Nghiên cứu một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh tại Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh tại Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 9 42 02 01 CAO THỊ TÀI NGUYÊN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DẠNG BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ Y Ở NAM GIỚI KHÁM VÔ SINH TẠI BỆNH VIỆN PHỤ SẢN THÀNH PHỐ CẦN THƠ Cần Thơ, 2018
2. CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: , Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc giờ ngày tháng năm Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
3. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Cao Thị Tài Nguyên, Nguyễn Trung Kiên, Vũ Thị Nhuận, Nguyễn Chung Viêng, Trịnh Thị Bích Liên (2017), “Nghiên cứu bước đầu áp dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán các kiểu mất đoạn nhỏ vùng AZFc trên NST Y ở nam giới vô sinh”, Tạp chí Y Học Việt Nam. Tháng 4 - Số 2, tr. 245-249. 2. Cao Thị Tài Nguyên, Trịnh Thị Bích Liên, Nguyễn Trung Kiên, Vũ Thị Nhuận, Nguyễn Phan Vinh, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Trịnh Minh Thiết, Phan Thị Nhan (2017), “Đặc điểm hormon FSH, LH và testosteron ở nam giới vô sinh có mật độ tinh trùng ≤5x106/ML tinh dịch”, Tạp chí Y Học Thực hành. 5(1043), tr. 178-181. 3. Cao Thi Tai Nguyen, Nguyen Trung Kien, Vu Thi Nhuan, Nguyen Chung Vieng, Trinh Minh Thiet, Nguyen Phan Vinh, Nguyen Thi Bich Ngoc, Cao Luong Binh, Trinh Thi Bich Lien (2017), “An infertility SRY-negative 46,XX male detected by quantitative fluorescent polymerase chain reaction”, Journal of clinical case reports. 7:1013, doi: 10.4172/21657920.10001013. 4. Cao Thị Tài Nguyên, Nguyễn Trung Kiên, Trịnh Thị Bích Liên, Vũ Thị Nhuận, Nguyễn Chung Viêng, Nguyễn Đắc Khoa, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Trịnh Minh Thiết, Cao Lương Bình, Nguyễn Phan Vinh, Nguyễn Văn Khuôn (2018), “Sử dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán một số nguyên nhân di truyền thường gặp ở nam giới vô sinh”, Tạp chí Công nghệ sinh học. 16(2), tr.241-252. 1
4. Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Có nhiều nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới, trong đó nguyên nhân di truyền chiếm từ 4-38%. Hiện nay, 2 nguyên nhân di truyền thường gặp ở nam giới vô sinh là hội chứng Klinefelter và mất đoạn AZF. Tại Việt Nam, tỷ lệ các nguyên nhân này là khoảng 23% ở nam giới có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch. Tỷ lệ nam giới vô sinh bị mất đoạn AZF ở Việt Nam khoảng 5-12,8%. Có 3 loại mất đoạn AZF là AZFa, AZFb và AZFc. Nam giới bị mất đoạn AZFc có thể có con nhờ vào kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (tỷ lệ thành công khoảng 70%), các mất đoạn khác rất khó có con. Viện Hàn Lâm Nam học Châu Âu/Mạng lưới kiểm định chất lượng Di truyền phân tử Châu Âu khuyến cáo nam giới có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch nên thực hiện xét nghiệm tìm nguyên nhân di truyền trước khi sử dụng kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (Krausz et al., 2014). Kỹ thuật QF-PCR với nhiều ưu điểm như thời gian trả kết quả nhanh, giá thành rẻ, độ chính xác cao nên nhiều tác giả đề xuất áp dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán tìm nguyên nhân di truyền ở nam giới vô sinh. Trên cơ sở đó, luận án “Nghiên cứu một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh tại Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ” được thực hiện. 1.2. Mục tiêu đề tài (1) Xây dựng và kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR để phát hiện một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch. (2) Xác định tỷ lệ một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch bằng quy trình kỹ thuật QF-PCR đã được xây dựng và kiểm định. (3) Mô tả đặc điểm tinh dịch đồ, nội tiết tố và một số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch. 1.3. Ý nghĩa của luận án 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Cung cấp những cứ liệu khoa học về tỷ lệ một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y, đặc điểm tinh dịch đồ, nội tiết tố, một số yếu tố liên quan 2
5. đến bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch. - Làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu này có ý nghĩa rất lớn trong việc hỗ trợ chẩn đoán, tư vấn và điều trị vô sinh hiệu quả và ít tốn kém hơn cho bệnh nhân tại Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ nói riêng và khu vực Đồng bằng sông Cửu Long nói chung. 1.4. Tính mới của luận án - Nghiên cứu xây dựng và tối ưu hóa thành công quy trình kỹ thuật QF-PCR với 14 chỉ dấu di truyền dùng để phát hiện một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh. - Nghiên cứu của Rozen et al. (2012) là công trình đầu tiên và duy nhất công bố về tỷ lệ mất một phần đoạn AZFc kiểu gr/gr và b2/b3 của người Việt Nam. Bên cạnh các kiểu mất một phần đoạn AZFc trên, nghiên cứu còn ghi nhận 4 dạng mất một phần đoạn AZFc mới là mất đoạn sY1191-sY1192, sY1291, 2 gen DAZ - 1 gen CDY1 và mất 1 gen CDY1. - Nghiên cứu ghi nhận sự đa hình về chiều dài đoạn gen được khuếch đại bằng chỉ dấu di truyền sY1291, dao động từ 507-527 bp. Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Đại cương về vô sinh và quá trình sinh tinh 2.1.1. Một số khái niệm về vô sinh và vô sinh nam Khoảng 80-85% các cặp vợ chồng có thai tự nhiên sau một năm chung sống, nhưng cũng có 15-20% cặp vợ chồng gặp vấn đề về khả năng sinh sản hay còn gọi là vô sinh (Ayensu-Coker et al., 2007; Jungwirth et al., 2012). Một cặp vợ chồng hay một đôi nam nữ được gọi là vô sinh khi họ giao hợp thường xuyên và không sử dụng biện pháp tránh thai nào sau 12 tháng mà vẫn không có con (WHO, 2000). Vô sinh nam là tình trạng các cặp vợ chồng hoặc cặp nam nữ không có thai sau một năm sinh hoạt tình dục bình thường và không dùng biện pháp tránh thai nào do nguyên nhân từ nam giới (Jungwirth et al., 2012). 2.1.2. Đại cương về quá trình sinh tinh Các tế bào mầm sinh dục nguyên thủy tham gia vào quá trình sinh tinh trải qua 3 giai đoạn là phân bào nguyên phân, giảm phân và biệt hóa để tạo thành tinh trùng trưởng thành (Oliveira và Alves, 2015). Nam giới 3
6. có khả năng sinh sản bình thường mỗi ngày tạo ra > 40x106 tinh trùng (Cheng và Mruk, 2013). Quá trình sinh tinh được điều hòa bởi 3 hormon chính là FSH (FSH - Follicle-stimulating hormon), LH (LH - Luteinizing hormon) và testosteron (Verhoeven et al., 2010; Rato et al., 2012). Bên cạnh đó, quá trình này còn được điều hòa bởi một số yếu tố khác như nhiệt độ, các dạng oxi hoạt động ROS (ROS - Reactive oxygen species) và hàng rào chống oxi hóa tại tinh hoàn (Oliveira và Alves, 2015). Xét nghiệm nồng độ hormon FSH, LH và testosteron là những xét nghiệm cần thiết và quan trọng giúp tìm ra được nguyên nhân và cách điều trị cho nam giới vô sinh do nội tiết (Hotaling và Walsh, 2009). 2.2. Tinh dịch đồ và một số yếu tố liên quan đến vô sinh nam 2.2.1. Tinh dịch đồ Hiện nay, tại các phòng xét nghiệm tinh dịch đồ đánh giá kết quả dựa trên hướng dẫn của WHO (2010). 2.2.2. Một số yếu tố liên quan đến vô sinh nam Một số yếu tố liên quan đến vô sinh nam đã được xác định như tuổi, chỉ số khối của cơ thể BMI (BMI - Body mass index), tiền sử gia đình về vô sinh, một số thói quen (hút thuốc, uống rượu, ít vận động), môi trường độc hại, nghề tiếp xúc với những chất độc hại, nhiệt độ cao, mặc quần lót chật, và xông hơi (Cavallini và Beretta, 2015). 2.3. Nhiễm sắc thể Y và một số bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới vô sinh 2.3.1. Nhiễm sắc thể Y của người Nhiễm sắc thể Y dài khoảng 60 Mb, gồm 2 vùng là vùng giả nhiễm sắc thể thường chiếm 5% và vùng không kết hợp chiếm 95% (Jangravi et al., 2013). Vùng không kết hợp gồm có vùng đồng nhiễm sắc và vùng dị nhiễm sắc (Hình 2.1). Hình 2.1. Cấu trúc nhiễm sắc thể Y (Kandeel et al., 2007). 4
7. 2.3.2. Một số chỉ dấu di truyền trên nhiễm sắc thể Y Trên vùng đồng nhiễm sắc của nhiễm sắc thể Y chứa khoảng 1287 vị trí trình tự đánh dấu STS (Sequence tagged site), trong đó 992 STS có trình tự đơn và 285 STS trình tự lặp (Lange et al., 2008). Hiện nay, đa số các nghiên cứu sử dụng 6 chỉ dấu di truyền (sY84, sY86, sY127, sY134, sY254 và sY255) để phát hiện mất đoạn AZFa, AZFb và AZFc (Krausz et al., 2014). Ngoài ra, Rozen et al. (2012) sử dụng một số chỉ dấu di truyền sY1189, sY1191, sY1192 và sY1291 để phát hiện mất một phần đoạn AZFc. Trên cơ sở đó, nghiên cứu này sử dụng các chỉ dấu di truyền sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255, sY1191, sY1192 và sY1291. Ngoài ra, để có thể phát hiện được một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y, nghiên cứu sử dụng thêm các chỉ dấu di truyền AMEL, TAF9B, DAZ, CDY, SRY. Như vậy, luận án sử dụng 14 chỉ dấu di truyền. Tất cả các trình tự mồi của các chỉ dấu di truyền được kiểm tra trên ngân hàng cơ sở dữ liệu của NCBI (Phiên bản GRCh38.p7) để phát hiện vị trí các đoạn sản phẩm PCR. Ở Hình 2.2 thể hiện sản phẩm PCR được khuếch đại của 13 chỉ dấu di truyền trên nhiễm sắc thể Y, ngoại trừ TAF9B (khuếch đại đoạn gen trên nhiễm sắc thể 3 và NST X). Hình 2.2. Vị trí sản phẩm các đoạn ADN được khuếch đại bằng cặp mồi của 13 chỉ dấu di truyền trên nhiễm sắc thể Y. 5
8. 2.3.3. Bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới vô sinh Các nguyên nhân di truyền chiếm khoảng 30% gồm có rối loạn đơn gen, bất thường di truyền tế bào và các loại bất thường đoạn AZF của nhiễm sắc thể Y (Aston và Conrad, 2013). 2.4. Một số kỹ thuật dùng để phát hiện nguyên nhân di truyền ở nam giới vô sinh Hiện nay, bên cạnh kỹ thuật di truyền tế bào người ta đã dùng nhiều kỹ thuật phân tử để phát hiện các bất thường trên nhiễm sắc thể Y như kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang (FISH), PCR đa mồi, Realtime PCR, khuếch đại các đầu dò phụ thuộc ghép nối (MLPA) và QF-PCR. 2.5. Tình hình nghiên cứu một số nguyên nhân vô sinh ở nam giới 2.5.1. Trên thế giới Nhiều nghiên cứu cho thấy hội chứng Klinefelter và mất đoạn AZF là 2 nguyên nhân di truyền thường gặp ở nam giới khám vô sinh có số lượng < 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch (Cavkaytar et al., 2012; Choi et al., 2013; Zhang et al., 2013b). Tỷ lệ mất đoạn AZF từ 4-38% (Mafra et al., 2011; Cavkaytar et al., 2012; Fu et al., 2012; Choi et al., 2013; Ambulkar et al., 2013; Nasasse et al., 2015). 2.5.2. Ở Việt Nam Tỷ lệ mất đoạn AZF từ 5-12,8%; trong đó mất đoạn AZFc lưu hành phổ biến nhất (Nguyễn Minh Hà, 2011; Nguyễn Thị Việt Hà, 2012; Nguyễn Đức Nhự, 2015). 6
9. Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Sơ đồ 3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 3.2. Đối tượng nghiên cứu Nam giới khám vô sinh tại Khoa Hiếm muộn Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch theo tiêu chuẩn WHO (2010). Tiêu chuẩn loại trừ: bệnh nhân không thể lấy tinh dịch bằng cách thủ dâm và không đồng ý tham gia nghiên cứu. Bên cạnh đó, cũng loại trừ 7
10. những nam giới thắt, cắt ống dẫn tinh, lấy mẫu tại nhà, làm rơi vãi tinh dịch trong khi lấy mẫu. 3.3. Cỡ mẫu - Áp dụng công thức tính cỡ mẫu ước lượng cho một tỷ lệ 2 p.(1 p) n Z1 / 2 . 2 d Trong đó: n: cỡ mẫu tối thiểu cần thiết. Z1- /2 = 1,96 với hệ số tin cậy mong muốn là 95%. p: tỷ lệ nam giới có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch bị mất đoạn AZF trên nhiễm sắc thể Y. Dựa trên nghiên cứu của Nguyễn Minh Hà (2011) với p = 12,8%, luận án chọn p = 0,128. d: sai số cho phép, chọn d = 0,037. Thay vào công thức tính được n = 313. Như vậy, cỡ mẫu nghiên cứu tối thiểu là 313 nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch. Trong thực tế, luận án đã nghiên cứu trên 322 trường hợp. 3.4. Phương pháp chọn mẫu Chọn mẫu thuận tiện không xác xuất. 3.5. Thời gian và địa điểm 3.5.1. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 11/2014 đến tháng 3/2017. 3.5.2. Địa điểm nghiên cứu - Thu nhận mẫu tinh dịch đồ và thực hiện xét nghiệm tinh dịch đồ tại Khoa Hiếm muộn, Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ. - Xét nghiệm nồng độ hormon FSH, LH, testosteron, ly trích ADN, kỹ thuật QF-PCR và giải trình tự được thực hiện tại Khoa xét nghiệm - Di truyền học, Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ. - Gửi 1 mẫu máu, 3 mẫu ADN đến phòng xét nghiệm kỹ thuật cao ISOLABO tại địa chỉ 101/26 Nguyễn Chí Thanh, Phường 9, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh để kiểm định kết quả QF-PCR. 3.6. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất - Nghiên cứu sử dụng các hóa chất và trang thiết bị để xét nghiệm tinh dịch đồ, nội tiết tố, di truyền (kỹ thuật QF-PCR) và giải trình tự. -14 đoạn mồi (mồi ngược) và mồi đánh dấu huỳnh quang (mồi xuôi) của các chỉ dấu di truyền được trình bày ở Bảng 3.1A. 8
11. Bảng 3.1A. Các chỉ dấu di truyền dùng phát hiện một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y Chỉ dấu Vị trí Trình tự mồi (5’-3’) Màu Kích thước sản phẩm PCR Nguồn di truyền nhiễm sắc thể huỳnh quang tham khảo (bp) tham khảo sY84-F AZFa F: AGAAGGGTCCTGAAAGCAGGT NED 326 Krausz et al. sY84-R R: GCCTACTACCTGGAGGCTTC (2014) sY86-F AZFa F: GTGACACACAGACTATGCTTC VIC 318 Krausz et al. sY86-R R: ACACACAGAGGGACAACCCT (2014) sY127-F AZFb F: GCACCCACTGGAATCTACC FAM 195 Fu et al. sY127-R R: CATGGCTACACAGACAGGGA (2012) sY134-F AZFb F: GTCTGCCTCACCATAAAACG NED 301 Krausz et al. sY134-R R: ACCACTGCCAAAACTTTCAA (2014) sY254-F AZFc F: GGGTGTTACCAGAAGGCAAA FAM 380 Krausz et al. sY254-R R: GAACCGTATCTACCAAAGCAGC (2014) sY255-F AZFc F: GTTACAGGATTCGGCGTGAT FAM 123 Krausz et al. sY255-R R: CTCGTCATGTGCAGCCAC (2014) sY1191-F AZFc F: CCAGACGTTCTACCCTTTCG VIC 385 Krausz et al. sY1191-R R: GAGCCGAGATCCAGTTACCA (2014) sY1192-F AZFc F: ACTACCATTTCTGGAAGCCGG NED 255 Krausz et al. sY1192-R R: CTCCCTTGGTTCATGCCATT (2014) sY1291-F AZFc F: TAAAAGGCAGAACTGCCAGG VIC 527 sY1291-R R: GGGAGAAAAGTTCTGCAACGT SRY-F Yp11.2- p22.1 F: GAATATTCCCGCTCTCCGGA FAM 472 Fu et al. SRY-R R: GCTGGTGCTCCATTCTTGAG (2012) CDY-F AZFc F: GTTTCTTCCACTGTAGAAATTCACCTCC VIC 200 Plaseska et al. CDY-R AZFb R: GAAGTTTGCATAGTGGACAGC 194 (2011) AMEL-F Xp22.1-p22.31 F: CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAGTG FAM 106 Xie và Liang et al. AMEL-R Yp11.2 - p22.1 R: ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG 112 (2014) TAF9B-F X F: TTTGACAGGTAGTTTTGGGTCA FAM 144 Plaseska et al. TAF9B-R NST 3 R: TGGTTTTGCCTAGGTCCAGT 140 (2011) DAZ-F AZFc F: TTAAGTACTACTGTAGACACC FAM 214 Alimardanian et al. DAZ-R NST 3 R: GTTTCTTGTATAATGTAGAAGAGTAGAGC 217 (2016) 9
12. - Chứng âm (nước cất, nữ bình thường) và chứng dương (nam giới bị mất đoạn AZFc, hội chứng Klinefelter do Bộ môn Y Sinh học – Di truyền, Học viện Quân Y và Đại học Y Hà Nội cung cấp, được xác định bằng kỹ thuật multiplex-PCR (AZF) và nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi (hội chứng Klinefelter)). + Cặp mồi thường sY1291 đặt công ty Macrogen, Hàn Quốc sản xuất và cặp mồi thường LAPT đặt công ty Macrogen, Hàn Quốc và công ty TNHH Phù Sa, Cần Thơ, Việt Nam sản xuất (Bảng 3.1B). Bảng 3.1B. Một số đặc điểm của 2 chỉ dấu di truyền sY1291 và LAPT Kích thước sản phẩm Chỉ dấu Trình tự mồi (5’-3’) PCR tham khảo (NCBI, di truyền GRCh38.p7) (bp) sY1291 F: TAAAAGGCAGAACTGCCAGG 527 R: GGGAGAAAAGTTCTGCAACGT LAPT F: CAGAACTGCCAGGTCTGTGTCTTAT 288 R: ACCATCCCGGCTAAAAACGGTG 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Xây dựng và kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR để phát hiện một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng /mL tinh dịch 3.3.1.1. Ly trích ADN 3.3.1.2. Xây dựng quy trình kỹ thuật QF-PCR Luận án khảo sát các điều kiện thực hiện phản ứng QF-PCR và điện di mao quản để xây dựng và tối ưu hóa quy trình kỹ thuật QF-PCR. a. Khảo sát các điều kiện thực hiện phản ứng QF-PCR Xác định nhiệt độ gắn mồi của từng chỉ dấu di truyền dựa vào trang web của NEB calculator Tm tại Sắp xếp nhóm các chỉ dấu di truyền dựa vào nhiệt độ gắn mồi và tối ưu dựa vào điều kiện thực nghiệm. Thử nghiệm phản ứng QF-PCR ở nồng độ cuối cùng của mồi là 5 pmol và 10 pmol; multiplex PCR mastermix là 1X và 2X ở thể tích phản ứng là 25 µl và 50 µl. Xác định điều kiện tối ưu của các nhóm chỉ dấu di truyền trong phản ứng QF-PCR. b. Khảo sát các điều kiện điện di mao quản sản phẩm PCR huỳnh quang Thực hiện pha HiDi-Formamide (HiDi) và thang chuẩn ở 2 thể tích là 200 µl HiDi + 4 µl thang chuẩn và 120 µl HiDi + 4 µl thang chuẩn. 10
13. Pha loãng 40 lần, 60 lần và 100 lần sản phẩm PCR huỳnh quang với nước cất khử ion 2 lần (Bảng 3.2). Bảng 3.2. Thể tích pha loãng sản phẩm PCR huỳnh quang Thể tích dung dịch cuối Thể tích pha loãng cùng điện di mao quản Sản phẩm PCR huỳnh quang Nước cất khử ion 2 lần 0,5 µl 0,5 µl 20 µl 0,5 µl 0,5 µl 30 µl 0,5 µl 0,5 µl 50 µl Thử điều kiện điện di mao quản theo chương trình của Devyser và Elucigen đã được cài đặt trên máy phân tích di truyền ABI 3500. Chọn điều kiện điện di mao quản dựa vào kết quả QF-PCR. c. Kết quả QF-PCR Phân tích bằng phần mềm Genemarker V2.6.3 và ghi nhận kết quả xuất hiện peak sản phẩm PCR huỳnh quang được đánh dấu bằng màu FAM (xanh da trời), VIC (xanh lá cây) và NED (đen). 3.3.1.2. Kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR Để đánh giá độ chính xác và tin cậy của quy trình kỹ thuật đã xây dựng và tối ưu, kết quả QF-PCR được kiểm định bằng những cách sau đây: - So sánh với NCBI (Phiên bản GRCh38.p7) và một số nghiên cứu trên thế giới. - So sánh với mẫu chứng dương do Bộ môn Y Sinh học Di truyền của Đại học Y Hà Nội và Học viện Quân Y cung cấp. - Gửi mẫu máu và ADN của đối tượng nghiên cứu đi kiểm chứng. - Giải trình tự để khẳng định sự tương đồng trình tự nucleotid ở mẫu thể hiện sự đa hình về chiều dài sản phẩm PCR huỳnh quang. 3.3.2. Xác định tỷ lệ một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng /mL tinh dịch bằng quy trình kỹ thuật QF-PCR đã được xây dựng và kiểm định Áp dụng quy trình kỹ thuật QF-PCR đã kiểm định vào xác định một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y. Nam giới khám vô sinh không có bất thường nhiễm sắc thể Y (bình thường) xuất hiện các peak như sau: AMELX/AMELY là 1:1 (103-106 bp), DAZ/DAZL là 4:2 (210-214 bp), TAF9B3/TAF9BX là 2:1 (144-148 bp), CDY2/CDY1 là 2:2 (198-204 bp), SRY ( 465 bp), sY84 (328 bp), sY86 (316 bp), sY127 (192 bp), sY134 (302 bp), sY254 (380 bp), sY255 (122 bp), sY1191 (385 bp) và sY1192 (255 bp). Peak của sY1291 có thể xuất 11
14. hiện tại một trong các vị trí sau: 507 bp hoặc 512 bp hoặc 523 bp hoặc 527 bp. + Mất một phần đoạn AZFb kiểu mất 2 gen CDY2 xuất peak CDY2/CDY1 là 0:2; các peak còn lại đều xuất hiện như ở nam giới bình thường. + Mất một phần đoạn AZFc kiểu gr/gr: xuất hiện peak DAZ/DAZL là 2:2 (DAZ bị giảm ½); CDY2/CDY1 là 2:1 (mất 1 CDY1), không có peak của sản phẩm PCR huỳnh quang sY1291 và các peak còn lại giống như nam giới bình thường. + Mất một phần đoạn AZFc kiểu b2/b3: xuất hiện peak DAZ/DAZL là 2:2 (DAZ bị giảm ½); CDY2/CDY1 là 2:1 (mất 1 CDY1), không có peak của sản phẩm PCR huỳnh quang sY1191 và sY1192; và các peak khác giống ở nam giới bình thường. + Mất một phần đoạn AZFc kiểu mất 2 gen DAZ: xuất hiện peak DAZ/DAZL là 2:2; các peak khác giống như ở nam giới bình thường. + Mất một phần đoạn AZFc kiểu mất 1 gen CDY1: xuất hiện peak CDY2/CDY1 là 2:1; các peak còn lại giống ở nam giới bình thường. + Mất một phần đoạn AZFc kiểu mất 2 gen DAZ và 1 gen CDY1: peak DAZ/DAZL là 2:2 và CDY2/CDY1 là 2:1; các peak còn lại đều xuất hiện như ở nam giới bình thường. + Mất một phần đoạn AZFc kiểu mất sY1191-sY1192: không có peak của 2 chỉ dấu di truyền sY1191 và sY1192; các peak khác đều xuất hiện như ở nam giới không có bất thường nhiễm sắc thể Y. + Mất một phần đoạn AZFc kiểu mất sY1291: xuất hiện các peak giống nam giới bình thường, ngoại trừ sY1291 không xuất hiện peak tại bất kỳ vị trí nào 507 bp, 512 bp, 523 bp, 527 bp. + Mất hoàn toàn đoạn AZFc (b2/b4): không có peak của sY254, sY255, sY1191, sY1192 và sY1291; peak CDY2/CDY 1là 2:0 và DAZ/DAZL là 0:2; các peak khác đều xuất hiện như ở nam giới bình thường. + Mất hoàn toàn đoạn AZFbc: kết quả QF-PCR không có peak của sY127, sY134, sY254, sY255, sY1191, sY1192, sY1291, CDY2/CDY1, DAZ; các peak còn lại và DAZL đều xuất hiện như ở nam giới không có bất thường nhiễm sắc thể Y. + Nhân đoạn gen DAZ: xuất hiện peak DAZ/DAZL là 6:2 hoặc 8:2, các peak còn lại đều giống nam giới bình thường + Hội chứng Klinefelter với nhiễm sắc thể Y bị mất một phần đoạn AZFc kiểu gr/gr: là nam giới tăng 1 nhiễm sắc thể X (tỷ lệ peak 12
15. AMELX/AMELY là 2:1 và TAF9B3/TAF9BX là 2:2) và các peak khác giống ở nam giới mất một phần đoạn AZFc kiểu gr/gr. + Hội chứng Klinefelter với nhân đoạn gen DAZ: là nam giới tăng 1 nhiễm sắc thể X và có peak DAZ/DAZL là 6:2 hoặc 8:2 và các peak khác giống nam giới bình thường. + Hội chứng Klinefelter với mất 2 gen DAZ: là nam giới tăng 1 nhiễm sắc thể X và peak DAZ/DAZL là 2:2 và các peak khác giống nam giới bình thường. 3.3.3. Mô tả đặc điểm tinh dịch đồ, nội tiết tố và một số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng /mL tinh dịch - Tư vấn và hướng dẫn bệnh nhân lấy mẫu tinh dịch. - Đánh giá các thông số tinh dịch đồ theo WHO (2010). - Phỏng vấn bệnh nhân theo phiếu điều tra. - Thăm khám lâm sàng: đo chiều cao, cân nặng, khám và ghi nhận các bất thường ở bìu. - Xét nghiệm nội tiết trục tuyến yên-tinh hoàn. - Phân tích kết quả. Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1. Xây dựng và kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR để phát hiện một số dạng bất thường phân tử nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch 4.1.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật QF-PCR 4.1.1.1. Khảo sát các điều kiện thực hiện phản ứng QF-PCR Qua thực nghiệm, luận án đã tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng QF-PCR và chia làm 3 set. Set 1 gồm có 4 chỉ dấu di truyền (sY254, sY255, sY1191, sY1192), set 2 gồm có 5 chỉ dấu di truyền (AMEL, CDY, DAZ, TAF9B, SRY) với nhiệt độ gắn mồi là 560C. Set 3 gồm có 5 chỉ dấu di truyền (sY84, sY86, sY127, sY1291, sY134) với nhiệt độ gắn mồi là 580C. Bên cạnh nhiệt độ gắn mồi, nồng độ cuối cùng và thể tích phản ứng QF-PCR cũng đã được tối ưu tương ứng là 5 pmol và 25 µl. Ngoài ra, multiplex PCR 5X mastermix cũng đã được tối ưu trong phản ứng QF- PCR với nồng độ cuối cùng là 1X. Chu trình nhiệt phản ứng QF-PCR set 1 và set 2 như sau: 940C - 2 phút, {[940C - 30 giây, 560C - 1 phút, 680C - 1 phút 30 giây], 30 chu kỳ}, 680C - 10 phút, 40C - ∞ 13
16. Chu trình nhiệt phản ứng QF-PCR set 3 thực hiện tương tự set 1 và set 2, chỉ khác nhiệt độ gắn mồi là 580C. Quy trình thực hiện phản ứng QF-PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Qua so sánh với các nghiên cứu cho thấy, sự khác biệt về điều kiện, nhiệt độ gắn mồi và chu trình nhiệt của phản ứng QF-PCR có lẽ là do loại hóa chất sử dụng và điều kiện thực nghiệm khác nhau. 4.1.1.2. Khảo sát các điều kiện điện di mao quản sản phẩm PCR huỳnh quang Luận án sử dụng quy trình điện di mao quản: trộn 3 set phản ứng QF-PCR lại vào chung 1 tube. Mỗi tube chứa 8 µL Hidi-thang chuẩn/1 tube + 0,5 µL sản phẩm PCR huỳnh quang pha loãng 100 lần và đặt vào máy phân tích di truyền ABI 3500 ở điều kiện điện di theo chương trình của Devyser hoặc Elucigen. Phân tích kết quả bằng phần mềm Genemarker V2.6.3. 4.1.1.3. Kết quả QF-PCR Với quy trình QF-PCR đã tối ưu, kết quả nghiên cứu ghi nhận sản phẩm PCR huỳnh quang khuếch đại bằng các chỉ dấu di truyền được thể hiện bằng các peak trên 3 nhóm màu đánh dấu huỳnh quang là màu FAM, VIC và NED. Nhóm chỉ dấu di truyền sử dụng màu FAM gồm có AMEL, sY255, TAF9B (ký hiệu là T3), sY127, DAZ, sY254 và SRY xuất hiện peak có màu xanh da trời (Hình 4.1). Hình 4.1. Kết quả QF-PCR nhóm chỉ dấu di truyền màu FAM. Với quy trình đã tối ưu, nam giới không có bất thường nhiễm sắc thể Y xuất hiện peak ở kết quả QF-PCR tại các vị trí sau: AMELX/AMELY tại 103 bp (nhiễm sắc thể X) và 109 bp (nhiễm sắc thể Y) theo tỷ lệ 1:1; sY255 tại 122 bp; TAF9B3/TAF9BX tại 144 bp (nhiễm sắc thể 3) và 148 bp (nhiễm sắc thể X) theo tỷ lệ 2:1; sY127 tại 192 bp; DAZ/DAZL tại 210 bp (nhiễm sắc thể Y) và 214 bp (nhiễm sắc thể 3) theo tỷ lệ 4:2; sY254 tại 380 bp và SRY tại 465 bp (Hình 4.1) . Nhóm chỉ dấu di truyền sử dụng màu VIC gồm có CDY, sY86, sY1191 và sY1291 xuất hiện peak màu xanh lá cây (Hình 4.2). 14
17. Hình 4.2. Kết quả QF-PCR nhóm chỉ dấu di truyền màu VIC với peak của sY1291 có kích thước 507 bp. Nam giới không có bất thường nhiễm sắc thể Y kết quả QF-PCR xuất hiện peak của CDY tại vị trí 198 bp (AZFb) và 204 bp (AZFc) theo tỷ lệ 2:2; sY86 tại vị trí 316 bp; sY1191 tại vị trí 385 bp (Hình 4.2). Riêng peak của sY1291 có thể xuất hiện 1 trong 4 vị trí sau: 507 bp, 512 bp, 523 bp và 527 bp (Hình 4.3). Điều này cho thấy có sự đa hình về chiều dài sản phẩm PCR huỳnh quang của đoạn gen này. Sự đa hình về chiều dài của đoạn gen này phù hợp với nghiên cứu của Lin et al. (2006) và Evguenia et al. (2016). Để khẳng định sự đa hình về chiều dài, luận án sử dụng kỹ thuật giải trình tự và được trình bày chi tiết ở mục 4.1.2. Hình 4.3. Sự đa hình về chiều dài sản phẩm PCR huỳnh quang khuếch đại bằng cặp mồi của chỉ dấu di truyền sY1291. Kết quả QF-PCR của nhóm chỉ dấu di truyền sử dụng màu NED (sY1192, sY134 và sY84), sản phẩm PCR huỳnh quang được thể hiện bằng các peak màu đen (Hình 4.4). 15
18. Hình 4.4. Kết quả QF-PCR nhóm chỉ dấu di truyền sử dụng màu NED. Nam giới không có bất thường nhiễm sắc thể Y kết quả QF-PCR của nhóm màu này xuất hiện peak của sY1192 tại vị trí 255 bp; sY134 tại vị trí 302 bp; sY84 tại vị trí 328 bp. Bên cạnh những peak chính, ở trên Hình 4.1, 4.2 và 4.4 còn có những peak phụ khác. Những peak phụ này có thể là sản phẩm PCR huỳnh quang không đặc hiệu của các đoạn gen khác. Nguyên nhân là do một số cặp mồi của các chỉ dấu di truyền có thể khuếch đại những sản phẩm với kích thước > 600 bp nhưng không đặc hiệu nên kích thước xuất hiện là những sản phẩm phụ ngắn hơn (NCBI, phiên bản GRCh38.p7). 4.1.2. Kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR 4.1.2.1. So sánh kết quả nghiên cứu với dữ liệu trên NCBI (Phiên bản GRCh38.p7) và một số nghiên cứu trên thế giới Kết quả QF-PCR ghi nhận kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang có thể chia làm 3 nhóm là bằng, ngắn hơn hoặc dài hơn kích thước sản phẩm PCR tham khảo (kích thước đoạn gen được công bố trên NCBI (Phiên bản GRCh38.p7). Nhóm 1 có kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang bằng kích thước sản phẩm PCR tham khảo gồm có sY84, sY254, sY1191 và sY1192. Nhóm 2 có kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang ngắn hơn khoảng 2-5 bp so với kích thước PCR tham khảo (SRY, sY86, sY127, sY255, CDY2/CDY1, AMELX/AMELY, TAF9B3/TAF9BX và DAZ/DAZL). Nhóm 3 có kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang dài hơn kích thước sản phẩm PCR tham khảo (sY134). Ngoài 3 nhóm trên, kết quả nghiên cứu ghi nhận sY1291 có kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang có thể ngắn hơn từ 4-20 nucleotid (507 bp, 512 bp, 523 bp) hoặc bằng với kích thước sản phẩm PCR tham khảo (527 bp). So sánh với nghiên cứu của Plaseska et al. (2011), kết quả có sự phù hợp về kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang ở nhóm 2 và nhóm 3. Ở nhóm 2, tác giả ghi nhận kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang của SRY là 243 bp, ngắn hơn 5 nucleotid so với kích thước gen mong đợi là 248 bp. Sở dĩ có sự khác nhau là do nghiên cứu sử dụng trình tự đoạn mồi khác. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Plaseska et al. (2011) và 16
19. Papoulidis et al. (2012) là 103 bp và 109 bp. Một nghiên cứu khác của Fodor et al. (2007) và Majumder et al. (2015) cũng ghi nhận kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang của đoạn gen này là 104 bp và 110 bp. Như vậy, kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang có thể ngắn hơn từ 2-3 bp so với kích thước sản phẩm PCR tham khảo do điều kiện phản ứng QF-PCR không giống nhau. Điều này hoàn toàn phù hợp với khuyến cáo của hãng về bộ kit Devyser dùng phát hiện mất đoạn AZF. Như vậy, vị trí peak của các sản phẩm PCR huỳnh quang có thể bằng, ngắn hoặc dài hơn kích thước nucleotid tham khảo là phù hợp với nhiều nghiên cứu trên thế giới. Kết quả luận án ghi nhận đa số sản phẩm PCR huỳnh quang ngắn hoặc dài hơn 2-5 bp so với sản phẩm PCR tham khảo; ngoại trừ đoạn gen thể hiện sự đa hình về chiều dài (ngắn hơn 4-20 bp) được khuếch đại bằng chỉ dấu di truyền sY1291. 4.1.2.2. So sánh với mẫu chứng dương Nghiên cứu thực hiện xét nghiệm một số mẫu chứng dương (ADN nam giới bị mất đoạn AZFc và hội chứng Klinefelter) bằng kỹ thuật QF- PCR. Kết quả ghi nhận hoàn toàn giống với mẫu chứng dương. 4.1.2.3. Gửi mẫu đi kiểm chứng Kết quả kiểm định 1 mẫu máu bằng phương pháp nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi cũng cho thấy nam giới tăng 1 nhiễm sắc thể X, karyotype là 47,XXY, giống với kết quả QF-PCR. Ngoài ra, luận án chọn ngẫu nhiên 3 mẫu ADN (1 mẫu ADN không có bất thường nhiễm sắc thể Y, 1 mẫu ADN bị mất đoạn hoàn toàn AZFbc và 1 mẫu ADN bị mất đoạn hoàn toàn AZFc) gửi đi kiểm định tại Phòng xét nghiệm kỹ thuật cao ISOLABO bằng kit của Devyser cũng cho kết quả tương tự. 4.1.2.4. Giải trình tự để xác định sự đa hình về chiều dài của sản phẩm PCR huỳnh quang được khuếch đại bằng chỉ dấu di truyền sY1291 Thực hiện giải trình tự đoạn gen được khuếch đại bằng cặp mồi của sY1291 lặp đi lặp lại 10 lần trong 1 tháng, kết quả đều ghi nhận trình tự nucleotid của mẫu tương đồng khoảng 400 bp so với trình tự nucleotid tham khảo (tương đồng khoảng 77%) (Hình 4.5A, B). 17
20. Hình 4.5A. Độ tương đồng giữa trình tự nucleotid tham khảo (REF) và mẫu (SA100) với kích thước đoạn gen khuếch đại là 527 bp (Bioedit). Hình 4.5B. Độ tương đồng giữa trình tự nucleotid tham khảo (REF) và trình mẫu (SA207) với kích thước đoạn gen 507 bp (Bioedit). 18
21. Sự tương đồng trình tự nucleotid chỉ đạt được khoảng 77% là do tất cả các mẫu đều ghi nhận trên cả 2 đoạn ADN được khuếch đại bằng mồi xuôi hay mồi ngược đều bắt đầu xuất hiện trình tự nhiễu sau trình tự lặp đơn nucleotid T. Theo y văn, đoạn ADN có trình tự lặp đơn nucleotid trong phản ứng PCR sẽ làm cho enzym polymerase khi tổng hợp sợi mới sẽ tự thêm vào hoặc làm mất đi loại nucleotid lặp ở đoạn đó và làm nhiễu trình tự ở sau đoạn lặp đơn nucleotid (Jinks-Robertson, 2002). Như vậy, kết quả giải trình tự cho thấy sự đa hình về chiều dài sản phẩm PCR huỳnh quang được khuếch đại bằng cặp mồi của chỉ dấu di truyền sY1291 với kích thước 507 bp, 512 bp, 523 bp và 527 bp là do khác nhau về số lần lặp nucleotid T. Trên những cơ sở đó, quy trình kỹ thuật QF-PCR với 14 chỉ dấu di truyền để phát hiện một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y có độ chính xác cao và đáng tin cậy. 4.2. Xác định tỷ lệ một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch bằng quy trình kỹ thuật QF-PCR đã được xây dựng và kiểm định Kết quả nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể Y ở đối tượng nghiên cứu là 35,1% (Hình 4.6), cao hơn một số nghiên cứu trong và ngoài nước (4-24%). Hình 4.6. Tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể Y ở đối tượng nghiên cứu. 19
22. Có 3 dạng bất thường nhiễm sắc thể Y, trong đó mất đoạn AZF chiếm tỷ lệ cao nhất (83,18%), thấp hơn là nhân đoạn gen DAZ (13,27%) và hội chứng Klinefelter có bất thường cấu trúc nhiễm sắc thể Y chiếm 3,55%. Không giống nghiên cứu của chúng tôi, đa số các nghiên cứu chỉ ghi nhận bất thường về karyotype và mất đoạn AZF. Sự khác biệt là do phương pháp nghiên cứu và số lượng chỉ dấu di truyền khác nhau. Có 4 dạng mất đoạn AZF; trong đó mất một phần đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất (80,85%), thấp hơn là mất hoàn toàn đoạn AZFc chiếm 9,57%; mất hoàn toàn đoạn AZFbc chiếm 6,38%; và thấp nhất là mất một phần đoạn AZFb chiếm 3,2%. Kết quả nghiên cứu tương tự với nhiều nghiên cứu khác trên thế giới (45-98%) (Choi et al., 2013; Zhang et al., 2013b; Fadlalla et al., 2014; Gallego et al., 2014; Bichile et al., 2016; Zhu et al., 2016; Asadi et al., 2017). So sánh với các nghiên cứu trong nước cũng cho thấy tỷ lệ mất đoạn AZFc chiếm cao nhất (Nguyễn Minh Hà, 2011; Nguyễn Thị Việt Hà, 2012; Nguyễn Đức Nhự, 2015). Kết quả nghiên cứu công bố năm 2011- 2012 trên 70 nam giới khám vô sinh tại Bệnh viện Từ Dũ cho thấy mất đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất 11,4% và mất đoạn AZFb là 1,43% (Nguyễn Minh Hà, 2011). Một nghiên cứu khác của Nguyễn Thị Việt Hà (2012) cho thấy mất đoạn AZFc chiếm tỷ lệ cao nhất 4,4%, thấp hơn là AZFa chiếm 2,4%, AZFb và AZFabc chiếm tỷ lệ thấp nhất là 0,4%. Năm 2015, nghiên cứu của Nguyễn Đức Nhự phát hiện mất đoạn AZFc và AZFcd chiếm tỷ lệ cao nhất là 26,53% (13/49 trường hợp), thấp hơn là AZFbcd chiếm 8/49 trường hợp (16,33%), AZFd chiếm 7/49 trường hợp (14,29%), AZFabcd và AZFbc chiếm 3/49 trường hợp (6,12%), AZFb chiếm 2/49 trường hợp (4,08%). Trong các kiểu mất một phần đoạn AZFc, kết quả ghi nhận có 7 kiểu mất đoạn gồm: gr/gr, b2/b3, mất 2 gen DAZ, mất 1 gen CDY1, mất 2 gen DAZ và 1 gen CDY1, mất đoạn sY1191-sY1192 và mất đoạn sY1291. Một số đột biến mất một phần đoạn AZFc mới so với các nghiên cứu trên thế giới là mất đoạn sY1291, mất đoạn sY1191-1192, mất 2 gen DAZ, mất 2 gen DAZ và 1 gen CDY1. Sỡ dĩ, kết quả nghiên cứu khác biệt với nhiều nghiên cứu trên thế giới là do hầu hết các nghiên cứu chỉ dựa vào sự vắng mặt sản phẩm PCR được khuếch đại bằng các cặp mồi của các chỉ dấu di truyền sY1291, sY1191, sY1192 để xác định mất đoạn kiểu gr/gr, b2/b3 và b1/b3. Trong khi theo y văn cho thấy, mất đoạn kiểu gr/gr, b2/b3 hay b1/b3 có liên quan đến mất 2 gen DAZ và 1 gen CDY. 20
23. Mất đoạn gr/gr chiếm tỷ lệ cao nhất (31,6%), thấp hơn là mất 2 gen DAZ (21,1%), mất đoạn sY1191-sY1192 (14,5%), mất đoạn sY1291 (10,5%), mất 2 gen DAZ - 1 gen CDY1 (9,2%), mất đoạn kiểu b2/b3 (7,9%), và thấp nhất là mất 1 gen CDY1 (5,2%). Kết quả phù hợp với nhiều nghiên cứu trên thế giới (Rozen et al., 2012; Sen et al., 2015; Olesen et al., 2017). Sau mất đoạn AZF, nhân đoạn gen DAZ là nguyên nhân di truyền phổ biến thứ 2. Ở nam giới không có bất thường nhiễm sắc thể Y, DAZ/DAZL xuất hiện peak theo tỷ lệ 4:2. Tuy nhiên, kết quả luận án ghi nhận 15/113 (13,27%) trường hợp nam giới có peak DAZ/DAZL xuất hiện với tỷ lệ là 6:2 (Hình 4.7) hoặc 8:2 (Hình 4.8). Hình 4.7. Kết quả QF-PCR mẫu A236 với tỷ lệ peak DAZ/DAZL là 6:2 tại vị trí 210 bp và 214 bp. Hình 4.8. Kết quả QF-PCR mẫu A174 với tỷ lệ peak DAZ/DAZL là 8:2 tại vị trí 210 bp và 214 bp. Nhân đoạn gen DAZ cũng đã được Lu et al. (2013); Saito et al. (2015); Vaszko et al. (2016) và Alimardanian et al. (2016) ghi nhận. Ngoài ra, nghiên cứu ghi nhận dạng bất thường số lượng nhiễm sắc thể X kết hợp với bất thường nhiễm sắc thể Y. Cụ thể ở nam giới bình thường tỷ lệ AMELX/AMELY là 1:1 và TAF9B3/TAF9BX là 2:1, còn ở 21
24. nam giới có bất thường số lượng nhiễm sắc thể giới tính X tỷ lệ này là 2:1 và 2:2 (Hình 4.9A và 4.9B). Hình 4.9A. Nam giới bình thường có tỷ lệ peak AMELX/AMELY và TAF9B3/TAF9BX tương ứng là 1:1 và 2:1 của mẫu A95. Hình 4.9B. Nam giới tăng 1 nhiễm sắc thể X với tỷ lệ peak AMELX/AMELY và TAF9B3/TAF9BX là 2:1 và 2:2 của mẫu A97. Bốn trường hợp tăng 1 nhiễm sắc thể X này có bất thường nhiễm sắc thể Y: mất một phần đoạn AZFc kiểu gr/gr (1 trường hợp), nhân đoạn gen DAZ (2 trường hợp) và mất 2 gen DAZ (1 trường hợp). Kết quả nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu của Mitra et al. (2006), Hadjkacem-Loukil et al. (2009), Ceylan et al. (2010) và Li et al. (2015). 4.3. Mô tả đặc điểm tinh dịch đồ, nội tiết tố và một số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch 4.3.1. Đặc điểm chung và một số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y 4.3.1.1. Đặc điểm về tuổi và liên quan với bất thường nhiễm sắc thể Y Tuổi trung bình là 31,62±5,53, phù hợp với nhiều nghiên cứu. Nhóm tuổi 30-34 chiếm tỷ lệ cao nhất (31,1%). Nghiên cứu chưa tìm thấy mối liên quan giữa tuổi với bất thường nhiễm sắc thể Y. 4.3.1.2. Đặc điểm về nghề và liên quan với bất thường nhiễm sắc thể Y Nông dân chiếm tỷ lệ cao nhất 30,1%, khác với các nghiên cứu trước (cán bộ viên chức chiếm tỷ lệ cao nhất). Nam giới tiếp xúc với hóa chất, thuốc trừ sâu nguy cơ bất thường nhiễm sắc thể Y cao gấp 1,64 lần (p > 0,05). 22
25. 4.3.1.3. Đặc điểm về phân loại vô sinh nguyên phát và thứ phát Tỷ lệ vô sinh nguyên phát là 91,3%, cao hơn nghiên cứu của Nguyễn Quốc Tuấn (2011), Võ Xuân Đào (2014) và Masoumi (2015). Điều này có lẽ đối tượng nghiên cứu có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch. 4.3.1.4. Đặc điểm về thời gian vô sinh Thời gian vô sinh trung bình là 3,74±3,25 năm, phù hợp với nghiên cứu của Vũ Minh Ngọc (2009) và Phạm Chí Kông và ctv (2011). Thời gian vô sinh của nhóm 1-2 năm chiếm tỷ lệ cao nhất (48,1%), phù hợp với nghiên cứu Radwan et al. (2016) và Nguyễn Xuân Bái (2010). 4.3.1.5. Đặc điểm về thói quen và thời gian sử dụng điện thoại di động Thói quen để điện thoại di động trong túi quần vào ban ngày chiếm 90,7% và để trong giường khi ngủ vào ban đêm chiếm 83,9%. Thời gian sử dụng điện thoại di động trung bình là 8,76 4,28 năm. Nhóm sử dụng điện thoại di động 6-10 năm chiếm tỷ lệ cao nhất (44,7%), phù hợp với nghiên cứu của Radwan et al. (2016). 4.3.1.6. Đặc điểm về tiền sử quai bị Có 42/322 (13,0%) trường hợp với tiền sử quai bị, phù hợp với nghiên cứu của Radwan et al. (2016). 4.3.1.7. Đặc điểm về BMI và liên quan với bất thường nhiễm sắc thể Y BMI bình thường chiếm tỷ lệ cao nhất (52,8%) và thấp nhất là nhóm gầy (3,1%), phù hợp với nghiên cứu của Wang et al. (2017). Ngoài ra, nghiên cứu chưa ghi nhận mối liên quan giữa BMI với bất thường nhiễm sắc thể Y. 4.3.1.8. Đặc điểm về thể tích tinh hoàn Thể tích tinh hoàn trung bình là 9,97 2,72 mL, thấp hơn nghiên cứu của Nguyễn Đức Nhự (2015). Thể tích tinh hoàn 6-10 mL chiếm tỷ lệ cao nhất (67,4%), khác biệt với Nguyễn Đức Nhự (2015). Điều này có lẽ do cỡ mẫu và địa điểm nghiên cứu khác nhau. 4.3.1.9. Đặc điểm về bìu và liên quan giữa giãn tĩnh mạch thừng tinh với bất thường nhiễm sắc thể Y Tỷ lệ nam giới có bất thường bìu là 10,8%, phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Đức Nhự (2015). Kích thước tinh hoàn 2 bên không đều và giãn tĩnh mạch thừng tinh chiếm tỷ lệ cao nhất (37,1%), phù hợp với nghiên cứu của Phạm Chí Kông và ctv (2011), Olesen et al. (2016) và Suganya et al. (2016). Kết quả chưa tìm thấy mối liên quan giữa giãn tĩnh mạch thừng tinh với bất thường nhiễm sắc thể Y. 23
26. 4.3.2. Đặc điểm tinh dịch đồ 4.3.2.1. Đặc điểm các thông số tinh dịch a. pH tinh dịch pH trung bình là 7,51±0,46, tương tự nghiên cứu của Nguyễn Xuân Bái (2010), Trần Thị Thu Trang và ctv (2014) và Trần Đức Long (2016). b. Thể tích tinh dịch Nhóm có thể tích tinh dịch bình thường chiếm 78,9%, phù hợp với nghiên cứu của Trần Thị Hòa và ctv (2008), Khan et al. (2012), Nguyễn Đức Nhự (2015). Thể tích tinh dịch trung bình là 2,85±1,85 mL, phù hợp với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Xuân Bái (2010), Lê Hoàng Anh và ctv (2012) và Ugwa (2015). 4.3.2.2. Đặc điểm các thông số của tinh trùng a. Mật độ tinh trùng Nam giới vô tinh là 28,9%, thấp hơn so với các nghiên cứu trước đây. Sự khác biệt này có thể do nam giới vô tinh thường đi Thành phố Hồ Chí Minh để khám và điều trị. Ngoài ra, mật độ tinh trùng trung bình là 2,52x106±1,75x106 tinh trùng/mL tinh dịch, cao hơn nghiên cứu của Song et al., (2010), nhưng thấp hơn của Milardi et al. (2012). Sự khác biệt này có lẽ do cỡ mẫu và dân số nghiên cứu khác nhau. b. Các thông số còn lại của tinh trùng Tổng số tinh trùng, khả năng di động tiến tới của tinh trùng, hình dạng tinh trùng bình thường và tỷ lệ sống của tinh trùng phần lớn là bất thường. Cụ thể, chỉ có 0,4% trường hợp đạt được giá trị bình thường về tổng số tinh trùng và 1,3% bình thường về khả năng di động tiến tới. 4.3.3. Đặc điểm nội tiết trục tuyến yên-tinh hoàn và liên quan giữa bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ hormon 4.3.3.1. Đặc điểm nồng độ hormon FSH và liên quan giữa bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ hormon FSH Nhóm có nồng độ hormon FSH bình thường chiếm tỷ lệ cao nhất (68,0%), phù hợp với nghiên cứu của Hoàng Thị Thu Hương và ctv (2008). Ngoài ra, nồng độ hormon FSH trung bình là 10,55±10,64 mIU/mL, thấp hơn nghiên cứu của Evangelini et al. (2016). Những nam giới bất thường nhiễm sắc thể Y có nguy cơ bất thường nồng độ hormon FSH cao gấp 1,43 lần. Tuy nhiên, mối liên quan chưa có ý nghĩa thống kê với p > 0,05; phù hợp với Choi et al. (2013). 24
27. 4.3.3.2. Đặc điểm nồng độ hormon LH và liên quan giữa bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ hormon LH Nhóm có nồng độ hormon LH bình thường chiếm tỷ lệ cao nhất (92,9%), phù hợp với nghiên cứu của Hoàng Thị Thu Hương và ctv (2008). Ngoài ra, kết quả ghi nhận nồng độ hormon LH trung bình là 8,59±6,97 mIU/mL, phù hợp với nghiên cứu của Evangelini et al. (2016). Nam giới có bất thường nhiễm sắc thể Y có nguy cơ bất thường nồng độ hormon LH gấp 1,2 lần. Tuy nhiên sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê với p > 0,05. 4.3.3.3. Đặc điểm nồng độ hormon testosteron và liên quan giữa bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ hormon testosteron Nồng độ testosteron bình thường chiếm tỷ lệ cao nhất (83,5%), phù hợp với nghiên cứu của Hoàng Thị Thu Hương và ctv (2008); nhưng cao hơn khi so với nghiên cứu của Nguyễn Xuân Bái (2010) và Jimoh et al. (2012). Điều này có thể do cỡ mẫu khác nhau. Nồng độ testosteron trung bình là 4,05±1,88 ng/mL. Nghiên cứu chưa ghi nhận mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ testosteron (p > 0,05). 4.3.3.4. Đặc điểm phân loại kết quả xét nghiệm nội tiết Có 41,3% (133/322 trường hợp) có bất thường về nội tiết, phù hợp với nghiên cứu của Emokpae et al. (2007). Nhóm nam giới có nội tiết bình thường chiếm tỷ lệ cao nhất (58,69%), phù hợp với nghiên cứu của Ishikawa et al. (2004). Trong 133 trường hợp có bất thường nội tiết, tổn thương tế bào mầm nguyên phát chiếm tỷ lệ cao nhất 44,3% (59/133 trường hợp), phù hợp với nghiên cứu của Phạm Chí Kông (2012). Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1. Kết luận Nghiên cứu đã xây dựng và tối ưu thành công quy trình kỹ thuật QF-PCR với 14 chỉ dấu di truyền có độ tin cậy cao. Tỷ lệ nam giới khám vô sinh có bất thường nhiễm sắc thể Y là 35,1% (113/322 trường hợp) gồm: mất đoạn AZF, nhân đoạn gen DAZ và hội chứng Klinefelter có bất thường nhiễm sắc thể Y. Mất một phần đoạn AZFc lưu hành phổ biến nhất chiếm 80,9% (76/94 trường hợp). 25
28. Nghiên cứu ghi nhận một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y mới là mất đoạn sY1191-sY1192, mất đoạn sY1291, mất 2 gen DAZ - 1 gen CDY1 và mất 1 gen CDY1. Đặc điểm tinh dịch đồ ghi nhận pH và thể tích tinh dịch trung bình tương ứng là 7,51±0,46 và 2,85±1,85 mL. Nam giới vô tinh chiếm 28,9%. Mật độ tinh trùng trung bình 2,52x106±1,75x106 tinh trùng/mL tinh dịch. Nồng độ hormon FSH, LH và testosteron bình thường chiếm tỷ lệ cao, tương ứng là 68%, 92,85% và 83,54%. Ngoài ra, tỷ lệ bất thường về nội tiết là 41,3% (133/322 trường hợp); trong đó tổn thương tế bào mầm nguyên phát gặp nhiều nhất là 44,3% (59/133 trường hợp). Nghiên cứu chưa ghi nhận mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa bất thường nhiễm sắc thể Y với một số đặc điểm chung và nồng độ hormon FSH, LH và testosterone của đối tượng nghiên cứu. 5.2. Kiến nghị Áp dụng quy trình xét nghiệm QF-PCR đã kiểm định vào phát hiện một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y cho nhóm nam giới khám vô sinh. Ngoài ra, cần nghiên cứu bổ sung thêm một số chỉ dấu di truyền vào quy trình xét nghiệm QF-PCR đã kiểm định để phát hiện thêm một số dạng bất thường số lượng nhiễm sắc thể giới tính. Căn cứ vào các chỉ dấu di truyền sY1291, DAZ và CDY để xác định mất một phần đoạn AZFc kiểu gr/gr. Bất thường nội tiết chiếm tỷ lệ cao, bác sĩ nên chỉ định cho nhóm bệnh nhân này làm xét nghiệm nồng độ hormon FSH, LH và testosteron để có thể điều trị kịp thời cho những trường hợp vô sinh do nội tiết. Cần nghiên cứu thêm để tối ưu quy trình giải trình tự chứa đoạn lặp đơn nucleotid. 26