Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kĩ thuật in vitro

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kĩ thuật in vitro

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ NHUNG NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH SINH HỌC Hà Nội, 2021
2. Công trình được hoàn thành tại: 1. Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2. Viện Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Bùi Xuân Nguyên Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Việt Linh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: . Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ ’, ngày . tháng . năm 2021. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Viện Công nghệ sinh học
3. NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 1. Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Thị Hồng, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Hoàng Thịnh, Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi, Ngô Thị Kim Cúc, Nguyễn Thanh Sơn, Đồng Văn Quyền, Chu Hoàng Hà, Bùi Xuân Nguyên, Nguyễn Việt Linh. Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sự phát triển của phôi lợn nhân bản vô tính. Tạp chí sinh học, 2018, 40(2se):101-105 2. Nguyen Thi Nhung, Dong Van Quyen, Chu Hoang Ha, Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi, Ngo Thi Kim Cuc, Nguyen Thi Hong, Bui Xuan Nguyen, Barbara Beck-Woerner, Nguyen Viet Linh. Effect of donor cell type on the development of pig embryos produced by somatic cell nuclear transfer. Journal of Biotechnology 17(2): 1-5, 2019. 3. Nhung Thi Nguyen, Nguyen Xuan Bui, Viet Linh Nguyen, Van Khanh Nguyen, Kazuhiro Kikuchi, Hiep Thi N Nguyen, Hong Thi Nguyen, Hoang Thinh Nguyen, Quyen Van Dong, Hoang Ha Chu, Ngo Thi Kim Cuc, Tamas Somfai. Optimization of in vitro embryo production and zygote vitrification for the indigenous Vietnamese Ban pig: the effects of different in vitro oocyte maturation systems. Anim Science Journal. 2020;91:e13412 4. Nguyen Viet Linh, Thi Hiep Nguyen, Nguyen Thi Nhung, Nguyen Thi Hong, Nguyen Tien Dat, Nguyen Hoang Thinh, Nguyen Khanh Van, Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi. Optimization of the in vitro fertilization protocol for frozen epididymal sperm with low penetration ability in a native Vietnamese pig. Anim Science Journal. 2018 Aug;89(8):1079- 1084. -3, Issue-1, Jan-Feb, 2019 ISSN: 2456-8635. 5. Huỳnh Thị Hường, Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Hoàng Thịnh, Nguyễn Việt Linh. Ảnh hưởng của giới tính dòng tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn Bản nhân bản vô tính. Tạp chí hội chăn nuôi Việt Nam. Số 256 tháng 4 năm 2020.
4. 1 MỞ ĐẦU Phát triển công nghệ sinh học sinh sản với sự bùng nổ các thành tựu mới về cấy chuyển phôi, thụ tinh ống nghiệm, nhân bản vô tính, bảo quản lạnh tế bào sinh sản và phôi, sự giao thoa giữa công nghệ sinh sản và các liệu pháp công nghệ di truyền trên tế bào sinh sản đã và đang mở ra những tiềm năng ứng dụng to lớn trong các lĩnh vực cải tiến năng suất vật nuôi, đảm bảo an ninh lương thực, bảo tồn và khai thác đa dạng sinh học (ĐDSH), cân bằng sinh thái và phát triển công nghệ y dược hiện đại. Lợn là một trong các đối tượng quan trọng nhất của công nghệ sinh học. Ngoài mục đích cung cấp thực phẩm cho con người, lợn còn là một trong những nhân tố trong hệ thống bảo tồn đa dạng sinh học và có triển vọng lớn ứng dụng trong y học. Lợn là loài động vật có kích thước các cơ quan nội tạng tương đồng với các cơ quan của người, có hệ gen, quá trình sinh lý học, thể chất và hệ miễn dịch gần giống với người, vì vậy là đối tượng khả thi nhất được lựa chọn cho hướng nghiên cứu cấy ghép tạng khác loài (xenotransplantation). Do khả năng tồn tại các cá thể không mang virus Porcine Endogenous Retrovirus (PERVs), giống lợn Bản đang được đánh giá là đối tượng tiềm năng quan trọng đối với công nghệ cấy ghép mô tạng khác loài và là nguồn gen quý cần được bảo tồn và phát triển. Vì vậy chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản địa Việt Nam bằng kỹ thuật in vitro”. Mục tiêu: Nghiên cứu được tiến hành trên mô hình lợn Bản với các mục tiêu: (1). Xác định được tiềm năng khai thác trứng của buồng trứng lợn Bản; (2). Xác định được các điều kiện nuôi thành thục trứng lợn Bản; (3). Thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản bằng thụ tinh ống nghiệm (TTON) và nhân bản vô tính (NBVT). Dựa trên các nội dung nghiên cứu: (1). Nghiên cứu đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng ở lợn Bản theo mùa; (2). Nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản bằng phương pháp chuẩn hóa môi trường nuôi; (3). Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình tạo phôi lợn Bản TTON thông qua môi trường thụ tinh, điều kiện thụ tinh và nuôi phôi; (4). Nghiên cứu tạo phôi lợn Bản bằng NBVT khác loài. Tính mới của luận án: (1). Luận án đã cung cấp các thông tin mới về ảnh hưởng của mùa vụ, môi trường nuôi thành thục trứng, môi trường và chế độ thụ tinh, nuôi phôi và bảo quản lạnh phôi TTON, tạo phôi NBVT bằng cấy nhân khác giống làm cơ sở thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản có hiệu quả cao, có thể phát triển nhằm mục đích bảo tồn đa dạng sinh học. (2). Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về sử dụng hệ thống Piezo để tạo phôi NBVT trên đối tượng lợn.
5. 2 CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh và phát triển phôi in vivo ở lợn 1.1.1. Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn Buồng trứng là một bộ phận của cơ quan sinh dục cái, có chức năng tạo tế bào trứng (giao tử cái -noãn bào). Miền vỏ buồng trứng chứa nang ở các giai đoạn phát triển khác nhau gồm nang nguyên thủy, nang sơ cấp, nang thứ cấp và nang trứng thành thục. Nang trứng là đơn vị cấu trúc cơ bản của buồng trứng, có chức năng duy trì quá trình phát triển trứng (oogenesis), bảo đảm khả năng thụ tinh và hình thành phôi. 1.1.2. Sự thụ tinh và phát triển phôi lợn in vivo 1.1.2.1. Các giai đoạn thụ tinh Cũng như các loài khác, quá trình thụ tinh ở lợn gồm các giai đoạn: Hoạt hóa tinh, tinh trùng gắn vào màng zona của trứng, phản ứng acrosome, tinh trùng xuyên qua màng zona, tinh trùng vào tế bào chất của trứng và liên kết với trứng, trứng được kích hoạt và phản ứng vỏ trứng xảy ra. 1.1.2.2. Các giai đoạn phát triển của phôi lợn Khoảng 30 giờ sau thụ tinh trứng phân chia thành 2 tế bào, tiếp tục quá trình phân chia nhanh chóng đề tạo phôi 4, 8 tế bào. Phôi dâu hình thành vào ngày 3-4 sau thụ tinh. Phôi tiếp tục phân chia và tạo thành phôi nang và bắt đầu làm tổ trong tử cung. 1.1.3. Ảnh hưởng của mùa vụ đến hoạt động sinh sản ở lợn Lợn là loài động vật đa thai, mặc dù việc khai thác trứng lợn có thể thực hiện trong suốt cả năm, các yếu tố mùa vụ có ảnh hưởng đáng kể tới chất lượng buồng trứng, từ đó ảnh hưởng tới số lượng và chất lượng trứng. 1.2. Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro 1.2.1. Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu trứng và điều kiện nuôi thành thục Kết quả thí nghiệm nuôi thành thục trứng thu từ các nang có kích thước khác nhau cho thấy chất lượng và trạng thái nang có ảnh hưởng lớn tới sự thành thục của trứng. Môi trường nuôi trứng lợn thành thục thông thường bao gồm môi trường nền (môi trường Hank với L-glutamine và Hespes) được bổ sung huyết thanh (fetal calf serum: FCS) hoặc dịch nang trứng (follicular fluid: FF) và các thành phần khác như gonadotropin, các nhân tố tăng trưởng Hormone (LH, FSH), Dibutyryl-cAMP (dbc-AMP). Kết hợp hài hòa sự thành thục tế bào chất và thành thục nhân của trứng trong quá trình nuôi in vitro là yếu có ảnh hưởng quan trọng lên chất lượng thụ tinh và sự phát triển phôi. 1.2.2. Tạo phôi lợn thụ tinh ống nghiệm, ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng, chế độ thụ tinh, nuôi và bảo quản phôi
6. 3 TTON bị chi phối bởi nhiểu yếu tố ảnh hưởng, từ phương pháp bảo quản và hoạt hóa tinh, tác động môi trường nuôi thành thục trứng, chế độ thụ tinh đến môi trường nuôi phôi và phương pháp bảo quản phôi. 1.2.2.1. Bảo quản và hoạt hóa tinh Nghiên cứu sử dụng tinh lợn đông lạnh để tạo phôi TTONđược Nagai và cs thực hiện thành công lần đầu tiên vào năm 1988. Nghiên cứu của nhóm các tác giả Nagai (1988) và Kikuchi (1998) cho thấy tinh trùng thu từ mào tinh hoàn có khả năng khả năng chịu lạnh cao hơn so với tinh trùng thu được sau xuất tinh, có thể đông lạnh và sử dụng để thụ tinh với trứng thành thục. 1.2.2.2. Môi trường thụ tinh, nuôi phôi và các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh Hai loại môi trường cơ bản được sử dụng phổ biến là môi trường Tyrode’s albumin lactate pyruvate (TALP) và môi trường Fertilization Medium for Porcine oocytes (Pig-FM). Bổ sung 10 mg/mL BSA và 2 mmol/L caffein, dịch nang trứng (pFF) vào môi trường nuôi trứng và môi trường thụ tinh làm tăng đáng kể tỷ lệ tinh trùng xâm nhập, tỷ lệ phân chia và phát triển của phôi. Các môi trường Porcine Zygote Medium-3 (PZM-3) và PZM-5 được cho là có hiệu quả tạo phôi cao hơn và bắt đầu được sử dụng nhiều hơn những năm gần đây. Trở ngại lớn nhất ảnh hưởng tới hiệu quả tạo phôi tạo phôi lợn in vitro là hiện tượng thụ tinh đa tinh trùng (polyspermic). Tỷ lệ phôi đa tinh trùng ở lợn dao động từ 13% đến 90%. Tế bào cận noãn có vai trò quan trọng, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ tinh đơn tinh trùng. Hiệu quả TTON cao nhất trong điều kiện tế bào trứng còn các lớp tế bào cận noãn và được thụ tinh với nồng độ ở 0.5 × 105 tinh trùng/ml. 1.2.2.3. Đông lạnh phôi lợn thụ tinh ống nghiệm Nghiên cứu đông lạnh phôi lợn được tiến hành từ khá sớm, tuy nhiên việc bảo quản phôi gặp khá nhiều khó khăn do phôi lợn rất nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt độ. Các phương pháp đông lạnh nhanh với thể tích tối thiểu (minimum volume cooling: MVC), phương pháp thả trực tiếp phôi vào nito lỏng (microdrop), hoặc lên bề mặt kim loại đã được làm lạnh bằng nito lỏng (Solid Surface Vitrification- SSV), phương pháp mới Hollow Fiber Vitrification (HFV) đã được áp dụng để đông lạnh phôi lợn ở giai đoạn phôi nang. 1.2.3. Tạo phôi lợn bằng kỹ thuật nhân bản vô tính 1.2.3.1. Kỹ thuật nhân bản vô tính, quá trình methyl hóa và sự tái lập trình trong phôi nhân bản NBVT là kĩ thuật tạo ra những bản sao của một cá thể mà không qua sinh sản hữu tính. Cơ thể sống đầu tiên được tạo ra nhờ kỹ thuật NBVT theo phương pháp này là chú cừu Dolly sinh ngày 5 tháng 7 năm 1996 tại Viện Nghiên cứu Roslin. Yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng quan trọng đến hiệu quả của NBVT. Các kỹ thuật NBVT phổ biến là kỹ thuật kinh điển sử dụng kính
7. 4 hiển vi vi phẫu thuật để loại và cấy nhân bằng kim vi tiêm, kỹ thuật loại và cấy nhân kết hợp kính hiển vi vi phẫu thuật có gắn hệ thống piezo và kỹ thuật handmade cloning. 1.2.3.2. Nhân bản vô tính khác loài NBVT khác loài là kỹ thuật tạo phôi nhân bản do cấy nhân tế bào cho nhân của một loài này vào trứng đã loại nhân của loài khác (Interspecies somatic cell nuclear transfer –iSCNT). NBVT khác loài được xem là một giải pháp tiềm năng để tái tạo, bảo tồn các loài động vật quý hiếm đã và đang có nguy cơ bị tuyệt chủng. Wells và cs, 1998 đã công bố nhân bản thành công cá thể bò đảo Enderby (là cá thể duy nhất còn sống sót của giống giá súc quý hiếm bậc nhất thế giới). 1.2.3.3. Nhân bản vô tính trên lợn. Các nhóm nghiên cứu của Onishi và Polejaeva đã thông báo thành công trong việc tạo lợn nhân bản vào năm 2000. Tuy nhiên, cho đến nay hiệu quả NBVT trên lợn vẫn còn rất thấp. Tỷ lệ lợn con được sinh ra chỉ dao động khoảng 1-3% tổng số phôi được cấy. Chất lượng trứng, mùa vụ, yếu tố môi trường như photoperiod, nhiệt độ có thể ảnh hưởng lên chất lượng trứng và qua đó lên hiệu quả NBVT. Nghiên cứu của Kurome và cs, 2013 cho thấy khi tiến hành cấy phôi NBVT, tỷ lệ đậu thai đạt cao nhất vào mùa đông (5,3%) và thấp nhất vào mùa hạ. Hiệu suất NBVT cao nhất, đạt 4.1% lợn sinh ra sau cấy phôi đã được thông báo trong thời gian gần đây. 1.3. Nghiên cứu tạo phôi in vitro lợn Bản 1.3.1. Một số đặc điểm hình thái và sinh sản của lợn Bản Lợn Bản được xem là đối tượng lý tưởng đối với công nghệ ghép mô tạng khác loài (xenotransplantation) do nó có đặc điểm về kích thước, hệ gen tương đồng với con người. Ngoài ra lợn Bản là giống lợn duy nhất hiện nay có số lượng bản sao virus PERV thấp, vì vậy chúng có tiềm năng to lớn trong nghiên cứu và ứng dụng y-sinh đặc biệt là cấy tạng khác loài. Hiện nay, quần thể lợn Bản có khoảng 30.000 – 32.000 con nhưng đã bị lai tạp nhiều, phân bố ở khắp các huyện vùng núi cao của tỉnh Hòa Bình, trong đó chủ yếu tập trung ở Đà Bắc, Cao Phong, Lạc Sơn, Mai Châu, Tân Lạc 1.3.2. Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản tại Việt Nam Các thí nghiệm về nuôi thành thục trứng và tạo phôi in vitro trên lợn Bản được triển khai lần đầu tiên trong khuôn khổ dự án hợp tác khoa học Việt-Nhật (JSPS-VAST, 2005-2007). Năm 2008, Ước và cs thông báo kết quả nghiên cứu sản xuất phôi lợn mini nội địa bằng tổ hợp công nghệ TTON và NBVT. Các tác giả cũng đã tiến hành thành công thí nghiệm thử nghiệm tạo phôi NBVT bằng cấy nhân tế bào sinh dưỡng của lợn Bản vào tế bào trứng của lợn Landras, với tỷ lệ hợp nhất giữa trứng và tế bào đạt 70% và tỷ lệ phôi nang đạt 12%.
8. 5 CHƯƠNG 2- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phân loại tháng theo mùa 2.2.2. Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng 2.2.3. Phương pháp đo kích thước và trọng lượng buồng trứng 2.2.4. Phương pháp phân chia nhóm nang 2.2.5. Phương pháp thu trứng 2.2.6. Phương pháp phân loại chất lượng trứng 2.2.7. Phương pháp đo kích thước trứng lợn 2.2.8. Phương pháp nuôi trứng 2.2.9. Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi 2.2.10. Phương pháp đông lạnh tinh từ mào tinh 2.2.11. Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh trước và sau đông lạnh 2.2.12. Phương pháp thụ tinh ống nghiệm 2.2.13. Phương pháp đánh giá trạng thái thụ tinh 2.2.14. Phương pháp đông lạnh phôi 2.2.15. Phương pháp thu, nuôi tế bào sinh dưỡng lợn 2 2.16. Phương pháp nhân nuôi tế bào 2.2.17. Phương pháp đông lạnh tế bào 2.2.18. Phương pháp nhân bản vô tính 2.2.19. Phương pháp nuôi phôi 2.2.20. Phương pháp nhuộm Hoechst 2.2.21. Phương pháp nhuộm Orcein 2.2.22. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu
9. 6 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU Tiềm năng Khảo sát kích Khảo sát Khảo sát chất khai thác thước và khối kích thước lượng trứng trứng theo lượng BT nang bề mặt sau thu mùa NỘI DUNG 1 Tỷ lệ thành thục Chọn lọc môi của trứng theo trường nuôi thành mùa thục trứng tối ưu NỘI DUNG 2 MT thụ tinh (TALP, Pig), Chọn lọc môi NĐ tinh 5 6 trường nuôi trứng (1x10 , 1x10 tối ưu (TCM-199, Trứng sau nuôi TT/ml) POM) Hệ thành thục thống Chế (ND2) TTON nuôi Trạng thái TB độ trứng, cận noãn (để thụ TTON nguyên, tách 1 tinh Thu và bảo MT nuôi % phôi và phần, bỏ hoàn tối quản lạnh phôi nang, số nuôi toàn ) ưu (NCSU-37, tinh lợn TB/phôi phôi Bản PZM-3) tối ưu NĐ cafein (2 mM, 5 mM) và thời gian thụ Ngân hàng Đông tinh (3 giờ, 6 phôi lạnh giờ) NỘI DUNG 3 phôi Loại tế bào cấy nhân Hệ thống Ngân hàng tế bào tạo phôi lợn Bản lợn Bản NBVT NBVT Nuôi thành Môi trường thục trứng nuôi phôi (NCSU-37, lợn Landrace PZM-3) NỘ I DUNG 4
10. 7 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng ở lợn Bản theo mùa Phần nội dung này được thực hiện với 3 nghiên cứu cơ bản: 1. Khảo sát ảnh hưởng của các mùa xuân, hạ, thu, đông lên kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản. 2. Khảo sát ảnh hưởng của các mùa lên tiềm năng khai thác trứng căn cứ theo tỷ lệ trứng loại A,B,C thu được/BT. 3. Khảo sát ảnh hưởng của các mùa lên kích thước trứng loại A, B sau thu. Thí nghiệm được tiến hành trên các cá thể lợn Bản có cùng độ tuổi, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng, có khối lượng từ 20-25 kg. 3.1.1. Đặc điểm hình thái, kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa Bảng 3.1. Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản theo mùa Số Mùa xuân Mùa hạ Mùa Thu Mùa đông BT(n) ( TB±SEM) ( TB±SEM) ( TB±SEM) ( TB±SEM) Chiều dài 10 (17±0,8)a (15±1)b (15,2±0,6)b (17,4±0,8)a (mm) Chiều rộng 10 (12,2±0,3)a (10,9±0,7)b (11,3±0,4)b (11,9±0,5)a (mm) Chiều dầy 10 (8,1±0,4)a (6,3±0,3)b (7±0,3)b (8±0,5)a (mm) Khối lượng 10 (2,4±0,1)a (2.0±0,2)b (2,1±0,2)b (2,3±0,2)ab (g) Thí nghiệm được lặp lại 5 lần, mỗi lần thu buồng trứng từ 1 lợn cái.Số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một hàng là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Aspin-Welch T-test) Kết quả cho thấy, kích thước buồng trứng lợn Bản có sự khác biệt theo 2 lô: mùa xuân-đông và mùa hạ-thu. Theo đó, kích thước cả 3 chiều của buồng trứng giữa mùa xuân và mùa đông là tương đương nhau và cao hơn so với 2 mùa là mùa hạ và mùa thu, kích thước giữa mùa hạ và mùa thu cũng tương đương nhau. Tương tự, khối lượng buồng trứng lợn Bản có sự thay đổi theo mùa, trong đó khối lượng TB của buồng trứng trong mùa xuân là cao nhất và trong mùa hạ là thấp nhất (Bảng 3.1) 3.1.2. Phân bố nang bề mặt buồng trứng lợn Bản Thí nghiệm được tiến hành với số lượng 10 buồng trứng được thu từ 5 lợn/mỗi mùa. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 cho thấy TB số nang/BT có kích thước 3-5 mm tương đương nhau ở các mùa xuân và đông (0,7±0,2; 0,6±0,2), cao hơn đáng kể so với mùa hạ và mùa thu (0,1±0,1; 0,1±0,1) (Bảng 3.2).
11. 8 Bảng 3.2. Số lượng nang trung bình theo kích thước Số nang (n, TB số nang/buồng trứng) Tổng số nang Mùa (n,TB số 5mm nang/BT) 102 56 7 165 Xuân 0 (0) (10,2±0,7) (5,6±0,3)a (0,7±0,2)a (16,5±0,8)a 93 39 1 133 Hạ 0 (0) (9,3±0,6) (3,9±0,4)b (0,1±0,1)b (13,3±0,7)b 105 59 1 165 Thu 0 (0) (10,5±0,5) (5,9±0,3)a (0,1±0,1)b (16,5±0,6)a 94 53 6 153 Đông 0 (0) (9,4±0,4) (5,3±0,4)a (0,6±0,2)a (15,3±0,7)a Số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Aspin-Welch T-test) 3.1.3. Đặc điểm phân loại chất lượng trứng theo mùa và kích thước trứng lợn Bản 3.1.3.1. Phân loại chất lượng trứng theo mùa Bảng 3.3. Ảnh hưởng của mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản Mùa Tổng số Tổng số Tổng số Tổng số trứng Tổng số trứng trứng loại A trứng loại B loại C trứng loại (n, TB/BT) (n, TB/BT) (n, TB/BT) (n,TB/BT) A+B (n,TB/BT) Xuân 1025 230 312 483 542 (34,2±3,1)b (7,6±0,4)a (10,4±0,5)a (16,1±3,6)b (18,1±0,6)a Hạ 990 187 215 588 402 (33±0,7)b (6,2±0,4)b (7,2±0,4)b (19,6±0,2)ab (13,4±0,8)c Thu 1150 205 285 660 490 (38,3±0,7)a (6,8±0,9)b (9,5±0,6)a (22±1,0)a (16,3±0,7)b Đông 1168 248 279 641 527 (38,9±1,1)a (8,3±0,8)a (9,3±0,3)a (21,4±1,8)a (17,5±0,9)a TB: Trung bình, BT: Buồng trứng. Thí nghiệm được lặp lại 5 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b,c) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Aspin-Welch T-test) Tổng số 15 lợn cái thành thục về tính, có cùng độ tuổi và chế độ chăm sóc đã được giết mổ trong mỗi mùa. Trứng được thu và phân loại dựa vào hình thái theo phương pháp phân loại chất lượng trứng loại A, B và C. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 cho thấy số trứng loại A/BT (Hình 3.3) trong mùa xuân và mùa đông cao hơn so với mùa hạ và mùa thu (7,6±0,4 và 8,3±0,8 so với 6,2±0,4 và 6,8±0,9) 3.1.3.2. Kích thước trứng lợn Bản Kết quả khảo sát đối với tổng số 30 trứng trong mỗi mùa cho thấy cho
12. 9 thấy mùa vụ không ảnh hưởng lên kích thước trứng của các trứng có chất lượng A+B. Trong đó kích thước trứng không có màng sáng dao động từ 110,1±2,4 tới 113,6±2,1. Tổng hợp phần nghiên cứu ở phần này chúng tôi nhận thấy ảnh hưởng của mùa vụ lên tiềm năng khai thác trứng ở lợn Bản thể hiện qua các biến đổi có quy luật về sự tương quan về kích thước buồng trứng, sự phát triển của nang và chất lượng trứng. BT được thu vào mùa xuân và mùa đông kích thước lớn hơn so với mùa thu và hạ, tương ứng với tỷ lệ trứng A+B thu được/BT trong mùa xuân và mùa đông cũng cao hơn so với mùa hạ và mùa thu. Tương tự, trung bình số nang có kích thước lớn (>2 mm) trên mỗi buồng trứng có mối liên quan tỷ lệ thuận với số trứng loại A+B thu được/BT lợn Bản và có sự phụ thuộc vào mùa vụ. Tỷ lệ thuận với số nang có kích thước > 2 mm, trung bình số trứng loại A+B thu được/BT lợn Bản trong mùa xuân cũng đạt cao nhất (18,1), tuy nhiên kế tiếp là số trứng A+B thu được vào mùa đông (17,5), tiếp theo là mùa thu (16,3) và mùa hạ đạt tỷ lệ này thấp nhất (13,4). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy mùa vụ không ảnh hưởng lên kích thước trứng của các trứng có chất lượng A+B. Kết quả tương tự về sự thay đổi về kích thước của tế bào trứng các giống lợn ngoại theo mùa vụ cũng đã được một số tác giả thông báo trên đối tượng lợn ngoại. Nghiên cứu của Kyzekova và cs, 2019 cho thấy các trứng thu từ các nang ≤ 3mm có kích thước trung bình nhỏ nhất vào mùa xuân và lớn nhất vào mùa đông, song với sự sai khác không có ý nghĩa thống kê [33]. 3.2. Kết quả nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản Phần nghiên cứu này được tiến hành nhằm tìm hiều khả năng thành thục của trứng lợn Bản theo từng mùa vụ, qua đó xác định thời gian thu mẫu đạt hiệu quả tối ưu, đồng thời lựa chọn được loại môi trường nuôi thành thục phù hợp với sự phát triển của trứng lợn Bản. Nghiên cứu được bố trí với 2 thí nghiệm cơ bản: 1) Khảo sát trạng thái phát triển của trứng trong 4 mùa sau 44-46 giờ nuôi trong môi trường NCSU-37 với các chỉ tiêu: Tỷ lệ trứng ở giai đoạn GV, GVDB, MI, MII, tỷ lệ trứng ở giai đoạn khác; 2) Nghiên cứu nuôi thành thục trứng trong 5 loại môi trường cơ bản được sử dụng phổ hiến hiện nay là: NCSU-37+pFF, NCSU-37+FBS, TCM-199+pFF, TCM199+FBS, POM và chọn lựa loại môi trường nuôi phù hợp với sự phát triển của trứng lợn Bản. 3.2.1. Ảnh hưởng của mùa vụ lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản Trứng lợn Bản sau khi thu được nuôi trong môi trường NCSU-37+10% pFF có bổ sung hormone trong 22 giờ, sau đó nuôi trong NCSU-37+10% pFF không bổ sung hormone trong 22 giờ tiếp theo. Sau 44 h nuôi, trứng được tách tế bào cận noãn và nhuộm với Orcein 1% để kiểm tra tỷ lệ trứng ở các giai đoạn GV, GVDB, MI, MII tại thời điểm 44 giờ. Kết quả thu được cho thấy trong cùng môi trường nuôi là NCSU- 37+10% pFF và cùng điều kiện nuôi thành thục thì tỷ lệ thành thục của trứng
13. 10 lợn Bản khác nhau giữa các mùa, cụ thể tỷ lệ này trong mùa xuân và mùa đông cao hơn so với mùa hạ và mùa thu (67,8±0,7% và 67,9±0,5% so với 58,8±1,0% và 61,2±1,8%) (sai khác có ý nghĩa thống kê, P<0,05) (Bảng 3.5). Mặc dù vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi cũng nhận thấy, tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản thấp hơn so với tỷ lệ thành thục của các giống lợn ngoại đã được công bố trước đó khi sử dụng cùng một hệ thống nuôi. Kết quả cũng cho thấy có mối liên kết tương ứng về tiềm năng khai thác trứng và tỷ lệ thành thục theo mùa của trứng lợn Bản. Mùa xuân và mùa đông số nang có kích thước lớn/buồng trứng nhiều hơn so với hai mùa còn lại (Bảng 3.2), ngoài ra trung bình số trứng loại A+B thu được trong hai mùa này cũng cao hơn so với mùa hạ và mùa thu (Bảng 3.3) dẫn tới tỷ lệ thành thục của trứng trong hai mùa xuân, đông cao hơn so với hai mùa hạ, thu. Bảng 3.5. Sự thành thục của trứng lợn Bản Mùa Tổng Số trứng Số trứng Số trứng Số trứng Số trứng trứng GV GVBD MI MII giai đoạn (n) (n,%) (n,%) (n,%) (n,%) khác (n,%) Xuân 638 42 90 19 433 54 (6,6±0,7) (14,1±0,7) (2,9±0,4) (67,8±0,7)a (8,4±1,1) Hạ 547 52 79 40 322 54 (9,5±1,1) (14,5±1,0) (7,3±0,3) (58,8±1,0) (9,9±1,5) b Thu 611 47 65 42 375 82 (7,7±0,9) (10,7±1,3) (6,8±0,7) (61,2±1,8) (13,4±1,7) b Đôn 644 29 89 25 437 64 g (4,4±0,9) (13,8±0,9) (3,8±0,7) (67,9±0,5)a (9,9±1,3) Số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05). 3.2.2. Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản Nhằm xác định loại môi trường có hiệu quả cải thiện tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản chúng tôi tiến hành nghiên cứu so sánh hiệu quả thành thục trên 5 loại môi trường: NCSU-37 +pFF, NCSU-37 +FBS, TCM- 199+pFF, TCM-199 +FBS, POM. Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, tỷ lệ trứng thành thục (trứng phát triển đến giai đoạn MII) trong môi trường POM (Hình 3.7A) và môi trường TCM-199+pFF (Hình 3.7D) là tương đương nhau (74,5±2,7% và 73,4±2,5%) và cao hơn trong các môi trường NCSU-37+pFF (Hình 3.7B), NCSU-37+FBS (Hình 3.7C), TCM-199+FBS (Hình 3.7E) (64,1±0,6%; 61,6±2,4%; 55,8±2,0%) (Bảng 3.6). Kết quả so sánh sự phát triển của trứng được nuôi trong các loại môi trường khác nhau cho thấy, mặc dù trứng được nuôi trong môi trường
14. 11 NCSU-37+pFF và NCSU-37+FBS có tỷ lệ trứng phát triển tới giai đoạn MI khá tốt, tuy nhiên trứng sau khi phát triển đến giai đoạn MI thì dừng lại, không tiếp tục phát triển đến giai đoan MII (tỷ lệ trứng MI lần lượt là: 17,9±3,7 và 23,8±0,5). Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, tỷ lệ trứng thành thục (trứng phát triển đến giai đoạn MII) trong môi trường POM (Hình 3.7A) và môi trường TCM-199+pFF (Hình 3.7D) là tương đương nhau (74,5±2,7% và 73,4±2,5%) và cao hơn trong các môi trường NCSU-37+pFF (Hình 3.7B), NCSU-37+FBS (Hình 3.7C), TCM-199+FBS (Hình 3.7E) (64,1±0,6%; 61,6±2,4%; 55,8±2,0%) (Bảng 3.6). Như vậy môi trường TCM-199+pFF và POM phù hợp hơn với sự phát triển của trứng lợn Bản. Bảng 3.6. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản Môi trường Tổng số Số trứng GV Số trứng MI Số trứng MII Số trứng giai trứng (n,%) (n,%) (n,%) đoạn khác (n) (n,%) NCSU- 131 12 23 84 12 37+pFF (9,0±1,9) (17,9±3,7)b (64,1±0,6)b (9,0±2,1) NCSU- 130 12 31 80 7 37+FBS (9,3±1,5) (23,8±0,5)a (61,6±2,4)b (5,2±3,5) TCM- 135 13 8 99 15 199+pFF (9,6±1,3) (5,9±1,2)c (73,4±2,5)a (11,1±3,0) TCM- 136 15 21 91 24 199+FBS (11,2±2,4) (15,6±1,8)b (55,8±2,0)c (17,4±2,5) POM 145 11 9 108 17 (7,6±1,3) (6,2±0,6)c (74,5±2,7)a (11,7±3,5) Thí nghiệm lặp lại 4 lần, mỗi lần thu trứng từ 5 lợn cái, số liệu% biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b,c) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05), Aspin-Welch T-test 3.2. Kết quả tạo phôi lợn Bản bằng thụ tinh ống nghiệm Trứng được sử dụng trong các nghiên cứu tạo phôi là trứng được nuôi trong môi trường TCM-199+pFF và môi trường POM đã được chọn lọc phù hợp ở nội dung 1-2. Thí nghiệm trong nghiên cứu tạo phôi lợn Bản TTON bao gồm: 1) Nghiên cứu tạo nguồn tinh lợn Bản bằng phương pháp đông lạnh tinh thu từ mào tinh; 2) Nghiên cứu chế độ và điều kiện thụ tinh tối ưu; 3) Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự thụ tinh và phát triển phôi ; 4) Nghiên cứu chọn lọc loại môi trường nuôi phôi phù hợp cho chất lượng phôi tốt; 5) Nghiên cứu đông lạnh phôi TTON. 3.3.1. Nghiên cứu đông lạnh tinh lợn Bản 3.3.1.1. Khảo sát chất lượng tinh dịch lợn Bản thu từ mào tinh hoàn Hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh, tỷ lệ sống và tỷ lệ kỳ hình trước và sau đông lạnh được kiểm tra bằng phương pháp kiểm tra chất lượng tinh đã trình bày trong phần phương pháp, trong đó mỗi chỉ số được kiểm tra 4 lần
15. 12 để tính số liệu trung bình. Kết quả nghiên cứu về thể tích tinh dịch, hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ kỳ hình của tinh dịch ngay sau khi thu được trình bày ở bảng 3.7. Bảng 3.7. Chất lượng tinh sau khi thu Ký hiệu Thể tích thu Hoạt lực Nồng độ Tỷ lệ tinh Tỷ lệ kỳ được V tinh trùng tinh trùng sống hình (%) (ml) (Triệu/ml) (%) TLB 001 3,2 50±1,1 6406±137,8 58±1,5 31±0,5 TLB 002 3 72±1,5 9332±119,3 76,3±0,8 12,3±0,6 TLB 003 4 76±1,1 11337±56,1 85,6±0,6 10,6±1,4 TLB 004 3,5 61,6±1,6 8772±14,8 73,3±0,6 11±1,7 Thu tinh từ 4 lợn đực. Số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, TLB:Tinh lợn Bản Từ kết quả bảng 3.7 ta thấy tỷ lệ tinh trùng sống và hoạt lực của tinh trùng ở cả 4 lô tinh trong nghiên cứu của chúng tôi đều đạt >50%, trong đó hoạt lực của TLB 001 và TLB 004 thấp hơn so với TLB 002 và TLB 003 (72±1,5 và 76±1,1 so với 50±1,1 và 61,6±1,6%). Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, tỷ lệ sống và hoạt lực ở lô tinh TLB 002 và TLB 003 có thể sử dụng để đông lạnh và tạo phôi ống nghiệm. Như vậy, căn cứ vào các chỉ tiêu của tinh dịch sau khi thu, chúng tôi nhận thấy lô tinh TLB 002 và TLB 003 có các chỉ tiêu phù hợp và tốt nhất phục vụ cho nghiên cứu TTON và tạo phôi lợn Bản. 3.3.1.2. Chất lượng tinh sau đông lạnh Bảng 3.8. Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh Ký hiệu Hoạt lực tinh trùng Tỷ lệ tinh trùng Tỷ lệ kỳ hình (%) sống (%) (%) TLB 002 26,6±0,8a 38,6±2,3b 13±0,5 TLB 003 25,7±1,4a 45,8±0,6a 12±1,5 Số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Aspin-Welch T-test) Do lô tinh TLB 002 và TLB 003 có hoạt lực, nồng độ tinh và tỷ lệ sống sau khi thu cao hơn 2 lô tinh còn lại, hơn nữa tỷ lệ kỳ hình của TLB 001 cao vì vậy chúng tôi chỉ tiến hành đông lạnh 2 lô tinh là TLB 002 và TLB 003. Kết quả kiểm tra chất lượng tinh sau đông lạnh được trình bày tại bảng 3.8. Tinh trùng sau đông lạnh được giải đông và kiểm tra các chỉ số về hoạt lực, tỷ lệ sống, tỷ lệ kỳ hình. Kết quả thu được cho thấy, hoạt lực của TLB 002 và TLB 003 là tương đương nhau, tuy nhiên tỷ lệ tinh trùng sống sau đông lạnh của TLB 003 cao hơn so với TLB 002 (45,8±0,6 so với 38,6±2,3) (Bảng 3.8). Tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh trong nghiên cứu của chúng
16. 13 tôi cao hơn so với công bố tương tự trên lợn Bản của Nguyen và cs, 2015 (45,8±0,6 và 38,6±2,3 so với 31,9±2). 3.3.1.3. Kiểm tra chất lượng tinh thông qua kết quả thụ tinh ống nghiệm Trứng sau khi thu và nuôi trong môi trường TCM-199 sau 44-46 h được chia thành 2 lô thí nghiệm: Lô thụ tinh với TLB 002, lô 2 thụ tinh với TLB 003 trong môi trường Pig FM với nồng độ tinh 1x106 tinh trùng/ml, phôi được nuôi trong môi trường PZM-3 và theo dõi tỷ lệ phân chia, tỷ lệ hình thành phôi nang ở ngày thứ 5, 6, 7 sau thụ tinh. Bảng 3.9. Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh Số phôi Số phôi Số phôi Số phôi Số phôi thoát màng Ký hiệu phân chia nang ngày nang nang ngày ngày 7 (n,%) 5 (n,%) ngày 6 7 (n,%) (n,%) (n,%) 47 8 12 16 1 TLB 002 (52,2±1,1) (8,9±2,9) (13,3±1,9) (17,7±2,9) (1,1±1,1) 49 9 13 17 4 TLB 003 (54,4±4,4) (10±1,9) (14,4±1,1) (18,8±1,1) (2,2±1,1) Số liệu % biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, (Aspin-Welch T-test) Kết quả trình bày ở bảng 3.9 cho thấy, mặc dù tỷ lệ sống và hoạt lực tinh trùng sau giải đông của TLB 003 cao hơn so với TLB 002 (Bảng 3.8), tuy nhiên tỷ lệ phôi phân chia ở ngày thứ 2, tỷ lệ phôi nang ở các ngày 5,6,7 sau thụ tinh không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 2 lô tinh. Mặc dù tỷ lệ sống và hoạt lực tinh trùng sau giải đông của TLB 003 cao hơn so với TLB 002 (Bảng 3.8), tuy nhiên tỷ lệ phôi phân chia ở ngày thứ 2, tỷ lệ phôi nang ở các ngày 7 (17,7±2,9 sv 18,8±1,1%) sau thụ tinh không có sự khác biệt giữa 2 lô tinh (Bảng 3.9). Như vậy chúng tôi đã chọn lựa và đông lạnh thành công 2 lô tinh là TLB 002 và TLB 003 làm nguyên liệu cho TTON trong các bước nghiên cứu tiếp theo. 3.3.2. Nghiên cứu chế độ thụ tinh tối ưu 3.3.2.1. Ảnh hưởng môi trường thụ tinh và nồng độ tinh lên kết quả thụ tinh ống nghiệm Tỷ lệ tinh trùng xâm nhập cao nhất khi sử dụng môi trường Pig-FM với nồng độ 1×106 tinh trùng/ml, tỷ lệ tinh trùng xâm nhập ở các lô còn lại thấp hơn đáng kể nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (Bảng 3.10). Không có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ trứng có tinh trùng xâm nhập và tỷ lệ trứng thụ tinh đơn tinh trùng giữa 4 lô (Bảng 3.10). Như vậy trong nghiên cứu này chúng tôi đã chọn lọc được môi trường thụ tinh Pig-FM và nồng độ tinh 1x106 tinh trùng/ml dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
17. 14 Bảng 3.10. Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng Môi Nồng độ Tổng Số trứng có Số trứng thụ Số trứng thụ trường tinh trùng số tinh trùng tinh bình tinh đơn tinh thụ tinh (tinh trứng xâm nhập thường (n,% (n,% số trứng trùng/ml) (n) (n,% tổng số) tổng số) có tinh trùng xâm nhập) Pig-FM 1x105 138 19 11 16 (11,9±3,7)b (6,0±3,2) (74,7±18,8) Pig FM 1x106 181 47 21 28 (25,8±4,4)a (11,5±3,3) (61,4±9,9) TALP- 1x105 177 13 7 10 PVA (7,2±2,1)b (3,8±1,3) (78,3±15,7) TALP- 1x106 159 17 4 10 PVA (10,5±1,8)b (2,3±1,1) (63,3±11,0) IVF được thực hiện trong 3 h, trứng được tách 1 phần tế bào cận noãn, thí nghiệm lặp lại 5 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Aspin-Welch T-test) 3.3.2.2. Ảnh hưởng của tế bào cận noãn lên sự thụ tinh Chúng tôi so sánh việc sử dụng tế bào trứng cho TTON bằng cách giữ lại toàn bộ, loại bỏ một phần, loại bỏ hoàn toàn tế bào cận noãn. Kết quả cho thấy loại bỏ hoàn toàn tế bào cận noãn khỏi tế bào trứng trước khi TTON ngăn chặn sự xâm nhập của tinh trùng với tỷ lệ trứng có tinh trùng xâm nhập là 0%. Ở lô loại bỏ 1 phần hoặc không loại bỏ tế bào cận noãn đều có sự xâm nhập của tinh trùng. Kết quả của thí nghiệm tại bảng 3.11 một lần nữa khẳng định thêm vai trò của tế bào cận noãn trong việc hoạt hóa tinh trùng trong hệ thống TTON trên lợn đã được đề cập trước đây trong kết quả nghiên cứu của Kikuchi và cs, 199. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đối nghịch với kết quả nghiên cứu của Gil và cs, 2004, tuy nhiên cần lưu ý rằng khả năng xâm nhập của tinh trùng vào tế bào trứng có sự linh hoạt nhất định, tùy thuộc vào điều kiện thụ tinh trong ống nghiệm như nồng độ tinh và khả năng vận động của tinh. Việc sử dụng những môi trường thụ tinh cũng như nguồn tinh trùng với hoạt lực và khả năng thụ tinh khác biệt, đặc biệt từ giống lợn Bản là giống lợn chưa được nghiên cứu nhiều, có thể là nguyên nhân của sự không đồng nhất này. Bên cạnh đó, tỷ lệ xâm nhập kém của tinh trùng ở lô trứng không loại bỏ tế bào cận noãn cũng một lần nữa cung cấp số liệu cho giả thuyết về rào cản mà tế bào cận noãn tạo ra trong TTON. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy có thể khai thác thủ thuật loại bỏ phần lớn tế bào cận noãn xung quanh trứng và chỉ để lại một phần tế bào trước khi đưa vào thụ tinh để thiết lập một hệ thống tạo phôi lợn Bản TTON có hiệu quả.
18. 15 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản Trạng thái lớp Tổng số Số trứng có Số trứng thụ Số trứng thụ tinh tế bào cận noãn trứng (n) tinh trùng xâm tinh bình đơn tinh (n,% số nhập (n,% thường (n,% trứng có tinh trùng tổng số) tổng số) xâm nhập) Không loại bỏ 96 4 (4,2±1,2)b 3 (3,1±0,1)b 3 (83,3±16,6)b Loại bỏ 1 phần 87 13 (15,2±1,9)a 13 (15,2±1,9)a 13 (100±0)a tế bào cận noãn Loại bỏ hoàn 84 0 (0)c 0 (0) c 0 (NA) toàn TTON được thực hiện trong môi trường Pig-FM, trong thời gian 3 giờ nồng độ tinh là 1x106 tinh trùng/ml, thí nghiệm lặp lại 3 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b,c) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05. 3.3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ cafein và thời gian ủ tinh lên tỷ lệ thụ tinh ở lợn Bản Bảng 3.12. Trạng thái thụ tinh của trứng trong môi trường thụ tinh có nồng độ cafein khác nhau và thời gian thụ tinh khác nhau Nđ Thời Tổng số Số trứng có Số trứng thụ Số trứng thụ cafein gian ủ trứng (n) tinh trùng xâm tinh bình tinh đơn tinh (mM) tinh nhập (n,% tổng thường (n,% (n,% số trứng (giờ) số) tổng số) có tinh trùng xâm nhập) 2 3 87 13 13 13 (15,2±1,9)b (15,2±1,9) (100±0)a 2 6 78 21 17 18 (27,0±3,9)ab (21,8±6,4) (83,3±9,6)ab 5 3 96 25 18 23 (26,6±4,6)ab (19,1±3,0) (92,5±3,8)ab 5 6 80 47 22 26 (58,8±10,9)a (28,1±8,1) (57,3±9,4)b Nđ: Nồng độ, thí nghiệm lặp lại 3 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Aspin-Welch T-test) Nghiên cứu được thực hiện trong môi trường Pig-FM, tách một phần tế bào cận noãn, nồng độ 1×106 tinh trùng/ml trong 3 giờ hoặc 6 giờ. Môi trường thụ tinh Pig-FM bổ sung 2 mmol/l hoặc 5 mmol/l cafein. Trạng thái thụ tinh được kiểm tra bằng phương pháp nhuộm vào thời điểm sau thụ tinh10 giờ. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, khi kết hợp giữa việc tăng nồng độ cafeine lên 5mM với việc kéo dài thời gian thụ tinh lên 6 giờ có thể nâng tỷ lệ xâm nhập vào trứng lên trên 50%. Tỷ lệ xâm nhập của tinh
19. 16 trùng vào tế bào trứng ở lô thí nghiệm sử dụng môi trường có chứa 5mM/l cafein, thụ tinh trong 6 giờ cao hơn đáng kể so với lô sử dụng môi trường có chứa 2mM/l cafein, thụ tinh trong 3 giờ (58,8±10,9% so với 15,2±1,9%) (Bảng 3.12). Bên cạnh đó, tỷ lệ thụ tinh đơn tinh trùng cũng tăng lên trên 50%. Kết quả cho thấy tỷ lệ xâm nhập của tinh trùng vào tế bào trứng ở lô thí nghiệm sử dụng môi trường có chứa 5mM/l cafein, thụ tinh trong 6 giờ cao hơn đáng kể so với lô sử dụng môi trường có chứa 2mM/l cafein, thụ tinh trong 3 giờ (58,8±10,9% so với 15,2±1,9%). 3.3.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục lên sự thụ tinh và phát triển phôi 3.3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên kết quả thụ tinh và nuôi phôi Bảng 3.13. Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi Môi Tổng GVBD* Thành Trứng có Thụ tinh Tiền nhân Thụ tinh trường số (n,% tổng thục (n,% tinh trùng bình đực (n,% đơn tinh nuôi trứng số) tổng số) xâm nhập thường tinh trùng trùng (n,% trứng (n) (n,% (n,% xâm nhập) tinh trùng GVBD) GVBD) xâm nhập) TCM- 133 116 101 35 87 40 199+10% 134 (99,1±0,8) (85,7±4,4) (75,7±1,3)b (26,6±3,5) (86,5±2,1)b (40,6±4,0) pFF POM 142 124 124 45 122 46 145 (97,8±0,9) (85,5±4,5) (87,5±2,9)a (32,1±7,1) (98,3±1,1)a (38,2±7,2) Thí nghiệm lặp lại 5 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Aspin- Welch T-test), MPN (male pronucleus) = tiền nhân đực, *GVBD (germinal vesicle breakdown) = giai đoạn phá vỡ túi mầm Để tối ưu hóa điều kiện nuôi thành thục trứng, chúng tôi kiểm tra ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên kết quả TTON. Trứng được nuôi trong 2 môi trường là TCM-199+10% pFF và POM. Sau 44-46 h nuôi, một phần trứng được tách tế bào cận noãn và nhuộm để kiểm tra tỷ lệ thành thục, phần còn lại sau đó được thụ tinh trong Pig FM bổ sung 5 mmol/l cafein với nồng độ tinh:1×106 tinh trùng/ml, tách bỏ 1 phần lớp tế bào cận noãn trước khi thụ tinh. Trứng sau thụ tinh 10 giờ được cố định trong môi trường 1 acetic acid: 3 ethanol và nhuộm trong orcein 1% để đánh giá trạng thái thụ tinh bao gồm các chỉ tiêu: tỷ lệ trứng có tinh xâm nhập, tỷ lệ thụ tinh bình thường, tỷ lệ tiền nhân đực và tỷ lệ thụ tinh đơn tinh trùng. Kết quả cho thấy, không có sự khác biệt giữa 2 lô thí nghiệm về tỷ lệ thành thục của trứng (85.7±4.4%và 85.5±4.5%). Tỷ lệ% trứng có tinh trùng xâm nhập (Hình 3.9C) sau TTON trong môi trường TCM-199 +10% pFF thấp hơn so với môi trường POM (75.7±1.3 so với 87.5±2.9) (Bảng 3.13,
20. 17 tr.89). Trứng sau thụ tinh được nuôi trong môi trường TCM-199 và môi trường POM và theo dõi sự phát triển của phôi trong 7 ngày sau nuôi. Bảng 3.14. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh Môi Tổng Số trứng Số phôi Số phôi Số phôi Số phôi Số phôi Số tế trường số thành thục phân chia nang ngày nang ngày nang thoát bào/phôi nuôi trứng (n,%) (n,% tổng 5 (n,% 6 (n,% ngày 7 màng nang ở trứng (n) số) tổng số) tổng số) (n,% tổng ngày 7 ngày 7 số) (n,% tổng số) TCM- 132 111 14 25 32 3 52,1 199+10% 195 (67,6±2,5)a (57,4±3,4) (7,5±3,2) (13,3±4,3) (16,8±4,3)a (1,5±1,0) ±1,2b pFF 147 106 23 34 41 11 75,6 199 (73,8±3,0)a (53,7±3,9) (12,1±3,6) (17,8±5,2) (21,4±5,0)a (5,7±1,1) ±3,4a POM Thí nghiệm lặp lại 5 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P 0.05 (Bảng 3.14). 3.3.3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn Bản thụ tinh ống nghiệm Thí nghiệm được bố trí nhằm đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên chất lượng phôi TTON trên trứng lợn Bản sau khi đã tối ưu các chỉ tiêu về môi trường nuôi trứng và các điều kiện thụ tinh đã được kiểm soát ở trên. Trứng được nuôi môi trường POM trong thời gian 44-46 giờ. Pig-FM có bổ sung 5 mmol/l cafein được sử dụng làm môi trường thụ tinh, tách 1 phần tế bào cận noãn, nồng độ tinh trùng là 1x106 tinh trùng/ml, thời gian thụ tinh 6 giờ. Trứng sau TTON được tách sạch tinh trùng và được chia làm 2 lô thí nghiệm như sau: Lô 1: Nuôi phôi trong NCSU-37; Lô 2: Nuôi phôi trong PZM-3. Phôi được kiểm tra tỷ lệ phân chia vào ngày thứ 2 sau nuôi, tỷ lệ phôi nang ở ngày thứ 5,6,7 và tỷ lệ phôi thoát màng và số tế bào/phôi nang ở ngày thứ 7 bằng phương pháp nhuộm. Kết quả thu được cho thấy mặc dù tỷ lệ phân chia của phôi, tỷ lệ hình thành phôi nang ở ngày 5 ở hai lô thí nghiệm không có sự khác biệt, tuy nhiên tỷ lệ hình thành phôi nang ở ngày 6,7 trong môi trường PZM- 3 cao hơn so với trong môi trường NCSU-37 (16,3±1,0% so với 12,8±0,4% và 20,6±0,8% so với 17,7±1,4%, P<0,05) (Bảng 3.15). Số tế bào/phôi nang
21. 18 trong các thí nghiệm có điều kiện nuôi thành thục, điều kiện thụ tinh và nuôi phôi tối ưu của chúng tôi có thể đạt mức 72-75 tế bào/phôi nang, nằm trong giới hạn dao động từ 54 đến 77 tế bào/phôi nang đối với đối tượng lợn ngoại. Bảng 3.15. Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn Bản sau thụ tinh Lô Tổng Số phôi Số phôi Số phôi Số phôi Số phôi Số tế số phân chia nang nang nang thoát bào/phôi trứng (n,%) ngày 5 ngày 6 ngày 7 màng nang ở (n) (n,%) (n,%) (n,%) ngày 7 ngày 7 (n,%) 101 16 25 35 5 1 195 53,7±6,2b (51,5±3,2) (8,2±1,2) (12,8±0,4)b (17,7±1,4)b (2,5±0,3)b 109 20 34 43 12 2 208 72,3±3,9a (52,3±0,8) (9,5±1,1) (16,3±1,0)a (20,6±0,8)a (5,8±1,7)a Thí nghiệm lặp lại 3 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a, b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Aspin- Welch T-test). 3.3.4. Đông lạnh phôi thụ tinh ống nghiệm Với kết quả đông lạnh và nuôi phôi sau giải đông thu được trong các thí nghiệm này, chúng tôi đã nghiên cứu thành công phôi lợn Bản TTON và tối ưu hóa hệ thống tạo phôi lợn Bản bằng phương pháp thụ tinh ống nghiệm. Kết quả TTON lợn Bản trong nghiên cứu của chúng tôi đã được cái thiện hơn so với các kết quả đã được công bố trước đây. Bảng 3.16. Kết quả đông lạnh phôi thụ tinh ống nghiệm Môi trường Số hợp tử Số hợp tử Phân chia Phôi nang Phôi thoát nuôi trứng đông sống (n,% (n,% sống) ngày 7 màng (n,% lạnh/giải tổng số) (n,% sống) sống) đông (n) TCM-199 103 26 9 1 112 +10%pFF (93,8±3,1) (21,1±13,8) (7,7±6,0) (0,9±0,9) 98 31 14 3 POM 111 (89,9±4,0) (35,2±9,8) (18,2±10,7) (3,9±2,4) Thí nghiệm được bố trí với 3 lần lặp lại, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM Hệ thống TTON tối ưu đối với lợn Bản là sử dụng POM làm môi trường nuôi thành thục trứng, PigFM có bổ sung 5mmol/l cafein là môi trường thụ tinh, sử dụng trứng đã tách 1 phần tế bào cận noãn, thụ tinh ở nồng độ 1×106 tinh trùng/ml trong 6 giờ và nuôi phôi trong môi trường nuôi phôi PZM-3. 3.4. Kết quả nghiên cứu tạo phôi lợn Bản nhân bản vô tính 3.4.1. Kết quả nghiên cứu khảo sát chất lượng trứng lợn Landrace Kết quả thu được cho thấy, mặc dù trung bình số trứng thu được/BT trong 4 mùa không có sự khác biệt, tuy nhiên số trứng A+B/BT đạt cao nhất
22. 19 vào mùa xuân (23,1±1,8) và thấp nhất vào mùa hạ (19,8±1,9) (Bảng 3.17) số lượng trứng A+B/BT trong mùa thu và mùa đông là tương đương nhau, thấp hơn mùa xuân và cao hơn mùa hạ. Như vậy tiềm năng khai thác trứng của lợn Landrace cao hơn so với lợn Bản ở cả 4 mùa, mặc dù khai thác trứng vào mùa xuân và mùa đông cho hiệu quả cao hơn so với mùa hạ và mùa thu. Bảng 3.17. Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace Mùa Tổng số Tổng số Tổng số Tổng số Tổng số trứng (n, trứng loại A trứng loại B trứng loại C trứng loại TB/BT) (n,TB/BT) (n, TB/BT) (n, TB/BT) A+B (n, TB/BT) Xuân 1433 354 339 740 693 (47,7±4,8) (11,8±1,6) (11,3±0,8) (24,6±3,4) (23,1±1,8)a Hạ 1406 296 297 813 593 (46,8±10,2) (9,8±4,9) (9,9±1,2) (27,1±2,3) (19,8±1,9)b Thu 1423 334 324 765 658 (47,4±4,8) (11,1±0,8) (10,8±1,0) (25,5±4,0) (21,9±1,4)ab Đông 1411 337 345 729 682 (47,0±4,8) (11,2±1,3) (11,5±0,3) (24,3±4,4) (22,7±1,3)ab Thí nghiệm được lặp lại 5 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM,số liệu với chú thích khác nhau (a, b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) (Aspin-Welch T-test). 50 20 40 35.2 36.4 32 31.6 15 30 23.2 21.9 22.7 19.8 10 20 , SỐ NANG 5 10 0 0 TRỨNG Xuân Hạ Thu Đông SỐ TẾ BÀO/PHÔI NANG BÀO/PHÔI TẾ SỐ SỐ SỐ Lợn Landrace TB trứng A+B/BT Hình 3.10. Trung bình số trứng A+B thu được/BT trong 4 mùa của lợn Landrace 3.4.2. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Landrace Bảng 3.18. Khả năng thành thục của trứng lợn Landrace trong các loại môi trường nuôi Môi Tổng số Số trứng Số trứng giai Số trứng giai Số trứng giai trường trứng giai đoạn đoạn MI (n,%) đoạn MII đoạn khác (n) GV (n,%) (n,%) (n,%) TCM- 16 18 166 10 210 199+pFF (7,7±1,7) (8,5±1,2) (79±0,5) (4,8±0,4) POM 13 18 174 16 221 (5,8±1,7) (8,2±2,2) (78,7±4,5) (7,3±3,0)
23. 20 Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, (Aspin- Welch T-test) Sau 44 giờ nuôi, trứng được tách lớp tế bào cận noãn để kiểm tra tỷ lệ thành thục thông qua tỷ lệ xuất hiện thể cực. Tỷ lệ trứng lợn Landrace phát triển đến giai đoạn MI và MII ở cả hai nhóm thí nghiệm là tương đương nhau (8,5±1,2% so với 8,2±2,2% đối với môi trường TCM-199 và 79±0,5% so với 78,7±4,5% đối với môi trường POM) (Bảng 3.18). 85 79 80 78.7 74.5 75 73.4 TỶ LỆ% TỶ 70 65 Lợn Bản Lợn Landrace 60 TCM-199 POM Hình 3.11. Tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản và lợn Landrace nuôi trong TCM-199+10% pFF và trong POM Tương tự như trên lợn Bản, tỷ lệ thành thục của trứng lợn Landrace trong các môi trường TCM-199 và POM không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (79±0,5% và 78,7±4,5% đối với trứng lợn Landrace; 73,4±2,5% và 74,5±2,7% đối với trứng lợn Bản) (Hình 3.11). Tuy nhiên, tỷ lệ thành thục của trứng lợn Landrace cao hơn so với tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản ở cả môi trường TCM-199 và môi trường POM. Trong đó, tỷ lệ thành thục trong môi trường TCM-199 của trứng lợn Landrace và trứng lợn Bản là 79±0,5% so với 73,4±2,5% và 78,7±4,5% so với 74,5±2,7% tương tự với môi trường POM. 3.4.3. Tạo nguồn tế bào cho nhân trong nhân bản vô tính Trong nghiên cứu này chúng tôi đánh giá khả năng phát triển và mức độ ổn định của 2 loại tế bào: Tế bào sinh dưỡng lợn Landrace, tế bào sinh dưỡng lợn Bản thông qua việc khảo sát số lượng tế bào ở các lần cấy chuyển từ P2-P7với mật độ gieo ban đầu là 110.000 tế bào/đĩa sau 5 ngày nuôi. Kết quả về mức độ ổn định của 2 dòng tế bào được thể hiện qua hình 3.12 cho thấy khả năng phát triển của cả 2 loại tế bào đều ổn định qua các lần cấy chuyển từ P2 đến P7. Tuy nhiên, tế bào sinh dưỡng lợn Bản có khả năng nhân lên thấp hơn so với tế bào sinh dưỡng lợn Landrace và có thể sử dụng cả 2 loại tế bào này làm nguyên liệu trong NBVT. 3.4.4. Kết quả tạo phôi lợn Bản nhân bản vô tính 3.4.4.1. Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên kết quả tạo phôi lợn NBVT Thí nghiệm được bố trí với 2 lô: Lô 1: Cấy tế bào sinh dưỡng lợn Landrace vào tế bào trứng lợn Landrace; Lô 2: Cấy tế bào sinh dưỡng lợn
24. 21 Bản vào tế bào trứng lợn Landrace. Kết quả cho thấy có sự khác biệt giữa 2 nhóm về tỷ lệ phôi phân chia, tỷ lệ phôi nang và số lượng tế bào trên phôi nang. Trong đó tỷ lệ phôi phân chia, tỷ lệ phôi nang và TB số tế bào/phôi ở lô cấy nhân với tế bào lợn Landrace cao hơn so với lô cấy nhân tế bào lợn Bản (77,3±0,6% so với 70,6±3,7%);(14,5±0,7% so với 11,0±0,8%); (44,9±1,9% so với 39,5±1,1%). Như vậy, khi cấy tế bào sinh dưỡng lợn Landrace vào trứng lợn Landrace cho hiệu quả NBVT cao hơn so với trường hợp cấy nhân tế bào sinh dưỡng lợn Bản vào tế bào trứng lợn Landrace. Mặc dù vậy, với tỷ lệ hơn 11% phát triển thành phôi nang, giải pháp tạo phôi lợn Bản NBVT bằng cấy nhân vào trứng lợn Landrace có nhiều ưu việt về mặt số lượng. Nguồn trứng lợn Landrace và tế bào lợn Bản luôn sẵn có, dễ khai thác với số lượng lớn sẽ cho phép chúng ta chủ động tạo ra một số lượng lớn phôi lợn Bản mà không phụ thuộc vào sự hạn chế nguồn mẫu trứng lợn Bản như hiện nay. Bảng 3.19. Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn NBVT Loại tế bào cấy Tổng số Số phôi phân Số phôi nang Trung bình số phôi nuôi chia (n,%) (n,%) tế bào/phôi (n) nang TB sinh dưỡng lợn 16 (14,5±0,7)a 100 (44,9±1,9)a Landrace 85 (77,3±0,6)a TB sinh dưỡng lợn 71 (70,6±3,7)b 11 (11,0±0,8)b 100 (39,5±1,1)b Bản Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05). 3.4.4.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi lên kết quả tạo phôi nhân bản vô tính Thí nghiệm được bố trí với 2 lô: - Lô 1: Phôi được nuôi trong môi trường NCSU-37 không có glucose nhưng có pyruvate trong 2 ngày đầu và trong môi NCSU-37 có chứa glucose trong 5 ngày tiếp theo. - Lô 2: Phôi được nuôi trong môi trường PZM-3 trong 5 ngày đầu và bổ sung 10% FBS ở ngày thứ 5. Kết quả cho thấy phôi lợn Landrace NBVT có tỷ lệ phôi thoát màng trong cả 2 loại môi trường nuôi là tương đương nhau nhưng phôi được nuôi trong môi trường PZM-3 cho tỷ lệ phôi phân chia, tỷ lệ phôi nang và số tế bào/phôi cao hơn so với môi trường NCSU-37 (79,2±0,9% so với 2,7±2,1%; 14,6±0,5% so với 10,5±0,6%; 48,4±3,1 TB so với 38,9±1,5 TB). Như vậy đối với phôi lợn Landrace NVBT nuôi tại Việt Nam, môi trường PZM-3 tối ưu hơn so với môi trường NCSU-37. Tương tự như vậy với phôi lợn Bản NBVT, tỷ lệ phôi phân chia của phôi trong cả hai loại môi trường nuôi là NCSU-37 và PZM-3 là tương đương nhau (71,6±2,2% và 73,9±3,0%, theo thứ tự) nhưng tỷ lệ hình thành
25. 22 phôi nang, tỷ lệ phôi thoát màng và số tế bào/phôi nang của phôi trong môi trường PZM-3 cao hơn so với môi trường NCSU-37 (13,6±1,5% so với 8,6±0,4%; 6,4±1,2% so với 3,0±1,1% và 46,9±2,7 TB so với 32,3±0,1 TB). Như vậy môi trường PZM-3 có hiệu quả tốt hơn so với môi trường NCSU- 37 đối với phôi lợn Bản và lợn Landrace NBVT. Bảng 3.20. Sự phát triển của phôi lợn Landrae và phôi lợn Bản NBVT trong môi trường nuôi Tế bào Môi Tổng Số phôi Số phôi Số phôi Số tế cấy trường số phân chia nang thoát bào/phôi nuôi trứng (n,%) ngày 7 màng nang ở (n) (n,%) ngày 7 ngày 7 (n,%) 203 30 16 NCSU-37 278 38,9±1,5b Lợn (72,7±2,1)b (10,5±0,6)b (5,8±2,3)a Landrace 172 32 15 PZM-3 217 48,4±3,1a (79,2±0,9)a (14,6±0,5)a (6,9±1,8)a 216 26 9 NCSU-37 302 32,3±0,1c (71,6±2,2)b (8,6±0,4)c (3,0±1,1)b Lợn Bản 218 40 19 PZM-3 295 46,9±2,7a (73,9±3,0)b (13,6±1,5)a (6,4±1,2)a Thí nghiệm được lặp lại 5 lần, số liệu biểu thị tỷ lệ trung bình±SEM, số liệu với chú thích khác nhau (a,b) trong cùng một cột là sai khác có ý nghĩa thống kê (P<0,05) Như vậy chúng tôi đã thiết lập thành công hệ thống tạo phôi lợn Bản NBVT sử dụng tế bào sinh dưỡng lợn Bản cấy vào trứng lợn Landrace và chọn lọc được môi trường nuôi phôi phù hợp là PZM-3 nhằm thu được hiệu quả cao với số lượng lớn phôi. So sánh hiệu quả tạo phôi trong hệ thống tạo phôi thụ tinh ống nghiệm và nhân bản vô tính Hình 3.14 thể hiện hiệu quả tạo phôi và chất lượng sản xuất phôi bằng NBVT và TTON. Kết quả cho thấy, tỷ lệ phân chia của phôi NBVT cao hơn so với phôi TTON (73,9% so với 53,7%) (hình 3.14), tuy nhiên hệ thống TTON cho tỷ lệ hình thành phôi nang của cao hơn so với hệ thống NBVT (21,4% so với 13,6%). Tỷ lệ phôi thoát màng của phôi NBVT cao hơn so với phôi TTON có thể do quá trình tạo phôi bằng phương pháp chọc màng, hút nhân đã tạo khoảng trống của màng, giúp phôi dễ dàng thoát ra. Sự khác biệt về chất lượng giữa phôi TTON và phôi NBVT, giữa phôi in vitro và phôi in vivo (được tạo ra từ giao phối hoặc TTNT), đặc biệt đối với phôi lợn là vấn đề có tính quy luật đã được nhiều tác giả đề cập. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thu được cho thấy, phôi TTON có sức sống tốt hơn so với phôi NBVT. Các nghiên cứu trước kia đã chỉ ra rằng phôi NBVT có nhiều hạn chế trong việc phát triển, việc tái lập trình xảy ra không hoàn thiện là một vấn đề lớn nhất của phôi NBVT hiện nay. Phôi
26. 23 NBVT thường có quá trình methyl hóa ADN và quá trình sửa đổi historin xảy ra bất hường. Vì vậy mặc dù tỷ lệ phôi phân chia ở giai đầu của phôi NBVT cao nhưng có thể do yếu tố tái lập trình diễn ra không hoàn thiện đã dẫn tới hiệu quả của việc hình thành phôi nang và số tế bào phôi thấp. Do vậy mặc dù phôi NBVT có tỷ lệ phân chia bình thường ở giai đầu, nhưng tỷ lệ hình thành phôi nang và số tế bào phôi vẫn thấp hơn so với phôi TTON. 90 90 80 73.9 80 75.6 70 70 60 53.7 60 50 50 46.9 40 40 TỶ LỆ% TỶ 30 21.4 30 20 13.6 20 6.4 10 5.7 10 0 0 SỐ TẾ BÀO/PHÔI NANG BÀO/PHÔITẾ SỐ TTON NBVT Tỷ lệ phân chia Tỷ lệ phôi nang Tỷ lệ phôi thoát màng Số tế bào/phôi nang Hình 3.14. Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phội TTON, NBVT Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ phôi in vitro phát triển đến giai đoạn phôi nang (>20%) được cải thiện và ổn định hơn so với các công bố đã có trước đây. Mặc dù tỷ lệ hình thành phôi nang NBVT thấp hơn so với phôi TTON nhưng ưu thế của phương pháp này có thể tạo ra được số lượng phôi lớn với sự chủ động của con người và chất lượng phôi cũng ít bị ảnh hưởng bởi yếu mùa. Như vậy chúng tôi đã thiết lập thành công hệ thống tạo phôi NBVT có hiệu quả tốt trên giống lợn Bản tại Việt Nam. Trong đó tế bào trứng lợn Landrace được tận dụng làm tế bào nhận nhằm tăng hiệu quả tạo phôi, tế bào somatic thu từ tai lợn Bản được sử dụng làm tế bào cho nhân, phôi được nuôi trong môi trường PZM 3 mang lại hiệu quả tốt.
27. 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Buồng trứng lợn Bản có tiềm năng khai thác trứng vào mùa xuân và mùa đông lớn hơn so với vào mùa hạ và mùa thu. Trung bình số trứng loại A+B thu được/buồng trứng vào các mùa xuân và mùa đông là 18,1±0,6 và 17,5±0,9, cao hơn so với kết quả tương đương 13,4±0,8 và 16,3±0,7 đối với mùa hạ và mùa thu. 2. Trứng lợn Bản thu vào các mùa xuân và mùa đông cho kết quả nuôi thành thục cao hơn so với trứng thu vào các mùa hạ và mùa thu. Nuôi trứng trong môi trường POM và TCM-199+10% pFF cho tỷ lệ% trứng phát triển tới giai đoạn MII tương đương nhau là 74,5±0,27% và 73,4±2,5%, cao hơn so với các môi trường NCSU-37+pFF, NCSU-37+FBS, TCM-199+FBS. 3. Điều kiện TTON tối ưu bao gồm: Thu trứng vào các mùa xuân và mùa đông, nuôi thành thục trứng trong môi trường POM, thụ tinh trong môi trường Pig-FM có bổ sung 5 mmol/l cafein, tách một phần tế bào cận noãn, nồng độ tinh 1x 106 tinh trùng/ml, thời gian thụ tinh 6 giờ, nuôi phôi trong môi trường PZM-3. Kết quả TTON trong điều kiện tối ưu đạt tỷ lệ 58,8±10,9% trứng có tinh trùng xâm nhập, 57,3±9,4% trứng thụ tinh đơn tinh trùng và 21,4±5,0% phôi nang, với trung bình 72,3 tế bào/phôi. Đông lạnh phôi ở giai đoạn 10 giờ sau thụ tinh cho tỷ lệ sống trung bình đạt 89,9±4,0%, tỷ lệ hình thành phôi nang đạt 18,2±10,7%, tỷ lệ phôi thoát màng đạt 3,9±2,4%. 4. Buồng trứng lợn Landrace có tiềm năng cung cấp trứng cao hơn so với buồng trứng lợn Bản. Tương đương số trứng loại A+B thu được trên buồng trứng vào các mùa xuân, hạ, thu, đông lần lượt là: 23,1±1,8; 19,8±1,9; 21,9±1,4; 22,7±1,3. Nuôi thành thục trứng lợn Landrace trong môi trường POM và TCM-199+10% pFF cho tỷ lệ 78,7±4,5% và 79±0,5% trứng phát triển đến giai đoạn MII, cao hơn so với kết quả thu được trên trứng lợn Bản. Có thể sử dụng trứng lợn Landrace đã loại nhân để tạo phôi lợn Bản NBVT bằng kĩ thuật Piezo với kết quả 13,6±1,5% tổ hợp cấy nhân phát triển tới giai đoạn phôi nang, với trung bình 46,9±2,7 tế bào/phôi. KIẾN NGHỊ Sử dụng kết quả trong nghiên cứu này vào công tác bảo tồn nguồn gen lợn Bản hoặc tiếp tục nghiên cứu tìm các giải pháp thích hợp hơn để tối ưu hóa những tác động khác nhau nhằm nâng cao hiệu quả thụ tinh và NBVT ở lợn Bản đạt kết quả tương đương với lợn ngoại nhập. Đề nghị được hỗ trợ đầu tư đề duy trì ngân hàng trữ lạnh tinh trùng đã thành lập được và tiếp tục sử dụng hai hệ thống tạo phôi lợn Bản (TTON và NBVT) đã thiết lập được trong luận án để tạo ra ngân hàng phôi đủ lớn, phục vụ cho bảo tồn, nghiên cứu tế bào gốc, y sinh và tiến tới cấy tạo con.
28. 25 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 1. Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Thị Hồng, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Hoàng Thịnh, Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi, Ngô Thị Kim Cúc, Nguyễn Thanh Sơn, Đồng Văn Quyền, Chu Hoàng Hà, Bùi Xuân Nguyên, Nguyễn Việt Linh. Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sự phát triển của phôi lợn NBVT. Tạp chí sinh học, 2018, 40(2se):101-105. Doi:10.15625/0866- 7160/v40n2se.11610. 2. Nguyen Thi Nhung, Dong Van Quyen, Chu Hoang Ha, Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi, Ngo Thi Kim Cuc, Nguyen Thi Hong, Bui Xuan Nguyen, Barbara Beck-Woerner, Nguyen Viet Linh. Effect of donor cell type on the development of pig embryos produced by somatic cell nuclear transfer. Journal of Biotechnology 17(2): 1-5, 2019. 3. Nhung Thi Nguyen, Nguyen Xuan Bui, Viet Linh Nguyen, Van Khanh Nguyen, Kazuhiro Kikuchi, Hiep Thi N Nguyen, Hong Thi Nguyen, Hoang Thinh Nguyen, Quyen Van Dong, Hoang Ha Chu, Ngo Thi Kim Cuc, Tamas Somfai. Optimization of in vitro embryo production and zygote vitrification for the indigenous Vietnamese Ban pig: the effects of different in vitro oocyte maturation systems. Anim Science Journal. 2020;91:e13412 4. Nguyen Viet Linh, Thi Hiep Nguyen, Nguyen Thi Nhung, Nguyen Thi Hong, Nguyen Tien Dat, Nguyen Hoang Thinh, Nguyen Khanh Van, Tamas Somfai, Kazuhiro Kikuchi. Optimization of the in vitro fertilization protocol for frozen epididymal sperm with low penetration ability in a native Vietnamese pig. Anim Science Journal. 2018 Aug;89(8):1079-1084.-3, Issue-1, Jan-Feb, 2019 ISSN: 2456-8635. 5. Huỳnh Thị Hường, Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Hoàng Thịnh, Nguyễn Việt Linh. Ảnh hưởng của giới tính dòng tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn Bản NBVT. Tạp chí hội chăn nuôi Việt Nam. Số 256 tháng 4 năm 2020.