, thuộc danh sách "đỏ" trong Chương trình Nghiên cứu bảo tồn và phát triển nguồn gen quý hiếm về cây thuốc. Hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa là huperzine A (HupA) có tác dụng trong việc chữa trị các bệnh về trí nhớ, đặc biệt là bệnh Alzheimer ở người già [1]. Với kết quả nghiên cứu và phát hiện về tác dụng tuyệt vời của HupA dựa trên kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học phương tây đã cho thấy triển vọng phát triển các loại thuốc chữa bệnh Alzheimer từ loài cây này [2]. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, số lượng người có vấn đề về suy giảm trí nhớ nói chung và người mắc bệnh Alzheimer nói riêng đang ngày một tăng cao, nhu cầu về thuốc thảo dược có chứa hoạt chất HupA vì thế không ngừng tăng, đây có thể là nguyên nhân chính dẫn đến việc khai thác quá mức làm suy giảm nghiêm trọng nguồn gen loài cây dược liệu quý này trong tự nhiên. Do đó, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình thức giâm hom thân và nuôi cấy mô nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây này. Các nghiên cứu cho thấy, loài Thạch tùng răng cưa sinh trưởng tốt trong rừng với đất mùn ẩm ướt, độ cao 350 - 1700 m, lượng mưa trên 1500 mm/ năm, độ ẩm trên 78% [3, 4] Ở nước ta, Thạch tùng răng cưa đã được tìm thấy trên các vùng cao tại một số khu vực như Lào Cai, Lâm Đồng, Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Nghệ An, Tây Nguyên, Quảng Trị [5]. Trong đó, Lâm Đồng và Lào Cai là hai khu vực có điều kiện khí hậu và môi trường sống thích hợp hơn cho sự phát triển của loài Thạch tùng răng cưa so với các khu vực khác trong cả nước. Tuy nhiên, Thạch tùng răng cưa có đặc tính sinh trưởng chậm, khả năng sinh sản kém, mức khai thác nguồn cây trồng tự nhiên quá lớn đã làm mất dần nguồn gen quý này ở nước ta, dẫn đến loài Thạch tùng răng cưa không đáp ứng được nhu cầu về nguồn nguyên liệu
14. 2 cho sản xuất dược phẩm. Do vậy, để chủ động nguồn dược liệu cho chiết xuất hoạt chất HupA dùng làm thuốc, việc nghiên cứu một số đặc điểm sinh học để lựa chọn giống cây có khả năng sinh tổng hợp HupA cao, từ đó tìm ra các phương pháp để tái sinh và nhân giống nhằm bảo tồn và phát triển nguồn gen loài cây này là vô cùng cần thiết. Hơn nữa, Việt Nam cũng chưa có công trình nghiên cứu nào thành công về nhân giống loài Thạch tùng răng cưa với quy mô lớn. Xuất phát từ thực tế và nhận định trên, chúng tôi lựa chọn hai vùng Lâm Đồng và Lào Cai để thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và nhân giống loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) thu tại Lào Cai và Lâm Đồng”. 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài 2.1. Mục tiêu nghiên cứu Phân tích một số đặc điểm sinh học và xác định được các điều kiện thích hợp cho việc nhân giống (bằng hình thức giâm hom thân, nuôi cấy mô) loài Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam. 2.2. Nội dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu, sinh thái học và tính đa hình DNA của loài Thạch tùng răng cưa. i. Đặc điểm hình thái, giải phẫu của loài Thạch tùng răng cưa. ii. Đặc điểm sinh thái học của loài Thạch tùng răng cưa. iii. Tính đa hình DNA của loài Thạch tùng răng cưa. 2. Xác định hàm lượng huperzine A trong cây Thạch tùng răng cưa ngoài tự nhiên thu thập tại Lào Cai và Lâm Đồng. 3. Nghiên cứu nhân giống loài Thạch tùng răng cưa. i. Nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình thức giâm hom thân. ii. Nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng hình thức nuôi cấy mô. 4. Xác định hàm lượng huperzine A trong cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy
15. 3 mô. 3. Những đóng góp mới của đề tài Luận án là nghiên cứu mới có hệ thống khi kết hợp cùng lúc phương pháp phân tích về hình thái, giải phẫu thực vật và sinh học phân tử để đánh giá mức độ đa dạng nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng. Xác định được hàm lượng HupA trong 8 mẫu nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai và Lâm Đồng, trong đó, các mẫu Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng có hàm lượng HupA (90,23 µg/g) cao hơn so với các mẫu thu tại Lào Cai (76,28 µg/g); hàm lượng HupA ở lá cao hơn thân và rễ; lá Thạch tùng răng cưa thu hái vào mùa thu (tháng 9) có hàm lượng HupA (92,50 µg/g) cao hơn thu hái vào mùa xuân (tháng 3) (75,10 µg/g). Đã xác định được một số khâu cơ bản làm cơ sở cho việc xây dựng quy trình nhân giống loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp giâm hom thân (tại Lào Cai và Lâm Đồng) với tỉ lệ cây hồi xanh sau ra ngôi đạt 97,78% và phương pháp nuôi cấy mô với tỉ lệ sống sót trên giá thể đạt 97%; đồng thời, xác định được hàm lượng HupA trong cây nuôi cấy mô đạt 300 µg/ g khối lượng khô. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả của luận án cung cấp các thông tin khoa học về đặc điểm hình thái, tính đa dạng về hệ gen, hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa ở hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng. Cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về ứng dụng công nghệ tế bào thực vật trong nhân giống, mở ra triển vọng đáp ứng nguồn cây giống đồng đều và chất lượng cho phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu về đặc điểm sinh học có ý nghĩa định hướng cho công tác bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam. Xác định được thời điểm thu hoạch và bộ phận thu hái Thạch tùng răng cưa để nhận được hàm lượng HupA cao nhất phục vụ cho y học; đồng thời, giảm thiểu
16. 4 được việc khai thác dẫn đến mất dần nguồn gen Thạch tùng răng cưa trong tự nhiên. Thành công trong phương pháp nhân giống sẽ góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa tại các vùng có khả năng trồng ở Việt Nam, cung cấp nguyên liệu có hoạt chất HupA cao phục vụ cho việc sản xuất thuốc điều trị các bệnh rối loạn về trí nhớ.
17. 5 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm loài Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) 1.1.1. Phân loại Thạch tùng răng cưa tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis, (trước đây gọi là Lycopodium serratum Trevis, Huperziaceae), thuộc bộ Lycopodiales, họ Lycopodiaceae, chi Huperzia. Chi Huperzia có khoảng 500 loài trên toàn thế giới [6, 7]. Ở Việt Nam, họ Lycopodiaceae có 3 chi là Huperzia, Lycopodium và Lycopodiella với tổng số 14 loài. Trong đó, chi Huperzia là chi lớn nhất với 10 loài gồm Huperzia cancellata (Spring) Trevis., H. carinata (Poir.) Trevis, H. chinense (Christ) Ching, H. hamitolnii (Spring) Trevis, H. subdisticha Mak, H. obovalofolia (Bon.), H. plegmaria (L.) Roth., H. salvinoides (Herter) Alston., H. serrata (Thunb.) Trevis và H. squarrosa (Forst.) Trevis [8, 9, 10]. Đây là những loài được đánh giá có tiềm năng sử dụng trong điều trị nhiều bệnh như Alzheimer, Parkinson, đau, sưng tấy, phát ban, tâm thần phân liệt và bệnh nhược cơ ở các nước Đông Á [5]. Theo Nguyễn Thọ Biên (2017), họ Lycopodiaceae ở Việt Nam gồm 12 loài có tác dụng chữa bệnh, trong đó có 11 loài được phát hiện ở tỉnh Lâm Đồng: Thạch tùng (thông đá, thăng kim thảo - Lycopodium clavatum L.); Thạch tùng nhiều bông (Huperzia chinense (H. Chirst) Ching); Thạch tùng phi lao (Lycopodium casuarinoides Spring); Thạch tùng răng cưa (H. serrata (Thunb.) Trevis); Thạch tùng thân gập (Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis); Thạch tùng xoan ngược (Huperzia abovalifolia (Bon); Thông đất (Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm); Thông đất dẹp (Lycopodium complanatum L.); Thông đất Haminton (Huperzia hamilltonii (Spreng.) Trevis); Thông đất râu (Huperzia plegmaria (L.) Rothm); Thông đất song (Huperzia carinata (Desv. Ex Poir.) Trevis [11]; Thạch tùng Ford (Huperzia fordii (Backer) R. D. Dixit) chỉ gặp ở vùng núi thấp của Hà Nội (Ba Vì) [12]. Bốn trong số 12 loài trên đã được đưa vào danh mục cây thuốc Việt Nam (2016) gồm: Thạch tùng Ford, Thạch tùng nhiều bông, Thạch tùng phi lao, Thạch tùng răng cưa [12].
18. 6 1.1.2. Đặc điểm hình thái học của Thạch tùng răng cưa Thạch tùng răng cưa (Hình 1.1) thuộc loài thân cỏ mọc ở đất, thân cao 15 cm - 40 cm, thân đơn hay lưỡng phân 1 - 2 lần, hình trụ, đường kính khoảng 2 mm. Lá hình bầu dục, mũi mác, dài 15 mm, rộng 3 mm, phiến lá tương đối mỏng, nổi rõ gân giữa, mép lá có răng cưa, rễ dạng chùm [13]. Ngoài ra, theo nghiên cứu của Phạm Hoàng Hộ (2006), cây Thạch tùng răng cưa thu ở Sa Pa và Đà Lạt có đặc điểm là: thân đứng, cao 8 cm - 20 cm, lá thon hẹp, kích thước 2 – 3 cm x 0,40 cm, tương đối mỏng, gân rõ giữa, bìa có răng không đều. Bào tử nang ở nách lá không khác lá thường, hình thận, màu vàng tươi [14]. Sự phát triển của túi bào tử từ lúc bắt đầu đến khi trưởng thành mất gần 1 năm. Cấu trúc của thành túi bào tử trưởng thành bao gồm một lớp biểu bì, ở giữa là hai lớp tế bào và một lớp mô dưỡng chất gọi là tapetum. Do đó, túi bào tử của loài Thạch tùng răng cưa thuộc loại túi bào tử dày (eusporangium) [15]. Bào tử được phát tán ra khi túi bào tử trưởng thành. Mầm tập trung nhiều ở phần trên của cây và những mầm này có thể phát triển thành cây mới sau khi rơi xuống đất. Tuy nhiên, Thạch tùng răng cưa ít khi được nhân giống bằng mầm [16]. Bào tử Thân Lá Hình 1.1. Cây Thạch tùng răng cưa H. serrata [17]. Nghiên cứu đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cưa ở khu bảo tồn thiên nhiên Bắc Hướng Hóa - Quảng Trị cho thấy cây trưởng thành là những cây có khả năng sản sinh bào tử nang có màu vàng tươi, hình thận với kích thước 0,8 mm mọc ở nách lá. Ngược lại, cây tái sinh thường chưa sản sinh bào tử nang, chiều cao và đường kính nhỏ hơn cây trưởng thành, với chiều cao 3,54 cm, đường kính 0,75
19. 7 mm. Đối với cây trưởng thành có dạng cây thân thảo đứng có chiều cao trung bình 11,89 cm - 14,25 cm, đường kính thân trung bình 1,80 mm. Lá có hình dạng lưỡi mác, chiều dài 1,84 cm - 2,57 cm, chiều rộng 0,37 cm - 0,41 cm, gân giữa nổi rõ, mép lá có răng cưa không đều với số lá trung bình 79,80 lá/ cây [18]. 1.1.3. Đặc điểm sinh thái, sinh học của Thạch tùng răng cưa Thạch tùng răng cưa phân bố trên toàn thế giới nhưng tập trung nhiều nhất ở khu vực ôn đới phía đông, phía nam đến vùng nhiệt đới Đông Nam của Châu Á, cũng như Châu Đại Dương và Trung Mỹ (Hình 1.2) [19]. Chúng sống bì sinh ở những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá, phát triển tốt trong rừng hoặc trong khe núi với đất mùn ẩm ướt, ở độ cao 350 m - 1700 m, lượng mưa trên 1500 mm, độ ẩm tương đối cao 78%, hàm lượng nước trong đất 10% - 30%, pH đất 4,57 - 5,31, độ dẫn đất 0,06 - 0,85 cm/ cm, và hàm lượng chất hữu cơ 6,18% - 9,75% [3, 4]. Hình 1.2. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa trên thế giới [20]. Theo nghiên cứu của Kaur và cộng sự (2016), Thạch tùng răng cưa chủ yếu được tìm thấy ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nepal, Myanmar, Sri Lanka, Nhật Bản, Hàn Quốc, Việt Nam, Indonesia, Fiji, Samoa, Mexico, Mỹ, Thái Lan, bán đảo Malaysia, Nga, Đài Loan, Úc và Cuba. Ấn Độ phát hiện được 21 loài thuộc chi Huperzia. Trong đó, 6 loài bao gồm Huperzia cancellta (Spring) Trevis., H. carinata (Desv.) Trevis., H. quasipolytrichoides (Hayata) Ching (H. cryptomerina sensu Dixit), H. nummulariifolia (Blume) Jermy, H. phyllantha (Hook & Arn) Holub và H. vernicosa (Hook & Grev.) Trevis bị đe dọa nghiêm trọng và bốn loài là H. ceylanica (Spring) Trevis., H. nilagirica (Spring) Dixit., H. selago (Linn) Bernh. Ex Schrenk & Mart subsp arctica (Grossh ex. Tolm.) A. Love & D. Love (H. dixitiana P. Mondal & S. R. Ghosh) và H. phlemaria (Linn) Rothm. (Phlegmariurus Plegmaria
20. 8 (Linn.) Sen & Sen) xuất hiện với tỉ lệ hiếm. Thạch tùng răng cưa chủ yếu được tìm thấy ở vùng cận nhiệt đới đến rừng ôn đới ở độ cao 900 m - 3500 m khu vực Đông Bắc của Ấn Độ như West Bengal (Darjeeling), Meghalaya, Manipur và đồi Nilgiri của Tamilnadu [21]. Ở Trung Quốc, Thạch tùng răng cưa chủ yếu xuất hiện trong rừng lá rộng thường xanh, tập trung nhiều ở các khu vực từ vùng phía Nam đến sông Dương Tử; nơi đây, lượng mưa hàng năm trên 1000 mm và chúng thường sinh trưởng trong các môi trường được che bóng, ẩm ướt và đất mùn axit, ở độ cao dao động từ 300 đến 2700 m [4]. Ở nước ta, cây Thạch tùng răng cưa thường bì sinh ở những cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá. Cây thường phân bố ở độ cao trên 1000 m so với mực nước biển. Cây phát triển tốt trong môi trường bóng mờ, ẩm ướt và rất ẩm ướt, đất có nguồn chất hữu cơ phong phú, độ mùn cao, điều này làm hạn chế môi trường sống của chúng ở các vùng có độ cao cao hơn tại Việt Nam [22]. Chúng phân bố rải rác tại các vùng cao như Lâm Đồng, Lào Cai, Nghệ An, Cao Bằng, Quảng Trị, Quảng Nam - Đà Nẵng, Khánh Hòa, Tam Đảo [5, 8] (Hình 1.3). Hình 1.3. Sự phân bố của Thạch tùng răng cưa tại Việt Nam [20]. Từ Bắc vào Nam, bốn quần thể bản địa của loài này phân bố tại các khu bảo tồn thiên nhiên đã được xác định ở Việt Nam bao gồm Vườn Quốc gia Hoàng Liên (tỉnh Lào Cai), Vườn Quốc gia Bạch Mã (tỉnh Thừa Thiên Huế), Khu bảo tồn Quốc
21. 9 gia Ngọc Linh (giữa Tỉnh Quảng Nam và Kon Tum) và Vườn Quốc gia Bidoup (tỉnh Lâm Đồng). Trong năm 2013 và 2016, nghiên cứu định danh tại hiện trường đã xác định được 100 - 300 cá thể còn lại ở mỗi khu vực nghiên cứu. Kết quả ghi nhận này cho thấy, kích thước của quần thể và sự tái sinh khan hiếm của loài cây Thạch tùng răng cưa trở thành một mối đe dọa lớn đối với sự tồn tại của loài, thông qua sự suy giảm đa dạng di truyền [22]. Bên cạnh đó, tại khu bảo tồn thiên nhiên Bắc Hướng Hóa (Quảng Trị), Trần Mạnh Đạt và cộng sự (2019) đã nghiên cứu và xác định loài Thạch tùng răng cưa tại đây phân bố ở đai cao từ 1.400 m - 1.500 m so với mặt nước biển, chủ yếu ở vị trí sườn dốc và địa hình ven khe suối, tập trung nhất ở vị trí ven khe suối (78,09%) ở vùng Pa Thiên với độ dốc dưới 30o và những vị trí sườn dốc cũng thấy sự xuất hiện phân bố của loài nhưng ít hơn chỉ đạt 21,91% với độ dốc địa hình lớn hơn 30o, chưa bắt gặp cá thể nào phân bố ở đỉnh núi. Ngoài ra, cây phân bố tập trung ở những khu vực có độ ẩm cao trong rừng, thường phân bố theo các đám nhỏ tại những điểm bằng phẳng cục bộ trong rừng do bị giới hạn bởi có đá chắn, bạt chắn ven suối, cạnh các tảng đá, bờ suối với tỷ lệ đá nổi từ 10% đến 20%. Vùng phân bố tập trung được ghi nhận ở khu vực động Pa Thiên, núi Voi Mẹp (xã Hướng Sơn) và La Rường (xã Hướng Linh) của Khu bảo tồn thiên nhiên Bắc Hướng Hóa. Mật độ trung bình 98 cây/ km, tần số bắt gặp 5 - 20 cây/ km của tuyến điều tra. Trạng thái rừng có cây Thạch tùng răng cưa phân bố đều thuộc trạng thái rừng giàu, nguyên sinh ít bị tác động với độ tàn che cao 0,70 - 0,80 [18]. Các nghiên cứu cho thấy, cây Thạch tùng răng cưa có chứa nhiều loài nấm nội sinh [23, 24, 25]. Các loại nấm nội sinh này thường không gây ra triệu chứng rõ ràng về bệnh; ngược lại, chúng kích thích sự tăng trưởng của thực vật và tăng cường khả năng sống sót của vật chủ đối với nấm gây bệnh [23]. Một số nấm nội sinh được phát hiện như một nguồn thuốc chữa bệnh như chủng nấm Botryosphaeria sp. P483 [26], Aspergillus versicolor [27], hoặc chứa các hợp chất mới như chủng B14 thuộc loài nấm Penicillium oxalicum có chứa hợp chất pentapeptit mới [28], chủng Penicillium chrysogenum MT-12 có chứa axit 3,5-dimethylorsellinic bắt nguồn từ nhóm hợp chất meroterpenoid [29], bốn hợp chất steroid mới là neocyclocitrinol E-G (1-3) và 3β-hydroxy-5,9-epoxy-(22E, 24R)-ergosta-7,22-dien-6-one được phát
22. 10 hiện trong chủng nấm Chaetonium sp. M453 [30]. Điều này cho thấy, loài Thạch tùng răng cưa có chứa nhiều chủng nấm nội sinh khác nhau và đây là một nguồn tài nguyên phong phú cho việc khảo sát các sản phẩm tự nhiên mới. 1.1.4. Đặc điểm sinh sản Loài Thạch tùng răng cưa có sự kết hợp cả hình thức sinh sản hữu tính (bằng bào tử) và sinh sản vô tính (bằng mầm). Cây trưởng thành tạo ra các lá mới, túi bào tử từ tháng 2 đến tháng 3, và thường túi bào tử mở để giải phóng bào tử vào tháng 12 và tháng 1 năm sau [19]. Quá trình phát triển của bào tử và túi bào tử kéo dài hơn 1 năm. Sự phát triển của túi bào tử được xác định gồm sáu giai đoạn: (1) bắt đầu từ tế bào biểu bì và hình thành các tế bào sinh bào tử, (2) tế bào sinh bào tử nguyên sinh, (3) tế bào sinh bào tử thứ cấp, (4) tế bào bào tử mẹ, (5) giai đoạn bốn bào tử (tetrad) và (6) trưởng thành [15]. Các thể giao tử và thể bào tử của Thạch tùng răng cưa thường phát triển chậm trong môi trường sống có độ ẩm tương đối cao và cần nguồn chất hữu cơ phong phú nên khó khăn trong việc nhân giống [31]. Không chỉ vậy, sau khi bào tử nảy mầm, cây con phải mất 15 - 20 năm để phát triển đạt chiều cao 10 - 30 cm. Cho đến nay, trên thế giới chưa có công trình nào thành công với phương pháp nảy mầm bào tử trong phòng thí nghiệm [17, 32]. Hình 1.4. Hình thái của cây mầm ở các độ tuổi khác nhau [19]. Trong tự nhiên, sinh sản sinh dưỡng bằng mầm đóng vai trò quan trọng đối với việc phát tán và tái sinh loài Thạch tùng răng cưa [19]. Nghiên cứu cho thấy cây Thạch tùng răng cưa trưởng thành tạo ra mầm từ tháng 2 đến tháng 3, sau đó mầm rơi xuống đất trong khoảng thời gian từ tháng 8 đến tháng 10. Các mầm dễ dàng
23. 11 phát triển thành cây con trên môi trường đất rừng sinh thái. Sau 3 hoặc 4 ngày, mầm đã xuất hiện các rễ rất ngắn (< 0,10 mm). Sau 7 ngày, cây con phát triển một hoặc hai lá ban đầu. Sau 120 ngày, các lá hình thành răng cưa (Hình 1.4) [19]. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng cây Thạch tùng răng cưa lâu năm với trên ba lớp mầm (cây trên 3 năm tuổi, mỗi lớp mầm tương ứng với 1 năm tuổi) thì khả năng tạo mầm trở lên mạnh mẽ hơn, trung bình tạo ra hơn 20 mầm mỗi năm [19]. Tuy nhiên, trên thực tế, Thạch tùng răng cưa ít khi được nhân giống bằng mầm [16]. Điều này cho thấy mầm của loài Thạch tùng răng cưa thường được phát triển thành cây con trong môi trường tự nhiên với tỉ lệ sống sót cao. Đây là một trong những hình thức sinh sản giúp duy trì và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa trong điều kiện tự nhiên. 1.1.5. Đặc điểm hóa sinh Thế giới đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến việc xác định thành phần hoá học và tác dụng bảo vệ thần kinh của các hợp chất phân lập được từ cây Thạch tùng răng cưa [33, 34]. Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra rằng lycopodium alkaloid là thành phần hoá học chính trong cây và có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh [35]. Cao chiết giàu alkaloit từ Thạch tùng răng cưa thu tại Nhật Bản có khả năng ức chế enzyme AchE với giá trị IC50 là 5,96 µg/ ml [33]. Tại Việt Nam, Nguyễn Duy Tài và cộng sự (2013) đã nghiên cứu tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ của cao chiết cồn từ loài Thạch tùng răng cưa thuộc họ Lycopodiaceae trên chuột nhắt trắng. Kết quả cho thấy cao chiết cồn của Thạch tùng răng (liều 0,53 g/ kg) giúp cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ trên chuột thực nghiệm. LD50 của cao Thạch tùng răng cưa là 5,33 g/ kg [36]. Cao chiết toàn phần, các phân đoạn cao chiết và cao chiết alkaloit được phân lập từ cây Thạch tùng răng cưa thu tại Việt Nam đều có tác dụng ức chế enzyme AchE. Trong đó, cao chiết giàu alkaloit thể hiện tác dụng ức chế enzyme AchE và BuchE mạnh hơn hẳn so với các cao chiết toàn phần và các phân đoạn cao chiết với giá trị IC50 lần lượt là 14,08 µg/ml và 88,11 µg/ml [37]. Sử dụng phương pháp UPLC - MS, Wu và cộng sự (2018) đã xác định được một trăm mười tám hợp chất lycopodium alkaloid trong các mô khác nhau của loài Thạch tùng răng cưa [38]. Một số hợp chất lycopodium alkaloid với cấu trúc hóa học đa dạng được phân lập từ cây Thạch tùng răng cưa vẫn đang được các nhà khoa
24. 12 học nghiên cứu để xây dựng nên cấu trúc các hợp chất alkaloid mới. Đa số các lycopodium alkaloid là các chất hòa tan trong chất béo và chúng được phân thành bốn loại cấu trúc chính (Hình 1.5). Bốn loại cấu trúc chính bao gồm các nhóm: fawcettimine, lycodine, lycopodine và một tập hợp các hợp chất hỗn hợp (miscellaneous) [1]. Hình 1.5. Đại diện cho 4 nhóm hợp chất chính của lycopodium alkaloid thu từ loài Thạch tùng răng cưa [1]. Hầu hết các hợp chất alkaloid có khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AchE) thuộc về lớp lycodine (B) gồm có: HupA, 6-β-hydroxyhuperzine A, huperzine B (HupB), N-methylhuperzine B và huperzinine [39, 40]. Bằng kỹ thuật UPLC-PDA và UPLC-Q/TOF-MS, Zhao và cộng sự (2015) đã xác định nhanh 3 hợp chất có mặt trong cây Thạch tùng răng cưa là HupA, HupB và HupC [41]. Đối với vấn đề ức chế AchE thì HupA là hợp chất quan trọng có khả năng ức chế mạnh nhất [33, 40]. Nghiên cứu khác đã chứng minh một vài lycopodium alkaloid thuộc nhóm fawcettimine cũng có khả năng ức chế AchE như huperzine P và huperzine R nhưng khả năng ức chế của chúng thấp hơn HupA [42]. Ngược lại, 11-α-hydroperoxyphlegmariurine B, 7-hydroperoxyphlegmariurine B và phlegmariurine B cũng thuộc nhóm fawcettimine lại không có khả năng ức chế hoạt động của enzyme AchE [43]. Một hợp chất lycopodium alkaloid khác là 12-deoxyhuperzine O thuộc nhóm lycopodine cũng được tìm thấy trong cây Thạch tùng răng cưa, đây là một chất đối kháng của
25. 13 thụ thể N-methyl-D-aspartate (NMDA) [44]. Ngoài các hợp chất lycopodium alkaloid đã được khảo sát rộng rãi, cây Thạch tùng răng cưa còn chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học tự nhiên khác như nhóm triterpene: Serrat-14-en-3β,21α,29-triol [45]; Flavon:5,5’-dihydroxy-2’,4’-dimethoxyflavone-7-О-β-D-(6’’-O-Z-p-coumaroyl)-gl ucopyranoside [46], và axit phenolic [43, 47]. Hình 1.6. Các hợp chất khác từ loài Thạch tùng răng cưa [1]. A. Serrat-14-en-3β,21α,29-triol; B. 5,5’-dihydroxy-2’,4’- dimethoxyflavone-7-О-β-D-(6’’-O-Z-p-coumaroyl)-glucopyranoside. Năm 2019, Lê Đình Mạnh và cộng sự đã nghiên cứu phân lập được hai hợp chất terpenoid từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của cây Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp sắc ký cột và sắc kí lớp mỏng. Hai hợp chất phân lập được có tên là 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14-en-24-oic axit-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat) (HSE-1); 16-oxo-3α-hydroxyserrat-14-en-21β-ol (HSE-2) (Hình 1.7). Trong đó, lần đầu tiên hợp chất 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14-en-24-oic axit-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat) được phân lập từ cây Thạch tùng răng cưa [48]. Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của hai hợp chất HSE-1 (a) và HSE-2 (b) [48].
26. 14 1.1.6. Các nghiên cứu về đa dạng di truyền loài Thạch tùng răng cưa Huang và cộng sự (2010) đã sử dụng chỉ thị AFLP để nghiên cứu mức độ biểu hiện và mô hình biến dị di truyền trong và giữa các quần thể tự nhiên của loài Thạch tùng răng cưa. Nghiên cứu đã sử dụng 7 tổ hợp mồi để khuyếch đại 615 băng, trong đó có 532 băng là đa hình (86,50%). Điều này cho thấy ở mức độ loài có sự đa dạng di truyền lớn. Phân tích AMOVA cho thấy mười quần thể có mức độ đa dạng di truyền thấp. UPGMA cluster của tất cả các mẫu này cho thấy các cá thể từ quần thể giống nhau không tập trung lại thành một nhóm riêng biệt. Thử nghiệm Mantel test cho thấy không có sự tương quan đáng kể giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý (r = 0,28; P = 0,89). Do vậy, sự phát tán gen không bị hạn chế về mặt địa lý. Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến di truyền của loài Thạch tùng răng cưa bao gồm: sự tăng trưởng của dòng vô tính, hiệu quả của chọn lọc và lai xa, cũng như hiệu quả phát tán bào tử của gió [49]. Sự đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của 7 quần thể và 112 cá thể của loài Thạch tùng răng cưa thu tại dãy núi Wuyi ở Trung Quốc đã được phân tích bằng kỹ thuật AFLP. Tổng cộng 675 phân đoạn được khuếch đại, trong đó có 555 phân đoạn đa hình. Số alen quan sát được (Na) và số alen hiệu quả (Ne) lần lượt là 1,63 và 1,49. Giá trị trung bình của chỉ số đa dạng di truyền Nei (He) và chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I) lần lượt là 0,27 và 0,39. Các quần thể Tainning và Jianning nằm ở giữa dãy núi Wuyi có mức độ đa dạng cao nhất, trong khi quần thể Guangze phân bố ở phần phía bắc của dãy núi có độ đa dạng thấp nhất. Tổng đa dạng di truyền (Ht) là 0,33 và sự đa dạng gen của quần thể (Hs) là 0,27. Hệ số khác biệt gen giữa các quần thể trong loài (GST) là 0,17, cho thấy biến dị trong quần thể là nguyên nhân chính tạo nên sự đa dạng di truyền của loài Thạch tùng răng cưa ở dãy núi Wuyi [50]. Kỹ thuật SSR (kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản) đã được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của 177 cá thể loài Thạch tùng răng cưa ở Trung Quốc. Kết quả nghiên cứu cho thấy có 20 cặp mồi đã được khuếch đại thành công bằng kỹ thuật PCR. Trong số 20 cặp mồi này, có 10 cặp mồi biểu hiện tính đơn hình (không được nghiên cứu thêm) và 10 cặp mồi đa hình được sử dụng để đánh giá thông tin đa hình về năm quần thể loài Thạch tùng răng cưa, xác định
27. 15 tổng số 72 alen. Hệ số thông tin di truyền (PIC) đối với các mồi SSR dao động từ 0,31 đến 0,73, trung bình là 0,57. Mức độ dị hợp tử mong đợi của đa dạng di truyền nằm trong khoảng 0,06 đến 0,79 và mức độ dị hợp tử quan sát được dao động từ 0,00 đến 1,00. Tám markers SSR có mức độ dị hợp tử trên 0,50, điều này cho thấy loài Thạch tùng răng cưa có mức độ đa hình cao [51]. Sự đa dạng di truyền và sự biến đổi của bốn quần thể loài Thạch tùng răng cưa phân bố ở Việt Nam đã được phân tích dựa trên dữ liệu dấu vân tay DNA thu được từ các kỹ thuật ISSR và ScoT riêng rẽ và kết hợp với nhau. Cả hai chỉ thị ISSR và ScoT đều cho thấy sự đa dạng di truyền của Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam là tương đối cao ở cả cấp quần thể và cấp độ loài, trừ quần thể Hoàng Liên. Các chỉ số đa dạng di truyền của quần thể Hoàng Liên là chỉ số đa dạng gen Nei’s (He) = 0,1436, chỉ số Shannon (I) = 0,2161, tỷ lệ các băng đa hình (PPB) = 45,45%; của quần thể Bạch Mã là He = 0,21, I = 0,33, PPB = 71,97%; của quần thể Ngọc Linh với He = 0,20, I = 0,31, PPB = 74,24%; của quần thể Bidoup là He = 0,19, I = 0,30, PPB = 74,24% và ở cấp loài tại Việt Nam là He = 0,23, I = 0,36, PPB = 100%. Sự khác biệt di truyền cao với giá trị GST = 0,19 và số lượng cá thể di cư được ước tính thông qua dòng chảy gen là Nm = 2,16 cá thể trên mỗi thế hệ trong các quần thể. Kết quả phân tích phương sai phân tử (AMOVA) cho thấy tổng số biến thể nằm giữa và trong quần thể tương ứng là 28% và 72% [22]. 1.2. Huperzine A, hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa Huperzine A (HupA) là hoạt chất chính trong cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata), có hiệu quả trong việc cải thiện các dấu hiệu suy giảm nhận thức và được sử dụng để điều trị bệnh Alheizmer ở người già [52] (Hình 1.8). HupA được các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1948. Sau đó, HupA được các nhà khoa học phương tây phân lập, tinh sạch, sử dụng vào năm 1986 [53] và ngày càng được sử dụng rộng rãi trong sản xuất dược liệu và thuốc trên toàn thế giới. 1.2.1. Các nguồn tự nhiên có chứa HupA HupA là một lycopodium alkaloit có nguồn gốc từ loài Thạch tùng răng cưa ở Trung Quốc [54]. Các nghiên cứu cho thấy HupA có thể được tổng hợp hóa học [55, 56] nhưng hỗn hợp racemic ít có hiệu quả trong việc ức chế enzyme AChE so
28. 16 với HupA tự nhiên có nguồn gốc chiết xuất từ thực vật [56]. Do đó, HupA thương mại vẫn chủ yếu được chiết xuất từ toàn bộ lá của loài Thạch tùng răng cưa, dẫn đến việc thu mua quá mức và sự suy giảm mạnh mẽ quần thể loài Thạch tùng răng cưa trong tự nhiên trên khắp Trung Quốc [31]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa ít hơn 0,02% khối lượng tươi [57, 58] và 0,0047 - 0,025% khối lượng khô [59]. Hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thu tại Trung Quốc đạt từ 80,20 - 182,60 µg/g khối lượng khô [60]. Thạch tùng răng cưa sinh trưởng ở các khu rừng ẩm ướt có chứa hàm lượng HupA cao hơn đáng kể so với sinh trưởng ở các môi trường có độ ẩm thấp hơn. Thêm vào đó, hàm lượng HupA thay đổi đáng kể theo mùa, với hàm lượng HupA cao nhất thu được vào giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân. Hơn nữa, hàm lượng HupA còn mang tính đặc hiệu mô, mô lá non có chứa hàm lượng HupA cao nhất, tiếp đến là thân cây, sau đó đến lá già và thấp nhất ở rễ [17, 60]. Nghiên cứu khác về cây Thạch tùng răng cưa thu tại thành phố Yamagata, Nhật Bản đã xác định hàm lượng HupA ở loài cây này chiếm 0,5% khối lượng tươi [33]. Như vậy, hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa phụ thuộc vào vùng phân bố, độ ẩm môi trường sống, thay đổi theo mùa, mang tính đặc hiệu mô, phụ thuộc vào quá trình thu hái và phương pháp tách chiết [59, 60]. Việc tích luỹ HupA mang tính đặc hiệu mô cho thấy phương pháp nuôi cấy mô các loài thực vật trong chi Huperzia đóng vai trò quan trọng đối với việc sản xuất HupA [61]. Mặc dù, HupA có nguồn gốc từ loài Thạch tùng răng cưa nhưng hợp chất này còn được tìm thấy ở nhiều loài khác có mối quan hệ gần gũi với loài Thạch tùng răng cưa thuộc họ Huperziaceae như loài H. selago có chứa hàm lượng HupA từ 0,04 đến 0,16% khối lượng tươi [62]. Mặc dù, một số loài trong họ Huperziaceae có chứa hàm lượng HupA cao hơn loài Thạch tùng răng cưa như loài H. carinata (Desv. Ex Poir.) Trevis [= Phlegmariurus carinatus (Devs. Poir.) Ching] (hàm lượng HupA từ lá là 560 µg /g khối lượng khô [60]), loài H. selago (L.) Bernhardi ex Schrank & C.F.P. Martius (hàm lượng HupA là 1270 µg/g khối lượng khô [63], loài H. carinata (chứa hàm lượng HupA là 1030 µg/g khối lượng khô [2], loài H. elmeri (hàm lượng HupA là 1012 µg/g khối lượng khô [61]) và loài H. aqualupiana (hàm lượng 204
29. 17 µg/g khối lượng khô [61]) nhưng ít được quan tâm như loài Thạch tùng răng cưa vì những loài trên khó tìm và ngày càng khan hiếm hơn so với loài Thạch tùng răng cưa [64]. Ngoài ra, HupA còn được tìm thấy ở nhiều loài thực vật khác nhau thuộc họ Lycopodiaceae và Selaginella. Tuy nhiên, HupA chỉ được phân lập từ các loài thuộc chi Huperzia Bernhardi [2, 60]. Các loài thực vật trong họ Huperziacae sinh trưởng chậm và hàm lượng HupA được thu nhận từ nguồn tự nhiên bị hạn chế. Hàm lượng HupA rất thấp trong thực vật thô nên việc phát triển nguồn sản xuất HupA rất được quan tâm. Phương pháp nuôi cấy in vitro loài Phlegmariurus squarrosus, một thành viên của họ Huperziaceae, đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy mẫu mô được nuôi cấy in vitro đã sản sinh ra hàm lượng HupA (675,69 µg/g khối lượng khô) cao hơn so với hàm lượng HupA được tổng hợp từ cây trồng tự nhiên (378,83 µg/g khối lượng khô) và đây là một nguồn sản xuất HupA tuyệt vời [32]. Cytochrome P450 liên quan đến quá trình biến đổi oxy hoá của các hợp chất trung gian [65]. Hai mươi gen cytochrome P450 của loài Thạch tùng răng cưa mã hóa cho sinh tổng hợp lycopodium alkaloid (tập trung ở lá nhiều hơn ở rễ cây) đã được tìm thấy dựa trên việc so sánh dữ liệu trình tự 454-ESTs của Thạch tùng răng cưa và P. carinatus và phân tích Real-time PCR. Bốn chuỗi phiên mã giả định (PUT) CYP450 (Hs01891, Hs04010, Hs13557 và Hs00093) là các PUT chính tham gia vào quá trình sinh tổng hợp alkaloid lycopodium. Khoảng 115 PUT của loài Thạch tùng răng cưa và 98 PUT của loài P. carinatus liên quan đến quá trình sinh tổng hợp các triterpenoid, alkaloid và flavones/ flavonoid [47]. Nghiên cứu về các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp HupA trong cây Thạch tùng răng cưa cho thấy, quá trình sinh tổng hợp các tiền chất của HupA chỉ có 3 loại enzyme tham gia là lysine decarboxylase (LDC) [66, 67], đồng amin oxidase (CAO), và polyketide polysetase type III (PKS) (Hình 1.8) [68]. Ngoài ra, HupA còn được tìm thấy trong các loài nấm nội sinh trong cây Thạch tùng răng cưa như là Colletotrichum gloeosporioides ES026 với sản lượng trong quá trình lên men là 1 µg/g khối lượng khô [69], gen CAO có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp HupA ở chủng nấm ES026 [70], phát hiện hợp chất HupA và HupB trong dịch chiết nấm Colletotrichum gloeosporioides [71], loài
30. 18 Paecilomyces tenuis YS - 13 [72] (sản lượng HupA trong quá trình lên men là 21,0 µg/l [72]), loài Penicillium sp. LDL4.4 (sản lượng HupA là 1380 µg/l (168,90 µg/g khối lượng khô)) và còn nhiều loài nấm khác nữa [25]. Hình 1.8. Con đường sinh tổng hợp của HupA [7]. 1.2.2. Thành phần, cấu tạo và tính chất vật lý, hóa học của HupA HupA [(-) - HupA và (+) - HupA], ký hiệu hóa học là (1R,9S,13E)-1-amino-13-ethylidene-11-methyl-4-azatricyclo [7.3.1.02,7] trideca - 2(7),3,10-trien-5- one, là một sesquiterpene lycopodium alkaloid không bão hòa liên quan đến các quinolizidine [1, 73]. Về mặt cấu trúc, HupA là một phân tử khá độc đáo do bộ khung liên kết chặt chẽ chứa một nhóm ethylidene và một nhân thơm pyridone hợp nhất với một hệ thống mạch vòng mang nhóm amin (Hình 1.9). Hình 1.9. Các đồng phân quang học của HupA [1]. Công thức cấu tạo của HupA là C15H18N20 (khối lượng phân tử 242,14), nhiệt độ nóng chảy 230oC. HupA là một chất có hoạt tính quang học và tồn tại trong tự
31. 19 nhiên với 2 dạng đồng phân quang học là (-)-HupA (L-HupA) hoạt động mạnh hơn dạng (+)-HupA (D-HupA). HupA là chất rất ổn định, với hình dạng kết tinh trắng, tan trong dung dịch axit và chloroform. Cấu trúc hóa học của HupA không bị thay đổi khi bảo quản lâu dài ở 24oC với enzyme AChE hoặc butyrylcholinesterase (BuchE), hoặc sau 96 giờ ủ với axit HCl 0,1N hoặc NaOH, cho thấy việc mở vòng pyridone là không thể xảy ra. Những dữ liệu này chứng minh cho sự ổn định cao của HupA [1]. Hình 1.10. Cấu trúc tương tự của HupA và acetylcholine (ACh) [1]. Nghiên cứu cho thấy HupA có cấu trúc cơ bản giống ACh (Hình 1.10) [1]. Trên thực tế, một sự tương đồng hợp lý về mặt cấu trúc được tìm thấy giữa nhóm nitơ, oxy và cacbonyl của ACh, với nitơ - amin, nitơ và cacbonyl tương ứng của HupA. Nguyên tử nitơ - amin của HupA nằm xa nhóm cacbonyl của vòng pyridine, trong khi nguyên tử nitơ bậc bốn trong phân tử ACh là từ nhóm este cacbonyl, do đó, thành phần 5-aminomethyl-2(1H)-pridone của HupA được công nhận là nhóm chức mang lại tính dược phẩm của nó [74]. Sự có mặt đồng thời của các nhóm amine, vòng pyridone, gốc ethylidene exocyclic, cầu ba cacbon với liên kết đôi của nó, và nhóm metyl của cầu nối thẳng là điều kiện cần thiết với phân tử HupA để nó giữ được hiệu quả ức chế cao đối với enzyme AChE (Hình 1.11). Như vậy, việc loại bỏ hoặc thay thế một trong những đặc điểm cấu trúc này sẽ làm giảm đáng kể hoạt tính ức chế của HupA đối với enzyme AChE [1]. Hình 1.11. Cấu trúc phân tử HupA. (1) nhóm amin, (2) vòng α-pyridone; (3) gốc ethylydene exocyclic; (4) cầu ba cacbon và liên kết đôi; và (5) nhóm metyl [1].
32. 20 Cấu hình không gian vững chắc của phân tử HupA quyết định tính hoạt động của nó. Nghiên cứu cho thấy phân tử (-) - HupA (hằng số ức chế là 300 nM) có hiệu quả ức chế enzyme AChE mạnh hơn 38 lần so với dạng đồng phân (+) - HupA (hằng số ức chế là 8 nM) [75, 76]. Kết quả thử nghiệm trên chuột cho thấy cơ chế hoạt động sinh học của (±) - HupA và (-) - HupA là giống nhau [77, 78]. Tuy nhiên, hỗn hợp racemic tổng hợp (±) - HupA có hiệu quả ức chế enzyme AChE thấp hơn 3 s -7 -7 lần so với (-) - HupA trong ống nghiệm (IC50 tương ứng là 3 x l0 M và l0 M) vì trong thành phần của hỗn hợp racemic thì dạng đồng phân (+) - HupA được chứng -6 minh là có hiệu lực thấp hơn đáng kể (IC50= 7 x 10 M). Do đó, hỗn hợp racemic có hoạt tính sinh học yếu hơn các sản phẩm tự nhiên, có thể do sự hiện diện của đồng phân quang học (+) - HupA [77, 78, 79]. Các nghiên cứu về cấu trúc sinh học cho thấy HupA trực tiếp liên kết với các vị trí hoạt động trong enzyme AChE, ngăn chặn sự tiếp cận của cơ chất nội tại (Hình 1.12) [1]. Hình 1.12. Các tương tác chính giữa AchE và phân tử HupA [1]. HupA có hoạt tính ức chế AchE mạnh hơn các chất ức chế cholinesterase khác, với ái lực ức chế enzyme AchE cao gấp 900 lần so với ức chế enzyme BuChE được tìm thấy bên ngoài hệ thần kinh trung ương [54]. 1.2.3. Các nghiên cứu về tách chiết và xác định hàm lượng HupA Sử dụng kỹ thuật HPLC-UV, Szypula và cộng sự (2005) đã xác định được
33. 21 hàm lượng HupA cao nhất (3330 µg/g khối lượng khô) trong các mầm của cây phát triển từ phôi soma. Sản lượng HupA trong cây thạch tùng răng cưa thu được trong môi trường sống tự nhiên dao động từ 540 µg/g khối lượng khô (chồi thu hoạch vào mùa xuân) đến 1270 µg/g khối lượng khô (chồi thu hoạch vào mùa thu) [64]. Sự thay đổi hàm lượng HupA ở cả giữa và trong quần thể tự nhiên của loài Thạch tùng răng cưa đã được xác định bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) [49]. Kết quả cho thấy, hàm lượng HupA khác nhau đáng kể bởi vị trí địa lý và thay đổi theo kinh độ. Điều này cho thấy, hàm lượng HupA là kết quả sự tương tác giữa gen và môi trường và được kiểm soát chủ yếu bởi yếu tố di truyền [49]. Phương pháp sắc kí lỏng siêu hiệu năng - khối phổ (UPLC - MS) đã được sử dụng để xác định hàm lượng HupA có trong 11 loài Huperzia. Kết quả cho thấy, hàm lượng HupA cao nhất được tìm thấy ở loài Huperzia pinifolia [80]. Sự tích luỹ các lycopodium alkaloit khác được theo dõi bằng phân tích Q-IMS-TOFMS [80]. Zhang và cộng sự (2013) đã tách chiết được HupA từ loài Thạch tùng răng cưa bằng methanol/ nước/ axit formic (10/90/0,2; v/v/v). Sau đó, mẫu tách chiết được xác định hàm lượng HupA bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Việc tách chiết được thực hiện trên cột Xcharge C18 (150 mm x 4,6 mm, 5µm), dung dịch rửa giải là nước (có chứa 0,10% (v/v) axir trifluoroacetic) và acetonnitrile (chứa 0,09% (v/v) axit trifluoroacetic) là pha động. Kết quả tách nhanh chóng đạt được sau 10 phút, tốc độ dòng chảy là 2 ml/ phút, UV 310 nm. Theo các điều kiện tối ưu, đường tuyến tính tốt thu được trong khoảng 2,12 - 106 mg/ l với hệ số tương quan R2 khoảng 0,9999. Giá trị thu hồi trung bình khoảng 102,34% với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 0,46%. Kết quả chứng minh rằng phương pháp định tính và định lượng HupA bằng HPLC là phương pháp đơn giản, nhanh chóng và chính xác với khả năng thu hồi tốt và có thể sử dụng để đánh giá chất lượng của loài Thạch tùng răng cưa [81]. Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự (2016) đã nghiên cứu thiết lập chất chuẩn và định lượng HupA trong một số loài Thạch tùng ở Việt Nam. Nghiên cứu đã thiết lập được chất chuẩn HupA với độ tinh khiết 99,13% để làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm đánh giá chất lượng các dược liệu. Quy trình định tính và định lượng bằng phương pháp HPLC được xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu để ứng dụng xác
34. 22 định hàm lượng HupA trong 10 loài thuộc họ Thạch tùng ở Việt Nam. Nghiên cứu đã xác định được hàm lượng của HupA trong cây Thạch tùng răng cưa thu tại Kon Tum, Tây Nguyên là 181,64 µg/g [82]. Nguyễn Thị Minh Thành và cộng sự (2020) đã phát hiện trong 58 chủng nấm được tìm thấy từ rễ của loài Thạch tùng răng cưa thu hái tại tỉnh Lào Cai, trong đó chủng nấm Fusarium sp. Rsp5.2 có khả năng sản xuất HupA. Sử dụng kỹ thuật HPLC, nghiên cứu của Nguyễn Minh Thành đã xác định được hàm lượng HupA được sản xuất bởi chủng nấm này đạt 19,45 µg/g khối lượng khô của nấm [83]. 1.2.4. Vai trò của HupA trong y học HupA được xem là điều kiện để điều trị bệnh Alzheimer, dạng phổ biến nhất của bệnh sa sút trí tuệ [84]. 1.2.4.1. Bệnh Alzheimer Alzheimer (AD) là một bệnh thoái hóa thần kinh ảnh hưởng đến người cao tuổi và gần như chưa có liệu pháp điều trị hiệu quả [85, 86]. AD được công nhận là một trong những bệnh thoái hóa thần kinh phức tạp nhất và là một vấn đề lớn của xã hội. Càng ngày số người mắc AD trên thế giới càng tăng. Năm 2015, ước tính có 26,6 triệu bệnh nhân mắc AD được báo cáo trên toàn thế giới [87]. Đến năm 2018, số lượng người bị mắc bệnh mất trí nhớ và alzheimer là 50 triệu người. Con số này được dự đoán sẽ tăng lên 152 triệu vào năm 2050 [88]. Về mặt bệnh lý, Alzheimer được đặc trưng bởi sự tích tụ quá nhiều các β - amyloid peptide ở ngoại bào, ở dạng mảng xơ vữa và đám rối thần kinh nội bào [19, 89]. Ngoài ra, nó còn ảnh hưởng đến quá trình dẫn truyền thần kinh trong não [90]. Ở những người mắc bệnh Alzheimer diễn ra sự suy giảm chức năng nghiêm trọng của các tế bào dẫn truyền thần kinh cholinergic, dẫn đến mất trí nhớ hoặc suy giảm nhận thức, nguyên nhân là do sự suy giảm nồng độ của Ach trong não [91]. 1.2.4.2. Đặc tính chữa bệnh Alzheimer của HupA HupA có khả năng xuyên qua hàng rào mạch máu não và tác động trực tiếp lên não bộ với liều lượng rất thấp tính bằng microgram. Trên thực tế, HupA ức chế việc sản sinh ra AChE, một enzyme tạo ra sự suy thoái của ACh. Khi enzyme AChE bị thiếu hụt hoặc chỉ có với hàm lượng rất thấp thì hàm lượng AChE trong
35. 23 não tăng lên, giúp cho trí nhớ và các chức năng nhận thức được cải thiện. Kết quả nghiên cứu cũng cho biết việc vô hiệu hóa enzyme AChE được biết đến nhiều nhất với vai trò làm giảm hợp chất canabinoid trong não bộ, sẽ giúp ngăn ngừa sự sản sinh và tích tụ của mảng beta amyloid, nguyên nhân chính dẫn tới bệnh Alzheimer. Hạn chế enzyme AChE cũng làm giảm sự sưng tấy và thoái hóa neuron thần kinh, đồng thời làm tăng tính dẻo dai của não bộ, khả năng học hỏi và trí nhớ [1, 84, 89, 90]. Ở các vùng não khác nhau, HupA biểu hiện hoạt tính ức chế enzyme AchE với nồng độ thấp hơn các chất ức chế khác [54]. Hơn nữa, HupA có thời gian hoạt động dài hơn và xâm nhập vào hàng rào mạch máu não tốt, ít phản ứng phụ hơn so với tetrahydroaminoacridine, physostigmine, galantamine, donepezil, tacrine . Đồng thời, HupA được chứng minh là không có độc tính đối với người và động vật [84]. Với các đặc tính ưu việt trên, HupA có tác dụng điều trị chính đối với bệnh sa sút trí tuệ do thiếu acetylcholine, bao gồm bệnh Alzheimer, chứng sa sút trí tuệ mạch máu não, bệnh nhược cơ (myasthenia gravis), nhiễm độc organophosphate và tâm thần phân liệt, tính chống viêm, chống ức chế và chống co giật. Ngoài ra, HupA cũng là một chất đối kháng thụ thể N-methyl-D-aspartate của não. Do đó, HupA được dùng để chữa cho các đối tượng bị bệnh động kinh [91, 92]. Ngoài HupA, berry anthocyanin, trans-resveratrol, Ginkgo biloba, Bacopa monniera, Centella asiatica, ginseng, vitamin B12, axit alpha lipoic, vinpocetine, tocotrienols và dầu cọ palm, selenium, black pepper (hồ tiêu đen), acetylcholine và axit gamma aminobutyric cũng có hiệu quả trong việc tăng cường chức năng của não bộ và thể lực [93, 94, 95, 96, 97, 98]. 1.2.5. Dược động học của HupA Các nghiên cứu tiền lâm sàng về cơ chế hoạt động của HupA cho thấy đây là một chất ức chế mạnh đối với enzyme acetylcholinesterase (AChE). Hiệu lực của nó cạnh tranh với chất ức chế AChE cổ điển, physostigmine (Phy) [99, 100]. Các nghiên cứu về độc tính học của HupA được thực hiện trong khoảng 6 tháng trên chó và chuột cho thấy HupA không thể hiện độc tính đối với gan của chó và thỏ hoặc bất kỳ phản ứng phụ nào khác như buồn nôn, nôn mửa, rối loạn đường tiêu hóa, trầm cảm thường xảy ra sau khi điều trị bằng Phy [101, 102]. Về hành vi, HupA
36. 24 đã cho thấy tác dụng cải thiện trí nhớ và học tập ở chuột đồng [103, 104], chuột nhắt và sóc khỉ [104, 105]; Vì vậy, HupA là một chất tăng cường nhận thức hiệu quả ở một số loài động vật khác nhau [78]. Dược động học của HupA không chỉ được nghiên cứu ở các loài động vật khác nhau mà còn được nghiên cứu trên những người tình nguyện khỏe mạnh [106, 107]. Ở chuột, sau khi tiêm tĩnh mạch (iv) hoặc qua đường uống (po) dung dịch [3H] HupA thì nồng độ enzyme AChE trong máu giảm như một biên dạng hai pha và tác dụng sinh học là khá cao (96,90%) [106, 108, 109]. Hơn thế nữa, HupA được phân tán chủ yếu vào thận và gan, lá lách, phổi, tim và một lượng nhỏ cho não [108]. Tuy nhiên, sau khi tiêm tĩnh mạch HupA vào chuột, hình ảnh phóng xạ cho thấy các hợp chất này có mặt ở tất cả các khu vực của não bộ, nhưng nó đặc biệt tập trung ở vỏ não trước, vân não, vùng hồi hải mã và vùng nhân não [78]. Nghiên cứu cho thấy mức độ liên kết của HupA với các protein huyết tương chỉ có khoảng 17% [108]. Mặt khác, phần lớn hợp chất này được bài tiết vào nước tiểu trong 24h, còn 2,40% thu được trong phân. Tuy nhiên, điều đáng lưu ý là trong những con chuột mang thai có mặt một lượng nhỏ phóng xạ trong bào thai sau khi tiêm [3H] HupA vào tĩnh mạch [108]. Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng - khối phổ (LC - MS/MS), Wang và cộng sự (2004) đã xây dựng đường cong nồng độ HupA theo thời gian ở huyết tương của chó sau khi tiêm bắp (im) với cùng một công thức (10 µg/ kg/ 15 ngày). Nồng độ cao nhất (Cmax) đạt được sau 48h tiêm là 0,36 ng/ ml; Nồng độ HupA giảm còn một nửa sau 54,8h và vùng dưới đường cong về nồng độ - thời gian (AUC) là 92,6 ng h/ ml [110]. Qian và cộng sự (1995) đã nghiên cứu dược động học của HupA trên sáu người tình nguyện Trung Quốc theo đường uống với 1 liều duy nhất có chứa 0,99 mg (viên nén). Các giá trị Cmax và thời gian để đạt Cmax (Tmax) lần lượt là 8,40 µg/ l và 79,6 phút sau khi dùng thuốc. Nồng độ HupA thải ra ngoài một nửa sau 288,5 phút, liều lượng cho phép dùng mỗi ngày ở người là hai hoặc ba lần. Như vậy, HupA được hấp thu nhanh ở đường tiêu hóa, nhanh chóng phân tán vào cơ thể và bị đào thải ra ngoài với tốc độ từ từ [111]. Đặc tính dược động học của HupA cũng được thử nghiệm trên mười hai người tình nguyện khỏe mạnh (nam và nữ, độ tuổi
37. 25 từ 20 đến 25) với một liều duy nhất 0,40 mg (viên nén). Trong nghiên cứu của Ferreira và cộng sự (2016), mức định lượng của HupA đã được tìm thấy trong huyết tương sau 5-10 phút dùng thuốc và các kết quả tổng thể cho thấy đặc tính dược động học của HupA phù hợp với mô hình hai pha với giai đoạn phân phối nhanh, sau đó là giai đoạn loại bỏ chậm [1]. Như vậy, các nghiên cứu về dược độc học HupA ở cả trên cơ thể người và cơ thể động vật cho thấy HupA có khả năng sinh khả dụng cao, hấp thu nhanh và phân bố rộng, ít tác dụng phụ. Điều này cho thấy, HupA là một trong những hợp chất có giá trị lớn trong điều trị bệnh Alzheimer và các bệnh liên quan đến suy giảm trí nhớ khác. 1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới và ở Việt Nam 1.3.1. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa trên thế giới 1.3.1.1. Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô Các mẫu cấy Thạch tùng răng cưa được khử trùng bằng cách sử dụng H2O2, C2H5OH, HgCl2 và các dung dịch có chứa thành phần kháng sinh cùng với các phương pháp xử lý bằng nước nóng để loại bỏ các vi sinh vật nội sinh trong cây. Kết quả cho thấy, phương pháp thích hợp để khử trùng bề mặt và loại bỏ các vi sinh vật nội sinh trong thân cây là ngâm các mẫu cấy trong nước nóng (47°C) trong 1 giờ, tiếp theo là bằng dung dịch C2H5OH 70% trong 30 giây và sau đó bằng HgCl2 0,10% trong 7 phút. Phương pháp thích hợp để khử trùng bề mặt đối với các túi bào tử và chồi đỉnh là ngâm các mẫu cấy trong C2H5OH 70% trong 30 giây, tiếp theo là HgCl2 0,10% trong 4 phút. Sử dụng các chất khử trùng cùng với xử lý nước nóng có thể làm giảm đáng kể tỷ lệ nhiễm của mẫu cấy. Các túi bào tử và chồi đỉnh hầu như không chứa vi sinh vật nội sinh là các mẫu cấy tuyệt vời cho nuôi cấy mô thực vật [112]. Yang và cộng sự (2008) đã sử dụng chồi đỉnh dài khoảng 1,0 cm đến 1,5 cm của cây Thạch tùng răng cưa làm mẫu cấy. Các mẫu cấy được tiến hành khử trùng bề mặt bằng phương pháp khử trùng đơn hoặc khử trùng kép; khử trùng bên trong bằng chất kháng sinh và dung dịch malachite green để loại bỏ các vi khuẩn, nấm nội
38. 26 sinh và ngoại sinh; tiếp theo chuyển sang môi trường MS, 1/2 MS và 1/4 MS để nuôi cấy. Kết quả cho thấy phương pháp khử trùng thích hợp là sử dụng dung dịch C2H5OH 70% trong 40 giây, tiếp theo là HgCl2 0,1% trong 8 phút và sau đó là H2O2 70% trong 10 phút, và tỷ lệ vô trùng đạt được là 63%. Các mẫu cấy đã khử trùng được nuôi cấy trên môi trường có chứa 0,50 mg/l malachite green, kháng sinh 100 mg/l AAS trong 4 tuần và đạt được 52% các mẫu cấy vô trùng. Môi trường thích hợp để các mẫu cấy sinh trưởng và ra rễ chứa các thành phần khoáng của môi trường 1/4 MS, các thành phần hữu cơ của môi trường 1/2 MS, 2% đường sucrose và 4,50 g/l agar [46]. Trong nghiên cứu của Zhou và cộng sự (2009), thân và đỉnh chồi được sử dụng làm mẫu cấy để tạo mô sẹo. Các mẫu cấy này được nuôi trong bốn môi trường nuôi cấy: (1) 1/2 MS + 0,05 μmol/l IBA + 1,4 µmol/l KT + 2 mg/l pirydoxin; (2) MS + 0,05 µmol/l IBA + 1,4 µmol/l KT + 2 mg/l pirydoxin; (3) 1/2 MS + 2 mg/l pirydoxine; (4) MS + 2 mg/l pirydoxine. Kết quả cho thấy môi trường thích hợp để tạo ra mô sẹo là MS + 0,05 μmol/l IBA + 1,4 μmol/l KT + 2 mg/l pirydoxine. Trong quá trình nuôi cấy mô, sự nhiễm nấm rất nguy hiểm, do đó, việc khử trùng bề mặt rất quan trọng. Có hai phương pháp khử trùng bề mặt. Phương pháp thứ 1, đỉnh chồi được ngâm trong dung dịch ethanol 70% (C2H5OH) 1 phút, 5% sodium hypochlorite (NaOCl) 1 phút và 7% hydrogen peroxide (H2O2) 10 phút. Phương pháp thứ hai là ngâm trong HgCl2 trong 3 phút. Kết quả cho thấy, phương pháp thích hợp nhất để khử trùng bề mặt các mẫu cấy là phương pháp thứ hai [113]. Nghiên cứu nuôi cấy in vitro thể bào tử và phôi của loài Huperzia cùng với phân tích lý hóa để xác định hàm lượng HupA đã được thực hiện. Kết quả nghiên cứu cho thấy, mẫu cấy sinh trưởng mạnh nhất ở môi trường 1/2 MS. Sau 3 tháng, các tế bào mô sẹo phát triển từ mô phân sinh đỉnh nuôi cấy chuyển thành phôi sinh dưỡng (phôi soma) [64]. Nuôi cấy mô 11 loài thực vật thuộc chi Huperzia đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy 11 loài trong chi Huperzia đã được nuôi cấy in vitro thành công [80]. Nghiên cứu nuôi cấy mô loài H. selago cho thấy môi trường ½ MS thích hợp cho quá trình hình thành mô sẹo và phát triển thành cây của loài H. selago [64]. Năm 2015, Ma và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phương pháp khử trùng
39. 27 bề mặt và khử trùng vi khuẩn nội sinh trong chồi đỉnh của cây Thạch tùng răng cưa. Kết quả cho thấy sau khi khử trùng bề mặt, khử trùng kết hợp 0,50 mg/l malachite green với 100 mg/l AAS có thể đạt được hiệu quả tốt trong việc khử trùng mẫu cấy. Sau khi khử trùng, các mẫu cấy vẫn chứa một loại nấm nội sinh, nhưng có thể nuôi cấy cộng sinh với nấm nội sinh này. Các tác giả đã thu nhận được chồi của loài Thạch tùng răng cưa, những chồi này dễ dàng phân chia từ thân, có tốc độ ra rễ cao. Tốc độ ra rễ đạt 90% sau 30 ngày nuôi cấy [114]. Xu và cộng sự (2018) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy khác nhau đến đặc điểm hình thái tế bào, DNA, sự tăng sinh khối và hàm lượng HupA trong nuôi cấy in vitro loài Thạch tùng răng cưa. Các tác giả đã chỉ ra rằng trong các môi trường nuôi cấy khác nhau gồm môi tường Sh, W và Shx thì Thạch tùng răng cưa đã biệt hóa thành dạng tản, dạng sợi nấm (Rhizomorph) và dạng rêu tương ứng. Các tế bào đơn phát triển thành các cụm và phân chia tạo thành mô. Các rễ và rễ giả đã phát triển trên bề mặt dạng sợi nấm và bề mặt tế bào dạng rêu. Sự tăng sinh khối của dạng tản là 1,79 ± 31%, của dạng sợi nấm tăng 833 ± 27% và của dạng rêu tăng 1,96 ± 52% và hàm lượng HupA tương ứng là 71,7 ± 1,54 µg/l, 20,1 ± 0,82 µg/l và 0 µg/l với sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0,01%). Dạng tản phát triển chậm hơn so với dạng rêu nhưng hàm lượng HupA của dạng tản là cao nhất, trong khi đó dạng rêu sinh trưởng nhanh nhất nhưng không sản xuất HupA. Nghiên cứu trên cho thấy môi trường nuôi cấy khác nhau có thể tạo ra các kiểu hình khác nhau đối với cùng kiểu gen của loài Thạch tùng răng cưa, với các thay đổi về tỉ lệ sinh trưởng và hàm lượng HupA. Dạng tản là dạng tốt nhất đối với việc sản xuất HupA [115]. 1.3.1.2. Nhân giống vô tính bằng giâm hom thân Wang và cộng sự (2008) đã thiết lập và tối ưu hóa hệ thống nuôi cấy đối với loài Thạch tùng răng cưa hoang dại, thông qua việc đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự tăng trưởng của cây. Thạch tùng răng cưa được trồng trong điều kiện tự nhiên, trạng thái tăng trưởng của Thạch tùng răng cưa theo các yếu tố khác nhau như: cường độ ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm tương đối (RH), mức phân bón đã được nghiên cứu và phân tích. Kết quả cho thấy, Thạch tùng răng cưa phát triển tốt trong môi trường nhiệt độ dao động 18,9 - 26,3°C, độ ẩm tương đối trong
40. 28 phạm vi 81% - 90% và cường độ ánh sáng trong khoảng từ 1330 - 3000 lx [116]. Zeng và cộng sự (2008) đã nghiên cứu điều kiện nhân giống loài Thạch tùng răng cưa trong môi trường sinh thái học và khả năng nảy mầm của chúng, đồng thời, nghiên cứu vai trò của chất điều hòa sinh trưởng (GA3) đối với sự phát triển của Thạch tùng răng cưa. Kết quả cho thấy: (1) Phương pháp nhân giống bằng giâm hoặc chiết hom thân, các cây con có thể phát triển rễ bất định; (2) Đỉnh chồi không thể xuất hiện trở lại nếu chúng đã bị cắt đi; (3) GA3 có tác động không đáng kể đến sự tăng trưởng của loài Thạch tùng răng cưa; (4) Trong 2 năm, cây phát triển từ mầm có thể dài thêm khoảng 6 cm; (5) Trong đất có chứa kiềm, hầu hết các cây sẽ khô héo; (6) Giâm hom thân, chiết hom thân và nhân giống bằng mầm là phương pháp tốt để nhân giống loài Thạch tùng răng cưa, đặc biệt là trong môi trường sống của cây [117]. Dựa trên các vườn ươm họ Huperziaceae, thí nghiệm giâm hom thân loài Thạch tùng răng cưa đã được Zhang và cộng sự (2009) tiến hành trong rừng sinh thái gốc. Kết quả cho thấy, môi trường thích hợp để giâm hom thân loài Thạch tùng răng cưa là đất rừng sinh thái. Mùa khác nhau (mùa xuân hoặc mùa thu) không ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả của thí nghiệm giâm hom thân trong môi trường sống ban đầu. Sử dụng chất điều hoà sinh trưởng IBA cho hiệu quả tốt nhất ở nồng độ 2×10-3 ppm IBA. Chỉ số giâm hom thân chồi đỉnh là tốt hơn đáng kể so với các nhóm giâm hom thân khác. Những kết quả này rất hữu ích cho nhân giống vô tính loài Thạch tùng răng cưa [118]. Qin và cộng sự (2010) đã nghiên cứu và phát triển phương pháp giâm hom thân đối với loài Thạch tùng răng cưa bằng hệ thống kỹ thuật NFT thông qua việc lựa chọn các mẫu cấy, so sánh các công thức hoocmon và phương pháp xử lý, lựa chọn nồng độ chất dinh dưỡng được cung cấp, chế độ nuôi cấy, cải thiện cấu trúc và chức năng của vườn ươm NFT. Kết quả cho thấy điều kiện thích hợp cho giâm hom thân loài Thạch tùng răng cưa là sử dụng hom thân chồi đỉnh + ngâm IBA 1000 mg/l trong 30 phút + chất dinh dưỡng vô cơ của môi trường 1/8 MS + 98 ngày nuôi cấy NFT. Tỉ lệ ra rễ đạt 98% và tỉ lệ sống đạt 93% - 98% [119]. Sử dụng các cây Thạch tùng răng có chiều cao 10 - 15 cm làm nguyên liệu và tiến hành nuôi trồng trên 4 loại giá thể là giá thể rong rêu, giá thể đất xói mòn,
41. 29 giá thể hỗn hợp đất xói mòn/ đất vườn và đất cát, sau 3 tháng nuôi trồng, kết quả cho thấy một lượng lớn các cây con đã bị héo. Tuy nhiên, tỷ lệ sống sót của Thạch tùng răng cưa cao nhất (90%) trong giá thể rong rêu, (53,30%) trong môi trường đất xói mòn, (40%) trong giá thể đá vermiculit/ perlit, (30%) trong giá thể cát, (20%) trong giá thể đất xói mòn/ đất vườn và thấp nhất (13%) trong môi trường đất vườn thí nghiệm. Do đó, giá thể thích hợp cho nhân giống Thạch tùng răng cưa là giá thể rong rêu [16]. Quá trình nhân giống loài Thạch tùng răng cưa bằng phương pháp giâm hom thân và mầm được tiến hành tại trang trại rừng thuộc vùng Yantuozhai, Gaowangjie, huyện Guzhang, địa khu Xiangxi, tỉnh Hồ Nam, Trung Quốc. Nghiên cứu cho thấy, 3 yếu tố được nghiên cứu để xác định ảnh hưởng đến quá trình tạo rễ của hom thân là chiều dài hom thân, nồng độ NAA và thời gian xử lý NAA. Kết quả cho thấy, trong môi trường đất rừng sinh thái, sử dụng hom thân có chiều dài 6 cm, ngâm 5 phút trong NAA 20 mg/l là thích hợp nhất cho việc nhân giống hom thân. Sau 60 ngày giâm, hom thân xuất hiện rễ bất định, tỷ lệ sống lên đến 90%. Sự tăng trưởng của hom thân tăng rõ rệt sau 210 ngày nuôi trồng [120]. 1.3.1.3. Nhân giống bằng bào tử Maridass và cộng sự (2011) đã nghiên cứu về sự phát triển của túi bào tử, bào tử nảy mầm, giai đoạn đầu của thể giao tử và tái sinh của H. hilliana (Spring) trong điều kiện tự nhiên của vùng Kodaiyar, miền Nam Ấn Độ. Kết quả quan sát túi bào tử trưởng thành dưới kính hiển vi của H. hilliana cho thấy bào tử nảy mầm trong vòng một tháng. Sự nảy mầm của bào tử và các giai đoạn phát triển của thể giao tử được quan sát ở điều kiện tự nhiên. Giai đoạn đầu của thể giao tử tăng trưởng mạnh mẽ. Chu kì sống của H. hilliana trong điều kiện tự nhiên ngắn, trong vòng 6 tháng (từ tháng 2/ 2011 đến tháng 7/ 2011) và bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường [121]. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng, bào tử của các loài thuộc chi Huperzia phải mất 2 - 5 năm để phát triển thành thể bào tử [122]. Loài Thạch tùng răng cưa phát triển chậm hơn, thường đòi hỏi 15 - 20 năm sinh trưởng từ khi bào tử nảy mầm đến lúc cây trưởng thành đạt chiều cao từ 10 - 30 cm [31, 32, 47]. Cho đến nay, thế giới chưa thiết lập được phương pháp nảy mầm bào tử ở môi trường đất
42. 30 hoặc môi trường nuôi cấy vô trùng. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống Thạch tùng răng cưa ở Việt Nam Ở Việt Nam, các nghiên cứu về nhân giống vô tính loài Thạch tùng răng cưa còn rất ít và bố trí chưa bài bản, quy mô nhỏ. Thạch tùng răng cưa là đối tượng mới trong nghiên cứu nuôi cấy mô ở nước ta. Hiện nay, tại Việt Nam, Phan Xuân Bình Minh và cộng sự (2018) đã tiến hành nghiên cứu về nuôi cấy mô loài Thạch tùng răng cưa nhưng mới chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm đến tỉ lệ sống, chết của mẫu cấy Thạch tùng răng cưa mà chưa đi sâu nghiên cứu, phân tích sự sinh trưởng, phát triển của cây con nuôi cấy mô [123]. Hơn nữa, nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở mức độ nghiên cứu, lưu giữ cây trong phòng thí nghiệm và cũng chưa xác định được sự có mặt của hợp chất HupA trong cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô. Trong khuôn khổ nghiên cứu của đề tài, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm về khử trùng mẫu cấy, khả năng nhân chồi, đánh giá chất lượng chồi và tiến hành nghiên cứu sự ra rễ của chồi Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô; xác định hàm lượng HupA trong cây con Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô. Tiếp theo, nghiên cứu đã tiến hành khảo sát khả năng ra cây của cây con nuôi cấy mô trên giá thể thích hợp tại các vùng nghiên cứu. Đây là một số bước quan trọng tạo cơ sở cho việc xây dựng quy trình nhân giống và phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa với quy mô lớn. Chính vì vậy, xuất phát từ giá trị sử dụng làm thuốc chữa các bệnh liên quan đến giảm trí nhớ và sự suy giảm nhanh chóng của loài Thạch tùng răng cưa trong tự nhiên, việc nghiên cứu phát triển nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa Huperzia serrata là hết sức cần thiết. Trong đó, hai vấn đề chính phải thực hiện là bảo tồn và nghiên cứu phát triển nguồn gen. Trong công tác bảo tồn nguồn gen, ngoài đánh giá đặc điểm hình thái và hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học của loài thì việc phân tích đa dạng di truyền và xác định mối quan hệ di truyền giữa các loài thực vật là những thông tin quan trọng cho chiến lược bảo tồn và phát triển các giống cây trồng. Đồng thời, những thông tin này cũng hữu ích cho việc mô tả nguồn gen và phân loại thực vật.
43. 31 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng: Cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb. Ex Murray) Trevis) được lựa chọn theo phương pháp của Nông Văn Duy và cộng sự [124]. Các mẫu Thạch tùng răng cưa thu tại các địa điểm khác nhau được Vườn Quốc gia Hoàng Liên và Viện Sinh học Tây Nguyên cung cấp. Các mẫu nghiên cứu được xác định tên khoa học bởi TS. Nông Văn Duy. Địa điểm lấy mẫu cụ thể tại 5 vùng thuộc Lào Cai và 3 vùng thuộc Lâm Đồng như trong hình 2.1, hình 2.2 và bảng 2.1. Hình 2.1. Bản đồ 5 vị trí lấy mẫu ở Lào Cai Hình 2.2. Bản đồ 3 vị trí lấy mẫu ở Lâm Đồng
44. 32 Bảng 2.1. Địa điểm lấy mẫu sử dụng trong nghiên cứu. STT Địa điểm Tên mẫu sử Thời gian lấy Tuổi Tọa độ lấy mẫu dụng trong mẫu mẫu Kinh độ Vĩ độ nghiên cứu 1 Nậm Cang, Sa SP1, SP1A 7h sáng 3- 5 104o02'19'' 22o13'12'' Pa, Lào 5/12/2015 năm Đông Bắc Cai 2 Bản Hồ, 8h sáng Sa Pa, SP2, SP2A 5/12/2015 3- 5 104o53'21'' 22o11'38'' Lào Cai năm Đông Bắc 3 Tả Van, Sa 9h sáng Pa, Lào SP3, SP3A 5/12/2015 3- 5 103o52'58'' 22o14'56'' Cai năm Đông Bắc 4 Lao Chải, 7h sáng Sa Pa, SP4, SP4A 6/12/2015 3- 5 103o51'44'' 22o17'12'' Lào Cai năm Đông Bắc 5 Tả Phìn, 9h sáng Sa Pa, SP5, SP5A 6/12/2015 3- 5 103o50'44'' 22o23'39'' Lào Cai năm Đông Bắc 6 Bidoup- Núi Bà, 7h sáng 3- 5 108o31'47'' 12o08'06'' Lạc DL1, DL1A 13/12/2015 năm Đông Bắc Dương, Lâm Đồng 7 Lạc Xuân, Đơn 8h sáng 3- 5 108o36'01'' 11o46'56'' Dương, DL2, DL2A 14/12/2015 năm Đông Bắc Lâm Đồng 8 Nam Ban, Lâm Hà, 9h sáng 3-5 108o16'35'' 11o49'56'' Lâm DL3, DL3A 15/12/2015 năm Đông Bắc Đồng Chú ý: kí hiệu các mẫu SP1A SP5A và DL1A DL3A là các mẫu sử dụng trong thí nghiệm chạy HPLC toàn bộ cây. 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất Hóa chất tách chiết DNA tổng số: Nitơ lỏng, đệm CTAB (H2O, Tris - HCl
45. 33 1M pH 8, EDTA 0,5 M pH 8, NaCl 5M, mecaptoethanol 14 M, CTAB), đệm TE, RNase (10 µg/ml), isopropanol lạnh, phenol, chloroform, isoamylalcohol (25:24:1), cồn tuyệt đối, cồn 70%. Hóa chất PCR: H2O khử ion, mồi, PCR master mix, DNA mẫu. Hóa chất chạy sắc ký bản mỏng: Chloroform, isopropanol, acetone, ammonia, ethyl acetate, 1 - butanol, acetic axit, H2O, KMnO4. Hóa chất chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Acetonitrile, amino axetat, axit axetic và nước cất loại dùng cho phân tích và chạy HPLC. Hóa chất sử dụng cho nhân giống: α - NAA, IBA, IAA, BA, kinetin, pyridoxine, glutamin HgCl2, Javen, C2H5OH, oxy già, axit clohydric, axit citric, myo - inositol, thiamin, axit nicotinic. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu được mua chủ yếu từ các hãng uy tín như Merck (Đức), Sigma (Mỹ), Himedia (Ấn Độ) 2.1.2.2. Thiết bị Các thiết bị dùng trong sinh học phân tử: máy điện di gel agarose MSmidi (Cleaver Scientific, Mỹ), máy PCR PTC - 100 (MJ Research Inc, Mỹ). Máy ly tâm thường và lạnh, máy chụp gel agarose CLS Mcrodoc (Cleaver Scientificc, Mỹ), cân phân tích, tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu, máy đo quang phổ UV - 1601 (UV - Visble Spectrophotometer, Shimadzu), máy Voltex, bể ổn nhiệt, nồi khử trùng, lò vi sóng, các loại pipetman và ống Eppendorf các loại. Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: box cấy vô trùng, bình nuôi cấy, máy đo pH cùng các trang thiết bị khác của phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.1.3. Môi trường nuôi cấy Môi trường cơ bản MS (Phụ lục 1.1), môi trường WPM (Phụ lục 1.2) và môi trường Gamborg B5 (Phụ lục 1.3) đã được thử nghiệm trong quá trình nuôi cấy mô loài Thạch tùng răng cưa. 2.1.4. Thời gian và địa điểm thí nghiệm Thời gian: từ tháng 12/2015 đến 11/ 2019. Địa điểm: Phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Vườn Quốc gia Hoàng Liên - Sa Pa (Lào Cai); Viện nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên - Đà Lạt (Lâm Đồng).
46. 34 2.2. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm tiến hành được bố trí theo sơ đồ tóm tắt sau: Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu 1. Đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng Đánh giá đa dạng di truyền cưa Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa Nhân giống vô tính bằng hình thức giâm hom thân 2. Nhân giống Thạch tùng răng cưa Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát. 2.2.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa 2.2.1.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm thực vật học a. Phương pháp kế thừa Thu thập các tài liệu nghiên cứu, các công trình nghiên cứu, báo cáo tài nguyên thực vật về sự phân bố, sinh học, sinh thái học và tri thức sử dụng của người dân bản địa có liên quan đến loài Thạch tùng răng cưa. b. Phương pháp thu mẫu: Thành phần loài được xác định nhanh ngoài thực địa về tên địa phương, tên phổ thông, tên khoa học và thu hái, mẫu có đủ thân, lá, cơ quan sinh sản để tra cứu định danh trong phòng thí nghiệm [125]. c. Phương pháp nội nghiệp: Sử dụng phương pháp so sánh hình thái để xác định thành phần loài thực vật [18, 19, 124].
47. 35 d. Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái: Mô tả hình thái (quan sát, chụp ảnh cây tại thực địa, phân tích, chụp ảnh cơ quan sinh sản, giám định tên khoa học của cây) [124]. f. Phương pháp đo kích thước: Dùng thước Panme, thước kẹp chuyên dụng để đo đường kính, chiều dài, chiều rộng của thân cây, lá cây. g. Phương pháp vi phẫu: Mẫu thân và lá Thạch tùng răng cưa được tiến hành vi phẫu theo phương pháp đã được mô tả bởi Nguyễn Quang Hiệu và cộng sự (2017) [5]. 2.2.1.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền a. Phương pháp tách chiết DNA tổng số DNA tổng số được tách từ các mẫu lá non theo phương pháp của Saghai Maroof và cộng sự (1984) có cải tiến [126]. DNA tổng số được tách theo các bước sau: Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng. Bổ sung 0,6 ml CTAB vào 20 mg bột đã nghiền. Ủ các ống trong bể ổn nhiệt (65°C/ 60 phút). Bổ sung 0,6 ml dung dịch chloroform/ isoamyl alcohol (24:1), ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Thu dịch pha trên, bổ sung isopropanol lạnh theo tỉ lệ 1:1. Để mẫu ở tủ -20°C qua đêm. Ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 15 phút, thu tủa. Thêm 0,6 ml EtOH 70% lạnh và ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 15 phút, thu tủa. Để khô và hòa tan tủa bằng 100 µl TE (10 mM Tris-HCl, 1 M EDTA, pH 8,0), ủ ở 65°C/ 60 phút. Bổ sung 4 µl RNase (10 mg/ ml), ủ hỗn hợp ở 37°C/ 60 phút. Bổ sung hỗn hợp phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25:24:1) theo tỉ lệ 1:1, ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 10 phút. Thu dịch pha trên, bổ sung 0,5 ml dung dịch chloroform/ isoamyl alcohol (24:1), ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 10 phút. Thu dịch pha trên, bổ sung EtOH 100% lạnh theo tỉ lệ 2 EtOH: 1 mẫu, thêm 15 μl NaCl 5M, ly tâm 12.000 vòng/ phút/ 10 phút. Thu tủa và rửa tủa bằng cồn 70% lạnh, bổ sung TE và giữ mẫu ở - 20°C. Kiểm tra sản phẩm DNA đã tách chiết bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Gel agarose được nhuộm trong ethidium bromide và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 - 260 nm trên máy chụp ảnh gel CLS - Microdoc (Cleaver
48. 36 Scientific Ltd, Mỹ). DNA tổng số sau khi tách chiết sẽ xác định hàm lượng và độ tinh sạch bằng quang phổ hấp phụ OD ở bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy quang phổ kế 8452 A Hewlett Parkard. Nồng độ DNA được tính theo công thức sau: Nồng độ DNA (µg/ µl) = OD260 x 50 x hệ số pha loãng DNA sau khi được xác định hàm lượng và độ tinh sạch được pha loãng về nồng độ 25 ng/ µl để chuẩn bị cho các thí nghiệm tiếp theo. b. Phương pháp PCR với các mồi RAPD Mười sáu (16) mồi ngẫu nhiên sử dụng trong phản ứng RAPD được tổng hợp bởi hãng Operon, Mỹ (Bảng 2.2.) Phản ứng PCR - RAPD Bảng 2.2. Trình tự nucleotide của 16 mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu Tên Trình tự nucleotide Tên Trình tự nucleotide STT STT mồi (5’-3’) mồi (5’-3’) 1 OPB1 GTTTCGCTCC 9 OPC1 TTCGAGCCAG 2 OPB4 GGACTGGAGT 10 OPC5 GATGACCGCC 3 OPB8 GTCCACACGG 11 OPC6 GAACGGACTC 4 OPB11 GTAGACCCGT 12 OPC10 TGTCTGGGTG 5 OPB13 TTCCCCCGCT 13 OPC12 TGTCATCCCC 6 OPB15 GGAGGGTGTT 14 OPC13 AAGCCTCGTC 7 OPB18 CCACAGCAGT 15 OPC17 TTCCCCCCAG 8 OPB20 GGACCCTTAC 16 OPC19 GTTGCCAGCC Phản ứng PCR được thực hiện theo phương pháp của Williams và cộng sự (1990) [127]. Thể tích cuối cùng là 25 μl dung dịch chứa: đệm PCR 10X (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 1,5 mM MgCl2 và 0,001% (w/ v) gelatin), 50 ng DNA khuôn, 0,25 mM dNTPs (Thermo Scientific), 0,025 mM mồi và 1U Taq polymerase. Hỗn hợp phản ứng được khuếch đại bằng máy PTC-100 (MJ Research Inc., USA). Phản ứng được thực hiện theo chương trình 94°C ở giai đoạn khởi đầu, 35 chu kỳ lặp lại theo 3 bước chính: biến tính DNA ở 94°C trong vòng 1 phút, gắn mồi 1 phút ở 37°C và kéo dài chuỗi ở 72°C trong 2 phút và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài chuỗi ở 72°C trong vòng 5 phút. Khi hoàn thành xong phản ứng PCR, các mẫu được giữ ở 4°C để phân tích. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%,
49. 37 nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh trên máy soi gel. c. Phân tích số liệu đa dạng di truyền Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng trên bản điện di ở các mẫu nghiên cứu theo DNA thang chuẩn (DNA marker). Nếu một băng DNA (có kích thước cụ thể) xuất hiện ở mẫu i nhưng không xuất hiện ở mẫu j hoặc đồng thời xuất hiện ở cả i và j nhưng không xuất hiện ở các mẫu khác thì băng DNA này gọi là băng đa hình. Ngược lại, nếu băng DNA nào xuất hiện ở tất cả các mẫu nghiên cứu thì gọi là băng đơn hình. Các băng được mã hóa bằng số tự nhiên 0 và 1. Nếu mẫu nào có băng thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0. Các số liệu nhị phân này được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc 2.0 để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu [128]. Ngoài ra, để đánh giá hiệu quả sử dụng mồi, các nhà khoa học còn đưa ra một thông số khác là hàm lượng thông tin tính đa hình PIC (Polymorphic Information Content) hay hệ số đa hình di truyền cho mỗi locus (i). Hệ số đa hình di truyền (PIC) được tính theo công thức [129]: 2 PIC = 1 - Σ Pi Pi: tần số xuất hiện của alen thứ i. 2.2.1.3. Xác định hàm lượng HupA trong cây Thạch tùng răng cưa Phương pháp thu mẫu: Cây Thạch tùng răng cưa có độ tuổi từ 3 - 5 tuổi, được thu hái tại rừng ở Lào Cai và Lâm Đồng. Sau đó, sấy mẫu ở 50°C cho đến khô và bảo quản ở nhiệt độ 25 - 26°C. Cây Thạch tùng răng cưa in vitro được nuôi cấy sau thời gian 3 năm (từ năm 2016 – 2019) được sử dụng làm nguyên liệu để xác định hàm lượng HupA. Phương pháp tách chiết HupA: HupA được tách chiết theo phương pháp của Ma và cộng sự (2005) có cải tiến cụ thể như sau: Nghiền mẫu bằng nitrogen lỏng. Cứ 1 g bột bổ sung 30 ml HCl 0,5% (chiết qua đêm). Tiếp theo, siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Lọc hỗn hợp sau khi siêu âm bằng giấy lọc và thêm ammonia vào phần dung dịch lọc được cho đến pH 9,0. Chiết bằng chloroform 2 lần với tỉ lệ 1:1, thu pha dưới. Loại
50. 38 chloroform bằng máy cô quay chân không. Hòa tan cặn với 3 ml methanol, lưu giữ ở 4°C [60]. a. Định tính hàm lượng HupA bằng phương pháp sắc kí bản mỏng (TLC) Phương pháp chạy sắc ký bản mỏng (TLC - Thin Layer Chromatography) được thực hiện theo phương pháp của Ma và cộng sự (2005) [60]: Pha HupA chuẩn với methanol ở nồng độ 1 mg/ 100 ml (giữ ở 4°C). Dịch chiết HupA được chạy với các hệ dung môi khác nhau như: chloroform : isopropanol : acetone : ammonia (4 : 1,5 : 4 : 0,15); chloroform : isopropanol : ethyl acetate : ammonia (4 : 1,5 : 4 : 0,1); 1-butanol : isopropanol : acetic acid (7,5 : 2: 4) hoặc 1-butanol : isopropanol : H2O (10 : 5 : 4). Chấm 1 µl mẫu HupA chuẩn và 10 µl các dung dịch chiết ở trên lên bản silicagel (bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Silicagel 60 F254). Các mẫu chấm cách nhau 7 mm, sấy khô rồi chạy ở các hệ dung môi khác nhau. Làm khô bản silicagel bằng máy sấy, sau đó phun KMnO4 0,3% lên bản silicagel, HupA xuất hiện có màu vàng nhạt (vết đốm). b. Xác định hàm lượng HupA bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - High-Performance Liquid Chromatography) [45]: Mẫu chất chuẩn HupA được pha trong dung môi MeOH thành nồng độ 1 mg/ml, sau đó pha loãng thành dãy các nồng độ khác nhau (0,03 mg/ml, 0,06 mg/ml, 0,13 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,5 mg/ml và 1 mg/ml HupA) để thiết lập đường chuẩn định lượng. Các mẫu Thạch tùng răng cưa được cân để xác định khối lượng, sau đó được chiết trong MeOH với thể tích xác định, dịch chiết được lọc qua màng lọc trước khi bơm vào hệ thống LC/ MS. Các dung dịch chất chuẩn và mẫu phân tích đều được lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi bơm vào hệ thống LC/ MS. Lượng mẫu bơm vào 1 µl, tốc độ dòng là 0,7 ml/ phút, bước sóng UV định lượng 310 nm. Hệ thống LC/ MS được kết nối với phần mềm Agilent OpenLAB Control Panel. Khí nitơ được bơm với tốc độ dòng 5,0 l/ phút, áp suất đầu phun đạt 60 psi, nhiệt độ làm khô
51. 39 đạt 250°C. Chế độ bắn mảnh phổ khối lựa chọn ESI ở mode postive với peak ion phân tử được lựa chọn 243,0 [M+H]+ của HupA. Pha động sử dụng hệ dung môi: acetonitrile (ACN)/ H2O (20 mM ammonium acetate, pH=4,0) với gradient nồng độ được thiết lập như sau: Tại thời gian 0 phút, 15 phút và 20 phút thì gradient nồng độ % ACN/ % H2O được sử dụng lần lượt là 10%/ 90% và 100%/ 0%. Tín hiệu của HupA được phát hiện dựa vào sự trùng thời gian lưu Rt giữa detector MS và số khối MS so với chất chuẩn. Đường chuẩn định lượng được xây dựng bằng phần mềm Chemostation dựa trên diện tích peak UV tại thời gian lưu. Đường chuẩn định lượng có dạng y = ax + b được xây dựng dựa trên mối quan hệ giữa diện tích peak UV được chọn (y) và nồng độ tương ứng của chất chuẩn (x). Hàm lượng HupA trong mẫu Thạch tùng răng cưa được tính theo công thức: CHupA (µg/ g) = (Co x Vdd x f x 1000)/ m Trong đó: Co: Hàm lượng HupA có trong dịch chiết Co tính theo đường chuẩn (mg/ml). Vdd: Thể tích dịch chiết thu được (ml). f: hệ số pha loãng. m: khối lượng mẫu thử (g). 2.2.2. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa 2.2.2.1. Phương pháp nhân giống vô tính bằng hình thức giâm hom thân a. Nguyên liệu Cây Thạch tùng răng cưa sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, kích thước đồng đều nhau, đã phân nhánh, được thu trong rừng Bidoup, Núi Bà, Lạc Dương, Lâm Đồng (DL1) và Nậm Cang, Sapa, Lào Cai (SP1) (thời vụ tháng 3/ 2015 và tháng 9/ 2015). Giá thể: phối trộn giữa đất rừng, phân chuồng hoai mục, trấu hun và phân trùn quế đảm bảo độ ẩm khoảng 85%. b. Phương pháp Thu và xử lý mẫu vật: Mẫu được thu vào những ngày có nắng, khô ráo và lấy vào buổi sáng từ 7 giờ đến 9 giờ. Sử dụng phương pháp so sánh hình thái: dựa vào các đặc điểm hình thái mẫu vật đã thu thập, tiến hành so sánh định loại với các mô tả theo tác giả Nông Văn Duy và cs, 2015 [124]. Đầu dưới cắt vát để tăng diện tích
52. 40 tiếp xúc với đất giúp cây mau mọc rễ. Vườn ươm được thiết kế ngay tại rừng. Sau khi chuẩn bị xong, hom thân sẽ được xử lý với IBA và NAA với các nồng độ và thời gian khác nhau. Sau khi xử lí xong, hom thân được cắm ngay vào giá thể giâm [130]. Các thí nghiệm được bố trí theo phương pháp khối ngẫu nhiên đầy đủ, 3 lần nhắc lại. Mỗi công thức giâm 120 hom thân/ lần nhắc lại trong bầu giâm kích thước 8 cm x 10 cm. Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chiều dài hom thân (từ 4 cm đến 10 cm) đến tỉ lệ hồi xanh, ra rễ và ra lá mới. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể giâm đến tỉ lệ hồi xanh, ra rễ, ra lá mới, thí nghiệm gồm 4 công thức với các thành phần: đất rừng: phân chuồng hoai mục : trấu hun : phân trùn quế: CT1 tỷ lệ: 3:1:0:0; CT2 tỷ lệ: 3:1:1:0; CT3 tỷ lệ: 3:1:1:1; CT4 tỷ lệ: 3:0:1:1. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng α - NAA, IBA, IAA đến sinh trưởng hom thân giâm Thạch tùng răng cưa. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng α -NAA đến khả năng ra rễ và tạo lá mới của hom thân. Thí nghiệm gồm 5 công thức: Không xử lý (nhúng nước lã), xử lý 500 ppm, xử lý 1500 ppm, xử lý 2500 ppm và 3500 ppm. Tất cả các công thức xử lý bằng cách nhúng sốc hom thân trong thời gian 4 - 6 giây. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng α - NAA đến khả năng ra rễ và tạo lá mới của hom thân. Thí nghiệm gồm 5 công thức: Không xử lý (ngâm nước lã), xử lý 10 ppm; xử lý 20 ppm, xử lý 30 ppm và 40 ppm. Tất cả các công thức xử lý bằng cách ngâm hom thân trong thời gian 5 phút. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng IAA đến khả năng ra rễ và tạo lá mới của hom thân. Thí nghiệm gồm 5 công thức: Không xử lý (ngâm nước lã), xử lý 50 ppm; xử lý 70 ppm, xử lý 90 ppm và 120 ppm. Tất cả các công thức xử lý bằng cách ngâm hom thân trong thời gian 30 phút. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng IBA đến khả năng ra rễ và tạo lá mới của hom thân. Thí nghiệm gồm 5 công thức: Không xử lý
53. 41 ngâm nước lã), xử lý 500 ppm; xử lý 1000 ppm, xử lý 2000 ppm và 3000 ppm. Tất cả các công thức xử lý bằng cách ngâm hom thân trong thời gian 30 phút. Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ nảy mầm (%); tỷ lệ ra rễ (%); tỉ lệ ra lá mới (%); số lá mới; số rễ. Mỗi thí nghiệm được theo dõi trong 4 tháng kể từ ngày bắt đầu đưa hom thân vào giá thể [130]. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ bón phân đến sinh trưởng cây con Thạch tùng răng cưa. Hom thân Thạch tùng răng cưa được xử lý và giâm trong các điều kiện thích hợp nhất đã được nghiên cứu ở 3 thí nghiệm trên. Sau 3 tháng giâm hom thân, chúng tôi sử dụng các loại phân để bón thúc cho cây con. Thí nghiệm được thiết kế gồm 5 công thức bón phân: Đối chứng (không bón phân), phân vi sinh Sông Gianh, phân chuồng (phân bò), phân NPK 3 màu và phân xanh. Các chỉ tiêu được theo dõi: tỉ lệ cây sống (%), đường kính thân và chiều cao cây con sau 2 tháng bón phân. Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ra ngôi cây con: ra ngôi 4 tháng sau giâm; ra ngôi 5 tháng sau giâm; ra ngôi 6 tháng sau giâm; ra ngôi 7 tháng sau giâm, ra ngôi 8 tháng sau giâm hom thân đến tỉ lệ cây con héo, chết và tỷ lệ cây con hồi xanh. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2013 và IRRISTAT version 5.0 (phương pháp kiểm định LSD, P < 0,05). Tỉ lệ hom thân hồi xanh (%) = Số hom thân hồi xanh/ ∑ số hom thân giâm Tỉ lệ ra rễ (%) = Số hom thân ra rễ/ ∑ số hom thân giâm. Tỉ lệ cây có lá mới = Số hom thân ra lá mới/ ∑ số hom thân giâm. 2.2.2.2. Phương pháp nhân giống vô tính bằng hình thức nuôi cấy mô a. Vật liệu Nguyên liệu thực vật được sử dụng là thân của cây Thạch tùng răng cưa được thu thập ở Bidoup-Núi Bà, Lạc Dương, Lâm Đồng. Các mẫu thực vật được xác định theo mô tả của tác giả Nông Văn Duy và cộng sự (2015) [124]. Môi trường cơ bản MS [131]; 1/2 MS: 1/2 thành phần khoáng của môi trường MS, vitamin giữ nguyên theo môi trường MS; 1/4 MS: 1/4 thành phần
54. 42 khoáng của MS, 1/2 vitamin của MS; 1/6 MS: 1/6 thành phần khoáng của MS, 1/4 vitamin của MS, môi trường WPM [132] và môi trường Gamborg B5 [133] đã được thử nghiệm. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA, IBA, kinetin và BA. Các thành phần khác: đường sucrose (20 g/l), agar (8 g/l). Điều kiện nuôi cấy: các thí nghiệm được đặt trong phòng nuôi ở nhiệt độ 22 ± 2oC, chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang trắng với cường độ ánh sáng 22,20 μmol/ m2/ s, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày. b. Phương pháp nghiên cứu i. Nghiên cứu kỹ thuật khử trùng mẫu nuôi cấy Đoạn chồi đỉnh 2 - 3 cm của cây Thạch tùng răng cưa khỏe mạnh được chọn làm nguyên liệu cho quá trình khử trùng mẫu. Đầu tiên, mẫu được rửa dưới vòi nước sạch, lắc trong nước xà phòng pha loãng 3 - 5 phút, rửa sạch xà phòng dưới vòi nước chảy. Sau đó, mẫu được chuyển vào tủ cấy vô trùng, mẫu được làm sạch trong EtOH 70% trong 30 giây, rửa lại với nước cất 3 - 5 lần, xử lý bằng HgCl2 0,05 - 0,15% trong thời gian từ 3 đến 7 phút, rửa lại nước cất 3 - 5 lần, lắc bằng NaClO 20% trong 7 phút, rửa lại nước cất 3 - 5 lần, ngâm mẫu cấy trong nước cất 1 tiếng, cấy chuyển vào môi trường MS. Đánh giá khả năng khử trùng mẫu sau 30 ngày nuôi cấy qua các chỉ tiêu: tỉ lệ mẫu vô trùng và tỉ lệ mẫu bật chồi. Sử dụng công thức cho hiệu quả khử trùng tốt nhất ở thí nghiệm này để tiến hành khử trùng mẫu cho các thí nghiệm tiếp theo. Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 120 mẫu và lặp lại 3 lần. ii. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy chồi đỉnh Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau đến tỉ lệ sống của chồi Thạch tùng răng cưa Chồi Thạch tùng răng cưa in vitro được cấy chuyển vào các môi trường khoáng MS, 1/2 MS, 1/4 MS, 1/6 MS, WPM, B5 có bổ sung 20 g/l đường, 8 g/l agar, pH 5,7 -5,8, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng để tìm ra môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của chồi Thạch tùng răng cưa với các chỉ tiêu theo dõi sau 60 ngày nuôi cấy: chiều cao chồi, đặc điểm chồi, số lá và kích thước lá. Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 120 mẫu và lặp lại 3 lần.
55. 43 Nghiên cứu khả năng tạo chồi của cây Thạch tùng răng cưa Chồi Thạch tùng răng cưa được cấy chuyển vào môi trường khoáng thích hợp (đã xác định ở trên) có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng BA, kinetin nồng độ 0,1 - 1,5 mg/l. Theo dõi khả năng hình thành, phát triển của chồi sau 120 ngày nuôi cấy. Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 120 mẫu và lặp lại 3 lần. Nghiên cứu khả năng tạo rễ cho chồi Thạch tùng răng cưa in vitro Các chồi in vitro có chiều dài từ 2 - 3 cm thu được từ các thí nghiệm trên, được tách riêng lẻ và cấy lên môi trường thích hợp có bổ sung riêng lẻ NAA, IBA với nồng độ từ 0,1- 1,5 mg/l để theo dõi khả năng hình thành và phát triển rễ của chồi in vitro sau 60 ngày nuôi cấy. Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 115 mẫu và lặp lại 3 lần. iii. Phương pháp nhân giống Thạch tùng răng cưa bằng nuôi cấy mô sẹo Bảng 2.3. Các môi trường nuôi cấy mô sẹo Chất điều hòa sinh trưởng (mg/l) Vitamin Axit amin Môi trường IBA Kinetin Piridoxine Glutamin MS 0,01 0,30 2 - ½ MS 0,01 0,30 2 - ¼ MS 0,01 0,30 2 - MS - - 2 - ½ MS - - 2 - ¼ MS - - 2 - MS 0,01 0,30 2 3 ½ MS 0,01 0,30 2 3 ¼ MS 0,01 0,30 2 3 MS - - 2 3 ½ MS - - 2 3 ¼ MS - - 2 3 MS 0,015 0,30 2 3 ½ MS 0,015 0,30 2 3 ¼ MS 0,015 0,30 2 3 MS 0,015 0,30 - 3 ½ MS 0,015 0,30 - 3 ¼ MS 0,015 0,30 - 3 Sử dụng đỉnh chồi (1 - 2 mm) của cây Thạch tùng răng cưa nuôi cấy mô để
56. 44 tiến hành nuôi cấy tạo mô sẹo trên các môi trường MS khác nhau (MS, ½ MS và ¼ MS) bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng, vitamin và axit amin ở các nồng độ khác nhau (Bảng 2.3). Mỗi thí nghiệm được tiến hành với 30 mẫu và lặp lại 3 lần. iii. Phương pháp xử lí số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft excel 2013 và IRRISTAT version 5.0 (phương pháp kiểm định LSD, P < 0,05). iv. Một số khâu cơ bản trong quy trình đưa cây trong ống nghiệm ra ngoài vườn ươm a. Giai đoạn tái sinh rễ để tạo cây con hoàn chỉnh Các cụm chồi được tách thành các cụm chồi nhỏ 2 - 5 chồi/ cụm và cấy chuyển sang môi trường ra rễ. Khi cây con có chiều cao 4 - 6 cm, có 3 - 5 rễ, chiều dài rễ đạt 2 - 3 cm và rễ có màu vàng nhạt thì kết thúc nuôi cây trong ống nghiệm. b. Giai đoạn chuẩn bị vườn ươm cây, chuẩn bị đất, làm bầu Đất vườn ươm, làm bầu phải tơi xốp, giầu dinh dưỡng, không mang mầm mống của sâu bệnh. Sử dụng giá thể CT2 trong thí nghiệm trên gồm đất rừng : phân chuồng hoai mục : trấu hun tỉ lệ 3 : 1 : 1 làm giá thể ươm cây. Nếu trồng trong bầu thì sử dụng túi bầu kích thước khoảng 8 x 12 cm, độ sâu hom thân giâm xuống đất 3,5 cm. Công thức tính: khối lượng đất = (số bầu) x (thể tích bầu) x 1,3 c. Giai đoạn ra cây từ ống nghiệm Dùng panh để lấy các cây Thạch tùng răng cưa trong ống nghiệm ra, rửa sạch bộ rễ, rửa sạch thạch bám vào rễ, không được làm thương tổn đến bộ rễ. Cắt bỏ 1/4 – 1/3 chiều dài lá để tránh thoát hơi nước giai đoạn mới trồng, tỉa bỏ lá già, tách cây chỉ để mỗi cây 1 - 3 chồi, chú ý khi tách không làm rụng rễ, gẫy cây. d. Giai đoạn trồng và chăm sóc cây con Cấy cây Thạch tùng răng cưa vào luống đã chuẩn bị với mật độ 100 cây/ m2,
57. 45 hoặc trồng trực tiếp vào bầu, sau khi cấy phun nước đủ ẩm cho luống cây. Khi giâm xong, phun thuốc trừ nấm, vi khuẩn: Kasuran hoặc Kasai, sau 02 ngày phun nhắc lại. Chế độ chăm sóc sau khi cấy: Trong 10 ngày đầu thường xuyên phun ẩm cho cây 6-8 lần/ ngày và huấn luyện ra môi trường tự nhiên bằng cách che phủ nilong luống cây, che sáng cho luống cây bằng lưới che râm với độ che sáng 80%. Sau 15 ngày bỏ dần lưới che râm để tỉ lệ che sáng 50%, giảm dần số lần tưới nước trong một ngày và tăng lượng nước tưới trong một lần. Sau 3 tháng, tháo lưới che râm, bón thúc cho cây con bằng phân chuồng (phân bò) với liều lượng 500 kg/ 1 ha. Phân tích số liệu: các giá trị trung bình và sai số chuẩn tính toán theo phần mềm Microsoft excel 2013. Tỉ lệ mẫu vô trùng (%) = số mẫu cấy vô trùng / ∑ số mẫu cấy Tỉ lệ mẫu bật chồi (%) = Số mẫu bật chồi / ∑ số mẫu vô trùng. Tỉ lệ chồi ra rễ = Số chồi ra rễ/ ∑ số chồi cấy. Tỉ lệ tạo mô sẹo = Số mẫu tạo mô sẹo / ∑ số mẫu cấy.
58. 46 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đánh giá đặc điểm sinh học của nguồn gen loài Thạch tùng răng cưa 3.1.1. Đánh giá đặc điểm hình thái của cây Thạch tùng răng cưa Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái cây Thạch tùng răng cưa tại Lâm Đồng và Lào Cai cho thấy cây trưởng thành (đã có bào tử) có dạng cây thân thảo đứng, nằm hoặc thõng xuống đất, phân nhánh theo lối rẽ đôi (Hình 3.1, Hình 3.2). Tại Lâm Đồng, kết quả cho thấy cây có chiều cao 11,70 - 40 cm, trung bình 29,05 cm (SD = 8,45) với đường kính thân 0,14 - 0,28 cm, trung bình 0,23 cm (SD = 0,04), lá hình bầu dục, mũi mác, dài 1,35 - 3,35 cm, rộng 0,25 - 0,44 cm, phiến lá tương đối mỏng, nổi rõ gân giữa, mép lá có răng cưa không đều, với số lá trung bình 122,95 lá/ 1 cây (SD = 20,45). Cây Thạch tùng răng thu tại Lào Cai có chiều cao từ 10,57 cm đến 40,03 cm, trung bình 28,74 cm (SD = 9,01) với đường kính thân từ 0,12 cm đến 0,31 cm, trung bình 0,23 cm (SD = 0,04), lá hình bầu dục, mũi mác, mép lá có răng cưa, nổi rõ gân giữa, chiều dài 0,44 cm - 4,67 cm (trung bình 2,12 cm), chiều rộng 0,10 - 3 cm (trung bình 0,32 cm), với số lá từ 65 đến 149 lá/ 1 cây, trung bình 119,10 lá/ 1 cây (SD = 22,92) (Bảng 3.1). Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu ở Lâm Đồng và Lào Cai. Địa Giá trị Chiều Đường Số lá Chiều Chiều điểm thu cao cây kính thân (lá) dài lá rộng lá mẫu (cm) (cm) (cm) (cm) Lớn nhất 39,97 0,28 151 3,01 0,43 Lâm Nhỏ nhất 11,90 0,15 77 1,38 0,26 Đồng Trung bình 29,05 0,23 122,95 2,20 0,36 SD ± 8,45 ± 0,04 ± 20,45 ± 0,48 ± 0,04 Lớn nhất 40,03 0,31 149 4,67 3 Nhỏ nhất 10,57 0,12 65 0,44 0,10 Lào Cai Trung bình 28,74 0,23 ± 0,04 119,10 ± 2,12 ± 0,32 ± SD ± 9,01 22,92 0,63 0,17 Kết quả bảng 3.1 cho thấy tại hai vùng Lào Cai và Lâm Đồng đa số các cây Thạch tùng răng cưa có sự tương đồng về mặt hình thái, tuy nhiên, một số cây có sự sai khác. Thậm chí ngay trong từng vùng nghiên cứu thì hình thái và các đặc điểm
59. 47 hình thái của một số cây cũng khác nhau (Bảng 3.1 và Hình 3.2). Điều này có thể giải thích là do môi trường sống và điều kiện khí hậu ở các vùng khác nhau, do đó loài Thạch tùng răng cưa có sự biến đổi về mặt hình thái giúp chúng thích nghi với điều kiện môi trường sống đa dạng. Đây được xem là hiện tượng đa hình của loài, hiện tượng này rất phổ biến trong tự nhiên và góp phần tạo nên sự đa dạng sinh học của loài. 1 mm 1cm Hình 3.1. Hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lâm Đồng 1 cm Hình 3.2. Một số hình thái cây Thạch tùng răng cưa thu tại Lào Cai Như vậy, cây Thạch tùng răng cưa trưởng thành (cây đã có túi bào tử) có chiều cao trung bình khoảng 28 cm đến 29 cm, thân có dạng tròn, đường kính thân trung bình 0,23 cm, chiều dài lá trung bình 2 cm, chiều rộng lá trung bình 0,32 cm,