Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã ngành: 62.54.01.01 L PHẠM T ĐỖ VIẾT PHƯƠNG ẤN QUỐC NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI (Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL Cần Thơ, 2020
2. CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS. TS. Lê Nguyễn Đoan Duy P Người hướng dẫn phụ: TS. Phạm Văn TấnGS.TS. Nguyễn Văn Mười Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ sở Họp tại: Vào lúc: Phản biện 1: S. Đái Thị Xuân Trang Phản biện 2: GS.TS. Đống Thị Anh Đào Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
3. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Đỗ Viết Phương, Phạm Văn Tấn và Lê Nguyễn Đoan Duy. 2017. Determination of caffeine in coffee pulp (Coffea robusta) using UV- Visible spectrophotometer. Vietnam Journal of Chemistry, 55: 86-91 (ISSN 0866-7144). 2. Do Viet Phuong, Pham Van Tan and Le Nguyen Doan Duy. 2017. Optimizing decaffeination conditions from coffee pulp in Vietnam (Coffea robusta) using hot water extraction. Proceedings of the 15th ASEAN Conference on Food Science and Technology, 112-118 (ISBN 978-604-67-1007-3). 3. Đỗ Viết Phương, Lê Hương Thủy, Đàm Sao Mai, Đặng Thị Sáu, Lê Nguyễn Đoan Duy và Phạm Văn Tấn. 2018. Thu nhận enzyme cellulase từ Trichoderma asperellum QT5 phân lập được từ quả cà phê tại huyện Krôngbuk, tỉnh Đăklăk, Việt Nam. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 3+4: 150-159 (ISSN 1859-4581). 4. Đỗ Viết Phương, Lê Nguyễn Đoan Duy và Phạm Văn Tấn. 2019. Khảo sát quá trình tiền xử lý, thủy phân và lên men vỏ quả cà phê để tạo thành cồn sinh học. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 5: 115-123 (ISSN 1895-4581). 5. Do Viet Phuong, Le Pham Tan Quoc, Pham Van Tan and Le Nguyen Doan Duy. 2019. Production of bioethanol from Robusta coffee pulp (Coffea robusta L.) in Vietnam. Foods and Raw materials, 7(1): 10-17 (ISSN 2310-9599).
4. Chương 1. MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của luận án Trong vài thập niên trở lại đây, đứng trước nhu cầu năng lượng ngày càng gia tăng và vấn đề ô nhiễm môi trường do sử dụng nhiên liệu hóa thạch đã thúc đẩy các nước phải quan tâm nhiều hơn trong việc theo đuổi và thay thế bằng các nguồn năng lượng tái tạo và đặc biệt là sản xuất ethanol sinh học. Một trong những nguồn nguyên liệu dồi dào nhất đến thời điểm hiện tại để sản xuất ethanol sinh học đó là sinh khối lignocellulose. Các nhà khoa học ước tính rằng sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose có thể tăng gấp 16 lần sản lượng hiện tại (Kwon et al., 2013). Nghiên cứu gần đây chỉ ra tiềm năng tuyệt vời của phế thải vỏ cà phê trong việc sản xuất ethanol sinh học (Saha and Cotta, 2008). Nếu đốt ethanol thay vì xăng sẽ giảm hơn 80% lượng khí thải carbon ra môi trường (Mussatto et al., 2011). Tuy nhiên rào cản lớn nhất trong việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu này đó chính là trong nguyên liệu có chứa nhiều hemicellulose và lignin. Các chất này liên kết chặt chẽ với cellulose và tạo rào chắn bảo vệ sự tấn công của các loại hóa chất cũng như các loại enzyme tới phân tử cellulose (Ragauskas et al., 2006; Hahn-Hägerdal et al., 2006). Đứng trước khó khăn đó các nhà khoa học đã nghiên cứu tìm ra nhiều phương pháp tiền xử lý nguyên liệu lignocellulose trước khi tiến hành đường hóa và lên men. Mặt khác, lignin được biết đến như là một trong những thành phần chính cấu thành nên thành tế bào thực vật và tảo. Lignin hiện diện nhiều nhất trong tất cả các loại thân cây gỗ, chính vì thế nó còn được gọi là “chất gỗ” (Martone et al., 2009). Trong vỏ quả cà phê lignin chiếm khoảng 20,07% và khi so sánh hàm lượng lignin trong vỏ quả cà phê với một số nguồn sinh khối lignocellulose tương tự như: Lignin trong rơm rạ chiếm 4,65% ; lignin trong lõi bắp chiếm 15%; trong bã mía là 20% hoặc trong cỏ là 12÷18% (Sun and Cheng, 2002; Mosier et al., 2005; Goyal et al., 2008; Sassner et al., 2008; Zhang et al., 2009). Có thể nhận thấy rằng, hàm lượng lignin trong vỏ cà phê cao hơn một số nguồn sinh khối lignocellulose tương tự và điều này sẽ là một cản trở lớn cho quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê trước khi thủy phân và lên men tạo ethanol. Do đó, cần thiết phải có những khảo sát về các phương pháp tiền xử lý để loại bỏ thành phần lignin này đồng thời phải giữ lại lượng cellulose có trong nguyên liệu trước khi tiến hành quá trình thủy phân và lên men tạo ethanol sinh học. 1
5. Trên thực tế, việc sản xuất cà phê ở Việt Nam lại tập trung chủ yếu ở các tỉnh Tây Nguyên cho nên sẽ giảm thiểu được chi phí thu gom nguyên liệu. Ngoài ra, có thể nhận thấy được tiềm năng về trữ lượng vỏ cà phê ở Việt Nam rất lớn, cùng với vấn đề mang tính thời sự đó là bài toán giải quyết ô nhiễm trường, tìm và thay thế nguồn năng lượng hóa thạch đang dần cạn kiệt. Chính vì vậy, vỏ quả cà phê được chọn lựa làm nguyên liệu cho nghiên cứu: “Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê để lên men tạo ethanol”. 1.2 Mục tiêu đề tài Sử dụng các tác nhân acid loãng, kiềm loãng, vi sóng hay nấm mục trắng để tiền xử lý vỏ quả cà phê vối nhằm loại bỏ nhiều nhất hemicellulose và lignin ra khỏi nguyên liệu. Đồng thời là quá trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc và ứng dụng vào thủy phân vỏ quả cà phê. Dịch thủy phân được đem đi lên men để so sánh hiệu quả thủy phân giữa enzyme thu nhận được với enzyme thương mại. 1.3 Nội dung nghiên cứu Khảo sát quá trình khử caffeine, polyphenol và quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê đồng thời tối ưu hóa các thông số quá trình khử caffeine, khử polyphenol. Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô từ nấm mốc và tinh sạch sơ bộ bằng phương pháp kết tủa với dung môi hữu cơ và muối vô cơ . So sánh hiệu quả thủy phân giữa enzyme thu nhận được và enzyme thương mại. Đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân và tối ưu hóa điều kiện thủy phân nhằm thu được hàm lượng đường khử là cao nhất. Kiểm tra thành phần dịch thủy phân và đưa ra phương pháp khử độc dịch thủy phân. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men và các phương pháp lên men dịch thủy phân để tạo ethanol. 1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án Nghiên cứu và đưa ra các giải pháp hữu ích nhằm giải quyết vấn đề phụ phẩm trong công nghiệp chế biến là khuynh hướng nghiên cứu đang được quan tâm ở trong và ngoài nước. Việc sử dụng vỏ quả cà phê vối là lựa chọn có ý nghĩa thực tiễn khi Việt Nam là nước xuất khẩu cà phê nhân lớn thứ 2 thế giới (đặc biệt, xuất khẩu cà phê Robusta lớn nhất thế giới). Kết quả nghiên cứu từ luận án đã cung cấp số liệu về thành phần hóa học của vỏ quả cà phê vối, cho thấy tính khả thi của việc sử dụng nguồn 2
6. phụ phẩm này như nguồn sinh khối lignocellulose tiềm năng để sản xuất ethanol sinh học. Nghiên cứu đã chú trọng sử dụng các giải pháp hạn chế sử dụng hóa chất độc hại nồng độ cao bằng việc kết hợp các phương thức tiền xử lý. 1.5 Điểm mới của luận án Đề xuất được giải pháp tiền xử lý có sự hỗ trợ của vi sóng để giảm đáng kể lượng hóa chất sử dụng (chỉ sử dụng kiềm loãng, acid loãng), giúp giảm ảnh hưởng đến môi trường và tăng hiệu suất; sự cần thiết của việc điều chỉnh thứ tự của các bước tiền xử lý theo thành phần nguyên liệu. Đánh giá được sự hình thành và tác động của một số chất hóa học nguy hại cho quá trình lên men và đề xuất được giải pháp loại trừ. Thu nhận được enzyme cellulase từ dòng nấm mốc Trichoderma asperellum (QT5) được phân lập từ bề mặt vỏ quả cà phê hỏng, ứng dụng có hiệu quả trong thủy phân vỏ quả cà phê vối. Thông tin từ kết quả nghiên cứu là tư liệu khoa học cho việc nghiên cứu về ethanol sinh học từ các nguồn phụ phẩm có hàm lượng lignin cao, sử dụng trong giảng dạy về quản lý và tận dụng phụ phẩm trong sản xuất thực phẩm. 1.6 Kết cấu của luận án Luận án bao gồm 142 trang với 5 chương: Chương 1- Giới thiệu (trang 1-4); Chương 2- Tổng quan tài liệu (trang 5-51); Chương 3- Phương pháp nghiên cứu (trang 52-79 với 28 thí nghiệm); Chương 4- Kết quả và thảo luận (trang 78-141); Chương 5- Kết luận và đề xuất (trang 142). Trong nội dung chính có 33 bảng và 65 hình. Bài viết sử dụng 262 tài liệu tham khảo, bao gồm 236 tài liệu tiếng Anh và 26 tài liệu tiếng Việt. Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vỏ quả cà phê Vỏ cà phê là phụ phẩm đầu tiên thu được trong quá trình chế biến cà phê nhân ướt. Vỏ quả chiếm khoảng 43,2% trọng lượng tươi hoặc 28,7% trọng lượng chất khô của toàn bộ quả cà phê. Thành phần chất xơ (bao gồm cellulose, hemicellulose và lignin) trong vỏ cà phê chiếm đến 51% (so với khối lượng vỏ khô), những thành phần khác như protein, pectin, tinh bột, đường khử, chiếm 49%. Vỏ cà phê được xem như là nguồn thức ăn rất tốt cho động vật vì nguồn dinh dưỡng khá cao. Tuy nhiên trong vỏ cà phê có chứa một số thành phần phi dinh dưỡng không tốt cho chuyển hóa thức ăn đối với động vật như: tannin hay caffeine. 3
7. Bên cạnh đó, vỏ quả cà phê cũng chứa một lượng chất xơ khá lớn: 25,88% cellulose; 3,6% hemicellulose và 20,07% lignin. Do đó, vỏ quả cà phê cũng được xem như là một nguồn sinh khối lignocellulose dùng trong sản xuất bioethanol (thế hệ sản xuất ethanol thứ 2). 2.2 Giới thiệu về quá trình tiền xử lý Tiền xử lý được xem là bước đầu tiên và quan trọng nhất của quy trình sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose bởi vì thông qua quá trình tiền xử lý mà các polymer carbohydrate trong sinh khối lignocellulose bị chuyển đổi thành dạng đường đơn giản hơn trước khi thực hiện quá trình lên men. Việc chuyển đổi này thường được thực hiện bởi enzyme thủy phân. Tuy nhiên do tính chất không đồng nhất và rất phức tạp của sinh khối lignocellulose (ví dụ như: độ kết tinh cellulose, mức độ trùng hợp, độ ẩm, diện tích bề mặt, mức độ liên kết của lignin và hemicellulose) nên sinh khối này bắt buộc phải tiền xử lý trước để có thể điều chỉnh được hoạt động thủy phân của enzyme. Điều quan trọng của quá trình tiền xử lý là phải làm giảm nhiều nhất có thể lượng lignin và hemicellulose có trong nguyên liệu mà vẫn giữ lại càng nhiều thành phần cellulose và làm giảm độ kết tinh của cellulose. Để đánh giá hiệu quả của quá trình tiền xử lý cần thiết phải dựa vào lượng đường khử được giải phóng sau quá trình thủy phân cũng như cần xem xét đến quá trình trung hòa dịch tiền xử lý. Bên cạnh đó cần phải quan tâm đến tính kinh tế của toàn bộ quá trình khi xem xét chọn phương pháp tiền xử lý nào. 2.3 Giới thiệu về quá trình thủy phân vỏ quả cà phê Quá trình thủy phân vỏ quả cà phê sau tiền xử lý chính là quá trình phân giải sinh học của cellulose và hemicellulose có trong vỏ quả cà phê dưới tác dụng của enzyme. Thường thì cellulose sẽ thủy phân tạo thành glucose, nó giống như quá trình thủy phân tinh bột thành đường glucose. Nhưng khác nhau ở chỗ, glucose trong cellulose được nối với các liên kết beta trong cấu trúc tinh thể khó phân hủy hơn nhiều so với liên kết alpha trong tinh bột vô định hình (Holtzapple, 1993). Để thủy phân hoàn toàn cellulose thành glucose phải nhờ sự phối hợp xúc tác của một phức hệ cellulase. Cần có ba kiểu enzyme tham gia vào phức hệ này: endo-β-1,4-glucanases, exo-β-1,4-glucanases và β- glucosidases. Hemicellulose có thể bị thủy phân bởi các enzyme như endoxylanases, exoglycanases, xylanases, endomannanases, β- 4
8. xylosidase, Bên cạnh đó, tác nhân acid loãng và kiềm loãng cũng có thể thủy phân được hemicellulose. 2.4 Các nghiên cứu về quá trình tiền xử lý và sản xuất ethanol Trong những thập niên gần đây, có rất nhiều nghiên cứu về quá trình tiền xử lý và sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose như: rơm rạ, lúa mì, bã mía, thân cây bắp, lõi bắp, cỏ hay là gỗ mềm. Chỉ có một vài nghiên cứu về sản xuất ethanol sinh học từ vỏ quả cà phê. Mới đây nhất, theo nghiên cứu của (Shenoy et al., 2011) đã nghiên cứu về quá trình sản xuất ethanol từ vỏ quả cà phê bằng phương pháp thủy phân bởi acid H2SO4 2% trong thời gian 30 phút ở 90oC. Hàm lượng đường tổng số thu được sau quá trình thủy phân là 1,62 g/100 mL dịch thủy phân, đường khử là 0,7 g/100 mL dịch thủy phân. Sau đó đem đi lên men và thu được lượng ethanol là 0,46 g/g đường. Một nghiên cứu khác cũng được thực hiện trên đối tượng là vỏ trấu cà phê. Vỏ trấu cà phê được thủy phân bằng acid H2SO4 1÷5%, tỷ lệ nguyên liệu:acid là 1:10 và thời gian thủy phân là 5 giờ. Hỗn hợp dịch thủy phân sau đó được tiến hành lên men với nấm men thương mại S. cereviciae ở nhiệt độ 30oC, pH = 5, trong thời gian 24 giờ thì thu được nồng độ ethanol cao nhất là 7,9 g/L (Sahu, 2014). Đa số các công trình nghiên cứu trước đây đều tập trung dùng acid H2SO4 ở nồng độ trung bình đến cao để tiền xử lý kết hợp với thủy phân sinh khối lignocellulose nhằm mục đích thu đường khử cho nên ưu điểm chính là thời gian xử lý được rút ngắn rất nhiều so với việc dùng enzyme để thủy phân. Ngoài ra tính kinh tế là yếu tố luôn được quan tâm khi tiến hành sản xuất thương mại và các nghiên cứu trước đáp ứng được điều này bởi vì nếu dùng enzyme để thủy phân sẽ tốn kém rất nhiều lần so với dùng acid. Tuy nhiên, nhược điểm lớn khi dùng acid để thủy phân là gây ô nhiễm môi trường ở mức nghiêm trọng, thiết bị yêu cầu phải chịu được acid và nhiệt độ cao. Cho nên các nghiên cứu sau này hầu như không còn sử dụng acid để thủy phân mà phải sử dụng đến enzyme. Theo nghiên cứu thuộc đề tài “Nghiên cứu công nghệ xử lý một số loại phụ phẩm nông nghiệp (PPNN) bằng nước áp suất cao để thu dung dịch đường có khả năng lên men tạo thành ethanol” (Nguyễn Hoàng Dũng, 2008), PPNN được sử dụng là rơm, rạ, trấu. Để tạo thành ethanol, rơm, rạ, trấu được xử lý bằng thiết bị phản ứng thủy nhiệt ở quy mô phòng thí nghiệm. Sau đó được tiếp tục nghiên cứu ở quy mô pilot trên thiết bị cấp hơi nước áp suất cao. 5
9. Năm 2005, nhóm nghiên cứu do TS. Phan Đình Tuấn, trường Đại học Bách Khoa TP.HCM phụ trách đã thực hiện nghiên cứu công nghệ xử lý các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp như rơm, rạ, trấu nhằm sản xuất bioethanol, tiến tới xây dựng mô hình “thị trấn biomass” tại xã Thái Mỹ, huyện Củ Chi, TP.HCM. Sau gần 5 năm thực hiện, các nhà khoa học đã nghiên cứu, sản xuất thành công xăng sinh học từ rơm rạ và các chất thải có nguồn gốc cellulose (Hồng Hoa, 2014). Tuy nhiên, một trong những khó khăn của dự án là giá thành xăng sinh học sản xuất từ rơm rạ khá cao, do chi phí phân hủy cellulose trong rơm rạ lớn. Quá trình này tiêu tốn nhiều năng lượng, hiệu suất và nồng độ đường tạo ra thấp, dẫn đến hiệu suất quá trình lên men cũng như nồng độ ethanol tạo ra thấp hơn nhiều so với quá trình sản xuất ethanol từ tinh bột. Nếu phân hủy cellulose bằng hóa chất, giá thành sẽ thấp hơn, nhưng trong dung dịch đường tạo ra cũng sẽ chứa một lượng hóa chất, không thuận lợi cho việc lên men ethanol. Do đó, dự án này hướng đến mục tiêu không dùng hóa chất để phân hủy cellulose. Chi phí tinh chế ethanol sau khi lên men cũng là một vấn đề khó khăn, gây tốn kém về mặt năng lượng, dù đã thành công trong việc sản xuất xăng sinh học từ rơm rạ, nhưng để thương mại hóa sản phẩm, các nhà khoa học vẫn đang tiếp tục nỗ lực nghiên cứu nhằm hạ giá thành sản phẩm. Cũng có nhiều nghiên cứu về quá trình tiền xử lý bằng kiềm loãng trên các đối tượng như rơm, bã mía, gỗ, Tương ứng với mỗi loại nguyên liệu thì phải có khảo sát riêng biệt để tìm ra phương pháp tiền xử lý tối ưu cho loại nguyên liệu đó. Hầu hết các loại sinh khối nông nghiệp thông thường đã có các chế độ tiền xử lý tối ưu. Tuy nhiên trên đối tượng vỏ quả cà phê thì chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu. Nhược điểm lớn khi sử dụng kiềm để tiền xử lý là gặp phải khó khăn trong việc thu hồi lượng kiềm trong dịch sau thủy phân. Ngoài ra việc sử dụng hóa chất đòi hỏi dụng cụ thiết bị chịu được nhiệt độ và khả năng chịu ăn mòn cao. Phương pháp không được khuyến thích sử dụng ở quy mô công nghiệp vì khả năng gây ô nhiễm môi trường tương đối nghiêm trọng. Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 3.1.1 Nguyên liệu Vỏ quả cà phê vối tươi được thu nhận tại xã Pơng Drang, huyện Krông Buk, tỉnh Đăk Lăk. Thời gian thu nhận từ tháng 11 đến tháng 1 dương lịch. Quả cà phê chín có màu đỏ tươi, không bị dập, không bị mốc. Quả cà phê 6
10. tươi sau khi thu hái tiến hành cho vào thùng xốp có ướp thêm đá và vận chuyển về phòng thí nghiệm trong thời gian không quá 12 giờ. 3.1.2 Enzyme và nấm men Các enzyme thương mại sử dụng: Viscozyme® Cassava C: (Bagsvaerd, Đan Mạch), Celluclast® 1.5L (Novozyme, Đan Mạch), Glucosidase (Novozyme, Đan Mạch). Nấm men: Sacharomyces cerevisiae. 3.1.3 Phương pháp nghiên cứu chính Phương pháp tiền xử lý Cân 50 g nguyên liệu vỏ cà phê đã sấy khô cho vào 1 bình cầu 1 L, sau đó cho thêm 500 mL dung dịch H2SO4 2% (w/w). Nguyên liệu sẽ được tiền xử lý trong nồi hấp tiệt trùng ở 140oC trong 45 phút. Lấy ra để nguội rồi dùng vải để lọc thu lấy phần bã rắn. Rửa bã này nhiều lần với nước cho đến khi pH trung tính. Tiếp tục cho vào bình cầu 500 mL dung dịch NaOH nồng độ 0,2 g NaOH/g nguyên liệu. Quá trình tiền xử lý kiềm thực hiện ở 120oC trong 20 phút, sau đó chuyển vào lò vi sóng thực hiện quá trình tiền xử lý vi sóng ở mức công suất 327 W, thời gian 20 phút. Cuối cùng, lọc, rửa trung tính và sấy khô như ban đầu (Phuong, Le Pham and Le Nguyen, 2019). Phương pháp thủy phân bằng enzyme cellulase Cân 15 g nguyên liệu đã qua tiền xử lý cho vào erlen 250 mL. Tiếp tục cho vào 150 mL dung dịch đệm citrate 0,05 mol/L, pH 4,8. Một thể tích enzyme cellulase cho vào với nồng độ 25 FPU/g và 30 CBU/g. Quá trình này được thực hiện trên máy lắc có gia nhiệt ở 50oC, 150 vòng/phút trong thời gian 72 giờ. Kết thúc quá trình thủy phân, dịch được ly tâm 2500 vòng trong 10 phút. Thu lấy dịch ly tâm và bỏ phần cặn. Dịch ly tâm sẽ đem xác định các chỉ tiêu đường khử, đường glucose (Phuong, Le Pham and Le Nguyen, 2019). Phương pháp lên men tạo ethanol Cho 250 mL dịch thủy phân vào bình lên men 500 mL. Bổ sung thêm vào 1 số thành phần môi trường: (NH4)2SO4 (1 g/L), K2HPO4 (0,1 g/L), o MgSO4.7H2O (0,2 g/L). Hỗn hợp sẽ được hấp tiệt trùng ở 121 C trong 20 phút sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng. Bổ sung vào dịch lên men lượng tế bào nấm men S. cereviciae ban đầu là 3x108 cfu/mL. Quá trình lên men được thực hiện ở điều kiện pH 5, nhiệt độ 30oC và lắc 120 vòng/phút. Tại các thời điểm lên men khác nhau lấy ra 1 lượng dịch lên men xác định các chỉ tiêu: ethanol, đường khử, đường glucose (Phuong, Le Pham and Le Nguyen, 2019). 7
11. 3.1.4 Phương pháp phân tích và đo đạc Bảng 3.1: Các chỉ tiêu, phương pháp phân tích và đo đạc STT Chỉ tiêu Phương pháp 1 Độ ẩm AOAC 934.06 2 Tro tổng số AOAC 942.05 3 Lipid tổng AOAC 948.16 4 Caffeine Đo quang ở 265 nm (Amos- Tautua and Diepreye, 2014) 5 Polyphenol tổng Phản ứng với thuốc thử Folin- Ciocalteu (Ayesha et al., 2010) 6 Protein tổng số Phương pháp Bradford (Bradford, 1976) 7 Pectin Phương pháp calcicum pectate (Carré and Haynes, 1922) 8 Đường tổng Phương pháp Phenol sulphuric acid (Dubois et al., 1956) 9 Đường khử Phương pháp Dinitrosalicylic Acid (Miller, 1959) 10 Đường glucose Phương pháp Glucose Oxidase (Sadasivam and Manickam, 1996) 11 Cellulose, hemicellulose, Phương pháp crude fiber (Van lignin Soest and Wine, 1967) 12 Ethanol Phương pháp Dichromate oxidation (Sayyad et al., 2015) 13 Độ thấm nước TCVN 1554 : 1974 3.1.5 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với một hoặc hai nhân tố, lặp lại ba lần. Kết quả tối ưu của thí nghiệm trước được sử dụng cho thí nghiệm kế tiếp. Số liệu được phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định LSD để kết luận sự khác biệt giữa trung bình các nghiệm thức với phần mềm hỗ trợ Statgraphics Centurion 15.2 và phần mềm Modde 5.0 dùng tính toán mô hình bề mặt đáp ứng. 3.1.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 8
12. Vỏ quả cà phê (khô) Xay, nghiền, rây Phân tích thành phần hóa học Nội dung 1: Khảo sát quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê Khảo sát một số phương pháp khử caffeine Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng kiềm và polyphenol (TN 1) (TN 4) Tối ưu hóa quá trình khử caffeine và Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng vi sinh polyphenol (TN 2) vật (TN 5) Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng acid (TN Khảo sát quá trình tiền xử lý kết hợp 3) acid-kiềm-vi sóng (TN 6) Chọn được các thông số cơ bản của quá trình tiền xử lý Nội dung 2: Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc Phân lập một số dòng nấm mốc (TN 7) Định tính khả năng sinh tổng hợp cellulase (TN Khảo sát nồng độ các tác nhân (NH4)2SO4, 8) NaCl, Ethanol và Acetone đến quá trình thu Khảo sát các điều kiện môi trường nuôi cấy đến nhận enzyme cellulase (TN 16-19) khả năng sinh enzyme celulase của nấm mốc (TN 9-15) Chọn được điều kiện thích hợp để thu nhận enzyme cellulase có hoạt tính cao Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân Khảo sát chủng loại enzyme đến hàm lượng Khảo sát nồng độ enzyme thủy phân (TN đường khử thu được sau quá trình thủy phân 21) (TN 20) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân (TN 22) Tối ưu hóa các thông số của quá trình thủy phân (TN 23) Khử độc dịch thủy phân (TN 24) Nội dung 4: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Khảo sát mật độ nấm men (TN 25) Khảo sát thời gian lên men (TN 27) Khảo sát nhiệt độ lên men (TN 26) Khảo sát phương pháp lên men (TN 28) Chọn được các thông số cho quá trình lên men Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 9
13. 3.2 Nội dung nghiên cứu và bố trí thí nghiệm cụ thể 3.2.1 Xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ quả cà phê vối Mục tiêu: Xác định một số thành phần cơ bản của nguyên liệu vỏ quả cà phê vối, làm cơ sở cho việc đánh giá khả năng sử dụng vỏ quả cà phê làm nguồn sinh khối lignocellulose để sản xuất ethanol sinh học. Chỉ tiêu đánh giá: Độ ẩm (%), protein tổng số (%), lipid (%), pectin (%), đường khử (%), đường tổng số (%), tro (%), caffeine (%), polyphenol (%), cellulose (%), helicellulose (%), lignin (%). 3.2.2 Nội dung 1: Khảo sát quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu suất quá trình khử caffeine và polyphenol Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hiệu suất khử caffeine và polyphenol trong nguyên liệu theo các phương pháp trích ly khác nhau. Yếu tố khảo sát: Trích ly thông thường, trích ly bằng nước có hỗ trợ siêu âm, trích ly bằng nước có hỗ trợ vi sóng. Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất khử caffeine (%), hiệu suất khử polyphenol (%). Thí nghiệm 2: Tối ưu hóa quá trình khử caffeine và polyphenol Yếu tố khảo sát: tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, nhiệt độ trích ly và thời gian trích ly. Chỉ tiêu đánh giá: Hiệu suất khử caffeine (%), hiệu suất khử polyphenol (%). Thí nghiệm 3: Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng acid Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin trong quá trình tiền xử lý bằng H2SO4 khi thay đổi nồng độ acid, nhiệt độ và thời gian xử lý. Yếu tố khảo sát: Nồng độ H2SO4, nhiệt độ tiền xử lý, thời gian tiền xử lý Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin. Thí nghiệm 4: Khảo sát quá trình tiền xử lý bằng kiềm Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin trong quá trình tiền xử lý bằng NaOH khi thay đổi của tỷ lệ kiềm, nhiệt độ và thời gian xử lý. Yếu tố khảo sát: Tỷ lệ NaOH, nhiệt độ tiền xử lý, thời gian tiền xử lý Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin. Thí nghiệm 5: Tiền xử lý bằng chủng nấm mục trắng Phanerochaete chrysosporium 10
14. Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin trong quá trình tiền xử lý bằng nấm mục trắng khi thay đổi thời gian xử lý và độ ẩm nguyên liệu ban đầu. Yếu tố khảo sát: Độ ẩm nguyên liệu, thời gian tiền xử lý Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin. Thí nghiệm 6: Hiệu quả của việc kết hợp nhiều phương pháp tiền xử lý trên đối tượng vỏ quả cà phê Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin trong vỏ quả cà phê khi có sự kết hợp của các tác nhân tiền xử lý acid-kiềm-vi sóng. Yếu tố khảo sát: tiền xử lý acid-kiềm, tiền xử lý kiềm-acid, tiền xử lý acid-kiềm-vi sóng Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin. 3.2.3 Nội dung 2: Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc Thí nghiệm 7: Phân lập một số dòng nấm mốc có đặc tính hình thái giống nhóm nấm Aspergillus sp và Trichoderma sp Mục tiêu: Thu nhận các dòng nấm có đặc điểm hình thái giống nhóm nấm Aspergillus và Trichoderma từ đất trồng cà phê, quả cà phê, cành cây cà phê. Yếu tố khảo sát: Đất trồng cà phê, quả cà phê bị mốc, cành cây cà phê bị mục. Chỉ tiêu đánh giá: Các dòng phân lập có đặc điểm bên ngoài giống với nấm mốc thuộc nhóm Aspergillus và Trichoderma. Thí nghiệm 8: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp cellulase của các dòng nấm mốc đã phân lập Mục tiêu: Sơ bộ chọn các dòng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp cellulase từ các mẫu nấm đã phân lập được. Yếu tố khảo sát: Các dòng nấm mốc đã nhận diện ở thí nghiệm 7. Chỉ tiêu đánh giá: Các dòng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase cao dựa trên đường kính vòng phân giải CMC. Thí nghiệm 9-15: Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme celulase của nấm mốc phân lập được từ quả cà phê Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hoạt lực enzyme cellulase khi thay đổi các điều kiện môi trường nuôi cấy nấm mốc. Yếu tố khảo sát: Nhiệt độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy, pH môi trường, nồng độ dịch chiết khoai tây, cơ chất cảm ứng, nguồn khoáng bổ sung, nitơ bổ sung. 11
15. Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính enzyme cellulase (CMCase). Thí nghiệm 16-19: Ảnh hưởng của nồng độ tác nhân kết tủa (NH4)2SO4, NaCl, ethanol và acetone đến hoạt lực enzyme cellulase thu được từ nấm mốc Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hoạt lực enzyme cellulase thu được từ nấm mốc khi thay đổi nồng độ các tác nhân kết tủa enzyme. Yếu tố khảo sát: Nồng độ (NH4)2SO4, nồng độ NaCl, tỷ lệ ethanol/enzyme thô, tỷ lệ acetone/enzyme thô. Chỉ tiêu đánh giá: Hoạt tính, hoạt tính riêng, hiệu suất thu hồi. 3.2.4 Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân vỏ quả cà phê Thí nghiệm 20: Ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng đường khử thu được sau quá trình thủy phân Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng đường khử sau quá trình thủy phân dưới sự thay đổi của loại enzyme cho vào quá trình thủy phân. Yếu tố khảo sát: Enzyme thu nhận, Viscozyme, Celluclast 1.5L, Glucosidase. Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng đường khử, đường glucose. Thí nghiệm 21-22: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian đến hàm lượng đường khử thu được sau quá trình thủy phân Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng đường khử sau quá trình thủy phân dưới sự thay đổi của nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian thủy phân. Yếu tố khảo sát: Nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân. Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng đường khử, đường glucose. Thí nghiệm 23: Tối ưu hóa các thông số của quá trình thủy phân Yếu tố khảo sát: Nồng độ enzyme, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân. Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng đường khử. 3.2.5 Thí nghiệm 24: Ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 đến hiệu quả khử độc dịch thủy phân Mục tiêu: Chọn được thể tích Ca(OH)2 thích hợp để kết tủa gốc sulphate trong dịch thủy phân nhiều nhất có thể trước khi lên men tạo ethanol. Yếu tố khảo sát: Thể tích Ca(OH)2 Chỉ tiêu đánh giá: Khối lượng kết tủa. 12
16. 3.2.6 Nội dung 4: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men Thí nghiệm 25-27: Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men, nhiệt độ và thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu được Mục tiêu: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng ethanol và glucose dưới sự thay đổi của mật độ tế bào nấm men ban đầu cho vào quá trình lên men. Yếu tố khảo sát: Mật độ tế bào nấm men, nhiệt độ lên men, thời gian lên men Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng ethanol tạo thành. Thí nghiệm 28: Ảnh hưởng của phương pháp lên men đến hàm lượng ethanol thu được Mục đích: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng ethanol tạo thành khi thực hiện quá trình lên men với các phương pháp khác nhau và ở những thời điểm lên men khác nhau. Yếu tố khảo sát: Lên men SHF, lên men SSF, lên men SHF kết hợp SSF. Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng ethanol tạo thành. Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Xác định thành phần hóa học của vỏ quả cà phê vối Kết quả cho thấy thành phần hóa học vỏ quả cà phê bao gồm: đường tổng 9,18±0,23%, pectin 4,37±0,06%, protein tổng 9,52±0,23%, cellulose 25,88±0,91%, hemicellulose 3,6±0,18%, lignin 20,07±0,56%, chất béo 1,22±0,11%, caffeine 0,78±0,01%, polyphenol 8,69±0,12% và tro 6,29±0,09%. 4.2 Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý đến sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin 4.2.1 Ảnh hưởng của phương pháp trích ly hiệu suất khử caffeine và polyphenol có trong vỏ quả cà phê Đối với phương pháp trích ly thông thường: hiệu suất khử caffeine là 88,1%, khử polyphenol là 80,6%. Đối với phương pháp trích ly bằng nước có hỗ trợ siêu âm: hiệu suất khử caffeine là 91,4%, khử polyphenol là 85,5%. Đối với phương pháp trích ly bằng nước có hỗ trợ vi sóng: hiệu suất khử caffeine là 92,3%, khử polyphenol là 87,7%. Phương pháp khử caffeine và polyphenol được lựa chọn đó là trích ly bằng nước nóng thông thường vì tính kinh tế, hiệu quả và sự thuận tiện. 13
17. 4.2.2 Tối ưu hóa các thông số quá trình khử caffeine và polyphenol Để tìm được giá trị tối ưu trong quá trình khử caffeine và polyphenol bằng nước nóng, cũng như các tương tác ảnh hưởng của các nhân tố đến hiệu suất khử caffeine và polyphenol, tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) với mô hình CCF với các thông số thay đổi như là: X1: tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, X2: nhiệt độ trích ly, X3: thời gian trích ly và hàm mục tiêu nghiên cứu lần lượt là Y1 (%, hiệu suất khử caffeine), Y2 (%, hiệu suất khử polyphenol). Bảng 4.1: Thông số của quá trình trích ly Các mức độ thay đổi Các nhân tố tối ưu Ký hiệu -1 0 1 Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) X1 30/1 40/1 50/1 Nhiệt độ trích ly (oC) X2 70 80 90 Thời gian trích ly (phút) X3 90 120 150 Phương trình hồi quy thu nhận được như sau: Y1= 88,33–3,56X1+5,17X2–7,6X12–9,97X22–5,23X32+4X1X3+4,49X2X3 (1) Y2= 80,65–1,28X1+1,59X2–4,24X12–3,19X22+0,52X1X2+0,77X1X3 (2) Cả 2 phương trình hồi quy đều có p 0,8) và hệ số đánh giá khả năng dự đoán của mô hình Q2 là 0,968 và 0,914 (>0,5) chứng tỏ mô hình đạt độ tin cậy cao. Bảng 4.2: Các thông số tối ưu của mô hình quy hoạch thực nghiệm Nhân tố X1 X2 X3 Y1 Y2 Giá trị dự đoán tối ưu 38,6/1 82,9 136,7 88,1 80,95 Giá trị kiểm tra 89,52±0,49 78,77±0,44 Kết quả tối ưu đạt được từ mô hình chọn lựa ban đầu là: Hiệu suất khử caffeine đạt 89,52% và khử polyphenol đạt 78,77% ở điều kiện tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 38,6/1, nhiệt độ trích ly 82,9oC và thời gian trích ly là 136,7 phút. 4.2.3 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin Khi tăng nồng độ acid, nhiệt độ và thời gian tiền xử lý thì sự suy giảm cellulose, hemicellulose và lignin tăng theo. Tuy nhiên acid loãng thực sự có hiệu quả trong việc loại bỏ hemicellulose nhưng không có hiệu quả cao đối với lignin. Điều kiện tiền xử lý tối ưu bằng acid loãng H2SO4 đối với vỏ quả cà phê là: Nồng độ acid 2% (w/w), tỷ lệ acid:nguyên liệu là 10:1, nhiệt độ tiền xử lý 140oC và thời gian là 45 phút. Ở điều kiện tiền xử lý này thì 14
18. cellulose tổn thất 7,5%, hemicellulose bị loại bỏ 43,9% và lignin bị loại bỏ 4,2%. A – B Hình 4.1: Bề mặt của vỏ quả cà phê trước (A) và sau (B) khi được tiền xử lý bằng H2SO4 2% dưới kính hiển vi điện tử (SEM) 4.2.4 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin Tiền xử lý bằng kiềm loãng thực sự có hiệu quả hơn so với acid khi loại bỏ được 46,11% hemicellulose, 76,63% lignin ra khỏi nguyên liệu nhưng vẫn giữ lại được 71,25% cellulose. Kết quả này tuy có tốt hơn so với tiền xử lý bằng acid loãng nhưng chưa phải là tốt nhất. Điều kiện tiền xử lý tối ưu bằng kiềm loãng NaOH đối với vỏ quả cà phê là: Tỷ lệ kiềm 0,2 g/g NL, tỷ lệ nguyên liệu/dịch kiềm là 1:10, nhiệt độ tiền xử lý 120oC và thời gian 20 phút. A – C Hình 4.2: Bề mặt của vỏ quả cà phê trước (A) và sau (C) khi được tiền xử lý bằng NaOH 0,2 g/g NL dưới kính hiển vi điện tử (SEM) 4.2.5 Tiền xử lý vỏ quả cà phê bằng chủng nấm P. chrysosporium Sau 50 ngày tiền xử lý: cellulose giảm tối đa 23,7%, hemicellulose giảm 14,1% và lignin giảm 51,4%. Phương pháp tiền xử lý bằng chủng nấm P. chrysosporium chưa thực sự có hiệu quả trong việc loại bỏ hemicellulose và lignin. Tuy nhiên phương pháp này thực hiện ở nhiệt độ phòng và không sử dụng đến hóa chất cho nên chi phí thấp và không gây ô nhiễm môi trường. 15
19. A – D Hình 4.3: Bề mặt của vỏ quả cà phê trước (A) và sau (D) khi được tiền xử lý bằng nấm mục trắng dưới kính hiển vi điện tử (SEM) 4.2.6 Hiệu quả của việc kết hợp nhiều phương pháp tiền xử lý trên đối tượng vỏ quả cà phê 100 Cellulose Hemicellulose Lignin 90 76.6 78.5 77.4 79.2 80 68.7 71.4 70 54.8 60 50.2 47.1 50 43.9 % bị loại bỏ bịloại % 40 34.2 34.4 28.7 29.6 30 20.7 20 12.8 7.5 10 4.2 0 Acid Kiem Acid-Kiem Kiem-Acid VSV Acid-Kiem-Vi song Phương pháp tiền xử lý Hình 4.4: Sự thay đổi thành phần chất xơ theo các phương pháp tiền xử lý khác nhau Đã có sự cải thiện đáng kể về phần trăm loại bỏ thành phần chất xơ có trong vỏ quả cà phê khi có sự kết hợp 2 hay 3 phương pháp tiền xử lý với nhau. Nếu xét về tiêu chí loại bỏ cảng nhiều càng tốt hemicellulose và lignin thì phương pháp tiền xử lý acid-kiềm-vi sóng được lựa chọn, khi loại bỏ được 71,4% hemicellulose và 79,2% lignin. Tuy nhiên nếu xét trên phương diện ít tổn thất cellulose nhất thì phương pháp tiền xử lý bằng acid được lựa chọn, khi tổn thất chỉ 7,5% cellulose. Do đó để có cơ sở cho việc lựa chọn phương pháp tiền xử lý nào là tốt nhất cần phải xem xét đến lượng đường khử tạo ra sau quá trình thủy phân của các phương pháp này sẽ thay đổi như thế nào. Với hàm mục tiêu 16
20. đường khử tạo ra ở phương pháp tiền xử lý nào cao nhất thì phương pháp đó sẽ được lựa chọn. A – E Hình 4.5: Bề mặt của vỏ quả cà phê trước (A) và sau (E) khi được tiền xử lý bằng acid-kiềm-vi sóng dưới kính hiển vi điện tử (SEM) Bảng 4.3: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự hình thành đường khử Phương Acid Kiềm Vsv Acid- Kiềm- Kiềm- Acid- pháp TXL kiềm acid vi sóng kiềm- vi sóng Đường khử 19,85 28,21 13,19 41,27 39,29 38,21 43,26 g/L Kết quả Bảng 4.3 cho thấy, đã có cơ sở cho việc lựa chọn phương pháp tiền xử lý thích hợp đối với vỏ quả cà phê đó là có sự kết hợp acid- kiềm-vi vóng. Tro Hemi Khác Khác Celulose 5.20 1.05 12.09% 44.09% 25.88% % % Lignin 20.07% Celulose 77.49% Lignin Tro Hemi 4.17% 6.29% 3.67% NL TXL acid-kiềm-vi NL chưa TXL sóng Hình 4.6: Thành phần nguyên liệu trước và sau khi tiền xử lý Nguyên liệu sau tiền xử lý còn lại chủ yếu là cellulose (77,49%, tính theo hàm lượng cellulose ban đầu), tro và một số chất khác (Hình 4.6). Vỏ cà phê sau tiền xử lý có đặc điểm cảm quan là mềm xốp, màu vàng nâu nhạt, khả năng thấm nước tốt. 17
21. 4.3 Thu nhận enzyme cellulose từ nấm mốc 4.3.1 Kết quả phân lập một số dòng nấm mốc có đặc tính hình thái giống nhóm nấm Aspergillus và Trichoderma Bảng 4.4: Số dòng nấm mốc được phân lập từ một số nguồn TT Nguồn phân lập Số dòng Ký hiệu mẫu Số dòng nấm Ký hiệu nấm Trichoderma mẫu Aspergillus 1 Đất trồng cà phê 2 DA1, DA2 2 DT1, DT2 2 Quả cà phê 6 QA1÷QA6 5 QT1÷QT5 3 Cành lá mục 5 CA1÷CA5 4 CT1÷CT4 Tổng số 13 11 Thông qua quan sát sơ bộ các đặc điểm về đại thể và vi thể có thể khẳng định, trong 24 dòng khảo sát có 13 dòng có đặc điểm giống Aspergillus và 11 dòng có đặc điểm giống Trichoderma. 4.3.2 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng nấm mốc phân lập được. Trong số 24 dòng nấm mốc phân lập được, nhóm nấm mốc phân lập được từ quả và cành cây mục thể hiện hoạt tính cellulase cao hơn là từ đất. Riêng 11 dòng phân lập được từ quả thì đã có 5 dòng cho hoạt tính cao (QA1, QA3, QA5, QT4, QT5). Với 9 dòng phân lập được từ cành lá thì có 3 dòng thể hiện hoạt tính cellulase cao (CA1, CT2, CT4). Còn lại 4 dòng phân lập được từ đất nhưng không có dòng nào thể hiện hoạt tính cellulase cao (D < 12 mm). Có năm dòng nấm mốc có khả năng sinh enzyme cellulase được tuyển chọn bao gồm: QA3 (phân lập từ quả), CA1 (phân lập từ cành lá), QT5 (phân lập từ quả), CT2 (phân lập từ cành lá) và CT4 (phân lập từ cành lá). Riêng dòng QT5 cho kết quả đường kính vòng phân giải và hoạt tính CMCase cao nhất. Kết quả định danh, xác định chủng QT5 là Trichoderma asperellum với tỷ lệ đồng hình 99%. 4.3.3 Xác định các điều kiện môi trường nuôi cấy nấm T. asperellum QT5 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy T. asperellum QT5 đến hoạt lực CMCase Hoạt tính của enzyme thu được tăng dần theo thời gian nuôi cấy và đạt cực đại tại thời điểm 7 ngày. Sau đó hoạt tính bắt đầu giảm dần khi thời gian nuôi cấy tăng từ 7 đến 9 ngày. Đối với chủng nấm mốc T. asperellum khả năng sinh tổng hợp cellulase tăng dần trong khoảng nhiệt độ từ 30÷35oC tương ứng hoạt lực tăng từ 1,69 U/mL đến cực đại là 1,84 U/mL (ở 35oC). Có thể nhận thấy chủng T. asperellum cũng là một chủng nấm ưa ấm. 18
22. Thời gian để nấm mốc phát triển tối ưu là 7 ngày và nhiệt độ nuôi cấy tốt nhất là 35oC, tương ứng với hoạt tính CMCase đạt cực đại là 1,6 U/mL. Ảnh hưởng của pH môi trường và nồng độ dịch chiết khoai tây đến hoạt lực CMCase Hoạt tính CMCase tăng dần khi pH môi trường tăng và hoạt lực đạt cực đại ở pH 7 (2,37 U/mL), sau đó khả năng sinh tổng hợp cellulase giảm nhanh chóng ở pH 9. Như vậy, chủng T. asperellum có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong điều kiện pH trung tính. Ngoài ra, khi tăng nồng độ dịch chiết khoai tây thì hoạt lực CMCase tăng theo và hoạt lực đạt cao nhất khi nồng độ dịch chiết là 100% (v/v). Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng đến hoạt lực CMCase Cơ chất cảm ứng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng nấm. Chủng T. asperellum QT5 được lên men trong môi trường chứa các nguồn cơ chất cảm ứng khác nhau ở nồng độ 1% (w/v). Kết quả cho thấy cơ chất cám gạo cho khả năng cảm ứng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất đạt 9,76 U/mL. Ảnh hưởng của nguồn nitơ và khoáng chất đến hoạt lực CMCase Một số nguồn khoáng: KCl, MgSO4 hay CaCO3 khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy thì có tác dụng làm tăng hoạt tính CMCase. Trong nghiên cứu của Ali and Akhand (1992), thì các khoáng NaCl và KCl không có tác dụng làm tăng hoạt tính Endo-glucanase. Tuy nhiên trong nghiên cứu này KCl có tác dụng gia tăng hoạt tính CMCase hơn so với MgSO4, điều này cho thấy ion K+ phân ly từ KCl cũng ảnh hưởng đến hoạt tính cellulase sinh ra bởi nấm mốc T. asperellum. Một số nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng, (NH4)2SO4 và NH4NO3 là hai nguồn nitơ thích hợp nhất đối với chủng Trichoderma spp. S1 (Ali and Akhand, 1992). Do đó, KCl và (NH4)2SO4 được lựa chọn để bổ sung vào môi trường nuôi cấy nấm T. asperellum. 4.3.4 Thu nhận enzyme cellulase từ T. asperellum QT5 bằng muối (NH4)2SO4, NaCl, ethanol và acetone Bảng 4.5: So sánh hiệu quả tinh sạch cellulase bằng các tác nhân kết tủa khác nhau Tác nhân kết tủa Tỷ lệ tác nhân Protein Hoạt tính Hoạt tính Hiệu suất và enzyme (mg/mL) (U/mL) riêng thu hồi (%) (U/mg) Đối chứng 0,96 13,6 14,16 (NH4)2SO4 F65-75 (w/v) 0,316 13,9 43,92 70,51 NaCl 25% (w/v) 0,471 16,42 33,42 78,36 Ethanol 3,5:1 (v/v) 0,438 21,72 49,59 89,43 Acetone 2: 1 (v/v) 0,507 13,8 26,78 43,54 19
23. Việc sử dụng dung môi ethanol tỏ ra hiệu quả đối với việc kết tủa sơ bộ enzyme, thể hiện ở hoạt tính riêng gia tăng khác biệt khi so sánh với các loại hóa chất kết tủa khác đã sử dụng và hiệu suất thu hồi tương đồng với việc sử dụng NaCl (89,43% và 78,36%). Đồng thời, việc sử dụng ethanol còn giúp giảm bớt công đoạn thẩm tích sau quá trình kết tủa với muối. Dựa trên các kết quả khảo sát, ethanol được sử dụng làm dung môi kết tủa cellulase với tỷ lệ ethanol:enzyme thô là 3,5:1. 4.4 Nghiên cứu quá trình thủy phân cellulose có trong vỏ quả cà phê bởi hệ enzyme cellulase 4.4.1 Ảnh hưởng của chủng loại enzyme đến hiệu quả quá trình thủy phân Kết quả phân tích cho thấy, lượng đường khử và glucose tạo ra sau quá trình thủy phân có sự khác nhau khi sử dụng các loại enzyme thủy phân khác nhau. Cụ thể, cellulase thu nhận được tạo ra 12,15 g/L đường khử và 8,35 g/L glucose; Viscozyme tạo ra 24,43 g/L đường khử và 17,46 g/L glucose; Celluclast 1.5L tạo ra 27,39 g/L đường khử và 18,65 g/L glucose. Đường khử và glucose tạo ra khác nhau là do hoạt tính enzyme endo và exo ban đầu của các enzyme khác nhau. Bên cạnh đó, khi thêm vào quá trình thủy phân enzyme Glucosidase thì đường khử và glucose ở các mẫu đều tăng đáng kể. Để đánh giá hiệu quả quá trình thủy phân của các loại enzyme trên cần xem xét đến hiệu quả kinh tế của quá trình thủy phân mà trước tiên là xem xét chi phí thủy phân tính trên 1 gam ethanol tạo ra. Bảng 4.6: Chi phí thủy phân của các loại enzyme khác nhau Chủng loại enzyme Chi Thể tích Chi phí Ethanol (g/L) Chi phí/1 enzyme (đồng) phí/1g mL (mL) ethanol (đồng) (đồng) Cellulase* 1.200 8,72 10.464 5,08±0,07f 2.060e Viscozyme 4.000 4,75 19.000 8,45±0,09e 2.249c Celluclast 1.5L 35.000 0,65 22.750 9,08±0,05d 2.506a Glucosidase 6.800 0,83 5.644 Cellulase* + 8,72 + 0,83 16.108 10,06±0,13c 1.601f Glucosidase Viscozyme + 4,75 + 0,83 24.644 11,67±0,15b 2.112d Glucosidase Celluclast 1.5L + 0,65 + 0,83 28.394 12,02±0,12a 2.362b Glucosidase Chi phí/1 mL enzyme và chi phí/1 g ethanol chỉ mang tính chất tham khảo vì được tính toán sơ bộ ở điều kiện phòng thí nghiệm 20
24. Hàm lượng ethanol tính theo g/L dịch lên men do enzyme cellulase thu nhận được tạo ra đều thấp hơn so với 2 loại enzyme thương mại thậm chí là khi có sự kết hợp với Glucosidase. Tuy nhiên, khi xem xét chi phí trên 1 gam ethanol tạo ra thì việc sử dụng enzyme cellulase thu nhận được (Cellulase*) cho thấy hiệu quả tương đương hoặc hơn so với enzyme thương mại. Do đó, enzyme cellulase* được chọn lựa kết hợp với Glucosidase để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 4.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân Trong điều kiện cơ chất nhất định, hiệu quả thủy phân của enzyme cellulase chỉ tăng tuyến tính trong một giới hạn tỷ lệ enzyme nhất định (5÷25 FPU/g và 5÷30 CBU/g). Hầu như tất cả các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm thường sử dụng với tỷ lệ từ 7 ÷ 33 FPU/g cơ chất và nó phụ thuộc vào loại và nồng độ cơ chất (Sun and Cheng, 2002). Qua đó, 25 FPU/g (đối với cellulase*) và 30 CBU/g (đối với glucosidase) là nồng độ được lựa chọn để thủy phân vỏ cà phê trong toàn bộ các thí nghiệm về sau. 4.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình thủy phân Khi tăng nhiệt độ thủy phân, tốc độ phản ứng ban đầu tăng và tăng rõ rệt trong khoảng nhiệt độ từ 35÷50oC. Thủy phân ở nhiệt độ 50oC cho hàm lượng đường khử cao nhất đạt 26,1 g/L. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thủy phân lên 50÷60oC thì tốc độ phản ứng đầu giảm đồng nghĩa với việc giảm hàm lượng đường khử tạo thành sau thủy phân và giảm một cách rõ rệt ở nhiệt độ 60oC. Dù enzyme có khả năng phản ứng ở nhiệt độ cao thì hiệu suất thủy phân vẫn bị chi phối bởi thời gian phản ứng, vì nồng độ glucose và cellobiose tích lũy tăng dần theo thời gian phản ứng. Đường khử tạo thành trong phản ứng thủy phân enzyme tăng mạnh trong thời than đầu thủy phân từ 1÷4 ngày, từ ngày 5 đến ngày thứ 7 đường khử tăng nhưng không đáng kể và đạt cực đại 26,95 g/L ở ngày thứ 6. Kết quả khảo sát cho thấy nhiệt độ hoạt động tốt nhất của enzyme Cellulase* + Glucosidase là 50oC và thời gian thủy phân là 4 ngày. 4.4.4 Tối ưu hóa các thông số quá trình thủy phân bởi enzyme cellulase thu nhận từ nấm mốc T. asperellum QT5 kết hợp với glucosidase Mô hình được thực hiện theo phương trình hồi quy như sau: 푛 푛 2 푛−1 푛 푌 = 0 + ∑푖=1 푖 푖 + ∑푖=1 푖푖 푖 + ∑푖=1 ∑푗=2 푖푗 푖 푗 21
25. Bảng 4.7: Mức thay đổi của các nhân tố tối ưu Các mức độ thay đổi Các nhân tố tối ưu Ký hiệu -1 0 1 Nồng độ enzyme (FPU/g) X1 20 25 30 Nhiệt độ thủy phân (oC) X2 45 50 55 Thời gian thủy phân (giờ) X3 72 96 120 Phương trình hồi quy thu nhận được như sau: 2 2 2 Y= 27,18+0,79X2–2,64X1 –2,1X2 –1,13X3 +0,78X2X3 Phương trình hồi quy có p 0,8) và hệ số đánh giá khả năng dự đoán của mô hình Q2 là 0,787 (>0,5) chứng tỏ mô hình đạt độ tin cậy cao. Bảng 4.8: Các thông số tối ưu của mô hình quy hoạch thực nghiệm Nhân tố X1 X2 X3 Y Giá trị dự đoán tối ưu 24,77 51,19 92,3 27,35 Giá trị thực nghiệm 26,22±0,39 Kết quả tối ưu đạt được từ mô hình chọn lựa ban đầu là: Hàm lượng đường khử đạt 27,35 g/L ở điều kiện nồng độ enzyme là 24,77 FPU/g, nhiệt độ thủy phân 51,19oC và thời gian thủy phân là 92,3 giờ. 4.4.5 Nghiên cứu quá trình khử độc dịch thủy phân Quá trình tiền xử lý bằng acid-kiềm-vi sóng đã tạo ra một số chất có khả năng gây độc cho nấm men đó là HMF và Furfural với hàm lượng 2,11 g/L HMF và 3,37 g/L furfural. Phương pháp để loại bỏ một số chất này là sử dụng phương pháp vôi hóa được phát triển bởi Millati (Millati et al., 2002) kết hợp với lọc than hoạt tính. Trọng lượng kết tủa (mg) pH 11 0.5 10 0.4 9 8 0.3 pH 7 0.2 6 0.1 5 4 0 (g) tủa Khốikết lượng 0 1 2 3 4 5 6 Thể tích Ca(OH)2 (mL) Hình 4.7: Ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 đến sự tạo thành kết tủa 22
26. Ở pH 10,2, lượng kết tủa hình thành đạt cực đại và có xu hướng giảm dần khi tăng pH. Tuy nhiên có thể nhận thấy rằng các gốc sulphate được kết tủa nhiều nhất ở giá trị pH = 9,8. 4.5 Nghiên cứu quá trình lên men dịch thủy phân vỏ quả cà phê 4.5.1 Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu bổ sung vào quá trình lên men Khi tăng mật độ tế bào nấm men từ 3x106 đến 5x108 cfu/mL thì hàm lượng ethanol thu được cũng tăng theo. Tuy nhiên mức tăng không đáng kể. Nếu tiếp tục tăng lượng nấm men nữa thì hàm lượng ethanol có xu hướng giảm. Lý do là với mật độ tế bào nấm men lớn, nấm men sẽ sử dụng đường tạo thành sau quá trình thủy phân để tăng sinh khối, do đó hàm lượng ethanol thu được sẽ không tăng nữa mà bị giảm theo thời gian. Theo đó, mật độ tế bào nấm men bổ sung là 5x107÷3x108 cfu/mL được chọn lựa cho các thí nghiệm sau này. 4.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu được Nấm men S. cereviciae có khả năng chịu nhiệt và lên men ở 42oC. Tuy nhiên, theo nghiên cứu này nấm men có thể lên men tốt ở nhiệt độ 30÷40oC. Nếu nhiệt độ tăng đến 45oC thì hiệu suất lên men giảm mạnh và ở nhiệt độ 50oC nấm men gần như không sinh trưởng và lên men. 12 10.1 9.91 10 9.16 8.11 8 9.05 8.57 8.66 6 7.11 5.02 24 giờ 6.22 5.79 6.02 48 giờ 4 4.44 4.25 72 giờ 3.71 4.12 1.8 Hàm lượng ethanol (g/L) ethanol lượng Hàm 2 3.12 0 25 30 35 40 45 50 Nhiệt độ lên men (độ C) Hình 4.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu được Mặc dù nhiệt độ 35oC được chứng minh là tốt nhất cho quá trình lên men nhưng khi xét đến các yếu tố khác như chi phí, thiết bị thì nhiệt độ lên men được lựa chọn là 30oC. 23
27. 4.5.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu được Kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng ethanol tạo ra trong quá trình lên men tăng dần theo thời gian lên men và đạt cực đại tại 72 giờ lên men với hiệu suất lên men đạt 72,55%. Sau thời gian 72 giờ hàm lượng ethanol không tăng nữa mà có xu hướng giảm nhẹ. 13 12 11.28 11.13 10.74 10.95 11 10 9 10.05 9.46 8 7.11 9.02 9.25 Viscozyme 7 Cellulase* 6 6.71 Hàm ethanol(g/L) Hàm lượng 5 4 24 48 72 96 120 Thời gian lên men (giờ) Hình 4.9: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu được Sau 72 giờ lên men, hiệu suất lên men đạt 75,96% có nghĩa là 75,96% lượng glucose được chuyển hóa thành ethanol nhờ vai trò của nấm men. Kết quả phân tích Hình 4.9, cho thấy điều kiện lên men ở 30oC, với mật độ tế bào ban đầu 3x108 cfu/mL và lên men trong 72 giờ là phù hợp khi hàm lượng ethanol và hiệu suất lên men đạt cao nhất. 4.5.4 Ảnh hưởng của phương pháp lên men đến hàm lượng ethanol thu được Bảng 4.9: So sánh hiệu quả lên men SHF, SSF và SHF+SSF Thời gian Thời gian Nhiệt độ thủy Ethanol (g/L) thủy phân lên men phân/lên men SHF SSF SHF+SSF (ngày) (ngày) (oC) 1 1 50/37 5,34±0,18a 4,76±0,14a 2 2 50/37 9,02±0,1a 8,13±0,14b 8,96±0,09a 3 3 50/37 11,28±0,19a 10,09±0,08b 9,43±0,16c 4 4 50/37 11,38±0,21a 10,79±0,15b 10,08±0,13c 5 5 50/37 10,29±0,13ab 10,72±0,11a 10,23±0,16b 6 6 50/37 7,1±0,12b 10,44±0,13a 10,26±0,06a Các giá trị cùng một hàng có ký tự in thường khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 24
28. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nếu không xét về mặt thời gian thì phương pháp lên men SHF thu được hàm lượng ethanol cao hơn lên men SSF và SHF+SSF. Cụ thể tại thời điểm 3 ngày, ethanol thu được từ lên men SHF là 11,28 g/L, cao hơn 10,5% và 16,4% so với lên men SSF và SHF+SSF. Tuy nhiên khi xem xét về mặt năng lượng và chi phí thực hiện thì phương pháp SHF tốn kém hơn so với 2 phương pháp còn lại. Bên cạnh đó, lên men SSF và SHF+SSF cho kết quả như nhau nhưng nếu áp dụng ở quy mô công nghiệp thì lên men SHF+SSF cho phép tăng nồng độ cơ chất khô lên đáng kể, bằng việc thực hiện thủy phân trước bởi enzyme để làm loãng dịch lên men, sau đó tiến hành bổ sung vỏ cà phê và lên men SSF. Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Phương pháp tiền xử lý kết hợp giữa acid-kiềm-vi sóng cho hiệu quả xử lý tốt nhất. Phương pháp kết hợp này loại bỏ được 71,4% hemicellulose và 79,2% lignin ra khỏi nguyên liệu nhưng vẫn giữ lại được 69,5% cellulose so với ban đầu. Phương pháp khử caffeine và polyphenol tốt nhất đó là sử dụng nước nóng 90oC để trích ly trong 120 phút. Quá trình khử caffeine và polyphenol được thực hiện sau quá trình tiền xử lý sẽ giúp tiết kiệm một lượng nước nhất định. Kết quả nghiên cứu đã đã tuyển chọn được một chủng nấm mốc Trichoderma asperellum (QT5), phân lập được từ quả cà phê hỏng. Enzyme cellulase thu nhận được từ chủng nấm này sau khi tinh sạch sơ bộ hoạt tính đạt 21,72 CMCase/mL và 43 FPU/mL. Enzyme cellulase* được ứng dụng vào thủy phân và lên men vỏ quả cà phê mang lại hiệu quả nhất định. Mặc dù hàm lượng đường khử và đường glucose tạo ra khi sử dụng chế phẩm enzyme cellulase* (kết hợp với Glucosidase) là thấp hơn so với khi sử dụng enzyme thương mại (Viscozyme + Glucosidase) nhưng hàm lượng ethanol tạo thành chỉ thấp hơn 13,8%. Kết quả nghiên cứu đã đưa ra được phương pháp để loại trừ các chất gây độc cho nấm men. Đó là sử dụng Ca(OH)2 để điều chỉnh độ pH của dịch thủy phân về 9,8. Trong điều kiện này, nó sẽ giúp kết tủa nhiều nhất Furfural và HMF. Sau 6 ngày thủy phân và lên men, lên men SHF mang lại hiệu quả cao hơn so với SSF hoặc SHF+SSF khi hàm lượng ethanol tạo ra đạt 11,28 g/L. Hàm lượng này cao hơn so với lên men SSF và SHF+SSF tương ứng là 7,4% và 9%. 25
29. 5.2 Đề xuất Để nâng cao hiệu quả của quá trình tiền xử lý cũng như quá trình thủy phân, nên nghiên cứu các giải pháp thu hồi lượng đường khử từ dịch tiền xử lý để bổ sung ngược vào quá trình lên men hoặc là lên men riêng. Để cải thiện hiệu quả của quá trình thủy phân cellulose bởi enzyme cellulase, trong các nghiên cứu tiếp theo nên đi sâu tìm hiểu cơ chế quá trình hấp thụ của enzyme cellulase lên bề mặt phân tử cellulose. Có thể tăng quá trình hấp thụ này bằng cách bổ sung một số chất hoạt động bề mặt như: Pluronic F68, Polyoxyethyleneglycol, Emulgen 147, Neopelex F-25 hay Cationic Q-86W. Để giảm hơn nữa chi phí cho các quá trình thủy phân và quá trình lên men, trong thời gian tới nên mở rộng nghiên cứu để tìm ra những phương pháp nhằm sử dụng hiệu quả một số enzyme cố định và nấm men cố định khác. 26