Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất..

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất..

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  NGUYỄN THỊ THANH NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI RÚT GÂY HOẠI TỬ THẦN KINH VÀ TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC-XIN PHÒNG BỆNH CHO CÁ MÚ (Epinephelus spp) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, năm 2018
2. Công trình được hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Công Hoạt 2. PGS.TS. Lê Văn Năm Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện Họp tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ ngày tháng năm 2018. Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư Viện Quốc gia 2. Thư Viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 3. Thư Viện Viện Di truyền Nông nghiệp
3. MỞ ĐẦU Ngành thủy sản trong những năm gần đây đã và đang phát triển nhanh chóng và trở thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam. Nghề nuôi cá biển được đánh giá là một nghề mang lại hiệu quả kinh tế cao và cá mú được xem là một trong số những đối tượng chủ lực. Cá mú (Epinephelus spp.) có giá trị kinh tế rất cao do giàu hàm lượng dinh dưỡng, thịt cá thơm ngon cho nên cá mú được thị trường trong và ngoài nước ưa chuộng. Tuy nhiên, khi nghề nuôi cá mú phát triển thì người nuôi cũng gặp không ít khó khăn bởi dịch bệnh gây ra trên cá. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếu trên cá mú thường là vi rút, nấm và vi khuẩn trong đó nguy hiểm nhất là bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous Necrocis - VNN) hay bệnh não và võng mạc (Viral Encephalopathy and Retinopathy - VER) do Betanodavirus gây ra. Vi rút có thể tấn công và gây bệnh trên cá mú ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá từ ấu trùng, cá giống đến cá thương phẩm. Khi bị bệnh cá có biểu hiện rối loạn thần kinh như bơi mất thăng bằng, bơi xoay tròn, đầu chúc xuống dưới hoặc treo trên mặt nước hay nằm dưới đáy bể, đáy lồng. Cá bệnh có thể chết sau 3-5 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80- 100% (Đỗ Thị Hoà và cs, 2004) [2]. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú đang ngày càng gia tăng đòi hỏi cần có các biện pháp phòng bệnh hiệu quả. Cá mú có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch khá tốt khi tiếp xúc với kháng nguyên, do đó việc nghiên cứu tạo nguyên liệu để sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá đang ngày càng trở nên cấp thiết. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh và tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú (Epinephelus spp.)”. Mục tiêu của đề tài luận án: - Xác định được vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam và một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh. - Tạo được kháng nguyên tái tổ hợp và đánh giá khả năng sinh kích thích miễn dịch của kháng nguyên để làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn: - Tính khoa học: Luận án đã xác định được vi rút gây bệnh và một số đặc tính sinh học của chúng. Đồng thời luận án đã sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 của vi rút gây bệnh, đánh giá tính sinh đáp ứng miễn dịch để làm cơ sở cho việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú. Dữ liệu khoa học của luận án sẽ cung cấp thêm tư liệu giảng dạy và nghiên cứu về bệnh và định hướng sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú nuôi hiện nay. - Tính thực tiễn: Đề tài đã tạo được kháng nguyên tái tổ hợp protein T4 và đánh giá được khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp làm nguồn nguyên liệu sản xuất vắc- xin phòng bệnh cho cá mú góp phần hạn chế dịch bệnh, tăng sản lượng cá nuôi và phát triển bền vững nghề nuôi cá mú. Đóng góp mới của đề tài luận án: - Lần đầu tiên tại Việt Nam đã nghiên cứu một cách toàn diện về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú, đã xác định được 26 chủng vi rút và một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh. - Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam đã tạo được kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp, kháng nguyên có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch bảo hộ cho cá mú kéo 1
4. dài cho đến ngày thứ 90 sau khi tiêm. Đây là cơ sở khoa học để sử dụng kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Cấu trúc của luận án: Luận án chính gồm 105 trang với 16 bảng số liệu và 32 hình. Luận án gồm 5 phần: Mở đầu (3 trang); tổng quan tài liệu (34 trang); phương pháp nghiên cứu (19 trang); kết quả và thảo luận (47 trang); kết luận và kiến nghị (2 trang). Luận án tham khảo 71 tài liệu trong đó 15 tài liệu tiếng Việt, 56 tài liệu tiếng Anh. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số đặc điểm sinh học của cá mú Cá mú thuộc họ Serranidae, giống Epinephelus. Theo Viện Hải dương học Nha Trang, vùng biển nước ta có khoảng 30 loài cá mú (Lê Anh Tuấn, 2004) [11]. Cá mú sống tại những vùng nước ấm, nhiệt độ thích hợp cho cá mú phát triển là từ 22-32ºC, thích hợp nhất là 25-30ºC. Cá chịu được độ mặn từ 11- 41‰. Hình 1.1 Hình thái ngoài cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides) Ở cá mú có hàng rào cơ học như dịch nhờn, da và mang bảo vệ giúp cơ thể cá chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh (Kim Văn Vạn và Lê Thanh Hòa, 2009) [12]. Cá mú có hệ thống miễn dịch đặc hiệu vì vậy khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, chúng có khả năng sản sinh ra kháng thể đặc hiệu để chống lại các kháng nguyên, bảo vệ cá tránh tác hại của tác nhân gây bệnh. 1.2. Ý nghĩa kinh tế và tình hình nuôi cá mú Cá mú có giá trị kinh tế cao, cá mú đen và cá mú chấm nâu có khối lượng từ 800 đến 1000g là 200.000 - 300.000 đồng/kg. Cá mú chấm đỏ giá dao động 400.000-500.000 đồng/kg [73][74]. Nghề nuôi cá mú ở nước ta tập trung phát triển ở vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nghệ An, Nha Trang, Ninh Thuận, Bình Thuận, Vũng Tàu và Kiên Giang (Lê Anh Tuấn, 2004 [11], Võ Văn Quang và cs, 2013 [5]). Trong những năm qua cả nước có 500 ha vùng biển ven bờ được xây dựng thành các ao đìa nuôi cá mú. Sản lượng cá mú hàng năm cung cấp trên 3000 tấn sản phẩm. Tuy nhiên cá mú thường hay bị một số bệnh như đốm đỏ, bệnh hoại cơ, bệnh đường ruột do vi khuẩn gây nên, đặc biệt là bệnh hoại tử thần kinh do vi rút gây ra. Hiện nay, chưa có vắc-xin phòng ngừa loại vi rút này và biện pháp phòng ngừa chủ yếu vẫn là đảm bảo vệ sinh và cách ly các nguồn lây nhiễm vi rút. 1.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới và Việt Nam 1.3.1. Đặc điểm về bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển 1.3.2. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú trên thế giới 1.3.3. Tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam 1.3.4. Các phương pháp chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá Hiện nay để chẩn đoán bệnh VNN thường sử dụng các phương pháp: mô bệnh học, phân lập vi rút trên tế bào, sinh học phân tử, sử dụng kính hiển vi điện tử và chẩn đoán miễn dịch học (OIE, 2005) [15]. 1.4. Tổng quan về vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh Tác nhân gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá là Betanodavirus, nhân RNA, hình cầu, đường kính 25-30 nm. Hệ gen có cấu trúc phân đoạn, RNA mạch đơn, tuyến tính hai phía có hai tiểu phần. Tiểu phần lớn chứa RNA1 (3.1 kb) mã hóa cho một protein có 2
5. kích thước 100 kDa với chức năng như là RNA polymerase. Tiểu phần nhỏ chứa RNA2 trên đó chứa hai vùng bảo tồn cao là T2 (870 bp) và T4 (420 bp) (Nishizawa và cs, 1997) 1.5. Một số biện pháp phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú Hiện nay chưa có loại vắc-xin nào đạt được hiệu quả phòng bệnh hoại tử thần kinh. Vì vậy những biện pháp đảm bảo vệ sinh, tránh các nguồn lây nhiễm vẫn được coi như là biện pháp chủ yếu để tránh gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá mú. 1.6. Kháng nguyên tái tổ hợp và tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá 1.6.1. Kháng nguyên tái tổ hợp của tác nhân gây bệnh Kháng nguyên tái tổ hợp là kháng nguyên (protein miễn dịch) được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền. Trên thế giới, việc sử dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất vắc- xin kiểm soát một số bệnh nguy hiểm cho cá nuôi đã được nghiên cứu từ những năm 1980. Việc ứng dụng công nghệ sinh học để sản xuất ra số lượng lớn kháng nguyên bằng con đường tái tổ hợp đã giúp tiết kiệm chi phí sản xuất, an toàn với cá nuôi. Công nghệ DNA tái tổ hợp được sử dụng để sản xuất kháng nguyên phòng bệnh do vi rút cho cá đã và đang phát triển rất mạnh mẽ 1.6.2. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá trên thế giới Hiện trên thế giới có một số loại vắc-xin vô hoạt sử dụng để phòng bệnh do vi rút gây ra như hoại tử tuyến tụy (IPNV), hoại tử cơ quan tạo máu (IHNV), nhiễm trùng xuất huyết (VHSV), vi rút đường máu cá chép vào mùa xuân (SVCV). Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi rút trên tế bào thường chi phí cao, khả năng tinh khiết khó. Gần đây, sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để sản xuất vắc-xin protein từ vi rút phòng bệnh cho cá rất khả thi và đưa lại hiệu quả kinh tế cao (Christie và cs, 1997; Lorenzen và cs, 2005) [26][43]. 1.6.3. Tình hình sử dụng vắc-xin phòng bệnh cho cá tại Việt Nam Năm 1996 - 1998, Bùi Quang Tề và cs đã chế tạo vắc-xin từ vi khuẩn Aeromonas hydrophila để phòng bệnh cho cá trắm cỏ, vắc-xin có tỷ lệ bảo hộ từ 90 đến 100% (Bùi Quang Tề và cs, 2006) [7]. Năm 2003, Vũ Dũng Tiến đã chế tạo vắc-xin từ sự kết hợp giữa kháng nguyên ngoại bào và nội bào của vi khuẩn Aeromonas hydrophila để phòng bệnh cho cá trắm cỏ, vắc-xin có hiệu quả tốt với tỷ lệ bảo hộ đạt 100% (Vũ Dũng Tiến và cs, 2003) [9]. Năm 2003 - 2005 đề tài KC-06-20NN đã chế tạo được vắc-xin phòng bệnh xuất huyết hoại tử nội tạng cho cá tra và cá basa. Vắc-xin đảm bảo được chỉ tiêu an toàn trên cá thí nghiệm, tỷ lệ bảo hộ đạt từ 90 - 100% (Bùi Quang Tề và cs, 2006) [7]. Năm 2006 - 2007, Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản II đã triển khai đề tài nghiên cứu tạo vắc-xin phòng bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasianodon hypothalmus) nuôi công nghiệp ở đồng bằng Sông Cửu Long. Kết quả bước đầu cho thấy khả năng đáp ứng miễn dịch ở cá tra đối với vi khuẩn E. ictaluri qua hàm lượng kháng thể có trong máu cá đạt cao. Từ năm 2011, Phạm Thị Tâm và cs đã tiến hành nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú nuôi công nghiệp. Sản phẩm từ đề tài là vắc-xin vô hoạt bằng formalin nồng độ 0,03% ở 4oC trong thời gian 5 ngày; lựa chọn được chất bổ trợ là dầu Montanique ISA70 có khả năng tăng kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch phù hợp với cá mú trong điều kiện thí nghiệm. Vắc-xin đã có tác dụng phòng bệnh cho cá mú, hiệu lực bảo vệ trên 83% cá giống, an toàn 100%, có độ vô trùng tuyệt đối (Phạm Thị Tâm và cs, 2015) [6]. 3
6. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Vi rút gây hoại tử thần kinh (NNV) - Kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp 2.1.2. Vật liệu nghiên cứu - Tế bào GS1 (lách cá mú) của hãng Sigma (Đức) - Vector pGEM-T và vector pET32a+ của hãng Novagen (Mỹ). - Chủng E. coliJM109 và E. coliBL21(DE3) của hãng HV Biotek. - Enzyme EcoRI (Invitrogen) - Kít RT-PCR one step (Quiagen của Mỹ), kít tinh sạch DNA Qick Gel Extraction (Invitrogen), thang DNA và protein (Invitrogen). - Cột Nikel chelating Resin (Invitrogen) - Cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides), cá mú cọp (Epinephelus fuscoguttatus) và mú chuột (Cromileptes altivelis) ở các kích cỡ khác nhau; - Cá mú chấm nâu (Epinephelus coioides) giai đoạn cá bột, cá con (chiều dài từ 1,5 – 2 cm) - Các loại môi trường, dụng cụ nuôi cấy tế bào: Leibovit, MEM, HANK's, FCS, kháng sinh, kháng nấm, - Các loại hóa chất tinh khiết cho xét nghiệm mô bệnh học; các hóa chất sử dụng trong kỹ thuật sinh học phân tử của các hãng: Sigma, Bio-Basic, Invitrogen, Biological bao gồm: IPTG, ampicilin, X-gal, agarose, EDTA, SDS, cao nấm men, peptone, NaCl, Ethidium Bromide, Ethanol, Isopropanol, Sodium acetate, acid acetic, glycine, methanol, TBST, BSA, TBS, Tris HCl, EDTA, TAE, NaOH, T4 ligase 2.2. Nội dung nghiên cứu - Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam - Xác định một số đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú - Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Nhóm các phương pháp xác định vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú - Phương pháp thu và xử lý mẫu 51 mẫu cá mú nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh ở vùng biển Quảng Ninh (QN1- QN8), Hải Phòng (HP1- HP11), Nam Định (NĐ1-NĐ11), Khánh Hòa (KH1-KH9), Bình Thuận (BT1-BT12) được thu và bảo quản lạnh. Mẫu bệnh phẩm được thu não và mắt. - Phương pháp mô bệnh học: theo OIE, FAO (2005). 4
7. - Xác định vi rút bằng nuôi cấy trên tế bào theo phương pháp Q.W.Qin và cs. (2006) - Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mẫu tế bào gây nhiễm VNN bằng Kit RNeasy Qiagen của hãng Qiagen. - Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR). - Điện di trên gel agarose: theo phương pháp của Sambrook và cs, 2001. - Phương pháp tách dòng gen: theo Sambrook và cs, 2001. - Phương pháp tạo plasmid tái tổ hợp mang gen T4. + Phân cắt plasmid pGEM-T bằng enzyme giới hạn EcoRI, ủ ở 37oC trong vòng 2,5- 3h. Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả. + Ghép nối gen T4 vào pGEM-T: . - Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến: với tế bào chủ là E.coli JM109, biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt. - Phương pháp tách plasmid từ vi khuẩn E. coli: - Phương pháp kiểm tra plasmid tái tổ hợp: - Phương pháp tinh sạch DNA bằng gel agarose: theo PureLink® Quick Gel Extraction Kit có trong bộ TOPO® TA Cloning Kit của hãng Invitrogen. - Giải trình tự gen T4 bằng máy tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). Dùng phần mềm Blast xác định mức tương đồng của trình tự gen T4 với GenBank. 2.3.2. Phương pháp xác định đặc tính sinh học của vi rút gây hoại tử thần kinh - Xác định độc lực của vi rút trên tế bào: dịch vi rút pha loãng từ 10-1 đến 10-9 với môi trường Leibovitz’s 15 (10% FCS). Giữ khay đã cấy ở 28oC để vi rút hấp phụ lên tế bào. Độc lực của vi rút đánh giá qua chỉ số TCID50. - Phương pháp xác định độc lực của vi rút trên cá mú: dịch vi rút pha loãng từ 10-1 đến 10-9, mỗi độ pha loãng tiêm 30 cá mú con (1,5-2 cm), liều 0,1 ml/con. Quan sát biểu hiện lâm sàng, tỷ lệ chết và gen mã hóa kháng nguyên T4 sau 5 ngày. Khả năng gây bệnh của vi rút đánh giá bằng chỉ số LD50. - Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên tế bào -6,8 GS1: chọn chủng QN4 có TCID50 cao (10 ) để gây nhiễm trên tế bào. Mỗi chủng NNV o được nuôi cấy ở 4 ngưỡng nhiệt độ: 17, 22, 27 và 32 C, liều gây nhiễm là liều TCID50 = 10-6,8. Theo dõi và đánh giá CPE sau 5 ngày thí nghiệm. - Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây nhiễm của vi rút trên cá -7,5 mú: Chủng QN4 có liều LD50 cao (10 ) được gây nhiễm vào cá mú. Lô đối chứng cá được tiêm môi trường Leibovit”z 15. Cá nuôi ở 280C (cả ngày) và 280 (ban ngày)/240C (ban đêm). Sau 15 ngày đánh giá tỷ lệ chết và xác định gen T4. 5
8. 2.3.3. Nhóm các phương pháp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên và đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp - Chuẩn bị vector pET32a+ để thực hiện phản ứng nối gen T4 (pET32a+-T4). Dùng phương pháp sốc nhiệt để đưa vector pET32a+-T4 vào tế bào E. coliBL21. - Tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc sau biến nạp - Kiểm tra PCR và enzyme giới hạn để xác định sự có mặt của gen T4 trong plasmid. - Nuôi cấy E. coli BL21 mang plasmid tái tổ hợp pET32a+-T4 - Phương pháp điện di SDS-PAGE. - Phương pháp Western blot: nhằm nhận biết protein tái tổ hợp T4 thể hiện được tính đặc hiệu với vi rút gây hoại tử thần kinh. - Phương pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp + Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hoà của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ: Đối chứng dương: huyết thanh thỏ khỏe, không có kháng thể đặc hiệu được ủ với 4 chủng QN2 (liều 10 TCID50) rồi hấp phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú nhỏ (≤ 5 g) bằng phương pháp tiêm (liều 0,05 ml dịch NNV cường độc QN2 hiệu giá 103 LD50) Đối chứng âm: huyết thanh thỏ khỏe, được gây miễn dịch với E.coliBL21- pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp được pha loãng theo hệ số 10 rồi hấp phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú con (≤ 5 g) bằng phương pháp tiêm. Lô thí nghiệm: huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 và 4 protein T4 tái tổ hợp, pha loãng theo hệ số 10, ủ với chủng QN2 liều 10 TCID50 rồi hấp phụ vào tế bào GS1 hoặc gây nhiễm vào cá mú con (≤ 5 g) bằng phương pháp tiêm (liều 3 0,05 ml dịch vi rút QN2 hiệu giá 10 LD50). + Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hoà của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú. Đối chứng dương: cá mú bột sạch bệnh được nghiền, xử lý kháng sinh, lọc và pha loãng 4 theo hệ số 10, ủ với chủng QN2 với liều 10 TCID50 và gây nhiễm vào tế bào GS1. Đối chứng âm: cá mú bột sạch bệnh được gây miễn dịch với kháng nguyên E.coli BL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp với 2 liều (0,2 mg/liều), liều nhắc lại sau 15 ngày. Theo dõi cá trong 90 ngày, định kỳ 15 ngày thu mẫu, nghiền, xử lý kháng sinh, lọc, pha loãng theo hệ số 10 rồi gây nhiễm vào tế bào GS1 Lô thí nghiệm: cá mú bột sạch bệnh được gây miễn dịch với E. coliBL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp với 2 liều (0,2 mg/liều), liều nhắc lại sau 15 ngày. Theo dõi cá trong 90 ngày, định kỳ thu mẫu, nghiền, xử lý kháng sinh, lọc, pha loãng rồi ủ với chủng 4 QN2 (10 TCID50) và gây nhiễm vào tế bào GS1, đánh giá CPE trong 7 ngày 6
9. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam 3.1.1. Sàng lọc mẫu nhiễm vi-rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp mô bệnh học Kết quả sàng lọc mẫu nhiễm vi-rút gây hoại tử thần kinh trên 51 mẫu cá mú được trình bày ở hình 3.1 và bảng 3.1 cho thấy có 26 mẫu xuất hiện không bào trong các mô mắt và mô não. Các không bào trong mẫu kiểm tra có dạng hình tròn hoặc hình elip, kích thước không bào từ 5-10µm. Hình 3.1. Bệnh tích tế bào ở mô não và mô mắt cá (a. Cá mú bệnh, b. Không bào trong não, c. Không bào trong mắt) Bảng 3.1. Kiểm tra vi-rút bằng phương pháp mô bệnh học Bệnh tích tế bào trong mô não cá Bệnh tích tế bào trong mô mắt cá (26 mẫu) (17 mẫu) Ký hiệu mẫu Tỷ lệ (%) Ký hiệu mẫu Tỷ lệ (%) QN2, QN4, QN7 37,50 QN2, QN4, QN7 37,50 HP2, HP4, HP5, HP8, HP10 45,45 HP4, HP5, HP8 27,27 NĐ1, NĐ3, NĐ4, NĐ5, NĐ1, NĐ4, NĐ5, 72,72 45,45 NĐ7, NĐ8, NĐ10, NĐ11 NĐ10, NĐ11 KH4, KH5, KH6, KH9 44,44 KH4, KH5 22,22 BT1, BT2, BT4, BT7, BT9, BT2, BT4, BT9, 50,00 33,33 BT12 BT12 Trung bình 50,98 Trung bình 33,33 Vi rút gây bệnh có ở tổ chức thần kinh của 26 mẫu thu thập được. Các mẫu còn lại tuy không thấy không bào xuất hiện nhưng không nằm ngoài khả năng đang ở thời kỳ tiền nhiễm. Do đó chúng tôi tiếp tục việc xác định vi rút bằng phương pháp sinh học phân tử để xác định gen mã hóa kháng nguyên của NNV. 3.1.2. Xác định mẫu cá nhiễm vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR 7
10. Bảng 3.2. Xác định vi-rút gây bệnh hoại tử thần kinh bằng phương pháp RT-PCR Số mẫu dương tính với gen T4 của NNV Tỷ lệ (%) (27 mẫu) QN2, QN4 25,00 HP2, HP4, HP6, HP7, HP8, HP10, HP11 63,63 NĐ1, NĐ3, NĐ4, NĐ5, NĐ7, NĐ8, NĐ10, NĐ11 72,72 KH4, KH5, KH9 33,33 BT2, BT3, BT4, BT7, BT9, BT10, BT12 58,33 Trung bình 52,94 Kết quả cho thấy có 27/51 mẫu dương tính với gen T4 chiếm tỷ lệ 52,94%. Sản phẩm PCR của một số mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm NNV cụ thể là HP1, HP2, NĐ3, NĐ2, QN2, QN4, KH4, KH 5, BT2 và BT3 được thể hiện ở hình 3.2. Mẫu HP2, NĐ3, QN2, QN4, KH4, KH5, BT2, BT3 xuất hiện băng có kích thước khoảng 420 bp tương ứng với kích thước đoạn gen T4. Mẫu HP1, NĐ2 không xuất hiện băng vạch. Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm RT-PCR của một số mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm NNV (Giếng 1-10: các mẫu lần lượt HP1, HP2, NĐ3, NĐ2, QN2, QN4, KH4, KH5, BT2, BT3, Giếng 11: marker) 3.1.3. Xác định vi rút trên tế bào Đề tài đã sử dụng dòng tế bào GS1 để đánh giá khả năng gây nhiễm của NNV, với 27 mẫu dương tính với gen T4, chúng tôi đã xác định được 26 chủng vi rút (hình 3.3, bảng 3.3). Mẫu HP11 không có biểu hiện bệnh tích ở mô não và mô mắt. Hình 3.3. Bệnh tích của tế bào GS1 sau khi gây nhiễm NNV A: Tế bào sau gây nhiễm NNV 2 ngày, tế bào kết hạt và co tròn, B: Tế bào sau gây nhiễm NNV 7 ngày, C: Không bào trong tế bào GS1 gây nhiễm NNV sau 2 ngày. 8
11. Từ ngày thứ 2 tế bào có hiện tượng kết hạt, co tròn, hình thành nhiều hạt không bào kích thước đa dạng; sau 5 ngày tế bào chết cục bộ ở khắp bề mặt đĩa nuôi cấy và tới ngày thứ 7, toàn bộ tế bào bị phá hủy hoàn toàn bởi hiện tượng tan bào (hình 3.3). Bảng 3.3. Xác định vi rút gây hoại tử thần kinh gây nhiễm trên tế bào GS1 Ký Thời gian xảy ra hiệu ứng CPE (giờ) STT hiệu mẫu 24 48 72 96 120 144 168 1 QN2 _ _ + + + ++ +++ 2 QN4 _ + + + ++ +++ ++++ 3 HP2 _ _ + + + ++ +++ 4 HP4 _ + + + ++ +++ ++++ 5 HP6 _ _ + + + ++ +++ 6 HP7 _ + + + ++ +++ ++++ 7 HP8 _ + + + ++ +++ ++++ 8 HP10 _ _ + + + ++ +++ 9 HP11 _ _ _ _ _ _ _ 10 NĐ1 _ + + + ++ +++ ++++ 11 NĐ3 _ _ + + + ++ +++ 12 NĐ4 _ + + + ++ +++ ++++ 13 NĐ5 _ + + + ++ +++ ++++ 14 NĐ7 _ _ + + + ++ +++ 15 NĐ8 _ + + + ++ +++ ++++ 16 NĐ10 _ _ + + + ++ +++ 17 NĐ11 _ _ + + + ++ +++ 18 KH4 _ _ + + + ++ +++ 19 KH 5 _ + + + ++ +++ ++++ 20 KH9 _ _ + + + ++ ++ 21 BT2 _ _ + + + ++ ++++ 22 BT3 _ + + + ++ +++ ++++ 23 BT4 + + + ++ +++ ++++ 24 BT7 _ + + + ++ +++ ++++ 25 BT9 - + + + ++ ++ +++ 26 BT10 - + + + ++ ++ ++ 27 BT12 - - + + + ++ ++++ Ghi chú: ++++: CPE > 98%; +++: CPE > 85%; ++ : CPE > 50%; +: CPE > 20%; +: nghi ngờ có CPE > 10%; -: không có CPE Các chủng vi rút xác định được có gen T4 và gây bệnh tích trên tế bào. Vì vậy đây là vi rút gây hoại tử thần kinh, để chứng minh cho nhận định trên chúng tôi giải trình tự gen T4 nhằm xác định đến loài. 3.1.4. Giải trình tự gen mã hóa kháng nguyên T4 của NNV đã xác định Gen T4 của các chủng NNV đại diện: QN2, HP7, NĐ1, KH5, BT12 được tinh sạch để tách dòng và xác định trình tự. Các kết quả dưới đây thể hiện bước xác định trình tự gen T4 của chủng KH5. 9
12. Hình 3.5. Thiết kế vector tái tổ hợp pGEMT- T4 A: Điện di sản phẩm tinh sạch gen T4 (giếng1: sản phẩm T4 tinh sạch; giếng M: 1kb Plus Ladder); B: sơ đồ thiết kế vector tách dòng gen T4 Sản phẩm sau tinh sạch có kích thước khoảng 420bp tương đương kích thước gen T4 (Hình 3.5A). Tách dòng bằng vector pGEM-T Easy, vector tái tổ hợp được thiết kế theo Hình 3.5B. Vector tái tổ hợp pGEM-T-T4 được biến nạp vào E. coli JM109. Lựa chọn các khuẩn lạc trắng và nuôi trong môi trường LB lỏng (bổ sung ampicilin 100µg/ml) để tách plasmid tái tổ hợp và cắt, tinh sạch gen T4. Sản phẩm DNA plasmid tách từ các khuẩn lạc trắng được kiểm tra trên gel agarose 1% thể hiện ở Hình 3.6 (A), kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen T4 thể hiện trong Hình 3.6 (B), kiểm tra sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn thể hiện trong Hình 3.6 (C). Hình 3.6. Điện di kiểm tra sản phẩm T4 tái tổ hợp (A): DNA plasmid tách từ 3 khuẩn lạc trắng (giếng 1,2,3); (B): Kiểm tra sản phẩm PCR của gen T4 từ 3 plasmid tái tổ hợp (giếng 1,2,3) (C): Kiểm tra đoạn DNA gen T4 chèn vào DNA của 3 plasmid tái tổ hợp cắt bằng emzyme EcoRI (giếng 1,2,3) Giếng M: Thang chuẩn1kb Plus Ladder; Kết quả hình 3.6 (C): các giếng 1-3 xuất hiện vạch có kích thước khoảng 420bp tương đương với kích thước gen T4, có khả năng chúng tôi tách dòng thành công gen T4. Sau khi xác định trình tự gen T4, chúng tôi sử dụng phần mềm Blast để xác định mức độ tương đồng của trình tự gen T4. Kết quả cho thấy đoạn gen T4 mã số HM017077.1 có độ tương đồng là 100% so với trình tự gen mã hóa kháng nguyên vỏ của NNV. 10
13. Hình 3.7. So sánh độ tương đồng của đoạn gen giải trình tự với đoạn gen T4 của Betanodavirus mã số HM017077.1 Từ kết quả giải trình tự gen như trên cho phép chúng tôi kết luận rằng chủng vi rút xác định được là Nervous Necrosis Virus thuộc họ Betanodavirus. 3.2. Xác định một số đặc tính sinh học của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh 3.2.1. Xác định đặc tính gây bệnh của vi rút trên tế bào Bảng 3.5. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên tế bào GS1 Liều gây chết 50% tế bào (TCID50) STT Ký hiệu mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Trung bình -6,9 -7 -6,9 -6,8 -6,9 1 QN2 10 10 10 10 10 -6,9 -7 -6,8 -6,8 -6,8 2 QN4 10 10 10 10 10 -4,3 -4,4 -4,3 -4,5 -4,3 3 HP2 10 10 10 10 10 -5 -4,9 -4,8 -4,9 -4,9 4 HP4 10 10 10 10 10 -4,8 -4,8 -4,7 -4,9 -4,8 5 HP6 10 10 10 10 10 -6,8 -6,9 -6,8 -7 -6,8 6 HP7 10 10 10 10 10 -6 -5,8 -5,7 -6,1 -5,9 7 HP8 10 10 10 10 10 -3,9 -4 -3,9 -3,8 -3,9 8 HP10 10 10 10 10 10 -6,8 -6,8 -7 -6,9 -6,8 9 NĐ1 10 10 10 10 10 -3 -3,1 -3 -3 -3 10 NĐ3 10 10 10 10 10 11
14. Liều gây chết 50% tế bào (TCID50) STT Ký hiệu mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Trung bình -4,9 -4,9 -4,8 -4,9 -4,9 11 NĐ4 10 10 10 10 10 -5,9 -5,8 -6 -5,9 -5,9 12 NĐ5 10 10 10 10 10 -4,3 -4,3 -4,2 -4,3 -4,3 13 NĐ7 10 10 10 10 10 -4,8 -4,9 -4,9 -4,9 -4,9 14 NĐ8 10 10 10 10 10 -3 -3 -3 -2,9 -3 15 NĐ10 10 10 10 10 10 -3 -3,1 -3 -3 -3 16 NĐ11 10 10 10 10 10 -2,7 -2,8 -2,7 -2,6 -2,7 17 KH4 10 10 10 10 10 -6,8 -6,8 -6,8 -6,9 -6,8 18 KH5 10 10 10 10 10 -3 -3 -3,1 -3 -3 19 KH9 10 10 10 10 10 -4,8 -4,9 -4,9 -5 -4,9 20 BT2 10 10 10 10 10 -4,8 -4,8 -4,7 -4,8 -4,8 21 BT3 10 10 10 10 10 -5,9 -5,9 -5,9 -5,8 -5,9 22 BT4 10 10 10 10 10 -6,8 -6,9 -6,8 -6,7 -6,8 23 BT7 10 10 10 10 10 -3,9 -4 -3,9 -3,9 -3,9 24 BT9 10 10 10 10 10 -2,5 -2,7 -2,9 -2,8 -2,7 25 BT10 10 10 10 10 10 -4,8 -4,9 -4,9 -4,9 -4,9 26 BT12 10 10 10 10 10 Qua thí nghiệm cho thấy có 6/26 chủng vi rút có độc lực cao với TCID50 từ -6,8 -6,9 -4,8 -5,9 10 đến 10 ; 10/26 chủng có liều TCID50 đạt 10 - 10 , ở độ pha loãng vi rút là -8 -2,7 -4,3 10 ; 10 chủng còn lại độc lực yếu có liều TCID50 đạt 10 - 10 . 3.2.2. Xác định đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú Đề tài đã chọn 6 chủng độc lực cao (QN2, QN4, HP7, NĐ1, KH5 và BT7) và 2 chủng độc lực thấp (KH4, BT10) để gây nhiễm trên cá mú. Theo dõi cá trong 5 ngày để xác định tỷ lệ chết và gen T4, kết quả trình bày trong bảng 3.6. Bảng 3.6. Đặc tính gây bệnh của vi rút gây hoại tử thần kinh trên cá mú Liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) STT Ký hiệu mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình -6,2 -6,2 -6,1 -6,2 1 QN2 10 10 10 10 -7,5 -7,6 -7,5 -7,5 2 QN4 10 10 10 10 -7,5 -7,5 -7,4 -7,5 3 HP7 10 10 10 10 -5,4 -5,6 -5,5 -5,5 4 NĐ1 10 10 10 10 -6,3 -6,2 -6,4 -6,2 5 KH5 10 10 10 10 -6,5 -6,5 -6,4 -6,5 6 BT7 10 10 10 10 -3,7 -3,6 -3,6 -3,6 7 KH4 10 10 10 10 -2,5 -2,7 -2,5 -2,6 8 BT10 10 10 10 10 9 Đối chứng ND ND ND ND (Ghi chú: ND không đánh giá) 12
15. -7,5 Kết quả cho thấy: 2 chủng QN4 và HP7 có độc lực cao trên cá với LD50 đạt 10 , 2 -2,6 -3,6 chủng có LD50 trên cá thấp từ 10 -10 là KH4, BT10. 3.2.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút trên tế bào -6,8 Tế bào GS1 được gây nhiễm NNV chủng QN4 với hiệu giá là 10 TCID50/ml rồi nuôi trong 5 ngày, theo dõi mật độ tế bào sống. Hình 3.8. Mật độ tế bào sống sót sau khi gây nhiễm NNV Kết quả trình bày ở hình 3.8 cho thấy, 220C là ngưỡng nhiệt độ phù hợp nhất cho sự nhân lên của vi rút và quá trình gây nhiễm của vi rút trên tế bào GS1. 3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng gây bệnh của vi rút trên cá mú Khả năng gây bệnh của NNV ở nhiệt độ 28oC (cả ngày và đêm) được thể hiện ở bảng 3.8 cho thấy: lô cá mú được gây nhiễm chủng QN4 có tỷ lệ chết tích lũy là 82,1% sau 3 ngày, 100% sau 6 ngày theo dõi. Đối chứng tỷ lệ chết là 10% sau 15 ngày theo dõi. Qua bảng cho thấy tác nhân gây chết cá là NNV chủng QN4 với sự xuất hiện của gen T4. Bảng 3.8. Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở 28oC cả ngày và đêm Tỷ lệ chết của cá mú (%) Xác định gen T4 Thời gian Lần Lô thí Lần 2 Lần 3 TB Đối chứng Đối chứng (ngày) 1 nghiệm 0 0 0 0 0 0 - - 3 86,6 83,3 76,6 82,1 3,3 + - 6 100 100 100 100 6,6 + - 9 6,6 - 12 10,0 - 15 10,0 - Ghi chú: +: có gen T4 -: không có gen T4 13
16. Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở điều kiện nhiệt độ nước nuôi cá là 28oC vào ban ngày và 24oC vào ban đêm được thể hiện ở Bảng 3.9. Bảng 3.9. Khả năng gây bệnh của NNV trên cá mú ở 28oC ban ngày và 24oC ban đêm Thời Tỷ lệ chết của cá mú (%) Xác định gen T4 gian Lô đối Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Đối chứng Đối chứng (ngày) chứng 0 0 0 0 0 0 - - 3 80,0 86,6 90,0 85,5 0 + - 6 100 100 100 100 3,3 + - 9 6,6 - 12 10,0 - 15 10,0 - Ghi chú: +: có gen T4 -: không có gen T4 Ở nhiệt độ 28oC (ban ngày) và 24oC (ban đêm), tỷ lệ chết của cá sau 3 ngày là 85,5% và sau 6 ngày cá chết hoàn toàn. Lô đối chứng sau 15 ngày tỷ lệ chết là 10%. Tác nhân gây bệnh có gen T4, chính là NNV chủng QN4 đã gây nhiễm. 3.3 Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. 3.3.1. Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4. Đề tài sử dụng pET 32a+ làm vector biểu hiện gen T4, chủng E. coli JM109 kiểm tra vector tái tổ hợp, chủng E. coli BL21(DE3) để biểu hiện gen T4. Quy trình tạo vector tái tổ hợp mang gen T4 (pET32a+- T4) được thể hiện ở hình 3.9. Phản ứng cắt plasmid vector pGEM-T-T4 và plasmid pET32a+ được thực hiện ở 370C trong 4 giờ, sản Hình 3.9. Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp phẩm cắt được điện di trên pET32a+- T4 gel agarose 1%. Kết quả phản ứng cắt vector pGEMT-T4 và vector pET32a+ thể hiện ở Hình 3.10. 14
17. Hình 3.10. Cắt vector pGEM-T-T4 (A) và vector pET32a+ (B) bằng enzyme EcoRI Giếng 1,2,3,4 (A): sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4; Giếng 1,2,3 (B): sản phẩm cắt plasmid pET32a+; Giếng M: Marker 1kb plus Kết quả Hình 3.10 (A): các giếng số 1, 2, 3 và 4 đều xuất hiện hai băng, một băng có kích thước khoảng 420bp (kích thước gen T4) và một băng có kích thước khoảng 3015bp (kích thước vector pGEM-T Easy). Hình 3.10 (B) cho thấy các giếng số 1, 2, 3 chỉ xuất hiện một băng vạch duy nhất có kích thước tương đương vector pET 32a+ khoảng 5900bp. Như vậy chứng tỏ đã cắt thành công plasmid tái tổ hợp pGEMT-T4 và plasmid pET32a+ tạo ra các vị trí tương thích để gắn gen T4 vào vector pET32a+. Băng vạch có vùng gen T4 kích thước 420bp và băng vạch có vector pET32a+ kích thước 5900bp được cắt để tinh sạch. Các sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4 và vector pET32a+ được điện di trên gel agarose 1%, kết quả được thể hiện ở Hình 3.11. Hình 3.11. Tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pGEM-T-T4 và vector pET32a+ Giếng 1: gen T4 sau khi tinh sạch, Giếng 2: plasmid pET32a+ sau tinh sạch M: 1kb Plus Ladder 15
18. Phản ứng nối gen được thực hiện ở 40C, ủ từ 14 đến 16h. Để kiểm tra sự tạo thành vector tái tổ hợp pET32a+-T4, sản phẩm nối gen được biến nạp vào tế bào E. coli JM 109. Sàng lọc chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampicillin (100µg/ml), nuôi ở 37oC trong 16h, kết quả được thể hiện ở hình 3.12. Sau 16 giờ tiến hành chọn sáu khuẩn lạc sang nuôi cấy trong 3ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampicillin (100µg/ml), nuôi lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở 370C trong 16h. Sau đó tách plasmid, điện di trên gel agarose 1%, kết quả ở hình 3.13. Hình 3.12. Đĩa khuẩn lạc sau khi Hình 3.13. Kiểm tra sự tạo thành vector chuyển gen pET32a+-T4 vào E. pET32a+-T4 trong vi khuẩn E. coli JM109 coli JM109 (Giếng 1-6: Plasmid các dòng từ 1 đến 6; Giếng M: 1kb plus ladder) Tiến hành PCR với cặp mồi P1 và R3 để kiểm tra sáu mẫu plasmid mang vector tái tổ hợp pET32a+- T4 và mẫu vector pET32a+ (đối chứng). Kết quả thể hiện ở hình 3.14 cho thấy sáu dòng vi khuẩn được lựa chọn đều có mang gen T4, trong khi đó mẫu đối chứng không mang gen này. Như vậy có thể khẳng định vector tái tổ hợp pET32a+- T4 đã được thiết kế thành công. Hình 3.14. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt gen T4 trong vector tái tổ hợp Giếng 1-6: sản phẩm PCR plasmid pET32a+-T4 các dòng đánh số từ 1 đến 6, Giếng M: 1kb Plus ladder; Giếng ĐC: sản phẩm PCR plasmid pET32a+ 16
19. 3.3.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây hoại tử thần kinh 3.3.2.1 Tạo chủng vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) mang gen mã hóa kháng nguyên của NNV. Sau khi tạo được vector tái tổ hợp pET32a+-T4 đề tài đã lựa chọn bốn trong sáu dòng vi khuẩn để biến nạp vào chủng vi khuẩn biểu hiện E. coli BL21 (DE3). Vi khuẩn biến nạp được nuôi cấy trên môi trường LB thạch (bổ sung kháng sinh Ampicillin 100µg/ml), nuôi ở 37oC từ 12 đến 16h, kết quả thể hiện ở hình 3.15 Hình 3.15. Đĩa khuẩn lạc sau khi biến nạp pET32a+-T4 vào E.coli BL21. Để kiểm tra khả năng biến nạp của plasmid pET32a+-T4 vào tế bào E. coli BL21(DE3), chúng tôi tiến hành sàng lọc bằng cách tách plasmid và kiểm tra PCR. Sản phẩm tách plasmid được điện di trên gel agarose 1%, kết quả thể hiện ở hình 3.16 Hình 3.16. Điện di đồ plasmid tái tổ hợp Hình 3.17. Kiểm tra khả năng biến nạp vector tách từ chủng E. coli BL21(DE3) mang tái tổ hợp pET32a+ -T4 vào chủng E. coli vector pET32a+-T4 BL21(DE3). Giếng 1-4: Plasmid các dòng từ 1 đến 4; Giếng 1-4: Sản phẩm PCR plasmid các dòng từ 1 Giếng M:GeneRulerTM 1kb DNA Ladder đến 4, Giếng M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder Thực hiện phản ứng PCR kiểm tra các mẫu plasmid mang vector pET32a+-T4. Kết quả điện di trên gel agarose 1% thể hiện ở hình 3.17 cho thấy các giếng từ 1 đến 4 đều xuất hiện vạch có kích thước tương đương với kích thước gen T4 là 420 bp. Do đó có thể kết luận chủng E. coli BL21(DE3) mang gen T4 của NNV đã được tạo thành công. 17
20. 3.3.2.2. Biểu hiện gen T4 trong tế bào vi khuẩn tái tổ hợp Nuôi tăng sinh bậc một bốn khuẩn lạc thuộc bốn dòng đã lựa chọn. Nuôi lắc đến khi OD600nm của dịch nuôi đạt từ 0,5 - 0,6 thì bổ sung chất cảm ứng IPTG. Lấy canh khuẩn vi khuẩn tái tổ hợp tại các thời điểm chưa bổ sung IPTG, sau khi bổ sung IPTG 2h, 4h, 6h để phân tích sự biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bằng điện di SDS-PAGE, kết quả được thể hiện ở hình 3.18 và hình 3.19. Hình 3.18. Điện di SDS-PAGE gel Hình 3.19. Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dòng số 1 và 2 polyacrylamide 15% dòng số 3, 4 Giếng1,5: protein dòng 1,2 chưa cảm ứng Giếng1,5: protein dòng 3,4 chưa cảm ứng IPTG; Giếng 2,3,4: protein dòng 1 cảm ứng IPTG; Giếng 2,3,4: protein dòng 3 cảm bởi IPTG 2h, 4h, 6h; Giếng 6,7,8: protein ứng IPTG 2h, 4h và 6h; giếng 6,7,8: dòng 2 cảm ứng bởi IPTG 2h, 4h, 6h. Giếng protein dòng 4 cảm ứng IPTG trong 2h, M: Broad-way Multi prestained protein 4h và 6h. Giếng M: Broad-way Multi Marker prestained protein Marker Kết quả hình 3.18: Giếng 1 và 5 không xuất hiện vạch protein lạ. Giếng 2,3,4 xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thước khoảng 17 kDa. Giếng số 6,7,8 xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thước khoảng 25 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết protein T4. Như vậy dòng số 2 đã biểu hiện thành công gen T4. Kết quả hình 3.19 cho thấy: Giếng số 1,5 không xuất hiện các vạch protein lạ. Các giếng 2,3,4,6,7,8 xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thước là 25 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết của kháng nguyên protein T4. Từ các kết quả trên cho thấy đã biểu hiện thành công gen T4 trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3) ở các dòng vi khuẩn BL21- pET32a+-T4 số 2, 3, 4; protein tái tổ hợp có kích thước là 25 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết của kháng nguyên protein T4 của NNV. 18
21. Sự biểu hiện protein của gen T4 được khẳng định lại bằng phương pháp lai Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng NNV. Kết quả cho thấy vị trí phản ứng giữa protein tái tổ hợp T4 với kháng thể đặc hiệu chuẩn tương ứng tại vạch điện di có kích thước khoảng 25 kDa (hình 2.20). Vì vậy có thể kết luận kháng nguyên protein T4 của NNV đã được biểu hiện thành công trong tế bào E. coli BL21(DE3). Hình 2.20. Kết quả Western blot của protein T4 tái tổ hợp (M: thang chuẩn; giếng 1: protein tái tổ hợp T4; giếng 2: protein T4 chuẩn của Mỹ) 3.3.2.3. Đánh giá các điều kiện biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên T4 của vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh Xác định thời gian thu mẫu Tế bào E. coli mang plasmid tái tổ hợp được nuôi cấy, thu mẫu tại các thời điểm sau cảm ứng 3, 4 và 12h. Kết quả (hình 3.21) cho thấy, thu mẫu sau 3h và 12h cho lượng protein ít hơn, mẫu thu sau 4h cho lượng protein nhiều nhất. Hình 3.21. Lượng protein tái tổ hợp T4 được tổng hợp theo thời gian (M: thang protein chuẩn; Giếng 1, 2, 3: lượng protein tái tổ hợp tại các thời điểm 3, 4, 12h) 19
22. Xác định nhiệt độ nuôi cấy Chủng E. coli BL21-pET32a+- T4 ở 28oC, 30oC và 37oC, thu mẫu sau 4h cảm ứng. Kết quả thể hiện ở hình 3.22 cho thấy ở 28oC và 30oC không xuất hiện băng protein ở kích thước 25 kDa, nhiệt độ nuôi 37oC thì đã biểu hiện được protein tái tổ hợp T4. Hình 3.22. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp T4 (giếng 1, 2, 3: lượng protein khi nuôi ở 28oC, 30oC và 37oC, M: thang protein chuẩn). Xác định nồng độ chất cảm ứng IPTG IPTG được bổ sung vào môi trường với các nồng độ từ 1- 6 mM. Kết quả trong hình 3.23 cho thấy, sau khi cảm ứng IPTG, dòng tái tổ hợp đã tổng hợp một lượng lớn protein có kích thước khoảng 25 kDa (kích thước lý thuyết của protein T4 tái tổ hợp). Trong các nồng độ IPTG được khảo sát cho thấy gen T4 được biểu hiện Hình 3.23. Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến mức độ tốt nhất khi chủng được biểu hiện protein T4 tái tổ hợp cảm ứng IPTG ở nồng độ M: thang chuẩn, giếng 1 - 6: nồng độ IPTG tương ứng từ 1 1 mM. mM đến 6 mM. 20
23. 3.3.3. Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp Kết quả Hình 3.24 cho thấy, tất cả các phân đoạn dịch tinh sạch đều xuất hiện duy nhất một băng protein ở kích thước 25 kDa chứng tỏ protein T4 đã được tinh sạch thành công. Đề tài đã sử dụng kháng nguyên protein T4 này để thử nghiệm đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hoà nhằm tạo nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh cho cá mú. Hình 3.24. Điện di protein T4 tinh sạch trên gel SDS- PAGE (M: Thang protein chuẩn, giếng 1-5: kháng nguyên T4 thu ở pha 1, 2, 3, 4, 5) 3.3.4. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp 3.3.4.1. Đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ Khả năng kích thích tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên E.coliBL21- pET32a+-T4 và protein tái tổ hợp T4 trên thỏ được trình bày trong Bảng 3.10 và bảng 3.11. Bảng 3.10. Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ở mô hình in vitro Thời gian thu Đối Độ pha loãng huyết thanh thỏ được huyết thanh chứng Đối chứng âm (CPE %) gây miễn dịch để trung hòa liều gây thỏ sau khi 4 dương nhiễm 10 TCID50 gây miễn dịch (CPE (ngày) E.coli BL21- Protein tái tổ E.coli BL21- Protein tái tổ hợp %) pET32a+-T4* hợp T4* pET32a+-T4* T4* 5 98 0 0 ND ND 15 98 0 0 1: 5 ND 25 98 0 0 1: 200 1: 50 35 98 0 0 1: 800 1: 200 45 98 0 0 1: 800 1: 200 60 98 0 0 1: 400 1:100 (Ghi chú: * Độ pha loãng cao nhất cho phản ứng trung hòa (không có hiệu ứng bệnh tích tế bào); ND: huyết thanh không trung hòa vi rút cường độc) Bảng 3.10 cho thấy: Các mẫu đối chứng âm đã không gây hiệu ứng bệnh tích tế bào. Các mẫu đối chứng dương, huyết thanh thỏ bình thường không có khả năng trung hòa chủng QN2 cường độc, tất cả các giếng nuôi cấy tế bào đều có xảy ra hiệu ứng bệnh tích tế bào (CPE). Ở lô thí nghiệm vào ngày thứ 15, chỉ có lô huyết thanh được gây miễn dịch E.coliBL21- pET32a+-T4 bắt đầu sinh kháng thể ở độ pha loãng 1: 5. Ở cả hai lô thí nghiệm đều sinh kháng thể từ ngày thứ 25 sau khi gây miễn dịch. Lô huyết thanh thỏ 21
24. được tiêm E.coliBL21-pET32a+-T4 trung hòa vi rút ở độ pha loãng 1:200 cao hơn so với lô huyết thanh tiêm protein tái tổ hợp có hiệu giá trung hòa là 1:50. Từ ngày thứ 35-45, hiệu giá trung hòa đạt giá trị cao nhất ở cả hai lô thí nghiệm, trong đó lô được tiêm E.coli BL21- pET32a+-T4 cho kết quả hiệu giá trung hòa ở độ pha loãng huyết thanh là 1:800, lô được tiêm protein T4 tái tổ hợp có hiệu giá trung hòa là 1:200. Vào ngày cuối cùng của thí nghiệm (ngày thứ 60) thì ở cả hai lô thí nghiệm hiệu giá trung hoà đều giảm, lô được tiêm E.coli BL21- pET32a+-T4 cho kết quả hiệu giá trung hoà là 1:400, còn lô được tiêm protein T4 tái tổ hợp có hiệu giá trung hòa là 1:100. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ở mô hình in vivo được trình bày ở Bảng 3.11. Bảng 3.11. Hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh ở mô hình in vivo Đối chứng Đối chứng âm (tỷ lệ Huyết thanh của thỏ được gây miễn dịch Thời gian thu dương nhiễm bệnh %) huyết thanh thỏ sau khi E.coli E.coli Protein T4 tái tổ Nhiễm Protein + gây miễn Chết BL21- BL21- pET32a -T4 hợp bệnh T4 tái tổ dịch (ngày) (%) pET32a+- Hiệu giá Gen Hiệu giá (%) hợp Gen T4 T4 trung hòa T4 trung hòa 5 100 100 0 0 ND + ND + 15 100 100 0 0 ND + ND + 25 100 100 0 0 1: 100 - 1: 50 - 35 100 100 0 0 1: 100 - 1: 50 - 45 100 100 0 0 1: 100 - 1: 50 + 60 100 100 0 0 1: 50 + 1: 10 + (Ghi chú: ND: huyết thanh không trung hòa vi rút cường độc; (+): có gen T4, (-): không có gen T4) Kết quả bảng 3.11 cho thấy ở hai lô thí nghiệm huyết thanh của thỏ được gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp thì trong thời gian 15 ngày đầu huyết thanh chưa tạo được kháng thể. Vào ngày thứ 25 kéo dài đến ngày thứ 45 ở lô huyết thanh thỏ được gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 có khả năng tiết kháng thể trung hòa NNV cường độc ở độ pha loãng là 1:100, kiểm tra gen mã hoá kháng nguyên T4 là âm tính. Ở lô huyết thanh được gây miễn dịch protein T4 tái tổ hợp từ ngày 25 đến ngày 35 cho thấy độ pha loãng huyết thanh đạt 1:50 và không phát hiện được gen mã hoá kháng nguyên. Tuy nhiên, tại ngày thứ 45, mặc dù hiệu giá trung hòa của huyết thanh đạt 1:50, toàn bộ cá mú không bị chết nhưng vẫn phát hiện được gen T4. Vào ngày thứ 60, mặc dù ở cả hai lô thí nghiệm huyết thanh thỏ vẫn tạo kháng thể trung hoà độc lực làm cho vi rút không còn khả năng gây bệnh, hiệu giá trung hoà ở hai lô thí nghiệm đạt từ 1:10 đến 1:50 nhưng vẫn phát hiện được gen T4 trên cá thí nghiệm. Từ các kết quả trên cho thấy protein T4 tái tổ hợp có khả năng tạo kháng thể trung hoà vi rút gây bệnh mặc dù kháng thể tạo ra thấp hơn so với chủng vi khuẩn biểu hiện gen mã hoá kháng nguyên E.coliBL21-pET32a+-T4. 22
25. 3.3.4.2. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú Các kết quả được trình bày ở bảng 3.12 cho thấy các mẫu đối chứng âm, cá được gây miễn dịch với kháng nguyên E.coliBL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp có sinh kháng thể đặc hiệu với NNV và không gây hiệu ứng bệnh tích tế bào. Bảng 3.12. Hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch của cá mú chống lại NNV trên mô hình in vitro Độ pha loãng dịch chiết của cá được gây miễn dịch để trung hòa NNV QN2 (104 TCID ) Lô thí nghiệm 50 30 45 15 ngày 60 ngày 75 ngày 90 ngày ngày ngày Đối chứng dương + + + + + + Dịch chiết cá gây miễn dịch - - - - - - với E.coliBL21-pET32a+-T4 Dịch chiết cá gây miễn dịch - - - - - - với protein T4 tái tổ hợp Dịch chiết cá gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 + 1:64 1:256 1:128 1:128 1:64 1:8 NNV cường độc Dịch chiết cá gây miễn dịch với protein T4 tái tổ hợp+ 1:16 1:128 1:128 1:64 1:64 1:8 NNV cường độc Ghi chú: +: có hiệu ứng bệnh tích tế bào -: không có hiệu ứng bệnh tích tế bào 4 Các mẫu đối chứng dương, chủng NNV QN2 cường độc liều TCID50 =10 gây nhiễm vào tế bào GS1 thì tất cả các tế bào đều có xảy ra hiệu ứng bệnh tích tế bào. Các lô thí nghiệm khi gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 và protein T4 tái tổ hợp thì đều sinh kháng thể từ ngày thứ 15 với hiệu giá tương ứng 1:64 và 1:16. Với thí nghiệm dịch chiết cá mú gây miễn dịch với E.coliBL21-pET32a+-T4 thì lượng kháng thể cao nhất vào ngày thứ 30 đến 60, đạt hiệu giá 1:128 - 1:256. Đến ngày thứ 75 thì lượng kháng thể giảm, hiệu giá đạt 1:64. Ở thí nghiệm dịch chiết cá mú được gây miễn dịch với protein tái tổ hợp T4 có tạo kháng thể cao nhất ở ngày thứ 30 đến ngày thứ 45, đạt 1:128. Từ ngày thứ 60 đến 75 thì lượng kháng thể giảm dần chỉ đạt hiệu giá 1:64. Thời gian bảo hộ đối với cá mú kéo dài đến 90 ngày ở cả hai lô thí nghiệm. Đây là cơ sở khoa học để ứng dụng sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. Hiện nay trên thế giới và Việt Nam mới chỉ có ít loại vắc-xin được sử dụng để phòng bệnh cho một số loài cá nuôi có giá trị kinh tế cao với quy mô nuôi công nghiệp như cá hồi, cá vược, cá mú, cá tráp, cá chim nhưng chủ yếu là vắc-xin bất hoạt. Năm 2009, tại Nhật Bản Yamashita và cs đã thử nghiệm dùng vắc-xin bất hoạt với formalin để phòng bệnh VNN cho cá mú 7 vạch (khối lượng trung bình 25,4 g/con). Sau 20 ngày thử nghiệm tiêm vắc-xin thì kháng thể được tạo ra trong khi đó cá ở các lô đối chứng không sản sinh kháng thể [69]. Vắc-xin bất hoạt chủng RGNNV, Pakingking và cs (2010) đã thử nghiệm tiêm để phòng bệnh VNN cho cá mú cọp nuôi thương phẩm. Kết quả cá được tiêm vắc-xin kháng thể trung hòa tạo ra từ ngày thứ 15 (hiệu giá 1: 800) và kéo dài đến 190 ngày (hiệu giá 1:400)[51]. 23
26. Tại Việt Nam, vắc-xin bất hoạt keo phèn được dùng phòng bệnh VNN cho cá mú nuôi quy mô công nghiệp có hiệu quả rất rõ rệt, vắc-xin có tỷ lệ bảo hộ cá ở điều kiện thí nghiệm đạt 83% trên cá giống. Ngoài ra vắc-xin còn sử dụng cho nuôi cá mú lồng và ao giai đoạn thương phẩm để phòng bệnh VNN hiệu quả cao, tỷ lệ bảo hộ cho cá đạt 82% (Phạm Thị Tâm và cs, 2015) [6]. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Qua nghiên cứu chúng tôi đã xác định được 26 chủng vi rút gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú tại Việt Nam. Các chủng vi rút xác định được đều là Nervous Necrosis Virus (NNV) thuộc họ Betanodavirus. 2. Vi rút có khả năng gây bệnh tích trên tế bào GS1, có 6 chủng độc lực cao với -6,8 -6,9 -4,8 -4,9 TCID50 từ 10 đến 10 ; 10 chủng độc lực đạt TCID50 từ 10 đến 10 ; 10 -2,7 -4,3 chủng độc lực yếu, TCID50 đạt từ 10 đến 10 . Vi rút có khả năng gây bệnh trên -7,5 cá mú, đề tài đã xác định 2 chủng có độc lực cao với cá (LD50 = 10 ), 4 chủng độc lực -5,5 -6,5 -2,6 -3,6 trung bình (LD50 từ 10 -10 ), 2 chủng có độc lực thấp (LD50 từ 10 -10 ). Vi rút thích nghi và phát triển tốt nhất khi được nuôi cấy ở 220C. Nhiệt độ có ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của vi rút trên cá mú. Tỷ lệ chết của cá sau 3 ngày nuôi là 82,1 – 85,5%; sau 6 ngày nuôi thì cá chết hoàn toàn ở cả hai điều kiện thí nghiệm là nhiệt độ 280C cả ngày và nhiệt độ biến thiên 280C ban ngày, 240C ban đêm. 3. Đề tài đã tạo được kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp. Kháng nguyên được biểu hiện thành công trong tế bào E. coliBL21(DE3) có kích thước 25 kDa. Protein T4 tái tổ hợp có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ cho cá mú với hiệu giá kháng thể trung hoà đạt 1:128 từ ngày 30 đến ngày 45; kháng thể tạo ra kéo dài cho đến ngày thứ 90 của thí nghiệm. Đây là cơ sở khoa học để ứng dụng kháng nguyên protein T4 tái tổ hợp làm nguyên liệu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú. KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện tối ưu để thu được lượng protein T4 nhiều nhất nhằm sản xuất lượng lớn kháng nguyên làm nguyên liệu phục vụ sản xuất vắc-xin sau này 2. Đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch trên cá mú nuôi ở giai đoạn cá hương, cá giống để xác định thời gian bảo hộ của kháng nguyên tái tổ hợp đối với cá. 3. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi kiến nghị cho triển khai nghiên cứu chế tạo vắc-xin tái tổ hợp thế hệ mới để phòng bệnh hoại tử thần kinh cho cá mú tại Việt Nam. 24
27. DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN TIỄN SĨ 1. Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Thị Thu Hiền, Vũ Tiến Lâm, Nguyễn Thị Vui, Nguyễn Thị Thanh (2012), “Nghiên cứu khả năng gây bệnh và gây đáp ứng miễn dịch của virus gây bệnh hoại tử thần kinh (Nervous Necrosis Virus) trên cá mú nuôi ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 6, trang 81-88. 2. Nguyễn Thị Thanh, Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Lê Văn Năm, Trần Thế Mưu, Nguyễn Quang Linh (2013), “Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên virus gây bệnh hoại tử thần kinh”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 5, trang 30- 36. 3. Nguyễn Thị Thanh, Phạm Thị Tâm, Mẫn Hồng Phước, Phạm Công Hoạt, Lê Văn Năm (2014), “Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên của vi rút gây hoại tử thần kinh (Nervous necrosis virus) ở cá mú”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, số 5, tập XXI, trang 26-32.