Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ______ LÊ NGỌC TRIỆU NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM (Panax sp.) PHÂN BỐ TỰ NHIÊN TẠI LÂM ĐỒNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62.42.02.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Đà Lạt, 2017 ĐÀ LẠT, 2016
2. Công trình đƣợc hoàn thành tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: Thầy hƣớng dẫn 1: PGS. TS. Nguyễn Văn Kết Thầy hƣớng dẫn 2: GS. TSKH. Trần Duy Quý Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp nhà nƣớc họp tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ ngày tháng năm 2017. Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: 1. Thư viện Quốc gia 2. Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
3. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chi sâm (Panax L. thuộc họ ra iaceae một chi th c v t m thuốc quan trọng v kinh điển trong Đông dược cũng như trong y học hiện đại. Kết quả từ các nghiên cứu trong nước gần nhất về th nh phần o i v phân oại chi Panax đã chỉ ra rằng hiện nay ở Việt Nam có 3 o i: P. vietnamensis Ha v Grushv., P. bipinnatifidus Seem., P. stipuleanatus Tsai & Feng v một thứ P. vietnamensis var. fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu & S.Q.Cai l các taxon có phân bố t nhiên. Lo i đầu tiên được Phạm Ho ng Hộ ghi nh n n m 1970 ở miền Nam Việt Nam Panax schingseng Nees var. japonicum Mak Trong các công trình xuất bản sau đó, tác giả n y vẫn uôn ghi nh n về s tồn tại của taxon n y. Tuy v y, trong những t i iệu gần nhất về th nh phần o i chi Panax ở Việt Nam, taxon n y không được nhắc đến. Trong quá trình điều tra khảo sát khu hệ th c v t tại vùng núi Lang Bian, chúng tôi đã phát hiện một quần thể sâm nh thuộc chi Panax mọc t nhiên có s khác biệt về cấu trúc c quan dinh dư ng v sinh sản so với các taxon thuộc chi Panax khác. Do mới được tái phát hiện v rất thiếu các dữ iệu khoa học iên quan đến taxon n y, trước mắt cần phải có các nghiên cứu chuyên sâu về phân tử v s bộ về th nh phần saponin để xác định rõ vị trí phân oại trong hệ thống phát sinh chi Panax v bước đầu tìm hiểu khả n ng m thuốc của taxon n y(được đặt tên sâm Lang Bian . Bên cạnh đó, cần nghiên cứu về tính đa dạng v biến động di truyền m c sở cho việc bảo tồn v phát triển. Từ đó, đề t i “Nghiên cứu phân loại và đánh giá đa dạng di truyền quần thể sâm (Panax sp.) phân bố tự nhiên tại Lâm Đồng” được tiến h nh. 2. Mục tiêu của đề tài Đề t i được tiến h nh hướng tới mục tiêu m sáng t vị trí phân oại v quan hệ phát sinh chủng loại của sâm Lang Bian đối với các taxon cùng chi khác; tính đa dạng v biến động di truyền quần thể của sâm Lang Bian, loại sâm n y có chứa các saponin chính như một số taxon thuộc chi Panax hay không. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Kết quả của đề t i c sở khoa học để công bố, bổ sung v o Danh ục th c v t, Sách đ Việt Nam một taxon mới đặc hữu. Góp phần m rõ về 1
4. th nh phần o i của chi Panax ở Việt Nam. Kết quả đánh giá đa dạng v biến động di truyền quần thể th c v t cho phép nh n thức rõ h n về tình trạng quần thể hay tổng thể taxon Panax phân bố t nhiên tại Lâm Đồng, tạo c sở cho việc đề xuất phư ng án bảo tồn v phát triển trong tư ng ai. Bên cạnh đó, các dữ iệu s bộ về th nh phần saponin c sở ban đầu cho việc xem xét giá trị m thuốc taxon n y. 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu bản thân taxon sâm Lang Bian, các taxon Panax khác phân bố tại Việt Nam v trên thế giới trong nghiên cứu về phân oại; t p hợp các cá thể thuộc hai quần thể taxon n y trong nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể v thân rễ v rễ củ của các taxon thuộc chi Panax có phân bố tại Việt Nam trong nghiên cứu về phân tích s bộ th nh phần saponin. 4.2. Phạm vi nghiên cứu Phạm vi chuyên môn: Với hai nội dung chính của đề t i nghiên cứu vị trí phân oại v đa dạng di truyền quần thể, s bộ phân tích hoạt chất đối với sâm Lang Bian, phạm vi nghiên cứu chuyên môn của u n án : (1 Xác định vị trí phân oại d a phư ng pháp phân oại th c v t kinh điển d a trên hình thái giải phẫu; (2 Xác định vị trí phân oại v quan hệ phát sinh chủng oại d a trên dữ iệu trình t DN bảo thủ trong nhân v ạp thể; (3 Đánh giá đa dạng di truyền quần thể d a trên DN fingerprint nảy sinh bằng kỹ thu t sinh học phân tử; v (4 S bộ phân tích hoạt chất của sâm Lang Bian d a trên phư ng pháp phân tích hóa học kinh điển. Địa điểm nghiên cứu: Điều tra, phân oại v thu th p mẫu th c địa được tiến h nh ở các vùng có phân bố các taxon thuộc chi Panax tại Việt Nam. Nghiên cứu về phân oại, quan hệ phát sinh d a trên sinh học phân tử cũng như đa dạng v biến động di truyền quần thể được th c hiện tại các phòng thí nghiệm sinh học phân tử của Trường Đại học Đ Lạt. Nghiên cứu về hình thái giải phẫu, phân oại th c v t truyền thống v s bộ về th nh phần saponin được th c hiện tại Bảo t ng th c v t Trường Đại học Đ Lạt (DLU , Bảo t ng th c v t (VTN) v Phòng thí nghiệm hóa hợp chất thiên nhiên - Viện Nghiên cứu khoa học Tây nguyên. Việc so sánh mẫu v t cũng được tiến h nh tại một số bảo t ng, phòng ưu trữ tiêu bản th c v t trong v ngo i nước. Thời gian nghiên cứu: tiến h nh từ n m 2012 đến n m 2016. 2
5. 5. Những đóng góp mới của luận án Chứng minh s tồn tại th c tế của một taxon thuộc chi Panax, họ Araliaceae tại vùng núi Lang Bian, Lâm Đồng, chỉ ra s mở rộng phân bố của chi Panax trên thế giới về phía Nam. Tạo c sở khoa học để công bố, bổ sung v o Danh ục th c v t, danh ục cây thuốc v Sách đ Việt Nam một taxon mới đặc hữu. Góp phần m rõ về th nh phần o i của chi Panax ở Việt Nam. Xây d ng c sở dữ iệu trình t DNA bảo thủ cho một chủng oại sâm mới, đ ng ký ở ngân h ng gene thế giới để khẳng định chủ quyền Quốc gia về nguồn t i nguyên n y. Xây d ng c sở khoa học cho việc hình th nh chiến ược bảo tồn nguồn t i nguyên th c v t đặc hữu, quý hiếm thông qua kết quả đánh giá về điều tra phân bố, nghiên cứu đa dạng v biến động di truyền quần thể. 6. Cấu trúc của luận án: Phần chính của u n án được trình b y trong 144 trang, 35 bảng số iệu v 36 hình. Không kể phần mở đầu 4 trang, các phần còn ại được chia m các phần: Chư ng I: Tổng quan t i iệu nghiên cứu 39 trang, Chư ng II: V t iệu, Nội dung v Phư ng pháp nghiên cứu: 17 trang, Chư ng III: Kết quả nghiên cứu v thảo u n: 71 trang, Phần Kết u n v Kiến nghị: 2 trang. Ngo i ra còn có các phụ ục. Lu n án sử dụng 141 t i iệu tham khảo, trong đó 22 t i iệu Tiếng Việt, 119 t i iệu tiếng nh. Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vai trò của các loại nhân sâm trong đời sống Các nghiên cứu về sâm trên trên thế giới cho thấy các taxon Panax, họ ra iaceae đều những o i th c v t m thuốc có giá trị kinh tế cao v thường đặt trong tình trạng quý hiếm, cần được bảo tồn. 1.2.Tổng quan phƣơng pháp nghiên cứu về phân loại, khảo sát quan hệ phát sinh chủng loại các taxon và đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở thực vật Các phư ng pháp nghiên cứu về phân oại, quan hệ phát sinh chủng oại, đánh giá đa dạng di truyền quần thể d a trên đặc điểm hình thái v dữ iệu phân tử cũng như c sở khoa học của chúng đã được hình th nh, ng y c ng phát triển v ứng dụng rộng rãi. Đây chính c sở cho việc tiến h nh nghiên cứu n y. 1.3. V trí hệ thống học và phân loại chi Panax, họ Araliaceae 3
6. Các kết quả nghiên cứu về phân oại v hệ thống học chi Panax đã trên thế giới được chỉ ra. Theo đó, việc sử dụng hình thái thân rễ v rễ củ trước sau đó đến đặc điểm hình thái khác để phân biệt các taxon phù hợp. Th nh phần o i của chi Panax theo các tác giả khác nhau rất khác nhau bởi đặc điểm hình thái của các taxon trong chi n y rất đa dạng, dẫn đến quan điểm về hệ thống phát sinh giữa các tác giả không đồng nhất. Theo thời gian, ng y c ng có nhiều phát hiện các taxon mới được phát hiện. Theo các t i iệu gần đây thì cho đến hiện nay, ở Việt Nam có 3 o i v 1 thứ có phân bố ở Việt Nam: P. vietnamensis, P. bipinnatifidus, P. stipuleanatus, P. vietnamensis var. fuscidiscus được ghi nh n chính thức. Mặc dù được Phạm Ho ng Hộ ghi nh n từ n m 1970 dưới tên khoa học P. schingseng var. japonicum v hiệu chỉnh th nh P. japonica trong các công bố sau đó của chính tác giả (1991, 1999, 2003 nhưng taxon tại Lâm Đồng không được nhắc đến hoặc được cho P. vietnamensis m thiếu c sở giám định mẫu trong các nghiên cứu về sau (Nguyễn T p, 2005; Nguyễn Tiến Bân, 1996&2007; Phan Kế Long v cộng s , 2013 . 1.4. Quan hệ phát sinh chủng loại chi Panax L. dựa trên hệ thống học mức độ phân t Để xây nghiên cứu mối quan hệ phát sinh giữa các taxon th c v t nói chung v chi Panax nói riêng, các nh nghiên cứu đi trước đã sử dụng sử dụng trình t các vùng bảo thủ một cách riêng rẽ hay phối hợp v biện u n cho kết quả bằng chính các đặc điểm hình thái v phân bố của các taxon. Hai hướng nghiên cứu chính bao gồm: nghiên cứu không d a v o giải trình t DN m d a v o đặc điểm DN fingerprint, nghiên cứu d a trên giải trình t các vùng DN bảo thủ. Trung gian giữa hai hướng trên nghiên cứu sử dụng DN fingerprint từ các vùng DN bảo thủ. Việc sử dụng các vùng DNA bảo thủ để hỗ trợ cho phân oại trong các nghiên cứu về các o i thuộc chi Panax khác nhau giữa các tác giả. Các vùng trình t 18S rRN ; ITS1-5,8S rRNA -ITS2 v một phần gene matK t ra thích hợp trong nghiên cứu n y bởi c sở khoa học trong việc ứng dụng các trình t n y đã được chứng minh. 1.5. Các nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền quần thể ở chi Panax Nhiều kỹ thu t sinh học phân tử trong đó có kỹ thu t ISSR đã được sử dụng để m xuất hiện các chỉ thị đa hình đủ để đánh giá đa dạng di truyền ở cả hai mức độ: trong v giữa các quần thể ở các o i thuộc chi Panax. 4
7. Việc khảo sát đa dạng di truyền quần thể trong các nghiên cứu được trình b y trên xoay quanh các tiêu chí: mức độ tư ng đồng di truyền giữa các cá thể trong t p hợp mẫu, tỷ ệ band đa hình (PPB , mức độ dị hợp hay chỉ số đa dạng gene (He , chỉ số biệt hóa gene v khoảng cách di truyền giữa các t p hợp mẫu (GST v D v chỉ số di cư (Nm). 1.6. Nghiên cứu về thành phần hoạt chất ở chi Panax Các nghiên cứu về mặt hóa học ở chi Panax đã tiến h nh trong v ngo i nước đã chỉ ra các th nh phần hoạt chất của nhóm dược iệu quý n y cũng như trong các taxon riêng rẽ. Có thể xem đây một trong các c sở để tham khảo, định hướng v ứng dụng phư ng pháp cho nghiên cứu so sánh th nh phần saponin giữa đối tượng nghiên cứu v các taxon khác thuộc chi Panax. 1.7. Nhận xét chung Kết quả từ các nghiên cứu trên các đối tượng cùng chi Panax có trước v các dữ iệu iên quan từ Genbank một nguồn tham khảo v so sánh tốt trong nghiên cứu về phân oại v quan hệ phát sinh, đánh giá đa dạng v biến động di truyền quần thể v nghiên cứu th nh phần hoạt chất chính (các saponin ở các taxon Panax. Những điều nêu trên góp phần định hướng cho nghiên cứu n y về mặt học thu t. Chƣơng 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1.Vật liệu cho nghiên cứu v trí phân loại và quan hệ phát sinh chủng loại của sâm Lang Bian và các taxon Panax khác: mẫu thuộc các taxon Panax tại Việt Nam v mẫu o i Polyscias fruticosa (L.) Harm. để nghiên cứu giải phẫu hình thái v m tiêu bản khô: các mẫu v t cần thu bao gồm: thân rễ, thân củ, lá, hoa, quả (to n cây để m tiêu bản khô v ưu giữ tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây nguyên. 03/05 mẫu tiêu bản sâm Lang Bian cùng với các mẫu thuộc các o i Panax đã được định tên có phân bố tại Việt v chuẩn ngoại (outgroup o i Polyscias fruticosa được sử dụng so sánh, đánh giá quan hệ phát sinh chủng oại. Trình t các DN bảo thủ của các mẫu thu th p được công bố trên Genbank (NCBI). Các trình t các vùng DN bảo thủ tư ng ứng của một số taxon Panax đã được công bố trên Genbank được sử dụng m chuẩn nội (cùng taxon với các taxon được thu mẫu tại Việt Nam v để so sánh kết quả v phân tích quan hệ phát sinh (P. quinquefolius, P. japonicus, P. pseudoginseng). 5
8. 2.1.2. Vật liệu cho nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể sâm Lang Bian: mẫu á từ t p hợp các cá thể được phát hiện thuộc các quần thể sâm Lang Bian, trừ các cá thể được giữ nguyên vẹn để m tiêu bản. 2.1.3. Vật liệu để nghiên cứu sơ bộ thành phần saponin ở sâm Lang Bian: thân rễ, rễ củ của các taxon thuộc chi Panax phân bố tại Việt Nam. 2.2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu vị trí phân oại, quan hệ phát sinh chủng oại giữa sâm Lang Bian v một số taxon Panax khác d a trên các trình t DNA bảo thủ v đặc điểm hình thái. - Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền ở quần thể sâm Lang Bian. - Nghiên cứu phân tích, so sánh s bộ th nh phần saponin ở sâm Lang Bian v một số taxon cùng chi khác. 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1.Điều tra, thu thập mẫu: tiến h nh theo phư ng pháp nghiên cứu th c v t của K ein v K ein (1970), v Nguyễn Nghĩa Thìn (2007 . 2.3.2. Nghiên cứu về hình thái nhằm bổ sung dữ liệu cho xác đ nh v trí phân loại sâm Lang Bian: theo phư ng pháp của K ein v K ein (1970 v Nguyễn Nghĩa Thìn (2007), bao gồm các bước triển khai th c địa v nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Các đặc điểm hình thái của sâm Lang Bian cũng như các taxon Panax khác được so sánh với nhau v với các bản mô tả gốc cũng như với các tiêu bản ưu giữ ở các bảo t ng th c v t ở Việt Nam v thế giới. 2.3.3. Tách chiết DNA và kiểm tra chất lƣợng, hàm lƣợng DNA: Mẫu á của từng cá thể được tiến h nh tách chiết DN theo quy trình CT B I cải tiến. Kiểm tra chất ượng v nồng độ DN theo phư ng pháp đo OD của Weising v cộng s (2005). 2.3.4. Phân loại, phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự bảo thủ 2.3.4.1. Phân lập và khuếch đại các vùng DNA bảo thủ Các trinh t DNA bảo thủ được khuếch đại bằng PCR với mồi đặc hiệu v điều kiện phản ứng được cải biến từ phư ng pháp đã sử dụng trong nghiên cứu có trước, với một phần gene matK: theo Zuo v cộng s (2011), với vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2: theo Ngan v cộng s (1999 v với Gene 18S rRNA: theo Komatsu v cộng s (2001) 2.3.4.2. Phân tích quan hệ phát sinh chủng loại dựa trên các trình tự DNA bảo thủ cao 6
9. Các trình t có được thông qua việc giải trình t cùng với các trình t tư ng ứng từ Genbank được sử dụng để phân tích đặc điểm trình t v quan hệ phát sinh giữa các taxon được khảo sát bằng cách sử dụng phần mềm MEG 5.1. Các vùng DN thuộc bộ gene trong nhân v bộ gene ạp thể được sử dụng riêng rẽ v sau đó phối hợp để phân tích quan hệ phát sinh giữa các taxon khảo sát. Tính bất tư ng đồng có thể có giữa các t p hợp trình t khảo sát khi phối hợp trong phân tích quan hệ phát sinh được kiểm tra bằng công cụ Incongruence Length Difference (ILD của phần mềm PAUP* (Swofford, 2003). 2.3.5. Phân tích đa dạng và biến động di truyền quần thể dựa trên DNA fingerprint nảy sinh bằng kỹ thuật ISSR 2.3.5.1. S dụng kỹ thuật ISSR để hình thành các DNA fingerprint Khuếch đại DNA: Phản ứng PCR được th c hiện với dung tích 20 µ chứa 2 mM MgC 2, 0,25 mM mỗi oại dNTP, 1U Taq DN po ymerase (ThermoScientific , 0,2 µM mồi v khoảng 30 ng khuôn mẫu DN . Quá trình khuếch đại DN được tiến h nh trên máy uân nhiệt Peqstar 96X Universa Gradient (Germany với chư ng trình nhiệt sau: Bước biến tính đầu tiên ở 94 0C trong 5 phút; 10 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0C trong 45 giây, nhiệt độ 0 0 gắn mồi thích hợp +5 (Ta +5) C (Ta trong khoảng 50-57 C tùy mồi) trong 45 giây, giảm dần 0,50C/chu kỳ, kéo d i mạch ở 720C trong 1 phút 30 giây; 36 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0C trong 45 giây, nhiệt độ 0 bắt mồi thích hợp (Ta) trong 45 giây, kéo d i mạch ở 72 C trong 1 phút 30 giây; Bước kéo d i mạch cuối cùng ở 720C trong 15 phút. Chọn lọc mồi: Khảo sát t p hợp 45 mồi đã được sử dụng trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền quần thể các o i cùng chi với đối tượng nghiên cứu. 5 mẫu DN chọn ngẫu nhiên từ các mẫu thu th p được thử nghiệm khuếch đại với mỗi mồi để s ng ọc mồi với tiêu chí ghi nh n được sản phẩm khuếch đại, có ít nhất 1 band đa hình. Ghi nhận các DNA fingerprint bằng các chỉ thị ISSR: Sản phẩm khuếch đại được phân tách trên ge agarose 2%, sử dụng đệm TBE với điện thế 60 Vo t trong 3 giờ, ge sau điện di được nhuộm với ethidium bromide (0,5 µg/m , v được chụp ảnh dưới các ánh sáng c c tím có bước sóng 254/312 nm bằng hệ thống Micro Doc Ge Documentation (Mỹ). 7
10. 2.3.5.2. Phân tích đa dạng và biến động di truyền dựa trên các DNA fingerprint thu nhận đƣợc Phần mềm Microsoft Office Exce 2007 được sử dụng để tính toán các thông số về đa dạng v biến động di truyền. Các thông số n y bao gồm: tỷ ệ phần tr m band đa hình (percentage of po ymorphic bands - PPB , mức độ dị hợp trông đợi trung bình/chỉ số đa dạng gene (the average expected heterozygosity - He , chỉ số biệt hóa di truyền giữa các t p hợp mẫu (gene differentiation among sample sets –GST , khoảng cách di truyền giữa các t p hợp mẫu (the genetic distance among samp e sets - D v chỉ số về dòng gene hay số ượng cá thể di cư trung bình (Nm). Công thức tính toán các thông số trên theo phư ng pháp của de Vicente v cộng s ( 2003 . Phần mềm chuyên dụng NTSYSpc 2.1 (Rohlf, 2004) được sử dụng để tính toán hệ số tư ng đồng di truyền giữa các cặp mẫu khảo sát v xây d ng s đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các mẫu, sử dụng phư ng pháp p nhóm UPGM . 2.3.6. Sơ bộ phân tích, so sánh thành phần saponin Đối tượng để so sánh về s bộ th nh phần hóa học với sâm Lang Bian (ký hiệu : PVL 2 taxon có quan hệ gần với nó gồm Panax vietnamensis (PV v P. vietnamensis var. fuscidiscus (PVF v hai biến thể dạng á của o i P. stipuleanatus [ á chét nguyên (PS v á chét xẻ (PSDL)]. Các hoạt chất phân tích 6 chất sau: G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, M-R2. Phân tích định tính bằng sắc ký ớp m ng theo phư ng pháp của Ho ng Hải nh v cộng s (2011 . Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. V trí phân loại, quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và một số loài Panax khác dựa trên đặc điểm hình thái và trình tự DNA bảo thủ 3.1.1. V trí phân loại của sâm Lang Bian dựa trên đặc điểm hình thái Đặc điểm hình thái của taxon sâm Lang Bian Cây có dạng thân thảo, âu n m, cao 50-90 cm. Thân rễ dạng đốt, thường bò ngang, đường kính 1-2,5cm, các đốt xếp gần nhau với khoảng cách giữa các đốt từ 2-5cm, mặt bên ngo i có m u nâu v ng. Rễ củ gắn v o phần dưới của thân rễ, dạng phồng ớn, có hình chóp hay gần như dạng hình nón, kích thước 3-5 × 2-4cm. Thân khí sinh thẳng, mảnh, nhẵn với phần õi xốp, mang các á kép chân vịt với 3, 4 hoặc hiếm khi 5 á kép mọc vòng ở đỉnh 8
11. thân khí sinh, cuống á kép d i 8-13cm, nhẵn, không có á kèm hay những phần phụ giống á kèm. Lá kép thường gồm 5 á chét (hiếm khi đến 7 , gồm ba á chét ớn iền nhau có hình ova hay e ip, kích thước 10–12 × 4–5 cm; hai á chét còn ại nh h n cũng có dạng oval-e ip với kích thước 4–5 × 2–3 cm; á chét mang 5-8 gân thứ cấp, phiến dạng m ng, có ông ở các gân cả hai mặt á; gốc á dạng nêm hay hẹp dần, mép á chét thường có r ng cưa, hiếm khi mang r ng cưa đôi; đầu á chét có dạng mũi nhọn ngắn, d i 8mm, cuống á chét d i 8-11mm. Cụm hoa dạng tán, khoảng 40-80 hoa, cuống cụm hoa d i 10-18cm, có tuyến. Các hoa có đường kính 1,5-2cm, cuống hoa d i 4-6mm, đế hoa có dạng chén, đĩa bầu ban đầu dạng h i ồi, m u xanh, sau đó chuyển sang dạng ồi hẳn ên v có m u v ng nhạt; đ i hoa 5, dạng tam giác, d i 0,45– 0,55 mm, nhẵn; cánh hoa 5, dạng hình trứng ngược, kích thước 1,4 × 0,75 mm, nhẵn. Bao phấn 5, kích thước 0,7–0,8 × 0,3–0,4 mm, chỉ nhị d i tư ng đư ng hay ngắn h n cánh hoa; vòi nhụy 2 (hiếm khi 1 , kích thước 0,6–0,8 mm; bầu nhụy 2 ô, d i khoảng 1mm. Quả có dạng trứng, h i dẹt, đường kính khoảng 4-5 mm, mang 1 (hiếm khi 2 hạt. Hạt chắc, dạng trứng với kích thước 3,5–4,5 × 3–4 mm. Hình 3.3. Ảnh chụp đặc điểm thực vật học của sâm Lang Bian : Sinh cảnh. - B-C: Thân, á chét mang tán hoa– D: thân rễ. – E: Tán hoa. - F, H-I: Hoa. – G: Cuống hoa. - J: cánh hoa. - K: Đĩa bầu v vòi nhụy – L: Nhị. – M: Quả. Với những đặc điểm như trên (hình 3.3), sâm Lang Biang thuộc chi Panax, họ ra iaceae. H n thế nữa, với thân rễ có dạng đốt, nên sâm Lang Bian rất gần với P. vietnamensis var. vietnamenis v P. vietnamensis var. fuscidiscus theo quan điểm của Hara (1970 , Xiang v Lowry (2007 . Các đặc điểm khác biệt thể hiện giữa 3 taxon n y thể hiện ở bảng 3.1. 9
12. Bảng 3.1. So sánh đặc điểm hình thái giữa sâm Lang Bian, P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus Đặc điểm Sâm Lang Bian P. vietnamensis P. vietnamensis var. var. fuscidiscus vietnamensis Kích thước 5–12 × 2–5 cm 8-14 × 3-5 cm 5–18 × 2–5,5 cm Gốc Dạng nêm hay Không cân hoặc Không cân hoặc hẹp dần, an dọc dạng nêm dạng nêm Lá xuống đến gần chét gốc cuống Chiều d i mũi 0,8 cm 1,5–2,0 cm 2,0–2,5 cm Chiều d i cuống 0,8–1,1 cm 0,3 – 2 cm 0,3–2 cm Chiều d i cuống hoa 0,4-0,6 cm 1,5–2,0 cm 1–2 cm. Số ượng hoa trên tán 40–80 50–120 70–100 Kích thước cánh hoa 0,75 × 1,4 mm 1 × 2 mm 1 × 2,5 mm Hình dạng đĩa bầu Lồi rõ Lõm Phẳng Số ượng vòi nhụy 2 (–1) 1 (–2–3) 1 (–2) 3.1.2. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên các trình tự bảo thủ 3.1.2.1. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên vùng gene matK Tiến h nh r soát, so sánh các trình t d i 818 nuc eotide tư ng ứng ở tất cả các taxon Panax, các taxon được khảo sát khác nhau ở 22 vị trí: 76, 126, 128, 133, 159, 163, 170, 258, 332, 347, 409, 425, 430, 539, 600, 611, 641, 721, 734, 762, 785, 793. Trình t các chuẩn nội P. vietnamensis và P. vietnamensis var. fuscidiscus trùng với trình t tư ng ứng của mẫu giải trình t . Trình t của P. stipuleanatus, P. bipinnatifidus trong nghiên cứu n y như nhau v trùng với trình t chuẩn nội P. stipuleanatus. Khoảng cách di truyền giữa sâm Lang Bian v các taxon khác cùng chi từ 0,0012 (P. vietnamensis đến 0,0203 (P. stipuleanatus . D a v o khoảng cách di truyền giữa các taxon để xây d ng các cây quan hệ phát sinh chủng oại, chuẩn ngoại (Polyscias fruticosa xen v o giữa các taxon Panax, điều n y cũng xảy ra khi sử dụng 5 chuẩn ngoại nhưng khi nâng số chuẩn ngoại ên 8 thì tất cả các chuẩn ngoại đều tách kh i nhóm các taxon Panax. Cây quan hệ phát sinh chủng oại (sau đây gọi tắt cây quan hệ phát sinh được xây d ng theo phư ng pháp Maximum ike ihood trong trường hợp n y như sau: 10
13. Hình 3.9. Cây quan hệ phát sinh dựa trên một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp ML s dụng 8 chuẩn ngoại Cây quan hệ chủng oại NJ tư ng ứng cũng có hình thể tư ng t . Qua cây quan hệ phát sinh, có thể nh n thấy sâm Lang Bian, Panax vietnamensis, Panax vietnamensis var. fuscidiscus v chuẩn nội P. bipinnatifidus p nhóm với nhau, tuy v y chuẩn nội P. bipinnatifidus có hình thái á v thân rễ ho n to n khác với các taxon còn ại. Do v y đề xuất Panax sp. th nh một thứ của P. vietnamensis hợp ý h n của P. bipinnatifidus. S khác biệt trình t gene matK giữa Panax sp. v P. vietnamensis v P. vietnamensis var. fuscidiscus thể hiện ở 9 vị trí 221, 388, 469, 535, 558, 566, 593, 594 v 602. Như v y, trình t một phần vùng gene matK có thể dùng để nh n dạng s khác biệt giữa các nhóm taxon gồm sâm Lang Bian v các taxon được so sánh, nhưng không thể hiện s sai biệt giữa hai taxon: P. vietnamensis var. fuscidiscus v P. japonicus var. bipinnatifidus. Mặt khác, chỉ ra rằng taxon P. bipinnatifidus được thu th p tại Việt Nam có sai khác ớn so với chuẩn nội. Taxon Polycias fruticosa thể hiện vai trò chuẩn ngoại khi được xem xét trong tổng thể ớn h n gồm nhiều taxon khác cùng họ. 3.1.2.2. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi dựa trên vùng trình tự ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 Sau khi c n trình t , xác p vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 tư ng ứng với tất cả các trình t đại diện cho các taxon được chọn để khảo sát, tiến h nh r soát, so sánh, các trình t ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 d i 595 đến 608 nuc eotide có được, các taxon Panax được khảo sát khác nhau ở 74 vị trí: 14, 29, 42, 43, 54, 60, 82, 83, 101, 103, 104, 109, 112, 115, 116, 117, 128, 139, 151, 162, 175, 176, 179, 182, 178, 189, 201, 203, 217, 274, 281, 340, 11
14. 350, 364, 384, 400, 404, 406, 407, 414, 416, 417, 418, 425, 429, 444, 462, 465, 466, 467, 470, 476, 481, 489, 493, 496, 498, 509, 526, 532, 546, 548, 554, 562, 564, 582, 583, 587, 589, 590, 592, 596, 598, 600. Điều đó cho thấy độ d i v th nh phần nuc eotide vùng ITS1– 5,8SrRNA–ITS2 biến động mạnh trong t p hợp các taxon khảo sát, thể hiện tiềm n ng ớn trong việc phân biệt các taxon trong chi Panax. Sâm Lang Bian có số ượng nuc eotide thuộc vùng ITS1 ITS1–5,8SrRNA–ITS2 giống với P. vietnamensis v P. vietnamensis var. fuscidiscus một trong các c sở cho thấy ba taxon n y có quan hệ gần với nhau. Sâm Lang Bian có khác biệt từ 0,41 – 2,93% so với các taxon khác cùng chi. Các trình t vùng ITS1 – 5,8S rRNA – ITS2 của P. stipuleanatus, P. bipinnatifidus thu th p ở Việt Nam v chuẩn nội P. stipuleanatus tư ng đồng ho n to n trong khi chúng khác với trình t của chuẩn nội P. bipinnatifidus ở mức 2,56%. Với các trình t có được, tiến h nh phân tích về mối quan hệ phát sinh chủng oại, thu nh n được cây quan hệ phát sinh thể hiện trong hình 3.12. Hình 3.12. Cây quan hệ phát sinh dựa trên vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood Cây quan hệ phát sinh NJ tư ng ứng cũng có hình thể tư ng t . Có thể nh n thấy sâm Lang Bian, P. vietnamensis v P. vietnamensis var. fuscidiscus p nhóm chặt chẽ với nhau, cho thấy việc đề xuất sâm Lang Bian th nh một thứ của P. vietnamensis hợp ý. Kết quả r soát cho thấy sâm Lang Bian khác với P. vietnamensis v P. vietnamensis var. fuscidiscus tại 9 vị trí: 217, 384, 465, 532, 554, 562, 589, 590 v 598. Như v y, trình t vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 có thể dùng để nh n dạng sai khác giữa sâm Lang Bian với các taxon được so sánh, tuy nhiên không 12
15. thể hiện s sai biệt giữa hai taxon P. stipuleanatus v P. bipinnatifidus thu th p được trong nghiên cứu n y. 3.1.2.3. Quan hệ phát sinh chủng loại giữa sâm Lang Bian và các taxon cùng chi khác dựa trên trình tự vùng gene 18S rRNA Sau khi c n trình t , xác p vùng tư ng ứng với tất cả các taxon, vùng gene 18S rRN của các taxon có độ d i 1808 đến 1809 nuc eotide, sâm Lang Bian khác với các taxon được so sánh tại 5 vị trí 233, 499, 712, 714, 729. S sai khác rất ít n y chứng t tính bảo thủ cao ở mức độ của vùng gene 18S rRN ở chi Panax. Kết quả n y tư ng đồng với các nghiên cứu trước đây. Khoảng cách di truyền giữa sâm Lang Bian, P. vietnamensis, P. quinquefolius v P. vietnamensis var. fuscidiscus từ cả nguồn t thu th p hay ấy từ Genbank đều bằng không. Các taxon P. stipuleanatus, P. bipinnatifidus được thu th p trong nghiên cứu n y v chuẩn nội P. stipuleanatus cũng có trình t vùng gene 18S rRN tư ng đồng ho n to n, nhưng khác với chuẩn nội P. japonicus var. bipinnatifidus (Genbank . Điều n y ại một ần nữa cho thấy mẫu được cho P. bipinnatifidus thu th p trong nghiên cứu n y có s tư ng đồng với taxon P. stipuleanatus. Sử dụng các trình t có được để tiến h nh phân tích về mối quan hệ phát sinh chủng oại, thu được cây quan hệ phát sinh thể hiện trong hình 3.16. Hình 3.16. Cây quan hệ chủng loại dựa trên vùng gene 18S rRNA giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood Cây quan hệ phát sinh Neiborgh joining tư ng ứng cũng có hình thể tư ng t . 13
16. Sâm Lang Bian, P. vietnamensis, P. vietnamensis var. fuscidiscus v P. quinquefolius p nhóm với nhau bởi s tư ng đồng ho n to n về trình t . Nếu chỉ d a trên trình t vùng gene 18S rRN thì không thể phân biệt được các taxon khác nhau trong chi, nhưng ại đóng một vai trò quan trọng trong việc thể hiện s p nhóm với nhau của các taxon. 3.1.2.4. Khảo sát quan hệ phát sinh dựa vào việc phối hợp các vùng trình tự 18S rRNA, ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK Trong nghiên cứu n y, việc sử dụng bất kỳ trình t vùng bảo thủ riêng rẽ n o đều có những nhược điểm: với trình t một phần gene matK: chuẩn ngoại chỉ thể hiện vai trò của nó khi xét trong một tổng thể ớn h n, không thể phân biệt hai taxon P. vietnamensis var. fuscidiscus v P. japonicus var. bipinnatifidus vì s tư ng đồng trình t ; với trình t ITS1-5,8S rRNA-ITS2: chưa phân tách được P. bipinnatifidus từ nhóm các taxon P. stipuleanatus; v với trình t gene 18S rRN : không thể phân tách sâu các taxon khảo sát. S p nhóm của các taxon Panax d a trên các các vùng riêng rẽ vẫn có s không đồng nhất về các taxon P. japonicus, P. japonicus var. bipinnatifidus v P. quinquefolius. Nếu sử dụng riêng rẽ từng vùng thì không phản ánh ở mức đầy đủ nhất mối quan hệ phát sinh trong khi có được dữ iệu từ cả ba vùng DN barcode. So tis (1999 v Qiu (1999 đã chỉ ra rằng việc phân tích quan hệ phát sinh d a trên việc phối hợp các trình t có trong các bộ gene khác nhau có ý nghĩa h n việc xây d ng cây quan hệ phát sinh chủng oại d a v o một gene riêng rẽ. Trong nghiên cứu n y, ba trình t đã khảo sát riêng nói trên được phối hợp để nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng oại. Kết quả kiểm tra tính bất tư ng đồng có thể có giữa các t p hợp trình t khảo sát khi phối hợp trong phân tích quan hệ phát sinh chủng oại được kiểm tra bằng công cụ Incongruence Length Difference (ILD của phần mềm P UP* cho thấy khi phối hợp các trình t theo các phư ng pháp khác nhau, giá trị P đều ớn h n 5%, cho thấy tính bất tư ng đồng khi phối hợp trình t đều không khả dĩ (Jonh v cộng s , 1996 . Số nuc eotide trong các trình t phối hợp dao động từ 3.222 đến 3.235. Sâm Lang Bian, P. vietnamensis v P. vietnamensis var. fuscidiscus có chung số nuc eotide ớn nhất, cho thấy chúng gần nhau về mặt di truyền. Khoảng cách di truyền của sâm Lang Bian so với các taxon khảo sát khác từ 0,0016 đến 0,0161. Từ khoảng cách di truyền thu nh n được, có thể nh n thấy rằng: 14
17. - Trình t P. vietnamensis v P. stipuleanatus từ Ganbank tư ng đồng với các taxon tư ng ứng tại Việt Nam. Các taxon khảo sát đều có thể phân biệt nhau ngoại trừ trường hợp duy nhất P. bipinnatifidus được thu th p trong nghiên cứu n y không thể phân biệt với P. stipuleanatus. - Sâm Lang Bian có khoảng cách di truyền so với P. vietnamensis 0,16% v so với P.vietnamensis var. fuscidiscus 0,28%, trong khi khoảng cách di truyền giữa P. vietnamensis so với P.vietnamensis var. fuscidiscus 0,19% cho thấy dù sâm Lang Bian khá gần với P. vietnamensis nhưng khác biệt với P.vietnamensis var. fuscidiscus. Đây một trong các c sở để xếp sâm Lang Bian th nh một thứ của P. vietnamensis. Tiến h nh phân tích về mối quan hệ phát sinh chủng oại d a trên các trình t có được sau khi oại b bớt các chuẩn nội tư ng đồng, kết quả thu được cây quan hệ phát sinh như trong hình 3.18. Hình 3.18. Cây quan hệ phát sinh dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood Cây quan hệ phát sinh d a trên trình t phối hợp tư ng ứng d a trên phư ng pháp Neiborgh joining cũng có hình thể tư ng t . Có thể nh n thấy s p nhóm chặt chẽ của ba taxon sâm Lang Bian, P. vietnamensis v P. vietnamensis var. fuscidiscus. Giá trị bootstrap tại nút phân nhánh đối tượng nghiên cứu với các taxon còn ại trong nhóm đạt 99. Như v y d a v o trình t phối hợp của ba vùng bảo thủ cho thấy việc xác định taxon đang nghiên cứu th nh một thứ của P. vietnamensis hợp ý. Điểm chưa hợp ý trong kết quả chính s giống hệt về trình t giữa taxon P. bipinnatifidus được thu th p, giải trình t trong nghiên cứu n y với taxon P. stipuleanatus nhưng ại khác xa với taxon P. japonicus var. bipinnatifidus (có tên đồng nghĩa P. bipinnatifidus m ẽ ra thì nó phải có quan hệ gần. Vấn đề n y được tìm hiểu v ý giải như sau: 15
18. + Lo i P. bipinnatifidus ở Việt Nam được xác định chủ yếu d a trên hình thái á xẻ thùy, vốn có s khác biệt rõ r ng so với taxon P. stipuleanatus với cùng khu phân bố tại L o Cai v Lai Châu, Việt Nam. Tuy nhiên, trong nhiều nghiên cứu trước đây, một số taxon trong chi Panax được ghi nh n có cả đặc điểm á chét xẻ v á chét nguyên (Wen v Zimmer, 1996; Guo v cộng s , 2010). Khuynh hướng phân oại d a trên hình thái thân rễ v rễ củ trước, tiếp đến mới các đặc điểm khác được Hara (1970 đề nghị chưa được sử dụng với taxon được cho P. bipinnatifidus ở Việt Nam. + Đặc điểm hình thái của mẫu được cho P. bipinnatifidus thu được ở Lai Châu, Việt Nam cũng như tiêu bản ưu giữ ở Viện Dược Liệu có nhiều điểm giống với P. stipuleanatus m không có đặc điểm nh n dạng o i P. bipinnatifidus hình thái thân rễ: kéo d i v phồng ên từng đoạn. Qua kết quả nghiên cứu d a trên đặc điểm hình thái v sinh học phân tử, taxon từng được cho o i P. bipinatifidus ở Việt Nam th c chất thuộc về o i P. stipuleanatus. Khi đó, các cây quan hệ phát sinh được xây d ng ại không sử dụng chuẩn nội cho chúng được thể hiện trong hình sau: Hình 3.21. Cây quan hệ phát loại chính thức dựa trên sự phối hợp vùng gene 18S rRNA, vùng ITS1-5,8S rRNA-ITS2 và một phần gene matK giữa các taxon thuộc chi Panax theo phƣơng pháp Maximum likelihood Cây quan hệ phát sinh d a trên trên trình t phối hợp tư ng ứng d a trên phư ng pháp Neiborgh joining cũng có hình thể tư ng t . Như v y, d a trên kết quả nghiên cứu về phân oại v quan hệ phát sinh chủng oại ở mức độ phân tử được kết hợp thêm các dữ iệu về hình thái, cho phép khẳng định sâm Lang Bian một thứ mới của o i Panax vietnamensis Ha et Grushv. var. vietnamensis với tên khoa học P. 16
19. vietnamensis var. langbianensis N.V. Duy, V.T Tran & L.N. Trieu v tên Việt đề xuất Sâm Lang Bian. 3.2. Đánh giá đa dạng di truyền ở quần thể sâm Lang Bian 3.2.1. Kết quả thu thập, chuẩn b mẫu và chọn lọc mồi phục vụ cho đánh giá đa dạng di truyền quần thể Mẫu thu từ hai quần thể được phát hiện thông qua quá trình điều tra cách nhau 25-30 km theo đường chim bay nằm tại hai huyện Đam Rông v Lạc Dư ng, tỉnh Lâm Đồng. Tên các quần thể được ấy theo ký t viết tắt của địa danh n i phân bố: quần thể ở Lạc Dư ng ký hiệu LD (64 mẫu , quần thể ở Đam Rông ký hiệu DR (51 mẫu . Sau khi thử nghiệm, 20 trong số 45 mồi ISSR cho kết quả đáp ứng hai tiêu chí tạo được band v các band mang tính đa hình trên 5 mẫu ấy ngẫu nhiên thuộc taxon nghiên cứu. Hình 3.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR UBC873 ở quần thể LD Hình 3.27. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ISSR HB12 ở quần thể DR Tỷ ệ band đa hình của các mồi khác nhau đối với các quy mô khảo sát theo chiều hướng giảm dần từ tổng thể nghiên cứu đến quần thể v đến các nhóm trong quần thể. Tỷ ệ band đa hình ở các t p hợp mẫu cùng quy mô cũng có s sai khác, hệ quả của quá trình biệt hóa di truyền. 3.2.2. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể LD 17
20. Mức độ đa dạng gene hay tính dị hợp trông đợi HeLD = 0,228 v tỷ ệ band đa hình PPBLD = 81,5 % được ghi nh n cho quần thể LD. Tư ng đồng di truyền trong tổng thể các mẫu khảo sát thuộc quần thể LD cao nhất giữa mẫu L47y v mẫu L51y với mức tư ng đồng 89,49%; thấp nhất giữa mẫu L19o v mẫu L56o với mức tư ng đồng 65,65%; trung bình các mẫu tư ng đồng nhau ở mức 77,80%. Tính đa dạng di truyền ở hai nhóm tuổi thể hiện qua chỉ số đa dạng gene v tỷ ệ band đa hình HeLD O = 0,233; PPBLD O = 77,1% v HeLD Y = 0,214; PPBLD Y = 72,4% ần ượt với nhóm tuổi ớn v nhóm tuổi nh . Kết quả về mức độ đa dạng gene n y cho thấy tính đa dạng di truyền của nhóm tuổi ớn có cao h n so với nhóm tuổi nh , nghĩa có s suy giảm di truyền nhất định giữa các cá thể ớn v nh tuổi. Mức độ tư ng đồng di truyền giữa các cá thể trong nhóm tuổi ớn trong dải từ 68,46% đến 86,92%, trung bình 76,6%. Ở nhóm cá thể nh tuổi, mức độ tư ng đồng di truyền giữa các cá thể trong dải từ 69,16% đến 89,49%, trung bình 79,1%. Điều đó đã cho thấy rằng nhóm các cá thể nh tuổi có mức độ tư ng đồng di truyền với nhau cao h n nhưng không nhiều so với nhóm các cá thể ớn tuổi. Những chỉ số n y phần n o cho thấy s suy giảm đa dạng di truyền đã được trình n y trên. D a trên mức tư ng đồng di truyền của từng cặp mẫu, s đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các mẫu trong quần thể LD được xây d ng v d a trên s đồ n y, các cá thể thuộc hai nhóm cấp tuổi trên 8 ( ớn v dưới 6 (nh không p nhóm riêng m xếp xen kẽ nhau, điều đó thể hiện đặc điểm sinh sản hữu tính của cây. Tuy nhiên s xen kẽ không đều m có những nhóm v i cá thể cùng nhóm tuổi xếp gần nhau cho thấy có s biệt hóa nh giữa hai nhóm tuổi. Chỉ số biệt hóa di truyền giữa hai nhóm tuổi thuộc quần thể LD ở mức GSTLD = 0,0205. Theo hệ thống học về đánh giá biệt hóa di truyền (de Vicente, 2003) thì s biệt hóa di truyền giữa hai nhóm cá thể tuổi ớn v nh trong quần thể n y chỉ đạt ở mức thấp. S biệt hóa di truyền ở mức thấp dẫn đến khoảng cách di truyền giữa hai nhóm tuổi trong quần thể DLD O-Y = 0,0061, khoảng cách n y rất bé so với tính dị hợp trông đợi của to n quần thể LD đạt đến HeLD = 0,228. 3.2.3. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền quần thể DR 18
21. Quần thể DR có mức độ đa dạng di truyền tư ng đối cao thể hiện qua chỉ số đa dạng gene hay tính dị hợp trông đợi HeDR = 0,213 v tỷ ệ band đa hình PPBDR = 79,4%, các chỉ số đa dạng n y đều thấp h n quần thể LD (HeLD = 0,228 v PPBLD = 81,5%). Tư ng đồng di truyền trong tổng thể các mẫu khảo sát thuộc quần thể DR cao nhất 87,62%, thấp nhất 60,51%, trung bình 77,65%. Tính đa dạng di truyền ở hai nhóm tuổi thể hiện qua chỉ số đa dạng gene v tỷ ệ band đa hình HeDR O = 0,204; PPBDR O = 75,2 % v HeDR Y = 0,209; PPBDR Y = 72,7% ần ượt với nhóm tuổi ớn v nhóm tuổi nh . Các chỉ số n y cũng thấp h n so với các nhóm tuổi ở quần thể LD (HeLD O = 0,233; PPBDL O = 77,1% v HeLD Y = 0,214; PPBDL Y = 72,4%). Mức độ tư ng đồng di truyền giữa các cá thể trong nhóm tuổi ớn trong dải từ 63,08% đến 86, 21%, trung bình 78,49%. Chỉ số tư ng ứng giữa các cá thể trong nhóm tuổi nh trong dải từ 67,52 % đến 87,62%, trung bình 77,74%. Qua đó cho thấy rằng xét ở góc độ phân tử, mức độ tư ng đồng giữa các cá thể không khác nhau giữa hai nhóm tuổi. Điều n y cho thấy s ổn định về mức độ đa dạng di truyền qua các thế hệ. D a trên mức tư ng đồng di truyền của từng cặp mẫu, s đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các mẫu trong quần thể DR được xây d ng ại v d a trên s đồ n y, các cá thể thuộc hai nhóm cấp tuổi ớn v nh không p nhóm riêng m tạo các nhóm nh xếp xen kẽ nhau, số ượng các cá thể cùng nhóm tuổi trong các nhóm nh ở quần thể DR nhiều h n quần thể LD hay nói cách khác các cá thể cùng nhóm tuổi p nhóm với nhau rõ h n. Điều đó thể hiện mức độ mức độ biệt hóa giữa hai nhóm tuổi ở quần thể DR cao h n so với quần thể LD. Th c v y, chỉ số biệt hóa di truyền giữa hai nhóm tuổi thuộc quần thể DR ở mức GSTDR = 0,0304, cao h n gần 50% so với quần thể LD. Kết quả tính toán cho thấy khoảng cách di truyền giữa hai nhóm tuổi ớn v nh trong quần thể DR chỉ đạt mức DDR O-Y = 0,01393, cao h n nhiều so với chỉ số tư ng ứng ở quần thể DL. 3.2.4. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền tổng thể taxon nghiên cứu Tổng thể nghiên cứu của taxon sâm Lang Bian trong nghiên cứu n y bao gồm tất cả các cá thể của cả hai quần thể được phát hiện. Mức độ đa dạng di truyền của tổng thể các mẫu nghiên cứu d a trên chỉ số dị hợp tử trông đợi đạt đến mức HeT = 0,284 v tỷ ệ band đa hình đạt đến mức PPBT = 97,2%. Tư ng đồng di truyền trong tổng thể các mẫu khảo sát cao nhất 89,49%, thấp nhất 52,80%, trung bình 69,37%. So các cặp mẫu từ hai 19
22. quần thể cho thấy mức độ tư ng đồng giữa chúng trung bình 60,94%, cao nhất 67,62% v thấp nhất 52,80%. S biệt hóa di truyền rõ r ng giữa hai quần thể khảo sát: mức độ tư ng đồng giữa các cặp mẫu có nguồn gốc khác quần thể thấp h n hẵn giữa các cặp mẫu cùng quần thể. Các cặp mẫu tư ng đồng nhau ở mức cao nhất chỉ đến mức 89,49% cho thấy khả n ng thụ phấn chéo cao của taxon. Việc sử dụng 20 mồi ISSR trong nghiên cứu cho phép phân tách các cá thể thuộc hai quần thể th nh hai nhóm ớn khác nhau như trong s đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể (hình 3.29). Có thể nh n thấy cây quan hệ di truyền giữa các cá thể trong tổng thể taxon nghiên cứu chia th nh hai nhánh rõ r ng, nhánh 1 tư ng ứng với quần thể LD v nhánh 2 tư ng ứng với quần thể DR. Hình thể nhánh 1 giống hệt với cây quan hệ phát sinh của quần thể LD (* v hình thể nhánh 2 giống hệt với cây quan hệ phát sinh của quần thể DR ( . Khoảng cách di truyền giữa hai quần thể LD v DR d a trên tần số a e e của 428 ocus khảo sát DLD-DR = 0,191 một ần nữa cho thấy s biệt hóa di truyền ớn giữa hai quần thể. Chỉ số biệt hóa di truyền giữa hai quần thể nghiên cứu ở mức GSTTaxon = 0,221. Theo quan điểm hệ thống học về ượng hóa tính biệt hóa di truyền thì chỉ số n y đạt ở mức cao, s biệt hóa di truyền ớn (de Vicente, 2003 v cũng ở mức cao so với s biệt hóa giữa các quần thể các th c v t t nhiên có đặc điểm tư ng t (Nybom v Bartish, 2000 . S biệt hóa di truyền trong trường hợp các quần thể của taxon nghiên cứu cao so với các o i t nhiên có cùng đặc điểm sống cho dù chúng chưa chịu áp c thu hái có thể có các nguyên nhân sau: việc thay thế rừng nguyên sinh bằng rừng Thông ba á đã m thay đổi môi trường sống của sâm Lang Bian; các oại động v t vốn đóng vai trò phát tán hạt v hạt phấn trong khu v c nghiên cứu không có nhiều do s s n bắt của người dân v sử dụng các thuốc trừ sâu; việc phá rừng, mở rộng các khu dân cư v hoạt động canh tác nông nghiệp dẫn đến s ng n cách giữa hai quần thể. S chia cắt điều kiện sống như trên đã hạn chế s trao đổi nguồn gene giữa hai quần thể. Kết quả nghiên cứu về dòng di cư đã thể hiện rõ điều n y khi chỉ số di cư trung bình Nm= 0,8793, xét trong tổng thể quan sát với số cá thể khảo sát N = 115 thì tỷ ệ di cư chỉ đạt 0,0076, tức chỉ xấp xỉ 8‰ cá thể di cư từ quần thể n y sang quần thể khác trong một thế hệ. 20
23. L1o L10o L1o L2o L10o L2o L3o L3o L14y L8o L39o L14y L15y L16y L17y L19y L8o L20y L21y L11o L39o L31o L46y L15y L47y L51y L52y L48y L16y L49y L50y L29o L17y L32y L33y L27y L19y L18y L36o L37o L20y L38o L24o L30y L21y L10o L59o L60o L61o L11o L62y L63y L64y L31o L41o L42o L43o L44o L46y L34o L35o L47y L5o L7y L6y L51y L4y L12y L13y L45o L48y L57o L53y L58o L49y L9y L22o L25o L52y L40o L23o L26y L50y L28y L55o L56o L29o L54y 0.60 0.67 0.73 0.80 0.87 0.93 1.00 L32y Coefficient L33y L27y L18y L36o L37o * L38o L24o L30y Nhánh 1 L59o L60o L61o L62y L63y L64y L41o L42o L43o L44o L34o L35o L5o L7y L6y L4y L12y L13y thể LD cá thuộc quầnCác thể L45o L53y L57o L58o D1o D3o L9y D5o D8o D6o D7o L22o D4o D9o D10o L25o D11o D12o L10o D13o L40o D15o D23o D24o L23o D20o D27y D33y D34y L26y D35y D36y D17o L28y D29y D39y D40y L55o D10o D41y D42y D43y D16o L56o D18o D25o L54y D26o D32y D28y D30y D1o D21o D48y D19o D3o D38y D45y D47y D49y D5o D50y D14o D22o D8o D51y D44y D46y D6o D31y D37y D2o D7o 0.60 0.67 0.73 0.80 0.87 0.93 1.00 Coefficient D4o D9o D10o D11o D12o D13o D15o D23o D24o DR D20o D27y D33y D34y D35y D36y Nhánh 2 D17o D29y D39y D40y D41y D42y D43y D16o D18o D25o thuộc quần thể D26o D32y D28y D30y D21o D48y D19o D38y D45y D47y D49y D50y thể cá Các D14o D22o D51y D44y D46y D31y D37y D2o 0.60 0.67 0.73 0.80 0.87 0.93 1.00 Coefficient Hình 3.29: Sơ đồ dạng cây về quan hệ di truyền giữa các cá thể trong tổng thể nghiên cứu 3.3. Kết quả nghiên cứu về phân tích sơ bộ thành phần saponin ở sâm Lang Bian và một số taxon cùng chi khác 21
24. Kết quả phân tích s bộ th nh phần saponin theo phư ng pháp sắc ký ớp m ng của 5 mẫu đại diện cho các taxon được thể hiện qua sắc đồ sắc ký ớp m ng saponin: PS PSDL PVF PV PVL G-Rb1 G-Rg1 G-Rd G-Re N-R1 M-R2 Hình 3.31. Sắc đồ sắc ký lớp mỏng saponin của các taxon đƣợc khảo sát và các chất chuẩn Từ sắc đồ nói trên, th nh phần saponin đặc trưng của các taxon được thể hiện qua bảng sau: Bảng 3.27. Thành phần saponin theo chất chuẩn của các mẫu khảo sát Rf PVL PV PVF PS PSDL G-Rb1 0,32 × × × G-Rg1 0,67 × × × G-Rd 0,48 × × × G-Re 0,55 × × × N-R1 0,53 × × × × × M-R2 0,60 × × × Ghi chú: ×: có xuất hiện vết, : không xuất hiện vết D a trên các hoạt chất được so sánh, ở taxon sâm Lang Bian phân bố tại Lâm Đồng (PVL) có các hoạt chất sau: G-Rb1, G-Re, N-R1, G-Rd, G-Rg1 v M-R2. PVL giống ho n to n với PV v PVF, khác với PS v PSDL bởi s thiếu vắng G-Rb1, G-Re, G-Rd, G-Rg1 v M-R2 ở các taxon n y. Ngo i ra, thông qua sắc đồ sắc ký ớp m ng, nếu không d a trên các chất chuẩn đã xác định từ trước thì với phư ng pháp chiết được tiến h nh trong nghiên cứu n y, có thể nh n thất s sai khác nhất định về th nh phần sản phẩm chiết thông qua hình thể các vết sắc ký giữa các taxon so sánh. Đặc điểm tạo vết trên sắc đồ sắc ký bản m ng của taxon Panax phân bố t 22
25. nhiên tại Lâm Đồng có s khác biệt so với các taxon khác. Tuy nhiên, giữa hai taxon PS v PSDL, hình thể các vết sắc ký gần như tư ng đồng ho n to n, điều n y một ần nữa ại bổ sung dữ iệu về mặt hóa học để nhìn nh n chúng thuộc cùng một o i. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1. Kết hợp các kết quả nghiên cứu về quan hệ phát sinh chủng oại d a trên các dữ iệu về hình thái so sánh với các trình t DNA bảo thủ cho phép khẳng định sâm Lang Bian một thứ mới của o i Panax vietnamensis Ha et Grushv. var. vietnamensis v được đặt tên khoa học Panax vietnamensis Ha & Grushvitzky var. langbianensis N.V. Duy, V.T Tran & L.N. Trieu, tên tiếng Việt đề xuất sâm Lang Bian. 2. Tổng thể taxon sâm Lang Bian gồm hai quần thể LD v DR được phát hiện trong quá trình điều tra, có thể phân tách nhau trong s đồ quan hệ phát sinh các cá thể. Chỉ số đa dạng gene v tỷ ệ band đa hình của tổng thể taxon ở mức cao: HeT = 0,284 v PPBT = 97,2 %, mức độ tư ng đồng di truyền giữa các cá thể trong khoảng 52,80% đến 89,49%, trung bình 69,37%. S biệt hóa gene giữa hai quần thể LD v DR thuộc tổng thể đạt đến mức GSTTaxon = 0,221 v khoảng cách di truyền giữa chúng ên đến DLD- DR = 0,191. Chỉ số di cư trung bình trong tổng thể taxon nghiên cứu Nm= 0,8793. Quần thể LD có HeLD = 0,228, PPBLD O = 77,1%, mức độ tư ng đồng di truyền giữa các cá thể trung bình 77,80%. Nhóm tuổi ớn có mức độ đa dạng di truyền cao h n nhóm tuổi nh . Chỉ số biệt hóa di truyền giữa hai nhóm tuổi v khoảng cách di truyền giữa chúng thấp. Quần thể DR có HeDR = 0,213, PPBDR = 79,4%, mức độ tư ng đồng di truyền giữa các cá thể trung bình 77,65%. Nhóm tuổi ớn có mức độ đa dạng di truyền tư ng đư ng nhóm tuổi nh . Chỉ số biệt hóa giữa hai nhóm tuổi v khoảng cách di truyền giữa chúng cao h n so với quần thể LD. 23
26. 3. D a trên các hoạt chất được khảo sát, ở taxon Panax vietnamensis var. langbianensis phân bố tại Lâm Đồng có các hoạt chất sau: G-Rb1, G-Re, N- R1, G-Rd, G-Rg1 v M-R2. Taxon P. vietnamensis var. langbianensis giống với P. vietnamensis v P. vietnamensis var. fuscidiscus, khác với hai biến thể á chét nguyên v á chét xẻ thuộc taxon Panax stipuleanatus bởi s thiếu vắng G-Rb1, G-Re, G-Rd, G-Rg1 v M-R2 ở hai taxon n y. Kiến ngh Cần bổ sung một taxon th c v t m cũng một loại dược liệu mới Panax vietnamensis var. langbianensis v o danh lục th c v t, danh lục cây thuốc v Sách đ Việt Nam, hiệu chỉnh tên o i đối với biến thể á chét xẻ của o i P. stipuleanatus trong các t i iệu n y trên c sở kết quả nghiên cứu về phân oại v quan hệ phát sinh từ lu n án. Cần nghiên cứu thêm để m rõ về vị trí phân oại của biến thể á chét xẻ của o i P. stipuleanatus tại Việt Nam. Cần hoạch định chiến ược khoanh vùng bảo vệ, bảo tồn, phát triển Sâm Lang Bian trên c sở kết quả nghiên cứu về đa dạng v biến động di truyền quần thể của u n án. Cần nghiên cứu về các biện pháp nhân giống, gây trồng v nghiên cứu chuyên sâu về th nh phần hoạt chất v tác dụng dược ý đối với sâm Lang Bian để phát triển, khai thác v sử dụng nguồn t i nguyên hiệu quả theo hướng bền vững. 24
27. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Trieu L.N., Mien N.T., Tien T.V., Ket N.V. & Duy N.V. (2016), “Genetic diversity of Panax stipuleanatus Tsai in North Vietnam detected by Inter simp e sequence repeat (ISSR markers”, Biotechnology & Biotechnological Equipment, 30(3): 506-:511. 2. Duy N.V., Trieu L.N., Chinh N.D., Tien T.V. (2016 , “ new variety of Panax (Araliaceae) from Lam Vien Plateau, Vietnam and its molecular evidence”, Phytotaxa 277(1): 047-058. Trieu L.N., Duy N.V., Quy T.D., Ket N.V., Tien T.V. (2016 , “Genetic diversity of Panax vietnamensis var. langbianensis populations in Lam Vien plateau - Vietnam detected by Inter simple sequence repeat (ISSR) markers”, Academia Journal of Biotechnology. (Đã chấp nh n đ ng, đang chờ in .