Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa methionine sulfoxide reductase trong điều kiện stress mặn, hạn ở cây Arabidopsis và đậu..

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa methionine sulfoxide reductase trong điều kiện stress mặn, hạn ở cây Arabidopsis và đậu..

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM CHU ĐỨC HÀ NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HÓA METHIONINE SULFOXIDE REDUCTASE TRONG ĐIỀU KIỆN STRESS MẶN, HẠN Ở CÂY ARABIDOPSIS VÀ ĐẬU TƯƠNG Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI – 2018
2. Công trình hoàn thành tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Người hướng dẫn: 1. TS. Lê Tiến Dũng 2. TS. Phạm Thị Lý Thu Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp viện họp tại: Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam Vào ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam
3. 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Đ ây ra ữ á ộng ến r á r a ữ ộ do a a ộ d ng ch a ôx y ử ho t ộng (ROS) ế á ộ a á yế . T á r r ế á Tr enzyme methionine sulfoxide reductase (MSR) methionine-S- f x e re a e (MS A) methionine-R-sulfoxide reductase (MSRB), ế ế ch ă ử á c methionine (Met) bị ôx a r l i Met. Đế ay, enzyme MS c a ế ế ch ng chị á yế r ây r ng. N v h enzyme MSR é a tiếp c n v ế ch ng chịu th c v t, t ì ra ững gen ô á n t o gi ng nhằ â a ch ng chịu ây r . Đ gi i quyế á â ỏ ặ ra ú ô ế r ây ô ì Arabidopsis thaliana (Glycine max) v á “Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa methionine sulfoxide reductase trong điều kiện stress mặn, hạn ở cây Arabidopsis và đậu tương” 2. Mục tiêu của uận án M a lu á ằ xe xé a rò a enzyme methionine sulfox e re a e a ế ă á u ki n b t l i th c v ng thờ ũ ì u v ng cầ c methionine sulfoxide reductase sửa chữa trong tế C th a :  Xe xé ì r e e e r ây ô ì Arabidopsis thaliana.  Xá ị â r e e e r  Xá ị â enzyme methionine sulfoxide reductase u  Đá á ộ bi u hi a á e a enzyme methionine sulfoxide reductase á ng v ặn. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Kết qu c a lu á á ữ li u khoa h c mộ á th ng v a rò a r e e e A. thaliana á u v ế á ộng c a yếu t b t l ến th c v ô a á rì ôx a e e S xá ị â enzyme methionine sulfoxide reductase ữ u
4. 2 biết quan tr ng v a rò a h enzyme sửa chữa trong ch ng chị t l i. Vi ì ế xá ị e a e zy e MS cung c p ngu n v t li á rị á u ch ă e Kết qu xá ị á e a r e ethionine e zy e methionine f x e re a e á ng v u ki t l ũ m ra u ng d ằm c i thi ă ờ ă ng chịu c a ây r ng. 4. Những đóng góp mới của luận án Kết qu c a lu á ầ th ng Vi Na r ế gi r e e onine ây ô ì A. thaliana u Cá e a r e e onine á r u ki t l xá ịnh trong lu á y cung c á ẫn li u quan tr ng v protein mẫn c m v i s ôx a e onine th c v t. Kế ì ế xá ị â e a e zy e MS A e e ũ ầ Vi Na r ế gi i. Kết h p v ộ â r e zy e MS ô r , nội dung c a lu á y rõ ă a e zy e MS u r c v V ì ra ộ e ộ bi u hi á ng v u ki t l ra ô á n t o gi ng nhằ â a ng chịu ây r ng. . ố cục của uận án á rì y r 106 ra ( ô ầ T a P ): M ầ (3 ra ) C : T a a a á (34 ra ) C : V ộ á (13 ra ) C : Kế (54 ra ) Kế ị (1 ra ) T a ử 186 r 8 T ế V 178 T ế A á 15 , 29 ì , 7 , 4 ô rì ô . CHƯƠNG 1 T NG UAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ HOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI á a á T ế V T ế A 4 ộ a a : a ô r ờ ế ờ ; Va rò a e zy e methionine sulfoxide reductase á rì ôx a methionine th c v t; Methionine r e e e th c v t; Ti ă ng d ng c a enzyme methionine sulfoxide reductase trong ch n t o gi ng nhằ â a ng chịu ây r ng.
5. 3 Tron ũy c a một s d ng ch a ôx y ử ho ộng (ROS) á a ây ra ữ ay r rú a â ử r a ra r ế [127]. Đ á á â ôx a á r r ế a a a á r e á nhau e zy e y a OS r e r e ửa ữa â ử [77]. Tr ửa ữa ôx a r e á á a a r ú a â [47, 80, 83]. C 68 â ử ị ôx a r ế r e , ây xe ị OS á ộ [138] S ôx a á methionine (Met) ộ amino acid quan tr ng a ị ị r y e e yế ế ò ú â ử ô ị ế r á ộ a ôx a. Mộ s â ỏ ặ ra a r e ẫ ôx a Me r ế Đặ a ữ r e y ì? Gen a á r e y á ra a r ? Tr ộ a á ôx a Me Me O ửa ữa a rò a e zy e methionine sulfoxide reductase (MSR) MS A MS [145]. Đế ay, h e a MS á nhi r c v r A. thaliana [145] một s ây r ng quan tr ng, bao g úa [65], a [41, 41] ô [186]. Gầ ây u Trung Qu ũ xá ị c h gen a MS r i u d i [159]. Tr Le ộng s ũ á á 5 gen a enzyme MSRB r [99] T y ô e zy e MS A ế ay ẫ a . V y â ỏ ặ ra a gen a enzyme MSRA r ặ a á gen y ì ế â rộng h gen y ì ử MetO c a h enzyme GmMSR (bao g m c MS A MS ) ế N ữ y rì y r a , y ầ ế a e zy e MS ửa ữa a MS á M P r Đ ì rõ M P ữ â r ế xe xé r M P A. thaliana. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ HƯƠNG HÁ NGHIÊN CỨU 2.1. Vật iệu nghiên c u Ge e r e e a ây ô ì á ầ A. thaliana, ò á Col-0 [91]. Ge e r e e a ô ì 'Williams 82' [149].
6. 4 H A. thaliana á C - Tr â K a y ữ IK N - N p. H A. thaliana y e á e At3G55240 Tr â y IK N - N [75]. H ô ì 'W a 8 ' ữ t V D r y Nô . 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên c u Cá ộ ă ế ă 2017. P ò C â ử - P ò r a ô ế - V D r y ô - P Vă Đ T H Nộ V Na . ộ ô S â ử - V D r y ô - P Vă Đ T H Nộ V Na . P ò P ẫ r y - Tr â K a T y ữ IK N, N . 2. . hư ng pháp nghiên c u a hương ph p t m i m gen mã hóa protein giàu methionine ở Arabidopsis Pr e e a A. thaliana [91] ử ộ á M P ằ ô rì a a â ử r e a a Me > 6 %. b hương ph p t m i m gen mã hóa protein giàu methionine ở đậu tương Pr e e a [145] ử ộ á M P ằ ô rì a a â ử r e a a Me > 6 %. c hương ph p phân oại chức n ng của gen mã hóa protein giàu methionine ở Arabidopsis và đậu tương Da á ị a a á gen a M P A. thaliana ử r y ô MAPMAN [168]. d hương ph p phân t ch đặc t nh của protein giàu methionine ở Arabidopsis và đậu tương T ầ a a a M P xá ị ằ ô DIT [68] K â ử MRP xá ị r NC I. Vị r â ộ a M P r ế á ằ C r P [49, 50], WoLF PSORT [73], CELLO [184] a 2GO Basic [35].
7. 5 e hương ph p c đ nh y u t điều h a cis- trên v ng promoter của gen mã hóa ở Arabidopsis Trì e e a rì 1000 e e r r er â ằ BioEDIT [68] ì ế x a yế á ABA (Abscisic acid responsive element, ABRE) [84, 133], yế ế M (MYB recognition, MYBR) yế ế M C (MYC recognition, MYCR) [173]. hương ph p phân t ch mức đ biểu hiện của gen mã hóa protein giàu methionine ở Arabidopsis Bi u hi n c a gen a M P A. thaliana â r ờ a r ữ r array GDS416 [26] ữ NA- e TraVA [86] tr a ữ r array xử n [123] ặ [122]. g hương ph p phân t ch mức đ biểu hiện của gen mã hóa protein giàu methionine ở đậu tương M ộ i u hi n c a gen a M P a á a r ữ a Đ M r [104] ữ r array xử [96]. h hương ph p c đ nh gen mã hóa en yme A ở đậu tương A G A MS A A. thaliana [145] c sử d rì tham chiế ì ế r r e e a [149] P y z e [60]. Kế ì ế r Pfam. M ị a gen ị a r e ị a gen ị r â r genome r y r P y z e [60] NC I [149] a á ì ế . i hương ph p phân t ch hiện tư ng gen ặp ở h gen mã hóa en yme A ở đậu tương H g gen ặ xá ị ằ P ant Genome Duplication Database [100]. M ộ a ặ gen ặ xá ị ô C a X [92] Trị ay ế á a (Ka) rị ay ế a (K ) xá ị ằ DNA [105]. hương ph p phân t ch đặc t nh protein của h A ở đậu tương K â ử xá ị r NCBI [149]. Tr â ử á rị ( I e e r ) á r x a y [58]. Vị r rú ộ a MS A á ằ Tar e P [49-51]. Că rì ế ằ C a X [169] Cây â xây e á Ne r- ằ M GA [89]. hương ph p dự đo n y u t điều h a cis- trên v ng promoter của gen mã hóa ở đậu tương Cá C ì ế r rì 1000 bp r r er a
8. 6 gen a enzyme MS ằ PlantCARE [101]. hương ph p phân t ch mức đ biểu hiện của gen mã hóa en yme ở đậu tương b ng thư viện d iệu trực tuy n M ộ a gen a MS â r ờ a r ữ ra r e ô [104] tr a r ữ r array xử [96], ữ RNA-seq xử ặ [24]. m hương ph p thi t m i cho ph n ứng -PCR Cá ử T-PC ( a a e rea e - PC ) ế ế ằ Pr er 3 [147]. M ặ xá ị ô a ă rì r e e a 'Williams 82' [149]. Tr , gen a ế ử ế Fbox ô r r ây [97]. a hương ph p đ nh gi h nh th i cây Arabidopsis chuyển gen H t gi ng A. thaliana chuy n gen a á gen At3G55240 [75] i ch ng Col-0 e r a e r a ô r ờ ½ MS (Murashige-S ) ặ ô á y r y e [75], trong u ki n c a ò ô y ô ế a g chu k 16 giờ á /8 ờ t i, ờ ộ chiế á μ -2.s-1, nhi ộ ± oC [36]. b hương ph p m u Arabidopsis trong điều iện b t i Cây A. thaliana chuy n gen a á gen At3G55240 xử ặ r a e r ch a ô r ờ ½ MS sung NaCl n ộ 175 mM. T , ây y i ũ y a ô r ờ ½ MS sung CdCl2 n ộ 7 µM Tr , cây A. thaliana chuy n gen a á c gen At3G55240 xử paraquat e ô r r ây [182]. c hương ph p m u đậu tương trong điều iện b t i P á xử ẫ r e á ô r r ây [98]. Cây y ặt r y r ô u ki ò r ời gian 0 - 2 - ờ Cây r r y a r ờ ờ . P á xử ẫ r ặ ằ á xử ây y trong ị NaC 250 mM t u ki ò r ời gian 0 - 2 - ờ Cây r r y a r ờ ờ . P á xử ẫ r A A
9. 7 ằ á xử cây y trong ị A A μM u ki ò r ời gian 0 - 2 - ờ Cây r r y a r ờ ờ . d hương ph p t ch chi t NA t ng s và t ng h p c NA t m u đậu tương Tá ế NA ế e á ử T Iz (T er er S e f H a K ). NA xử ộ A T r DNA e I (T er er S e f H a K ). NA xử DNA e I ử DNA ằ ộ e erTra A e PC T (T y N ) Cá a á ế ô r r ây [98]. e hương ph p đ nh ư ng - và phân t ch th ng ê s iệu P ị T-PC e á ử áy S ra a e MX P (A e Te e H a K ) ộ T er r S PC M x (T y N ) ô r r ây [98]. P á gen xử e á Δ- CT ô r r ây [98]. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .1. Xác định và phân tích protein giàu methionine ở Arabidopsis ì k , x và d e ã ó r e à e onine ở Arabidopsis T ng s â ử MRP xá ịnh. T t c M P ì ô gen a ô â ử y ịnh b i gen nằm trong a c s p xếp. Cá gen AtMRP ân b r rá r m s c th c a Arabidopsis, chỉ gen nằ r y Đ ì â AtMRP, ch ă a á gen y xá ị r tham chiếu TAIR10. â ại ch ă ủ r e à e onine ở Arabidopsis P â h dữ li ầ y á gen AtMRP Arabidopsis a a á rì n ra trong tế Ha gen AtMRP c xá ị a ế òa Tr , một s gen AtMRP a â òa á rì u hi n c a gen. Gen At4G34590 a e e z er Pr e y, ch a 6,33% Met, gầ ây c xá ị a ế òa r ng c a ộ r ô a nh ng c a a x r A. thaliana [180]. Một AtMRP á At3G23050 a r Indole-3-a e a ă ì u hi n c a á gen c m ng v i auxin. Tr , gen At3G23050 c a a á rì a ế a x ế ng quang [148] ịa át tri n bộ r [137] á .
10. 8 nh , một s gen a M P Ara ũ â i theo ch ă ỏ á ế r e (12 gen AtMRP - 11%), dẫn truy u (6 gen AtMRP - 5%), v n chuy n kim lo i (6 gen AtMRP - 5%), xử NA ( gen AtMRP - 4 ) rì ế ( gen AtMRP - 3%), ki á i (2 gen AtMRP - 2%), s á r á u ki n b t l gen AtMRP - ng 1%. Mặ á , 56 gen AtMRP, chiếm tỷ l 50%, a ô t ch ă th M ời b n trong a một s h r e ặ . Đây xe ột ngu y r t ti ă xá ịnh ch ă a ú r u tiếp theo. â í ặ í ản củ r e à e ionine ở Arabidopsis Lầ yếu t A M M C xá ị r r er a á gen a M P A. thaliana. T ng s 65 CRE â r r er a 121 gen AtMRP i 0,54 CRE r gen a M P S ặt c a A r r er a AtMRP ch ng tỏ gen a ế ờ u ph thuộ A A trong khi s xu t hi n c a M M C y gen á ng v u ki n b t l n, mặn [173]. S â á y ặc c a C y r r er a phần l á gen a M P y ú á ng v u ki n b t l ô a ờng ph thuộc (hoặ ô thuộ ) A A Mộ ặ m quan tr á a â ị r rú a á â tử AtMRP trong tế P â cho th y, 21 AtMRP c d á â l c l p bằ ô W PSO T / ặ C r P r â ử AtMRP xá ịnh nằm ty th ô a W PSO T / ặc CELLO. K ằ ầ m m Blast2GO ũ y 9 â ử AtMRP r y . 4 â í ộ bi u hi e ã ó MR r Ar d r ều ki và ều ki n bất lợi D a r á ịnh danh, m ộ bi u hi n c a 49 gen AtMRP, chiếm 40,5 % t ng s gen c ì y xá ịnh a - á â a c a Ara r u ki ờng [26]. Trong s á gen ì c, 6 AtMRP xá ịnh bi u hi n m nh ị r r , At3G05220 a r e a ế á rì n chuy n kim lo i, At4G35070 a e zy e S-r ea e a ế á rì ế r e At2G46600 a ế ờng dẫn truy 2 gen a rõ ă th , At1G67350, At5G39570 gen At4G32470 a e zy e y r e ubiquinol x a e ũ ộ bi u hi n m nh á â a a ây A. thaliana r u ki ờng. Tr ữ TraVa, hầu hết AtMRP bi u
11. 9 hi n m nh t 1 bộ ph r ây r u ki ờng, ặc bi a a a r ị r á gen AtMRP x u hi . Kho ng 50 % gen a M P ộ ay a r u ki n mặn [122] / ặ u ki n h n [123] C r u ki xử mặn, 11 7 gen ộ bi u hi ầ ă t 2 lầ Tr xử gen lầ ỉ ra ộ bi u hi a p. Sá gen á ă gen m bi u hi ần trong c u ki Đá ú , hầu hết gen u hi á ng thời v i c u ki n b t l a á r e ặc chỉ trong th c v Tr á gen ì , At3G59900 ă ờ u hi 10,7 lần r u ki n h m bi u hi n -2,6 lần r u ki n mặn ( 3.4). Bảng 3.4. Gen AtMRP có m c độ phiên mã đáp ng trong điều kiện hạn và m n M c độ thay M c độ thay Met Ch giải ch c Tên gen đ i trong đ i trong điều # (%) năng gen điều kiện hạn kiện m n 1 At1G32560 6,02 135,3 3,3 AtLEA4-1 2 At1G33860 8,55 2,4 2,2 C a rõ ă 3 At3G55240 6,12 -60,3 -26,9 C a rõ ă 4 At3G59900 6,20 10,7 -2,6 C a rõ ă 5 At3G62090 6,38 64,6 2,3 bHLH 6 At4G12334 6,25 -9,8 -3,0 Cytochrome P450 7 At4G33467 8,91 337,5 6,2 C a rõ ă 8 At4G34590 6,33 8,3 3,3 bZIP11 9 At5G42325 6,03 2,7 2,4 IIS 10 At5G67390 7,43 -4,2 -4,1 C a rõ ă hú th ch: àu đỏ thể hiện gen có đ p ứng t ng trong hi màu anh diễn t gen có đ p ứng gi m At4G33467 gen u hi ă nh nh r u ki n h á m ộ ay i g ầ ( 3.4). Một gen á At1G32560 a ộ r Late embryogensis abundant IV ă ờng bi u hi n g p kho ng 135 lầ r u ki n h Tr á r e y ỉ ra a ế ế m ng v i r á m A. thaliana [37, 125]. Gen At3G62090 a ộ a H H ặc tr i c rú n xo n- ò -xo m ộ bi u hi ă ờng g lầ r xử mặ N â H H ầ ây ũ a rò a r ng
12. 10 trong ki á á ô r ờ ặc bi n ng v á á r a y ầ [132]. N c l i, At3G55240 bị ì u hi n m nh nh ng kho ng 60 ần r u ki n h ặ ( 3.4) Mặ gen y ế ay ẫ a rõ ă y r , Ichika a ộ ( ) s bi u hi á c c a gen y ây ra ng ' úa' r ây A. thaliana [75]. ộ ng củ â Ar d e bi u hi e A 4 v ề k ấ ợ D a r á ết qu â , At3G55240, bị ì u hi n m nh nh r u ki n h ặ a gen c hi n nhữ u tiếp theo. Tr ờ , ây y gen á At3G5524 ( C1) á xa á t so v i ch ng Col-0 r r [75]. Hình .8. Đánh giá khả năng đáp ng của ng cây chuyển gen và đối ch ng khi ý m n c cây chuyển gen biểu hiện u mức At hiệu à và cây Arabidopsis o - đ i chứng hiệu à đư c mặn trên m i trư ng thạch ư ng cây ch t tr ng đư c uan s t đ n ngày sau . Dò y e C xử r ô r ờ sung 175 mM NaCl. Kết qu cho th y ây i ch ò RBC u hi á ng nh y c r u ki n xử NaCl cao. T y ế y 8, s ây y gen chết tr ă a i ch ng (Hì 3.8).
13. 11 Hình . . Đánh giá khả năng đáp ng của ng cây chuyển gen và đối ch ng khi ý C C 2 c cây chuyển gen biểu hiện u mức At hiệu à và cây Arabidopsis o - đ i chứng hiệu à đư c v i d trên m i trư ng thạch ư ng cây ch t đư c uan s t đ n ngày sau . K xử CdCl2 7 µM á a ò y gen b ầ ng úa T y ộ ẫ a ây C ộ ây ế , nhan (Hì 3.9). Do v y, d n th y rằng vi c bi u hi á c At3G55240 r A. thaliana ũ a ă ộ nh y c m c a tế i CdCl2 n ộ cao. Hình .10. Th nghiệm paraquat trên ng cây đối ch ng và ng cây chuyển gen RBC1 c cây chuyển gen biểu hiện u mức At hiệu à và cây Arabidopsis o - đ i chứng hiệu à đư c v i para uat ở c c n ng đ h c nhau trên gi ng c đ và h n ng m t màu của đư c uan s t sau gi .
14. 12 K xử ara a ă ờ a At3G55240 ũ ă nh y c m v ara a (Hì ) á y e ị m t di p l y a r a ờ xử ara a Kế ũ t t c á ộ sử d r ÷ µM (Hì ) N c l á i ch ng Col-0 bị m t di p l c m ộ ch ò C1. T i, vi c bi u hi á c gen At3G55240 r ây ô ì A. thaliana cho th y s a ă ộ nh y c m c a tế r u ki ặ ộc CdCl2 c di t cỏ ara a T á ây y e ế a C -0. .2. Xác định và phân tích protein giàu Methionine ở đậu tư ng ì k , x và d e ã ó r e à e onine ở D a r proteome c a [149], t ng s â ử MRP xá ịnh. T t c M P ì ô gen a ộ á ầy ô â ử a i gen nằ r a c s p xếp. Cá gen y â r rá r e e a , ô gen a M P ì y r ế . â ạ ă ủ e ã ó r e à e onine ở u T á gen a M P Arabidopsis, GmMRP a a hầu hế á rì n ra trong tế C á á rì y a á xử NA ế r e òa NA r y ẫ rì ế á r y r e y a gen a M P a rõ ă a ộ M P Me P â y ặ ra â ỏi rằng li á gen y a ến kh ă á ng v u ki n ngo i c nh ay ô ộ ửa r GmMRP a rõ ă r ế . Đây r ă ì a rò a ú a ế ă r á r ũ á . â í ộ ủ e ã ó r e à e onine ở u t T ữ ra r e a a et al. (2010), 49 gen GmMRP xá ị ô x ẫ ô a r ờ [104]. Cá gen GmMRP ò x 1 c a r ây r ờ . Tr á gen y, Glyma13g03910 a M P a rò a
15. 13 ế ẫ r y r ế ặ ộ r , ô â ỉ (SAM) ỏ (GP). Hai gen a r e y ặ ầ Glyma10g29710 Glyma20g37600 x ặ SAM Gầ ây, 1 gen a r e â ử G M P y r Atriplex canescens a rò r á á yế á [158]. Gen Glyma18g44300 a r e y ặ ô r SAM y rằ y ộ r á rì á r a ô r a ầ a e ũ ầ ế ũy ỉ ô a a r e y Glyma18g44300. Tr á gen ặ , Glyma15g05510 ặ a r r , ộ r e G y a A G 7 xá ị á á á r A. thaliana [120] Dữ y y gen Glyma15g05510 a ế á rì a ô a á rì á á á . Xe xé a gen GmMRP r ữ r array xử [96], 11 gen bị ì ộ bi u hi n trong khi 12 gen ă ờng bi u hi n ô á V r f a Tr ô á a 2 cho th y, gen xá ị ă ờng bi u hi n trong khi chỉ gen bị gi m bi u hi n. Trong s xá ị c t ng s 13 gen a M P á ng v u ki n h n á r a V ( 3.7). Trong s 13 gen ô B ng 3.7, gen Glyma04g37040 a r e á a ă ờng bi u hi n m nh nh t ô á - f -fold lầ t á V N c l i, gen Glyma02g10620 a r e c 98 amino acid bị ì ầ t 44- - fold á V ( 3.7) Mộ r ờ á gen Glyma19g43580 ị a r V ă ờ a r T Glyma19g43580 At5G28640 r A. thaliana, gen y a ế á rì â ằ ờ ì ế a a á rì a ế ô á [114, 115] G yế ặ ra Glyma19g43580 ă ờ r ế á ũy ờ a ế ú á rì é ò ờ . Gen Glyma19g43580 á a ế á rì r . Những kết qu y ặt ra một s â ỏi v ch ă a rò á gen GmMRP a a ằ á ng l i v i u ki n h n ô á r á a á a
16. 14 Bảng .7. Gen mã hóa GmMR có m c độ biểu hiện đáp ng với điều kiện hạn ở á V6 và R2 Điều kiện hạn # Mã gen Met L Định danh Lá V6 Lá R2 1 Glyma01g15910 8,08 100 C a rõ ă 3,63 4,96 2 Glyma01g15930 6,56 458 UNE10 -20,34 -3,87 3 Glyma02g10620 7,22 98 C a rõ ă -44,63 -4,04 4 Glyma03g32740 6,04 481 PIF1 -2,19 -2,02 5 Glyma04g37040 7,91 140 Calmodulin 38 15,03 40,08 6 Glyma06g39910 10,34 117 Calmodulin 3,12 4,14 7 Glyma10g30380 7,43 149 Calmodulin 5 7,50 5,27 8 Glyma15g05510 7,37 96 C a rõ ă 2,93 2,41 9 Glyma16g02510 7,26 125 Pr e á a x 2,05 4,63 10 Glyma19g43580 6,70 210 GIF, GIF1, AN3 -2,01 2,42 11 Glyma20g00780 6,69 285 Ch a homeodomain -3,03 -2,36 12 Glyma20g22280 6,59 426 PIF3 2,25 2,99 13 Glyma20g36730 7,89 153 Calmodulin 5 3,06 2,29 1 ư ng et (%),2 ch thư c phân t protein (aa),3 iệu microarray theo [96]. àu đỏ thể hiện mức đ phiên mã t ng trong hi màu anh minh h a cho mức đ phiên mã gi m. . . hân tích in silico họ gen mã hóa en yme MSR ở đậu tư ng X nh h e ã ó e z e MSRA ở e e â Kế xá ị 7 gen a e zy e MS A r e e S á MS A r ộ á , 5 gen AtMSRA xá ị r A. thaliana [145] trong khi 4 gen a MS A ị a r úa [65] N ữ ế y y gen a MS A a ộ a gen. â í ợ ặ e ủ e ã ó e z e MSRA ở u D a r â rì , 3 cặp gen lặp c xá ị trong h gen a MS A M ộ ng c ộ nucleotide c a á ặp gen lặp h gen GmMSRA á a t t 73,76 % (cặp gen ặ GmMSRA4/A7) ến 96,00 % (cặp gen GmMSRA2/A5) trong khi cặp gen GmMSRA1/A6 ộ r Mặ á ặp gen lặ y â r á m s c th á nhau trong genome c a Cặp gen lặp GmMSRA1/A6 rú r m s c th s GmMSRA2 r m s c th s 2 lặp v i GmMSRA5 r m s c th s 14, trong khi GmMSRA4/A7 lầ t nằm r m s c th s 8 8 Đ y y rằng t t c á gen lặp trong h gen MSRA u xu á hi ng lặ r á
17. 15 nhi m s c th á a ( e e a a ) Tr Le ộng s ( ) ũ xá ị c 2 cặp gen lặp trong h e a e zy MSRB nằ r á m s c th á a GmMSRB2/B5 GmMSRB3/B4 lầ â r m s c th s e e u [99]. Những kết qu y ị rằng hi ng lặ r á nhi m s c th á a th ế ch yếu gi â rộng c a h gen a e zy e MS ( a m c MS A MS ) H ữa, tỷ l Ka/Ks c a 3 cặp gen lặ u nhỏ ng tỏ á rì ch n l c t b o th c a h gen MSRA Đ u a r á rì ế a a h gen GmMSRA, s a á giữa á e e á gen GmMSRA ây ra ột biế m ô ị ì á c ch n l c [103]. â í ộ ặ í ả ủ e z e MSRA ở K â ử c a 7 G MS A t t (G MS A a i gen Glyma04g36480) ế a a ( ng v G MS A G MS A a ầ t b i Glyma02g46020 Glyma16g24130). Tr ng â ử c a á â ử GmMSRA biế (G MS A ) ến 87 Da (G MS A ) r I t t ế 8 78 á rị r ì t kho 77 N ế á rị á á ộ tan, vị r rú r ế a r e [14]. Giá rị pI c a G MS A -A -A -A -A7 t kho ÷ a a nhi u g a a a ì y á e zy e y á â ử x â trong tế ch G MS A G MS A á rị pI kho ng 8,7 g rằ r e y ă ịnh vị r a á a ( 3.10). ảng .10. Một số đ c tính c ản của họ en yme MSRA ở đậu tư ng ích Trọng ượng Điểm đẳng Vị trí Tên gen Mã định anh gen1 thước phân t điện cư tr GmMSRA1 Glyma02g05550 250 26,17 6,14 S* GmMSRA2 Glyma02g46020 266 29,87 8,78 C* GmMSRA3 Glyma04g36480 194 21,63 5,01 − GmMSRA4 Glyma08g42790 203 22,78 6,52 − GmMSRA5 Glyma14g02705 266 29,69 8,74 C* GmMSRA6 Glyma16g24130 250 28,11 6,39 S* GmMSRA7 Glyma18g11110 203 22,76 5,84 M hú th ch: : ào uan iên uan đ n vận chuyển n i bào; : Lục lạp; M: Ty thể. -: hưa c đ nh; *: K t qu dự đo n đạt đ tin cậy. D á ằ Tar e P y G MS A G MS A ă â á a a ế á rì n chuy n trong tế r
18. 16 G MS A G MS A ịnh vị l c l p. L a ũy OS ì ế G MS A G MS A5 a a á rì ử MetO l c l p khi tế ặp b t l i. Mặ á G MS A G MS A â r á a a ế á rì n chuy ì y ú ũ y ộ sửa chữa MetO t á ị r r ế Hình .1 . S đồ minh họa cây phân oại và cấu tr c vùng ảo thủ cho enzyme MSRA ở đậu tư ng và A. thaliana T ế e ây á xây ng d a r c sử d rì amino acid c a 7 G MS A r e a MS A A. thaliana [145]. Kết qu cho th y, h enzyme MSRA a (Hì ) C ộc n a G MS A -A -A -A -A7, r a G MS A GmMSRA6. Hầu hế á r á ờng chia sẻ một ặ a G MS A G MS A chung chi a a r â ử a ( ~ 87 Da) nhau (7,84 ~7,87). C u rú o th c a h e zy e G MS A ũ y s á t â e ây á (Hì 13). T t c á r u ch a g Cy a rò xú á Cy a rò á o. G c Cy xú á ằ r rì b o th F[G/A]AGCW[G/S][V/A]E. Kết qu y ũ r r A MS A -A -A -A A. thaliana [145] Tr o th c a a m GmMSRA1, - A A MS A ô xu t hi n c a g Cy xú á Cy á o. . . Đánh giá đ c tính của họ gen mã hóa en yme MSR ở đậu tư ng 3.4.1. D u t ề ò - ở vù r er ủa h e ã ó enzyme MSR ở Trong r ây gen a e zy e MS ì y [99] N y, h e zy e MS a m 7 gen a MS A
19. 17 gen a MS xá ị Đ ầ â ch c ă gen a rò òa a ú x a C r promoter c a h gen GmMSR ì ếm bằ ô PlantCARE [101]. Một s yếu t ộp TATA (TATA-box), hộp CAAT (CAAT- x) xá ị r r er a h gen GmMSR ( a GmMSRA GmMSRB). N ì C r r er a á gen GmMSR â i theo ch ă a m CRE a ến ph n á á u hi ặ ô a CRE á ng v i hormone hoặc . 4 ộ u hi n củ e ã ó MSR ở r ề k và ề k ạ ả ấ ợ Tr ờ [104], t ô a hầu hế á gen GmMSR u a á c, ngo i tr gen GmMSRA5 ô ô Phần l á gen GmMSR u r u hi / ặ ặ u hi n t mộ ô a ộ r ây. Trong s GmMSRB1 GmMSRB3 r bi u hi n á r GmMSRA3 t p trung nhi u n t sần. S bi u hi n m nh c a á gen GmMSR t t c mẫ ô a r ây cho th y rằ MS ô c t ng h c t á ị r y tham gia á rì ửa chữa sửa chữa â ử protein khi bị ôx a H ữa, s t ũy r t nhi u GmMSRA3, - -B3 á t sần, vị r c d á OS ây ra u ki n b t l (Hì 3.15). Hình .1 . M c độ biểu hiện của họ gen GmMSR trong điều kiện thường ở các mẫu mô c quan ở đậu tư ng. 84RH, 120RH: M u ng rễ thu sau và gi gieo hạt; A : phân sinh đỉnh ch i; F: Hoa; GP: Vỏ xanh; N: N t sần; L: L ; : ễ; : hóp rễ; i tr đư c minh h a b ng d i nhiệt đ màu nh m thể hiện c c u hư ng biểu hiện của m t gen t có biểu hiện đ n biểu hiện đặc th .
20. 18 Tr ữ r array xử [96] a gen a e zy e MS ay C , 5 gen ă ờ , trong khi 1 gen ị ì á a V / ặ K á a r V6, GmMSRB3 , GmMSRA3 ị r Mặ á á a 2, GmMSRA4, -A7, -B2 -B5 , GmMSRA3 ị ì (Hì 3.16A). Hình .16. M c độ biểu hiện của họ gen GmMSR trong điều kiện A hạn và m n ở các mẫu mô c quan ở đậu tư ng V6 và : u ở giai đoạn V6 và đư c x hạn; R-Na1hr, R-Na6hr và R-Na10hr: M u rễ thu ở th i điểm 1 gi , 6 gi và gi sau khi x mặn. Tr ữ NA- e xử ặ [24] á gen a MS ũ r GmMSRA5 ô ô (Hì 3.16B) Mộ gen GmMSR ay a r r ặ S á ô xử ặ , gen GmMSRA2 GmMSRB1 , trong khi 3 gen GmMSRA4, -B2 -B5 ă ờ r . 4 â í ộ ủ e ã ó MSR ở r ề k và ề k ạ ả ấ ợ Tr ờ , gen GmMSRB1 xá ị r 5 gen a e zy e MS . GmMSRB1 r ặ ô á á a (Hì 17). Gen GmMSRB1 ô u hi rõ r á a ò Tr e zy e MS c d á â a c l p [99]. Những kết qu y th y GmMSRB1 chỉ ặ r á gen y a a á rì ò ch ng l OS a l c l r ô á
21. 19 Tr GmMSRB5 bi u hi n th p nh t t t c á a ộ ph n. H ữa, kết qu â c cho th y ô u yếu t C á ng v u ki n â r er a gen GmMSRB5. T ô u hi n c a gen GmMSRB5 â r ữ li u microarray [104] ũ ô a r u ki ờ (Hì 3.15). Kết qu y y GmMSRB5 a rò ô á a tr r u ki ờng (so v á gen GmMSRB á ) Hình .17. ết quả phân tích m c độ iểu hiện của họ gen mã hóa MSR ở đậu tư ng trong điều kiện thường. h n m u m cơ uan b phận, bao g m và rễ cây non u ở giai đoạn V6 và hạt ở giai đoạn và 7 rễ và chóp rễ ở giai đoạn đư c hai th c để kiểm tra biểu hiện của gen mã hóa b ng qRT-PCR. Khi xử r r á c, chỉ gen GmMSRB2 GmMSRB5 u hi á ă mẫ á r u hi n c a 3 gen ò i ô ay á (Hì 18A). mẫu r xử ô gen ộ ay a (Hì 18B) Tr á á u hi n c a GmMSRB á V xử n cho th y t t c á gen u ă ờ y ỉ GmMSRB3 á ng một á a T ế e ì rõ a rò a á gen GmMSRB r a n sinh th c, m ộ a á gen y ũ xá ịnh á r a r u ki n h n. Gen GmMSRB2 GmMSRB5 ă ờ á r u ki n h (Hì 3.18D) r ô gen á ng v u ki n h n ô r (Hì 3.18 ) N â r ũ ị r á gen a enzyme MS ô x ng bi u hi n m r u ki ờ (Hì 15). Kết qu y y h enzyme MSRB ô ũy nhi u t i r r u ki ờ n.
22. 20 Hình .18. ết quả phân tích m c độ iểu hiện của họ gen mã hóa MSR ở đậu tư ng trong điều kiện hạn A : nh gi biểu hiện của gen m trong m u thân hi hạn sau - - gi : nh gi biểu hiện của gen m trong m u rễ hi hạn sau - - gi : nh gi biểu hiện của gen m trong m u V6 hi hạn và đủ nư c đ i chứng : nh gi biểu hiện của gen m ở m trong điều iện hạn và đủ nư c đ i chứng : nh gi biểu hiện của gen m ở chóp rễ hi hạn. Kết qu â T-PCR mẫ ô i cho th y á gen a MS ă u hi n sau 2 giờ xử ặ i gi m sau 10 giờ xử mặ Tr GmMSRB1 á ng gi m ch i sau 10 giờ xử ặn (Hình 3.19A). Một gen á GmMSRB5 xá ị á ă sau 2 giờ xử á ng gi m sau 10 giờ xử ặ K á á r xử y, hầu hế á gen GmMSRB, ngo i tr GmMSRB2, x ng bi u hi ă ần theo thời gian xử ặn. Mặ y, chỉ GmMSRB5 á ă r sau 10 giờ xử ặ (Hì 19B).
23. 21 Hình .1 . ết quả phân tích m c độ iểu hiện của họ gen mã hóa MSR ở đậu tư ng trong điều kiện m n nh gi biểu hiện của gen m ở thân A và ở rễ trong điều iện mặn sau - - gi . M u thân đư c thu thập ở th i điểm 0 gi (S0s), 2 gi s và gi (S10s) sau khi x mặn. M u rễ đư c thu thập ở th i điểm 0 gi (R0s), 2 gi s và gi (R10s) sau khi x mặn. Đ tr lờ â ỏi, li u rằ á gen GmMSRB á ng v u ki n ngo i c nh b t l ô a ờ u ph thuộ ay ô thuộ A A á ẫu xử A A c thu th â ộ bi u hi n c a á gen y Kết qu minh h a Hì 20A cho th y, t t c gen GmMSRB ũ x ă â xử i ABA, mặ ô gen á ng v A A X ă ũ c ghi nh n mẫu r xử A A i tr GmMSRB4 u hi n gi m sau khi xử A A Tr GmMSRB2 á ă r t m nh v i ABA r (Hì ). Hình .20. ết quả phân tích m c độ iểu hiện của họ gen mã hóa MSR ở đậu tư ng trong điều kiện ý với ABA A : nh gi mức đ biểu hiện của c c gen m ở thân trong điều iện A A và h ng A A đ i chứng : nh gi mức đ biểu hiện của c c gen m ở rễ trong điều iện A A và h ng A A đ i chứng). hân - : u thân cây đ i chứng; hân - ABA: M u thân cây v i abscisic acid; Rễ - : u rễ cây đ i chứng; Rễ - ABA: M u rễ cây v i abscisic acid.
24. 22 Trong s á a h MSRB G MS c d á â l c l p [99] P â ữ li u microarray [104] cho th y gen y u hi n m nh á x ng bi u hi n m nh vỏ qu . Ki m ch ng m ộ bi u hi n c a GmMSRB1 r u ki ờ ũ xá n s ă ờng t ng h p c a gen y á G MS rú l c l p [99] ũy u á r r u ki ờng. Th c nghi ng minh gen a MS 3 ũ u hi n m nh á x ng bi u hi n m nh qu . Mộ r ờng h GmMSRB4 c xá x ng bi u hi n m nh qu á r u ki ờng (B ng 3.11) Ha ò i c a h MSRB GmMSRB2 GmMSRB5 ô u hi ặ i b t k a T i, GmMSRB1, -B3 GmMSRB4 ô u á a á e zy e a h MS c t ng h p ra t 3 gen y ô ẵ á rì ửa chữa MetO ô á r r ờng h p cần thiết. Hai gen, GmMSRB2 GmMSRB5 a rò r ờ . Bảng .11. Tóm tắt kết quả phân tích iểu hiện của gen mã hóa MSR ở đậu tư ng trong điều kiện thường àu đỏ: iểu hiện t ng. T r u ki ờ â m tra qRT-PC a ra ững kết qu r á rị a r n á y T c kết qu c minh h a B ng 3.12. Gen GmMSRB3 c d á m ch u hi á ă nh nh t á V r u ki n h (Hì 18C) ô á ng v A A (Hì 20).
25. 23 Bảng .12. Tóm tắt kết quả phân tích iểu hiện của gen mã hóa MSRB ở đậu tư ng trong điều kiện hạn àu đỏ: iểu hiện t ng màu anh: iểu hiện gi m A : u t đ p ứng ABA. [TC]n: r nh tự ặp giàu . Bảng .1 . Tóm tắt kết quả phân tích iểu hiện của gen mã hóa MSR ở đậu tư ng trong điều kiện m n àu đỏ: iểu hiện t ng màu anh: iểu hiện gi m A : u t đ p ứng ABA. [TC]n: r nh tự ặp giàu . a GmMSRB4 ô ay r xử ặ e y x á r ờ N y, gen GmMSRB4 ô á ặ
26. 24 Cá ữ â r array ế T-PC rú ra rằ e GmMSRB ô ă ờ r r . Gen GmMSRB5 ặ ô r ờ ây e á xá ị r y Mặ GmMSRB1 ặ r ờ y y e y ỉ á ặ T ú ú a a ra ữ ế e ằ â a ị a ây . ẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGH ết uận Đ xá ị M P A. thaliana Cá e a M P a ế á rì r ế Dữ y At3G55240 bị ì nh nh ng kho ng - -26 lầ r u ki n h ặ á At3G55240 ò y e Ara ẫ xử . Đ xá ị M P Cá e a M P yế a ế òa NA ẫ r y P â ữ ỉ ra rằ á e a M P x ẫ a r ờ , r e a M P xá ị á ng v u ki n h n á V Đ xá ị 8 e a MS A MS A MS A â a a ến v n chuy n trong tế MS A MS A ằ l c l S a a á yế òa - r r er y á e GmMSRA GmMSRB á á á ô a ờ hormone. P â ữ r array y e a MS A MS ộ ay á a á a r ờ r T y á e GmMSRB ô ă ờ r r . GmMSRB5 e á r á y. Đề nghị T ế á e AtMRP GmMRP a rõ ă ộ r er a á C á ng b t l i quan tr ng. T ế a á e a e zy e MS A r .
27. 25 CÁC CÔNG TRÌNH HOA HỌC ĐÃ CÔNG Ố CÓ LIÊN UAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Chu Đ c Hà T ị N , P T ị T N y a H y T ế Dũ P â e a r e e e r ây Arabidopsis thaliana r . ạp ch inh h c, 37(4): 487-495. 2. Chu Đ c Hà N y T ị K P T ị T T ế Dũ Xá ị e a e zy e Me e-S- f x e re aza (Glycine max). ạp ch hoa h c ng nghệ N ng nghiệp Việt Nam, 9(70): 27-31. 3. Ha Duc Chu, Quynh Ngoc Le, Huy Quang Nguyen, Dung Tien Le, 2016. Genome-wide analysis of genes encoding methionine-rich proteins in Arabidopsis and soybean suggesting their roles in the adaptation of plants to abiotic stress. International Journal of Genomics, 2016: 1-8. 4. Ha Duc Chu, Kim-Lien Nguyen, Yasuko Watanabe, Dung Tien Le, Lam-Son Phan Tran, 2016. Expression analyses of soybean genes encoding methionine sulfoxide reductase under various condition suggest a possible role in the adaptation to stress. Applied Biological Chemistry, 59(5): 681-687.