Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia vùng Đồng bằng Sông Cửu long bằng kỹ thuật sinh học..

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia vùng Đồng bằng Sông Cửu long bằng kỹ thuật sinh học..

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 62 42 02 01 PHẠM THỊ NGỌC NGA NGHIÊN CỨU SỰ DI TRUYỀN CÁC ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH Ở BỆNH NHÂN BETA-THALASSEMIA VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Cần Thơ, 2017
2. CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Nguyễn Trung Kiên Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: , Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc giờ ngày tháng năm Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
3. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Phạm Thị Ngọc Nga, Nguyễn Trung Kiên (2017), “Sự di truyền bệnh Beta thalassemia trong 12 gia đình ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long”, Tạp chí Y học Việt Nam. Số 1/2017, tr.197-201. 2. Phạm Thị Ngọc Nga, Nguyễn Trung Kiên (2017), “Các kiểu đột biến gen gây bệnh Beta thalassemia trên bệnh nhân nhi khu vực Đồng bằng sông Cửu Long năm 2014-2016”, Tạp chí Y học Việt Nam. Số 2/2017, tr. 140-144. 3. Phạm Thị Ngọc Nga, Nguyễn Trung Kiên (2017), “Kết quả can thiệp bằng tư vấn di truyền cho những người mang gen bệnh Beta thalassemia trong 12 phả hệ nghiên cứu ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long”, Tạp chí Y học Thực hành. Số 9 (1056)/2017, tr. 59-61. 4. Phạm Thị Ngọc Nga, Nguyễn Minh Tuấn, Nguyễn Trung Kiên (2017), “Các kiểu đột biến gen gây bệnh Beta thalassemia trên bệnh nhân nhi đang điều trị tại bệnh viện Nhi đồng I, năm 2016”, Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh. Số 6 (21), tr. 395-401. 1
4. Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Thalassemia là bệnh Hemoglobin (Hb) di truyền đơn gen theo kiểu Mendel phổ biến nhất. Bệnh do đột biến (ĐB) trên gen globin gây ra. 71% quốc gia trên thế giới có bệnh lưu hành với 7% dân số thế giới mang gen bệnh. Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh và mang gen bệnh cao. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành cho thấy tần suất mang gen bệnh β-Thal khoảng 1,7-25% tùy từng vùng miền và dân tộc. Theo hiệp hội Tan huyết Việt Nam, hiện có khoảng hơn 20.000 bệnh nhân nặng cần điều trị, mỗi năm có khoảng gần 2.000 trẻ sinh ra bị bệnh. Và theo báo cáo của Chi hội Tan máu bẩm sinh khu vực Tây Nam Bộ, năm 2015, Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 2.105 người bị Thalassemia được các bệnh viện chẩn đoán. Với tỷ lệ lưu hành cao, Việt Nam rất cần một chương trình quản lý và phòng chống bệnh thalassemia. Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để tìm hiểu rõ các đột biến gây bệnh; sự di truyền bệnh trong các gia đình là hết sức cần thiết. Ngoài ra, tư vấn cho người mang gen bệnh sẽ góp phần giúp nâng cao kiến thức. Người mang gen có thể chủ động tìm tư vấn, lựa chọn tiền hôn nhân, chẩn đoán trước sinh trong trường hợp cần thiết. Đây là giải pháp quan trọng nhất để phòng bệnh và hạn chế sự chào đời của các trẻ β-Thal thể nặng. Đó lý do đề tài “Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia vùng Đồng bằng sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử” được thực hiện. 1.2. Mục tiêu đề tài (1) Xác định tỷ lê ̣ các kiểu đột biến gen β-globin gây bệnh và các thể bệnh trên bênḥ nhân β-Thal vùng Đồng bằng sông Cửu Long bằ ng các kỹ thuật sinh học phân tử. (2) Xây dựng phả hệ di truyền 3 thế hệ của một số bệnh nhân β-thal và xác định tỷ lệ người mang gen bệnh, các kiểu đột biến, các thể bệnh β- thal, kiểu hình huyết học của các thể bệnh trong phả hệ. (3) Đánh giá kết quả can thiệp bằng tư vấn về di truyền cho những người mang gen bệnh β-thal trong các phả hệ nghiên cứu. 2
5. 1.3. Ý nghĩa của luận án * Ý nghĩa về mặt khoa học, phục vụ công tác đào tạo: - Có thêm số liệu khoa học về tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh β-Thal; sự di truyền bệnh trong phả hệ của một số gia đình bệnh nhân β- Thal khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. - Làm tiền đề cho các nghiên cứ u tiếp theo. * Ý nghĩa về mặt xã hội: - Góp phần nâng cao hiểu biết của người dân về bệnh -Thal từ đó giúp giảm tỷ lê ̣ mắ c bênḥ và nâng cao chấ t lương̣ số ng, kéo dài tuổi tho ̣ cho ngườ i bị bệnh thalassemia. - Sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hạn chế chào đời các bé thể nặng, giảm gánh năng̣ cho gia đình và xa ̃ hôi.̣ 1.4. Tính mới của luận án - Nghiên cứu về bệnh -Thal trên cả 4 nhóm dân tộc: Kinh, Chăm, Khmer, Hoa ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. - Nghiên cứu thực hiện theo định hướng mới: + Phối hợp nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau để xác định nhiều nhất các đột biến gây bệnh trên bệnh nhân -Thal một cách hiệu quả, nhanh chóng. + Nghiên cứu khá toàn diện về bệnh -Thal: nguyên nhân gây bệnh (kiểu đột biến), sự di truyền bệnh qua các thế hệ, tư vấn di truyền kết hợp chẩn đoán trước sinh cho người mang gen. 3
6. Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng cho mục tiêu 1: xác định tỷ lệ kiểu đột biến gen Đối tượng là bệnh nhân không phân biệt tuổi và giới tính, có hộ khẩu ở 13 tỉnh và thành phố thuộc khu vực ĐBSCL được chẩn đoán mắc bệnh -Thal dựa theo kết quả điện di Hb. Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu hoặc người giám hộ của bệnh nhân là trẻ em không đồng ý tham gia nghiên cứu. 3.1.2. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2: xây dựng phả hệ Đối tượng là bệnh nhân mắc bệnh -Thal ở mục tiêu 1 và tất cả người thân có mối quan hệ huyết thống trong phạm vi 3 thế hệ. Tiêu chuẩn loại trừ: Những người vắng mặt trong thời gian nghiên cứu, người không đồng ý tham gia nghiên cứu, người không xác định được nơi cư trú, những người sống ở nước ngoài hoặc quá xa không thể tiếp cận để lấy mẫu xét nghiệm. 3.1.3. Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 3: tư vấn di truyền cho người mang gen bệnh -Thal Đối tượng là người mang gen bệnh -Thal được phát hiện trong phả hệ ở mục tiêu 2, có độ tuổi từ 18-65 tuổi. Tiêu chuẩn loại trừ: Người mang gen bệnh là người không thể trả lời phỏng vấn như: không hiểu rõ tiếng Việt, câm, điếc, , người vắng mặt trong thời gian nghiên cứu, người không đồng ý tham gia nghiên cứu. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ năm 2013–2016, tại 6 bệnh viện có đủ điều kiện chẩn đoán, điều trị bệnh -Thal thuộc khu vực ĐBSCL và bệnh viện Nhi Đồng I thành phố Hồ Chí Minh (bệnh viện tuyến cuối về nhi khoa của các tỉnh trong khu vực). 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Thiết kế nghiên cứu Sử dụng thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang và can thiệp bằng TVDT. 3.3.2. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu 3.3.2.1. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 1 * Xác định cỡ mẫu: áp dụng công thức 4
7. 2 2 n = Z(1-α/2) x p(1-p)/d Trong đó: Z = 1,96; p=0,333 là tỷ lệ các kiểu ĐB ở bệnh nhân - Thal theo nghiên cứu của Nguyễn Khắc Hân Hoan (2007); d = 0,05. Vậy cỡ mẫu cần nghiên cứu: n =341 bệnh nhân * Phương pháp chọn mẫu: Có 4 nhóm dân tộc chính đang sinh sống tại vùng ĐBSCL: dân tộc Kinh khoảng 90%, Khmer khoảng 6%, Hoa khoảng 2%, Chăm khoảng 2%. Đến thời điểm thực hiện nghiên cứu, chúng tôi vẫn chưa tìm được số liệu về tỷ lệ mắc bệnh β-Thal trên các nhóm dân tộc được công bố. Do vậy, nghiên cứu đã chọn mẫu gián tiếp qua tỷ lệ các dân tộc. Kết quả có: 307 bệnh nhân Kinh, 20 bệnh nhân Khmer, 7 bệnh nhân Hoa và 7 bệnh nhân Chăm cần lấy mẫu. Nghiên cứu chọn mẫu thuận tiện theo danh sách quản lý bệnh nhân β-Thal tại các bệnh viện cho đến khi đủ số lượng theo từng dân tộc. 3.3.2.2. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 2 * Xác định cỡ mẫu nghiên cứu: áp dụng công thức 2 2 n = Z(1-α/2) x p(1-p)/d Trong đó: Z = 1,96; p= 0,176 là tỷ lệ người mang gen bệnh trong các phả hệ của bệnh nhân β-Thal theo nghiên cứu của Phạm Thị Phượng (2013); d = 0,05. Vậy n = 223 người. Trung bình mỗi phả hệ nghiên cứu khoảng 20 thành viên. Do đó, số phả hệ cần xây dựng là 12 phả hệ. Thực tế chúng tôi đã nghiên cứu trên 263 đối tượng * Phương pháp chọn mẫu: Chọn dân tộc: theo tỷ lệ các nhóm dân tộc. Kết quả có: 7 phả hệ Kinh, 3 phả hệ Khmer, 1 phả hệ Hoa và 1 phả hệ Chăm. Chọn bệnh nhân để xây dựng phả hệ (đương sự): bốc thăm ngẫu nhiên từ danh sách các bệnh nhân β-Thal ở mục tiêu 1. 3.3.2.2. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 3 Chọn tất cả những người mang gen bệnh β-Thal trong độ tuổi cần tư vấn (18-65 tuổi) để tiến hành tư vấn di truyền (TVDT); tư vấn chẩn đoán trước sinh cho các cặp vợ chồng mang gen đang có thai ở giai đoạn đầu (≤ 24 tuần). Thực tế có 75 đối tượng tham gia TVDT và 3 cặp vợ chồng mang gen bệnh đang mang thai tham gia sàng lọc trước sinh. 5
8. 3.3.3. Nội dung nghiên cứu 3.3.3.1. Tỷ lệ các kiểu đột biến và các thể bệnh (n=341) * Tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin: ghi nhận từ kết quả xét nghiệm gen β-globin bằng các kỹ thuật sinh học phân tử và ghi theo quy ước quốc tế. * Các thể bệnh: Đồng hợp tử: bệnh nhân mang 2 ĐB giống nhau Dị hợp tử kép: bệnh nhân có 2 kiểu ĐB khác nhau Thể dị hợp tử: bệnh nhân có 1 kiểu ĐB trên gen β-globin Thể phối hợp HbE/β-Thal: bệnh nhân có một ĐB gây HbE (Cd26 G>A) kết hợp với một ĐB khác trên gen β-globin. 3.3.3.3. Xây dựng phả hệ, xác định tỷ lệ người mang gen bệnh và kiểu hình huyết học trong phả hệ (n=263) * Phả hệ: là sơ đồ mô tả mối quan hệ của các thành viên trong gia đình, phả hệ ở nghiên cứu này gồm 3 thế hệ và được xây dựng dựa vào các ký hiệu quốc tế sau khi đã xác định thể bệnh của từng thành viên trong gia đình. * Tỷ lệ mang gen bệnh: được xác định dựa vào chỉ số MCV/MCH, điện đi Hb và kết quả tìm được ĐB bằng các kỹ thuật sinh học phân tử (Sơ đồ 3.1). * Kiểu hình huyết học: được khảo sát ở môt vài thông số Số lượng hồng cầu; chỉ số Hct; chỉ số MCV; chỉ số MCH; chỉ số Hb được ghi nhận từ kết quả của xét nghiệm công thức máu 18 thông số. Tỷ lệ HbA, HbA2, HbF, HbE được ghi nhận từ kết quả điện di Hb. 3.3.3.4. Tư vấn di truyền (n=75) * Tư vấn di truyền về kiến thức bệnh β-Thal Các đối tượng mang gen 18-65 tuổi trong cùng 1 phả hệ sẽ được tư vấn di truyền. Đánh giá kiến thức liên quan đến bệnh β-Thal theo bộ 13 câu hỏi tự điền và được soạn sẵn. Kiến thức được đánh giá trước và sau khi bác sĩ tư vấn trên 3 lĩnh vực: kiến thức về bệnh (5 câu hỏi); kiến thức về chăm sóc bệnh nhân mắc bệnh (5 câu hỏi); kiến thức về phòng bệnh (3 câu hỏi). * Tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng mang gen và đang mang thai giai đoạn đầu (<24 tuần): cặp vợ chồng mang gen bệnh đồng ý nghiên cứu sẽ thực hiện chẩn đoán trước sinh khi thai nhi đạt 15-20 tuần tuổi tại bệnh viện Từ Dũ. 6
9. 3.3.4. Các xét nghiệm và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu * Mục tiêu xác định kiểu đột biến gen - 50% số mẫu máu của bệnh nhân được ly trích DNA bằng kít QIAamp DNA Blood Mini và xác định 22 kiểu ĐB phổ biến ở khu vực Đông Nam Á dựa vào nguyên lý của kỹ thuật lai dò ngược Reverse Dot Blot (RDB) tại trung tâm nghiên cứu Thalassemia, trường đại học Mahidol, Thái Lan bằng kít β-globin StripAssay SEA™ của ViennaLab Diagnostics GmbH, Vienna, Austria. Các mẫu bệnh chưa có kết quả sẽ tiếp tục giải trình tự gen β-globin. - 40% số mẫu máu của bệnh nhân được ly trích DNA và thực hiện kỹ thuật giải trình tự tại trung tâm Y - Sinh học phân tử, trường đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh. - 10% số mẫu máu của bệnh nhân được thực hiện RDB và giải trình tự để đối chiếu kết quả của 2 phương pháp. Các mẫu bệnh chưa có kết quả bằng giải trình tự sẽ được gửi đến khoa xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ để thực hiện kỹ thuật MLPA bằng kít MLPA Probemix P102 HBB cho nhóm gen globin ® của MRC – Holland để tìm ĐB ngoài gen β-globin. * Mục tiêu xây dựng 12 phả hệ - Người có quan hệ huyết thống 3 đời với bệnh nhân sẽ làm công thức máu 18 thông số tại Khoa Huyết học, bệnh viện trường Đại học Y Dược Cần Thơ. - Đối tượng có kết quả dương tính với chỉ số MCV và/hoặc MCH sẽ được thực hiện kỹ thuật điện di Hb tại Trung tâm chẩn đoán Y khoa Medic, thành phố Hồ Chí Minh để tìm người mang gen bệnh. - Người mang gen bệnh sẽ được ly trích DNA và thực hiện xác định 22 kiểu ĐB bằng các kỹ thuật như mục tiêu 1 để xác định thể bệnh β-Thal và GAP-PCR tìm ĐB gây α-Thal. 7
10. 3.3.5. Sơ đồ nghiên cứu Sơ đồ 3.1. Các bước chính trong nghiên cứu 8
11. Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Trong thời gian 1/6/2013 đến 30/6/2016, có 341 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh β-Thal tham gia xác định đột biến. Có 12 gia đình bệnh nhân với 263 thành viên đồng ý tham gia nghiên cứu sự di truyền bệnh qua phả hệ. Có 75/93 (80,6%) người mang gen bệnh đủ điều kiện tham gia tư vấn di truyền. Sau tư vấn có 3 cặp vợ chồng mang gen và đang có thai giai đoạn đầu đồng ý chọc ối chẩn đoán trước sinh xác định thể bệnh cho thai nhi. 4.1. Tỷ lê ̣cá c kiểu đột biến gen gây bệnh và thể bệnh β-Thal ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long 4.1.1. Các kỹ thuật sinh học phân tử đã dùng xác định đột biến gen β-globin Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường phổ biến ở Việt Nam. Có hơn 200 đột biến gây bệnh β-Thal đã được công bố trên thế giới. Việc phát hiện các kiểu đột biến gen sẽ giúp chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền hạn chế sự xuất hiện của các trẻ mắc thể nặng. Để tìm ĐB cho bệnh nhân β-Thal khu vực ĐBSCL, nghiên cứu đã kết hợp cả 3 kỹ thuật sinh học phân tử: RDB, giải trình tự và MLPA theo sơ đồ 4.1. Kết quả: 100% bệnh nhân đã tìm được ĐB phù hợp với kết quả điện di và lâm sàng. - 8/22 kiểu ĐB được phát hiện bằng kỹ thuật reverse dot blot (RDB) trên các mẫu bệnh nhân: -28 A>G, Cd17 A>T, Cd26 G>A, IVS1.1 G>T, Cd41/42 –TTCT, Cd71/72 +A, Cd95 +A và IVS2.654 C>T. - Có 15 kiểu ĐB được phát hiện bằng giải trình tự. Ngoài 8 đột biến phổ biến tìm gặp tương tự như RDB, còn có thêm 4 đột biến hiếm: IVS1.5 G>C (βIVS1.5), Cd26 G>T (βCd26), Cd15 G>A (c.48 G>A) (βCd15), Cd11 G>A (Hb Hamilton) (βCd11) và 3 đột biến mới: IVS2.499 C>T; IVS2.636 A>C là hai ĐB thay thế nucleotide ở vùng intron 2 của gen β-globin tại lần lượt các vị trí c.316-42C>T và c.316-179A>C; Đột biến Cd38-39 ACCCAG>CCCAA (βCd38/39) xảy ra tại vị trí c.115 đến c.120, 6 nucleotide thuộc 2 codon 38 và 39 ACC-CAG (Thr- Gln-) bị thay bằng 5 nucleotide là CCCAA (Pro-). Kết quả, khung giải mã bị dịch chuyển từ vị trí c.115 về sau (Hình 4.1). - 35 (10%) bệnh nhân thực hiện cả 2 kỹ thuật giải trình tự và RDB. Đối chiếu kết quả: 100% bệnh nhân cho kết quả tương tự nhau ở cả 2 9
12. phương pháp. Như vậy, cả hai kỹ thuật đều có độ đặc hiệu cao và tuy tốn nhiều thời gian thực hiện hơn nhiều so với RDB, kỹ thuật giải trình tự đã phát hiện được tất cả các ĐB trong vùng gen β-globin khảo sát với chi phí xét nghiệm tương tự. Đó là lý do, ngày nay giải trình tự được sử dụng khá phổ biến để tìm ĐB gen gây bệnh β-Thal. Hình 4.1. Đột biến Cd38-39 ACCCAG>CCCAA được phát hiện bằng SEQ - Có 2 kiểu mất đoạn lớn trong cụm gen β-globin được phát hiện trên 2 bệnh nhân bằng kỹ thuật MLPA: (1) Đột biến mất đoạn từ exon 3 thuộc gen Delta (HbD) đến 0,5kb sau của exon 3 thuộc gen β-globin (δβ)del; (2) Đột biến mất một đoạn từ vị trí promoter đến hết exon1 của gen β-globin (-pro)del. Sơ đồ 4.1. Các kỹ thuật sinh học phân tử và số lượng mẫu đã thực hiện. 10
13. 4.1.2. Tỷ lệ đột biến gây bệnh β-Thal ở khu vực ĐBSCL Có 609/682 alen của 341 bệnh nhân tìm được ĐB. Trong đó, có 268/341 bệnh nhân thuộc dạng truyền máu phụ thuộc, mỗi bệnh nhân sẽ có cả 2 alen mang ĐB và 73/341 bệnh nhân thuộc dạng không cần truyền máu, mỗi bệnh nhân chỉ có 1 alen mang ĐB. 17 kiểu ĐB được xác định: 97,2% các ĐB thuộc 8 kiểu phổ biến của Việt Nam; 9 kiểu ĐB thuộc dạng không phổ biến chiếm 2,8%. Ba đột biến mới chiếm 0,6%. Các kiểu ĐB được gặp với nhiều tần số khác nhau. Trong 17 kiểu đột biến: βHbE chiếm tỷ lệ cao nhất 33,8%, kiểu βCd41/42 và βCd17 đạt lần lượt 23,3% và 21%. Thấp nhất là các kiểu: βIVS2.499, βCd11, βIVS2.636, βCd38/39, (-pro)del và (δβ)del có tỷ lệ giống nhau 0,2%. Bảng 4.1. Tỷ lệ đột biến gây bệnh β-Thal ở khu vực ĐBSCL STT Kiểu ĐB Số lượng Tỷ lệ % Kiểu đột biến phổ biến ở Việt Nam 593 97,2 1 Cd26 G>A (βHbE) 206 33,8 2 Cd41/42 –TTCT (βCd41/42) 142 23,3 3 Cd17 A>T (βCd17) 128 21 4 -28 A>G (β-28) 28 4,6 5 Cd71/72 +A (βCd71/72) 28 4,6 6 IVS2.654 C>T (βIVS2.654) 26 4,2 7 IVS1.1 G>T (βIVS1.1) 22 3,6 8 Cd95 +A (βCd95) 13 2,1 Kiểu đột biến không phổ biến ở Việt Nam 16 2,8 9 Cd15 G>A (c.48 G>A) (βCd15) 5 0,8 10 IVS1.5 G>C (βIVS1.5) 3 0,5 11 Cd26 G>T (βCd26) 2 0,3 12 IVS2.499 C>T (βIVS2.499) 1 0,2 13 Cd11G>A (βCd11) 1 0,2 14 IVS2.636 A>C (βIVS2.636) 1 0,2 15 Cd38-39 ACCCAG>CCCAA (βCd38/39) 1 0,2 16 (-pro)del 1 0,2 17 (δβ)del 1 0,2 Tổng 609 100 * Các đột biến mới phát hiện Có 3 bệnh nhân mang 3 đột biến mới được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự. 100% các bệnh nhân là dân tộc Kinh. Trong đó, có 2 bệnh 11
14. nhân ở thể dị hợp tử kép có lâm sàng thiếu máu nặng, ứ sắt, gan lách to cần truyền máu, thải sắt định kỳ hàng tháng; 1 bệnh nhân thể dị hợp tử dị hợp tử bị thiếu máu nhẹ và không cần truyền máu. Kết quả thể hiện ở các chỉ số huyết học trong bảng 4.2. Bảng 4.2. Chỉ số huyết học và Hb của các đột biến mới Kiểu phối hợp Chỉ số huyết học Chỉ số Hb đột biến RBC Hct Hb MCV MCH HbA HbA2 HbF βCd17/ βCd38/39 2,7 19,7 6,1 71,8 22,3 65,3 2,7 32 (-pro)del/βIVS2.499 2,3 19,7 6,8 85,8 29,5 95,2 2,2 2,2 βIVS2.636 4.77 33 10 69.2 21 89.8 6 4.2 Như vậy, ba ĐB mới là βIVS2.636, βCd38/39 và βIVS2.499 cũng góp phần gây thiếu máu với mức độ tương tự như các bệnh nhân β-Thal thể nặng hoặc các bệnh nhân dị hợp tử do các ĐB phố biến. * Tỷ lệ các kiểu đột biến theo các nhóm dân tộc - Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Kinh: có 549/614 alen của 307 đối tượng dân tộc Kinh tìm được ĐB, 16 kiểu ĐB được xác định: 97,5% đột biến thuộc 8 kiểu phổ biến ở Việt Nam, có 8 kiểu ĐB khác thuộc dạng không phổ biến chiếm 2,5%. Kiểu đột biến βHbE, βCd41/42 và βCd17 chiếm tỷ lệ cao nhất >20%. Thấp nhất là các kiểu: βIVS2.499,βCd11, βIVS2.636, βCd38/39, (β-pro)del mỗi loại đạt 0,2%. - Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Khmer: có 39/40 alen của 20 đối tượng dân tộc Khmer tìm được ĐB, 5 kiểu ĐB được xác định: 4/5 kiểu thuộc dạng ĐB phổ biến: βHbE, βCd41/42, βCd17 và βIVS2.654 chiếm 97,4%. Trong đó, kiểu βHbE, βCd41/42 chiếm tỷ lệ cao nhất lần lượt là 48,7% và 33,3%. βCd15 là kiểu ĐB không phổ biến duy nhất trên dân tộc Khmer chiếm 2,6%. - Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Hoa: có 12/14 alen của 7 đối tượng dân tộc Hoa tìm được ĐB, 4 kiểu ĐB được xác định. 100% ĐB là phổ biến tại Việt Nam. Trong đó, kiểu βCd41/42 và βHbE chiếm tỷ lệ cao nhất lần lượt là 41,7% và 33,3%, còn lại là β-28, βIVS2.654. - Tỷ lệ các kiểu đột biến ở dân tộc Chăm: có 9/14 alen của 7 đối tượng dân tộc Chăm tìm được ĐB và chỉ có 2 kiểu ĐB được xác định: đột biến phổ biến βHbE (88,9%) và ĐB không phổ biến (δβ)del (11,1%). Như vậy, mỗi dân tộc có số lượng và tỷ lệ mỗi kiểu ĐB khác nhau. Kiểu ĐB đa dạng và chiếm tỷ lệ cao ở dân tộc Kinh do có số lượng bệnh nhân tham gia nghiên cứu nhiều (307 bệnh nhân). Ở mỗi dân tộc, 8 loại 12
15. ĐB phổ biến ở Việt Nam luôn chiếm tỷ lệ cao từ 88,9% ở dân tộc Chăm đến 100% ở dân tộc Hoa. Các ĐB hiếm được gặp với tần suất rất thấp <3%, trừ dân tộc Chăm 11,1%. Tóm lại, bên cạnh 8 kiểu ĐB phổ biến chiếm tỷ lệ cao, nghiên cứu đã ghi nhận có đến 9 kiểu ĐB khác. Trong đó có cả ĐB mới, ĐB chưa phát hiện trong các nghiên cứu trước tại Việt Nam, hơn nữa các ĐB này còn rất hiếm gặp trên thế giới. Điều này cho thấy phổ ĐB của bệnh nhân β-Thal khu vực ĐBSCL rất rộng. Kết quả nghiên cứu là một tiền đề quan trọng trong việc gợi ý các xét nghiệm tìm kiểu gen cho bệnh nhân hoặc chẩn đoán trước sinh cho đối tượng mang gen có ý định có con. Cần phải chú trọng sử dụng kỹ thuật phù hợp để tránh bỏ sót và dẫn đến việc chào đời bé thể nặng hoặc đánh giá sai về thể bệnh ảnh hưởng điều trị cho bệnh nhân. 4.1.3. Các thể bệnh β-Thal và các kiểu phối hợp gen giữa các ĐB 17 kiểu ĐB đã tạo 5 kiểu phối hợp gen chính (chiếm 99,1%) trên 341 bệnh nhân β-Thal: β0/β0, β0/β+, β+/β+, β+/β, β0/β và 2 kiểu gen chưa xác định được do ĐB mới tạo thành (0,9%). Bảng 4.3. Tỷ lệ các kiểu gen trên 341 bệnh nhân STT Kiểu gen Số lượng Tỷ lệ % 1 β0/β+ 211 61,9 2 β0/β 61 17,9 3 β0/β0 36 10,5 4 β+/β+ 19 5,6 5 β+/β 11 3,2 6 β0/β? 2 0,6 7 β?/β 1 0,3 Tổng 341 100 17 kiểu ĐB này do sự kết hôn ngẫu nhiên của các cặp vợ chồng nên đã tạo đến 42 kiểu phối hợp ĐB gen trong 4 thể bệnh β-Thal: đồng hợp tử, dị hợp tử kép, thể phối hợp HbE/β-Thal và β-Thal dị hợp tử. Tỷ lệ các thể bệnh trình bày ở bảng 4.4. Cũng tương tự như các nghiên cứu khác trong nước và trong khu vực, thể phối hợp HbE/β-Thal luôn là thể bệnh phổ biến nhất (58,1%). Khi tìm hiểu về sự phối hợp của các kiểu ĐB trong các thể bệnh, nghiên cứu ghi nhận: thể dị hợp tử kép có 16 kiểu phối hợp; thể dị hợp tử có 13 kiểu; phối hợp HbE/β-Thal có 10 kiểu; ít nhất là thể đồng hợp có 3 kiểu. 13
16. Bảng 4.4. Tỷ lệ các thể bệnh trên 341 bệnh nhân STT Thể bệnh Số lượng Tỷ lệ % 1 Phối hợp HbE/β-Thal 198 58,1 2 Dị hợp tử 73 21,4 3 Dị hợp tử kép 58 17 4 Đồng hợp tử 12 3,5 Tổng 341 100 Ở 12 bệnh nhân đồng hợp tử, chỉ có 3 kiểu đột biến tham gia trong thể bệnh này là: βHbE, βCd17, βCd41/42. Trong đó, sự phối hợp của 2 đột biến βCd17 chiếm đến 50%. Tương tự ở các thể dị hợp tử kép kiểu đột biến: Cd41/42 Cd17 Cd41/42 HbE Cd17 HbE β /β ; ở thể phối hợp HbE/β-Thal: β /β , β /β và ở thể dị hợp tử kiểu đột biến: βCd41/42/β, βCd17/β luôn chiếm tỷ lệ cao hơn so với các kiểu phối hợp của các ĐB khác trong nhóm. Sự kết hôn giữa các cặp vợ chồng đều mang tính chất ngẫu nhiên. Do đó, kết quả này, chỉ xuất hiện khi tần số của 3 loại ĐB rất cao trong cộng đồng. Như vậy, ở khu vực ĐBSCL 3 đột biến βCd41/42, βCd17, βHbE là ĐB gây bệnh phổ biến nhất. Ở thể đồng hợp tử, với sự phối hợp ngẫu nhiên 3 đột biến tạo ra hai kiểu gen chính: β0/β0, β+/β+. Trong đó, kiểu gen β0/β0 do 2 đột biến βCd17, βCd41/42 tự phối hợp tạo thành đã quy định kiểu hình thiếu máu nặng, cần truyền máu phụ thuộc hàng tháng. Ngược lại, kiểu gen β+/β+ do βHbE tạo ra chỉ mang kiểu hình β-Thal nhẹ, không cần truyền máu. Theo y văn, β-Thal là bệnh do gen lặn gây ra, nhưng trong nghiên cứu này không phải thể đồng hợp tử β-Thal nào cũng sẽ gây thiếu máu nặng. Bệnh nhân có biểu hiện mức độ thiếu máu nào thì cần phải xem xét đến bản chất các ĐB tạo nên kiểu gen đó. 4.2. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia 4.2.1. Xây dựng phả hệ di truyền 263 thành viên gồm: 12 bệnh nhân β-Thal và 251 người nhà tham gia trong 12 phả hệ. Trong đó có 141 nữ và 122 nam, ngoài ra các phả hệ còn có 2 thai nhi bị sảy, 1 thai đang phát triển và 1 bị chấm dứt thai kỳ do kết quả chẩn đoán trước sinh thai nhi ở thể bệnh β-Thal đồng hợp tử βCd41/42. 11/12 phả hệ có 3 thế hệ, chỉ có duy nhất một phả hệ kinh có 4 thế hệ. Số người trung bình trong mỗi phả hệ là 22 người. 8/12 phả hệ gia đình bệnh nhân là dạng phối hợp HbE/β-Thal: 4 dân tộc Kinh, 03 dân tộc Khmer và 1 dân tộc Hoa (Hình 4.2A). 14
17. 1/12 phả hệ gia đình bệnh nhân dân tộc Kinh 4 thế hệ đương sự ở thể dị hợp kép do phối hợp giữa 2 đột biến β-28 và βCd17. Hình 4.2. Bốn phả hệ di truyền bệnh β-Thal đại diện cho 04 dân tộc Ghi chú: Một số ký hiệu dùng trong phả hệ 1/12 phả hệ gia đình bệnh nhân dân tộc Kinh là dạng đồng hợp tử do phối hợp của 2 đột biến giống nhau βCd41/42. 1/12 phả hệ gia đình bệnh nhân dân tộc Kinh là dạng dị hợp tử kép do phối hợp 2 đột biến: β-28, βCd41/42 và có thêm đột biến -SEA gây bệnh α- Thal (Hình 4.2C). 1/12 phả hệ gia đình bệnh nhân dân tộc Chăm mang HbE và ĐB gây bệnh beta hiếm gặp là (δβ)del (Hình 4.2D). Tất cả các bệnh nhân β-Thal (có hai ĐB) và người mang gen bệnh (có 1 đột biến) trong phả hệ đều được di truyền và tổ hợp các ĐB từ bố mẹ, ông bà ở thế thệ thứ I và thứ II. 100% phả hệ mang đặc điểm di truyền gen lặn trên NST thường theo quy luật của Mendel. 15
18. 4.2.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu 4.2.2.1. Các xét nghiệm và kỹ thuật dùng sàng lọc, xác định người mang gen và các đột biến trong phả hệ nghiên cứu Người nhà của 12 đương sự (251/263 đối tượng) tham gia nghiên cứu trong phả hệ được làm xét nghiệm và nhiều kỹ thuật để sàng lọc tìm người mang gen cũng như xác định kiểu ĐB (Sơ đồ 4.2). Kết quả: - Công thức máu: 146/251 (58,2%) đối tượng có kết quả dương tính với chỉ số MCV/MCH (MCV 90%), 59 thể dị hợp tử β-Thal (HbA2 >3,5), 33 thể dị hợp HbE (HbE tăng). - Kỹ thuật RDB tìm đột biến gây bệnh β-Thal: 101/103 (98,1%) bệnh nhân tìm được ĐB trên gen β-globin; 2 bệnh nhân không tìm được ĐB tiếp tục tìm ĐB bằng kỹ thuật MLPA. Sơ đồ 4.2. Các bước sàng lọc, xác định người mang gen và tìm đột biến cho các đối tượng ở 12 phả hệ - Kỹ thuật GAP-PCR tìm đột biến gây bệnh α-Thal, kết quả có 8 bệnh nhân mang có đột biến –SEA. Trong đó, 6/8 bệnh nhân là người chỉ mang gen gây bệnh α-Thal và 2/8 bệnh nhân là người mang gen phối hợp α và β-Thal (thể dị hợp tử phối hợp ĐB của α/β-Thal) do cả 2 bệnh nhân này ngoài đột biến –SEA, kỹ thuật RDB cũng tìm được ĐB gây bệnh β- Thal. - Kỹ thuật MLPA: 2 bệnh nhân làm MLPA đều mang đột biến giống nhau (δβ)del. 16
19. Kết quả các ĐB gây bệnh β-Thal tìm được bằng 2 kỹ thuật RDB và MLPA đều phù hợp với kết quả điện di. Tuy nhiên, nếu chỉ sử dụng điện di Hb mà không sử dụng kỹ thuật RDB và GAP-PCR để tìm kiểu ĐB sẽ có 2/103 (1,9%) bệnh nhân dị hợp tử phối hợp ĐB của α/β-Thal không được phát hiện. Điều này cho thấy sự cần thiết phải sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc xác định thể bệnh cho bệnh nhân thalassemia. 4.2.2.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu Ở mỗi phả hệ tỷ lệ mang gen bệnh đều ≤50%. Tỷ lệ mang gen β khác nhau: thấp nhất là 9,4% và cao nhất là 50%. Tỷ lệ mang gen HbE cũng dao động từ 0%-37,5% trong từng phả hệ. Tỷ lệ mang gen bệnh chung cả beta và HbE của 12 phả hệ 34,6% và là 35,4% nếu thêm 0,8% bệnh nhân mang gen phối hợp giữa α/β-Thal (Bảng 4.5). Bảng 4.5. Tỷ lệ mang gen bệnh trong 12 phả hệ β-Thal HbE α-Thal α/β-Thal Phả hệ n % n % n % n % Kinh 01 (n=24) 3 12,5 9 37,5 - - - - Kinh 02 (n=12) 6 50 1 8,3 - - - - Kinh 03 (n=15) 5 33,3 - - - - - - Kinh 04 (n=26) 6 23,1 - - 6 23,1 2 7,7 Kinh 05 (n=32) 3 9,4 7 21,9 - - - - Kinh 06 (n=21) 5 23,8 - - - - - - Kinh 07 (n=21) 5 23,8 1 4,8 - - - - Khmer 01 (n=40) 6 15 1 2,5 - - - - Khmer 02 (n=34) 11 32,4 4 11,7 - - - - Khmer 03 (n=10) 3 30 2 20 - - - - Hoa (n=17) 4 23,5 3 17,6 - - - - Chăm (n=11) 3 27,3 3 27,3 - - - - Tổng (n=263) 60 22,8 31 11,8 6 2,3 2 0,8 Như vậy, tỷ lệ mang gen bệnh trong từng phả hệ, theo nhóm dân tộc và tỷ lệ mang gen bệnh chung rất cao. Có hơn 1/3 số người trong phả hệ là người mang gen, điều này sẽ tạo cơ hội dễ dàng gặp nhau của các đối tượng mang gen. Khi một cặp vợ chồng mang gen quyết định có con, theo y văn sẽ có cơ hội 25% con thể nặng, 50% con mang gen được chào đời. 17
20. Với các trẻ thể nặng được sinh ra, gánh nặng của gia đình và xã hội sẽ rất lớn. Trong 12 phả hệ nghiên cứu, có 15 cặp vợ chồng mang gen kết hôn. Có 2/15 (13,3%) cặp vợ chồng không có con bệnh nặng, trong 2 gia đình này có tổng 5 cá thể mang gen chào đời. 13 cặp vợ chồng còn lại, mỗi cặp có 1-5 người con thể nặng. Trẻ mắc bệnh β-Thal sẽ gặp những hậu quả nghiêm trọng về phát triển cơ thể, tuổi thọ bởi sự tan máu và các biến chứng của nó. Phương pháp điều tri ̣hiện nay chủ yếu là truyề n máu và thải sắ t định kỳ. Do đó, với các gia đình có con thể nặng, việc điều trị thật sự là gánh nặng kinh tế lớn. Ngoài trừ trẻ thể nặng, ở các cặp vợ chồng mang gen, các con khác cũng là người mang gen bệnh. Các đội tượng này sẽ lại mang đến nguy cơ cao về bệnh β-Thal cho gia đình và xã hội ở thế hệ tiếp theo. Nếu đối tượng mang gen may mắn không kết hợp với người mang gen, mà là một người bình thường. Cặp vợ chồng này tuy không có nguy cơ sinh con thể nặng, nhưng lại có đến 50% cơ hội sinh con mang gen. Và như vậy, tỷ lệ mang gen bệnh trong xã hội lại không ngừng gia tăng. Tất cả điều này làm cho β-Thal là một căn bệnh di truyền nguy hiểm. Do đó, từ năm 1983, tổ chức y tế thế giới đã đưa Thalassemia là vấn đề của toàn cầu. Theo các nghiên cứu trong, ngoài nước và báo cáo của giáo sư Sunthat Fucharoen, năm 2015 ở hội nghị Thalassemia khu vực Châu Á, Thái Bình Dương, Việt Nam tỷ lệ mang gen β-Thal từ 1,6-25%, HbE từ 1- 75% tùy theo dân tộc. Mỗi năm có hơn 1.700 trẻ thể nặng chào đời tại Việt Nam. Và từ kết quả nghiên cứu của đề tài về tỷ lệ mang gen cao rất nhiều trong các gia đình có con mắc bệnh. Như vậy, ở nước ta, thalassemia đến nay có thể nói là quả bom đang bùng nổ và rất cần có một chính sách phòng bệnh được can thiệp kịp thời từ các đơn vị có chức năng. Một chiến lược phòng bệnh hiệu quả khi hạn chế được sự chào đời của các trẻ mắc bệnh thể nặng. Điều này chỉ thành công khi người mang gen được phát hiện. Các đối tượng này có kiến thức và cần chấp nhận sàng lọc trước hôn nhân cũng như sàng lọc trước sinh nếu cả hai vợ chồng đều mang gen, hay sàng lọc sau sinh cho con để xem có mang gen bệnh không nếu vợ hoặc chồng có 1 người mang gen. Bên cạnh người mang gen bệnh β-Thal, ở phả hệ Kinh 04, nghiên cứu còn ghi nhận sự xuất hiện của 6 người mang gen α-Thal và 2 người mang gen α-Thal phối hợp với β-Thal. Ở Việt Nam, khoảng 6-10% dân số mang gen α-Thal (Sunthat Fucharoen, 2015). Do đó, vẫn có nguy cơ xuất 18
21. hiện bệnh α-Thal trong các gia đình β-Thal và ngược lại, như trong phả hệ Kinh 04 của nghiên cứu. Theo y văn, nếu một bệnh nhân mắc bệnh β-Thal kết hợp với α-Thal do khiếm khuyết gen α, sẽ làm bệnh cảnh của β-Thal giảm xuống rất nhiều, hay tình trạng thiếu máu sẽ tăng nếu có thêm ĐB nhân đoạn α. Như vậy, việc phòng bệnh thật sự không đơn giản chỉ sàng lọc mỗi bệnh β-Thal mà bỏ qua α-Thal. 4.2.3. Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ Trong 12 phả hệ, có 145 alen mang ĐB và 6 kiểu ĐB được phát hiện (Bảng 4.6). Ngoại trừ ĐB gây bệnh α do mất đoạn –SEA được phát hiện trong gia đình mắc bệnh β-Thal Kinh 04 và một ĐB gây β0 rất hiếm gặp (δβ)del ở gia đình Chăm, 4 kiểu gây bệnh β-Thal còn lại đều là ĐB phổ biến ở Việt Nam. Trong đó βHbE chiếm tỷ lệ cao nhất (35,8%), tiếp theo là βCd41/42 (32,4%); βCd17 (17,9%) và β-28(6,2%) (Bảng 4.6). Kết quả nghiên cứu của phả hệ một lần nữa chứng minh, khu vực ĐBSCL các ĐB phổ biến vẫn chiếm đa số, bên cạnh các ĐB hiếm. Bảng 4.6. Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ Số TT Các kiểu ĐB Số alen Tỷ lệ % 1 βHbE 52 35,8 2 βCd41/42 47 32,4 3 βCd17 26 17,9 4 β-28 9 6,2 5 (δβ)del 3 2,1 6 –SEA 8 5,5 Tổng 145 100 Tỷ lệ mang gen bệnh khá cao trong các phả hệ cảnh báo gia tăng nguy cơ xuất hiện thể nặng trong các thế hệ tương lai. Đồng thời sự xuất hiện của đột biến –SEA và ĐB hiếm (δβ)del bên cạnh các ĐB phổ biến, cho thấy việc cần thiết phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau trong trường hợp chẩn đoán trước sinh bệnh β-Thal. Như vậy, nghiên cứu phả hệ kết hợp với xét nghiệm sinh học phân tử sẽ là hai công cụ đắc lực giúp bác sĩ trong tư vấn tính nguy cơ và đưa ra các chỉ định chẩn đoán bệnh cũng như chẩn đoán trước sinh phù hợp. Tóm lại, việc sàng lọc, tìm ra đối tượng nguy cơ sinh con mắc bệnh (người mang gen) và TVDT là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này, các đối tượng mang gen sẽ được TVDT nhằm hỗ trợ trong công tác phòng bệnh. 19
22. 4.2.4. Các thể bệnh β-Thal và kiểu hình huyết học Bảng 4.7. Tỷ lệ các thể bệnh trong 12 phả hệ STT Thể bệnh Số lượng Tỷ lệ % 1 β-Thal đồng hợp tử (βHomo) 1 0,9 2 HbE đồng hợp tử (HbEE) 2 1,7 3 β-Thal dị hợp tử kép (βThal/βThal) 2 1,7 4 Phối hợp HbE/β-Thal (βE/βThal) 17 14,8 5 β-Thal dị hợp tử (βThal/β) 60 52,2 6 HbE dị hợp tử (HbE) 31 27,0 7 β-Thal dị hợp tử/α-Thal (α/β) 2 1,7 Tổng 115 100 Nếu HbE được tách thành thể bệnh riêng và tính cả thể dị hợp tử phối hợp α/β-Thal ở phả hệ Kinh 04, trong 12 phả hệ có tổng 7 thể bệnh cần xác định kiểu hình huyết học (Bảng 4.7). * Các chỉ số huyết học Nghiên cứu ghi nhận các chỉ số huyết học có sự thay đổi khác nhau ở từng thể bệnh: Số lượng hồng cầu (RBC) thấp nhất ở 3 thể bệnh βHomo, βE/βThal, 12 12 βThal/βThal 5x10 /L. Chỉ số HCT khác nhau trong các thể bệnh, thấp nhất ở thể bệnh βThal/βThal 18,05%, cao nhất là thể HbE 38,07%. βHomo, βThal/βThal, βE/βThal là 3 thể bệnh có Hb trong máu thấp nhất: 7,24g/dL, 7,40g/dL và 7,41g/dL. Cao nhất là ở thể HbE: 12,42g/dL. Trừ thể bệnh βHomo, tất cả các thể bệnh còn lại đều có MCV 3,5% ở các thể bệnh, ngoại trừ thể đồng hợp tử βHomo và dị hợp tử kép βThal/βThal: 2% và 2,6%. Tỷ lệ HbF rất khác nhau ở các thể bệnh. Thấp nhất là ở thể đồng hợp HbEE là 0%, dị hợp tử α/β-Thal và HbE chỉ có 0,8% và 1,02%, tăng lên 2,5% ở thể dị hợp tử β-Thal. HbF tăng đến 30,76% ở trường hợp dị hợp tử kép βE/βThal và cao nhất ở thể βHomo 98%. HbE chỉ xuất hiện ở 3 thể bệnh với tỷ lệ trung bình: 26,9% ở thể dị hợp tử HbE, 39,31% ở thể βE/βThal và tăng đến 93,75% ở thể 20
23. đồng hợp tử HbEE. Mỗi thể bệnh trong phả hệ đều có kiểu hình huyết học khác nhau. Biểu hiện rõ sự thay đổi trong các chỉ số huyết học cũng như điện di Hb là 3 thể bệnh: β-Thal đồng hợp tử, thể β-Thal dị hợp tử kép và thể phối hợp HbE/β-Thal. Tất cả 3 thể bệnh này đều có kiểu hình thiếu máu nặng và cần truyền máu phụ thuộc, trong đó thể đồng hợp tử có biểu hiện thiếu máu nặng nhất. Thay đổi chỉ số huyết học nhẹ là thể bệnh β-Thal dị hợp tử, HbEE và thể dị hợp tử phối hợp α/β-Thal. Bên cạnh đó, nghiên cứu còn ghi nhận 3 thể bệnh này có kiểu hình thiếu máu rất nhẹ, khó chẩn đoán trên lâm sàng nếu không dựa vào chỉ số MCV, MCH và điện di Hb. Ngoài bệnh nhân thể đồng hợp tử được ghi nhận thiếu máu với chỉ số MCV và MCH bình thường. Các thể bệnh còn lại đều có sự giảm đáng kể chỉ số MCV và MCH. Do vậy sàng lọc bằng MCV, hay MCH sẽ có tỷ lệ âm tính giả. Trong 7 thể bệnh tìm gặp ở 12 phả hệ, β-Thal dị hợp tử và dị hợp tử HbE rất cao (79,2%). Ngoài ra, Việt Nam là quốc gia trong vùng Đông Nam Á có nhiều bệnh β-Thal và HbE. Tần số mang gen bệnh không chỉ cao trong các gia đình có bệnh nhân mà còn ngoài cộng đồng. Do vậy, rất dễ có sự tổ hợp giữa hai cá thể mang gen trong cộng đồng. Nếu không thực hiện quá trình sàng lọc phát hiện người mang gen và tư vấn một quá trình phòng bệnh hiệu quả, nguy cơ sinh con mắc bệnh β-Thal thể nặng sẽ rất cao. Không phải tất cả các cá nhân trong cộng đồng cũng có điều kiện kinh tế và hiểu biết để tầm soát bệnh tại các cơ sở y tế. Đặc biệt, khu vực ĐBSCL, nơi điều kiện y tế và trình độ thấp so với cả nước. Do vậy, việc sử dụng các xét nghiệm cơ bản rẻ tiền như OF phát hiện người mang gen β- Thal, còn DCIP tìm sự hiện diện của HbE và công thức máu nên được khuyến khích thực hiện sàng lọc tại cộng đồng trước khi chỉ định điện di Hb và các xét nghiệm gen. 4.3. Tư vấn di truyền cho những người mang gen bệnh bệnh β- Thal trong các phả hệ nghiên cứu Có 93/99 đối tượng có mang gen bệnh β-Thal trong 12 phả hệ và có 75/93 (80,6%) người mang gen đủ điều kiện và đồng ý tham gia TVDT. 21
24. 4.3.1. Kiến thức đúng về bệnh β-Thal Bảng 4.8. Kiến thức đúng về bệnh β-Thal Trước tư vấn Sau tư vấn Nội dung p Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % Tên bệnh 36 48,0 71 94,7 <0,001 Nguyên nhân gây bệnh 0 0,0 49 65,3 - Dấu hiệu lâm sàng 12 16,0 36 48,0 <0,001 Diễn tiến của bệnh 26 34,7 56 74,7 <0,001 Xét nghiệm xác định bệnh 6 8,0 18 24,0 <0,001 Kiến thức chung 12 16,0 44 58,7 <0,001 Kết quả nghiên cứu ghi nhận: 100% các loại kiến thức đúng về bệnh đã tăng lên có ý nghĩa về mặt thống kê sau tư vấn. Sự gia tăng này khác nhau ở từng nội dung, thay đổi nhiều nhất là nội dung nguyên nhân gây bệnh từ 0% trước tư vấn tăng lên 65,3% sau tư vấn và nội dung tên bệnh 48% và 94,7% sau tư vấn. Tỷ lệ kiến thức chung về bệnh trước tư vấn đạt thấp 16% và sau tư vấn tăng 3,6 lần (58,7%). Tất cả, sự khác biệt này đều có thống kê ở mức ý nghĩa 95% (Bảng 4.8). Cùng một nghiên cứu khác, với mẫu lớn hơn trên những cặp có nguy cơ cao tại Ghaemshah- Iran của tác giả Kosaryan, M., 2009. Sau 9 năm chương trình tầm soát được thực hiện trong vùng thì tỷ lệ kiến thức đúng về bệnh cũng nâng cao là 82%. Điều này gợi ý cho một chương trình tư vấn và tầm soát ở Việt Nam cho bệnh Thalassemia là cần thiết và sẽ có hiệu cao. 4.3.2. Kiến thức đúng về chăm sóc bệnh nhân mắc bệnh β-Thal Bảng 4.9. Kiến thức đúng về chăm sóc bệnh nhân mắc bệnh β-Thal Trước tư vấn Sau tư vấn Nội dung Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ p lượng % lượng % Phương pháp điều trị 33 44,0 62 82,7 <0,001 Cần tái khám định kỳ 22 29,3 50 66,7 <0,001 Dễ mắc bệnh bội nhiễm 34 45,3 63 84,0 <0,001 Có chế độ ăn nghèo sắt 1 1,3 20 26,7 <0,001 Cần tiêm ngừa phòng bệnh khác 1 1,3 22 29,3 <0,001 Kiến thức chung 20 26,7 47 62,7 <0,001 Tỷ lệ kiến thức đúng về chăm sóc bệnh nhân mắc bệnh β-Thal đạt khác nhau trong từng nội dung, cao nhất là nội dung bệnh nhân β-Thal dễ mắc bệnh bội nhiễm 45,3% trước tư vấn và 84% sau tư vấn. Đúng ít nhất là kiến thức về chế độ ăn và cần tiêm ngừa cho bệnh nhân mắc bệnh chỉ 22
25. đạt 1,3% trước tư vấn và tăng lần lượt là 26,7% và 29,3% sau tư vấn. Tương tự như nội dung kiến thức về bệnh, 100% các nội dung về chăm sóc bệnh nhân đã được tăng lên có ý nghĩa về mặt thống kê sau tư vấn (Bảng 4.9). Việc gia tăng kiến thức về chăm sóc bệnh nhân β-Thal của những người mang gen bệnh tham gia tư vấn, trong đó có cả cha mẹ các bệnh nhân β-Thal thể nặng sẽ có ý nghĩa quan trọng hỗ trợ trong công tác điều trị, chăm sóc và nâng cao chất lượng cuộc sống cho người mắc bệnh ở các phả hệ nghiên cứu. 4.3.3. Kiến thức đúng về phòng bệnh β-Thal Trong nghiên cứu này, kết quả ở từng nội dung và tỷ lệ đối tượng có kiến thức đúng chung về phòng bệnh rất thấp, chỉ đạt 1,3% (Bảng 4.10). Đây là kiến thức mà các đối tượng đạt thấp nhất trong 3 lĩnh vực đánh giá về bệnh β-Thal trước tư vấn. Kết quả cho thấy, với các đối tượng mang gen việc phòng bệnh β-Thal hầu như là không biết. Bảng 4.10. Kiến thức đúng về phòng bệnh β-Thal Trước tư vấn Sau tư vấn Nội dung p Số lượng Tỷ lệ % Số lượng Tỷ lệ % Cần xét nghiệm cho các thành viên khác trong 1 1,3 26 34,7 <0,001 gia đình đã có con bệnh Cha/mẹ đã sinh con bị bệnh cần sàng lọc trước 1 1,3 20 26,7 <0,001 sinh khi có thêm con Cặp vợ/chồng mang gen cần được tư vấn và 1 1,3 38 50,7 <0,001 xét nghiệm trước khi có con Kiến thức chung 1 1,3 29 38,7 <0,001 Tuy nhiên, khi bác sĩ chuyên môn cung cấp các thông tin về khả năng có thể sinh con mắc bệnh cao từ người mang gen và chỉ rõ hậu quả do bệnh nhân β-Thal thể nặng thì dù là kiến thức mới nhưng sự hiểu biết đúng của các đối tượng mang gen về phòng bệnh đã tăng lên gần 30 lần sau tư vấn (38,7%). Bên cạnh đó, ở mỗi nội dung kết quả cũng tăng lên đáng kể. Đặc biệt, ở nội dung cặp vợ/chồng mang gen cần được tư vấn và xét nghiệm trước khi có con đã tăng từ 1,3% lên 50,7% (tăng gần 40 lần sau tư vấn). 23
26. 4.3.4. Ứng dụng kết quả tư vấn di truyền vào phòng bệnh Beta thalassemia Bên cạnh các kiến thức liên quan đến bệnh β-Thal đều đã tăng lên có ý nghĩa thống kê, hiệu quả tư vấn còn thể hiện rõ khi 3 cặp vợ chồng mang gen ở 3 phả hệ người Kinh đang mang thai trong giai đoạn đầu (<24 tuần) chấp nhận sàng lọc trước sinh. Bảng 3.4. Kết quả chẩn đoán trước sinh của các cặp vợ chồng mang gen bệnh Kiểu đột biến Kiểu đột biến của STT Kết quả Vợ Chồng thai 1 βCd17 βHbE βCd17 Tiếp tục thai kỳ 2 βCd41/42 βCd41/42 Đồng hợp βCd41/42 Chấm dứt thai kỳ 3 βCd41/42 β-28 β-28 (thai song sinh) Tiếp tục thai kỳ Kết quả 1/3 thai được tư vấn chấm dứt thai kỳ do mang kiểu gen đồng hợp tử với đột biến βCd41/42. Một thai nhi song sinh và một thai nhi khác mang kiểu gen dị hợp được tư vấn tiếp tục thai kỳ. Các bé chào đời khỏe mạnh với kết quả sàng lọc sau sinh tương tự như trước sinh. Tóm lại, tỷ lệ có kiến thức đúng trong tất cả các nội dung của 3 loại kiến thức trước tư vấn di truyền đạt khá thấp, không có nội dung nào đạt ≥50%. Tìm hiểu một số nguyên nhân, nghiên cứu ghi nhận đa phần bố mẹ và các thành viên sống cùng trẻ bị bệnh thường có khuynh hướng hạn chế nói về bệnh mà con/cháu họ mắc phải. Bên cạnh đó, sự thiếu hụt thông tin cũng là một nguyên nhân. Tại khu vực ĐBSCL thông tin về bệnh β-Thal vẫn còn rất hạn chế, chưa phổ biến trên các phương tiện công cộng. Người dân sống trong khu vực nông thôn lẫn thành thị vẫn không biết nhiều về bệnh di truyền này và điều này cũng là tình trạng chung của cả nước ta. Đây cũng là nguyên nhân, nghiên cứu không ghi nhận được loại kiến thức nào đạt mức hiểu biết đúng 100% sau tư vấn. Tuy nhiên, sau tư vấn, tất cả các kiến thức đều tăng lên nhiều lần và có ý nghĩa thống kê. Thái độ tích cực chấp nhận sàng lọc trước sinh của các cặp vợ chồng đã khẳng định sự quan tâm khá tốt đến các thông tin về bệnh mình đang mang gen. Do vậy, nghiên cứu khẳng định, tư vấn là một trong những cách hiệu quả để nâng cao chất lượng cuộc sống của bệnh nhân β-Thal và là biện pháp đặc hiệu để giảm nhanh tỷ lệ bệnh này trong tương lai. 24
27. Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1. Kết luận 5.1.1. Tỷ lê ̣cá c kiểu ĐB và thể bệnh β-Thal ở khu vực ĐBSCL - Có 17 kiểu ĐB được xác định: 8 kiểu ĐB phổ biến của Việt Nam chiếm 97,2%; 6 kiểu ĐB không phổ biến (2,2%): Cd15 G>A, Cd11G>A, Cd26 G>T, IVS1.5 G>C, (δβ)del, (β-pro)del; 3 kiểu ĐB mới (0,6%): Cd38-39 ACCCAG>CCCAA; IVS2.499 C>T; IVS2.636 A>C. - 4 thể bệnh β-Thal: thể phối hợp HbE/β-Thal (58,1%), β-Thal dị hợp tử (21,4%), dị hợp tử kép (17%) và thể đồng hợp tử (3,5%). 5.1.2. Phả hệ di truyền bệnh β-Thal - 7 phả hệ dân tộc Kinh, 03 phả hệ dân tộc Khmer, 1 phả hệ dân tộc Chăm và 1 phả hệ dân tộc Hoa được xây dựng. 100% phả hệ mang đặc điểm di truyền gen lặn trên NST thường theo quy luật của Mendel. - 93 (35,4%) người mang gen bệnh β-Thal trong 12 phả hệ - 6 kiểu ĐB được xác định trong các phả hệ: 5/6 kiểu ĐB gây bệnh β-Thal và có 1 kiểu ĐB gây bệnh α-Thal do mất đoạn –SEA - Có 7 thể bệnh được ghi nhận trong 12 phả hệ: + 3 thể bệnh β-Thal đồng hợp tử, phối hợp HbE/β-Thal, β-Thal dị hợp tử kép đều có kiểu hình thiếu máu nặng và cần truyền máu phụ thuộc. + Thể bệnh β-Thal dị hợp tử, thể dị hợp tử phối hợp giữa α/β-Thal và homo HbEE có kiểu hình thiếu máu nhẹ, không cần truyền máu. + Thể dị hợp tử HbE hầu như không có kiểu hình thiếu máu và biểu hiện thiếu máu qua các chỉ số huyết học 5.1.3. Tư vấn di truyền cho người mang gen trong 12 phả hệ 100% các nội dung kiến thức được tăng lên có ý nghĩa thống kê sau tư vấn. Ba cặp vợ chồng tham gia sàng lọc trước sinh và một thai nhi chấm dứt thai kỳ do mắc β-Thal thể nặng. 5.2. Đề xuất Tăng cường công tác giáo dục sức khỏe, tuyên truyền trong cộng đồng các thông tin về bệnh thalassemia và mức độ nghiêm trọng của bệnh. Thực hiện TVDT cho người nhà bệnh nhân mắc bệnh β-Thal, nhằm nâng cao kiến thức của người nhà và hạn chế chào đời của trẻ thể nặng. Xây dựng các chương trình phòng chống thalassemia tập trung vào các bước tầm soát, tư vấn tiền hôn nhân và chẩn đoán trước sinh để hạn chế sự chào đời của trẻ β-Thal thể nặng. 25