Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinylglycine từ Streptomyces spp. có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hoãn quá..

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinylglycine từ Streptomyces spp. có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hoãn quá..

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN NGUYỆN Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinylglycine từ Streptomyces spp. có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hoãn quá trình chín quả giai đoạn cận và sau thu hoạch Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 94 20 201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI – 2020
2. Công trình được hoàn thành tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS Trịnh Khắc Quang PGS. TS Phạm Anh Tuấn Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại (ghi rõ nơi bảo vệ luận án cấp Viện) ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư viện Quốc gia Việt Nam 2. Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 3. Thư viện Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch 4. Thư viện Viện Nghiên cứu rau quả
3. -1- MỞ ĐẦU 1. Lý do lựa chọn đề tài Việt Nam là nước có nhiều lợi thế để phát triển ngành rau hoa quả với tổng diện tích hơn 1,8 triệu ha. Tuy vậy, kim ngạch xuất khẩu của nước ta hiện mới chỉ chiếm trên 1%, tỷ lệ tổn thất sau thu hoạch còn cao, khoảng 20-25%, công nghệ sau thu hoạch còn nhiều hạn chế, tiềm ẩn nhiều rủi ro về an toàn thực phẩm. Để giảm tổn thất sau thu hoạch, nhiều chế phẩm sinh học và hóa học an toàn đã được thế giới nghiên cứu và ứng dụng cho đối tượng rau quả ở giai đoạn cận và sau thu hoạch. Trong đó, hoạt chất AVG đã được chứng minh là có hiệu quả cao để kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản sau thu hoạch một số loại quả nhờ khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene. AVG có thể được sản xuất bằng con đường sinh học hoặc tổng hợp hóa học. Kỹ thuật tổng hợp hóa học hiện tại phải sử dụng quá nhiều dung môi và hóa chất độc hại, do đó phương pháp sinh học vẫn là hướng nghiên cứu chính được sử dụng để sản xuất AVG hiện nay. Nhu cầu sản phẩm như AVG hiện tại là không nhỏ. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, trên cơ sở kế thừa và phát triển hướng nghiên cứu sinh học, tôi thực hiện đề tài nghiên cứu sinh: “Nghiên cứu tạo chế phẩm Aminoethoxyvinyl glycine từ Streptomyces spp. có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene để trì hoãn quá trình chín quả giai đoạn cận và sau thu hoạch”. 2. Mục đích của đề tài Phân lập, tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn Streptomyces spp. có khả năng sinh tổng hợp AVG từ đất trồng cây ăn quả của Việt Nam và xây dựng được quy trình tạo chế phẩm AVG có độ tinh khiết cao sử dụng cho trì hoãn sự chín của quả, đạt chỉ tiêu an toàn thực phẩm. Đánh giá được khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG tạo ra, có hiệu quả trong kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) và kéo dài thời gian thu hoạch, bảo quản chuối tiêu hồng (Musa Cavendish).
4. -2- 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Các chủng Streptomyces spp. có khả năng sinh tổng hợp AVG trong đất trồng cây ăn quả của Việt Nam. Quy trình phân lập, tuyển chọn, nuôi cấy, lên men, thu hồi và tạo chế phẩm AVG. Đánh giá khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG tạo được trong kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) và kéo dài thời gian thu hoạch, bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish). 4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 4.1. Địa điểm nghiên cứu: Hà Nội, Hưng Yên, Thái Nguyên. 4.2. Thời gian nghiên cứu: từ 10/10/2013-10/10/2019 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 5.1. Ý nghĩa khoa học Cung cấp cơ sở khoa học, các dữ liệu liên quan đến các chủng xạ khuẩn Streptomyces spp. sinh tổng hợp AVG phân lập được từ đất tại một số vùng trồng cây ăn quả của Việt Nam, môi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy, lên men, kỹ thuật tách chiết, thu hồi và tạo chế phẩm AVG. Kết quả của luận án là tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo về hoạt chất AVG. 5.2. Ý nghĩa thực tiễn Xây dựng được quy trình tạo chế phẩm AVG từ xạ khuẩn Streptomyces sp. của Việt Nam góp phần bổ sung, hỗ trợ hiệu quả cho các giải pháp hiện có để tăng sản lượng, chất lượng của các loại quả tươi, tiến tới thay thế và loại bỏ từng phần các hợp chất bảo quản có nguồn gốc hóa học độc hại. 5.3. Tính mới của luận án Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu sản xuất chế phẩm AVG từ xạ khuẩn Streptomyces sp. phân lập từ đất tại Việt Nam ứng dụng trong kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản quả tươi; Xây dựng được quy trình công nghệ lên men, sinh tổng hợp AVG từ xạ khuẩn Streptomyces sp. S6, tinh sạch hoạt chất AVG từ dịch lên men, tạo được chế phẩm AVG đạt hàm lượng hoạt chất 10% tính theo khối lượng; Quy trình này có thể áp dụng ở quy mô thích hợp để sản xuất ra
5. -3- chế phẩm AVG đáp ứng cho nhu cầu cấp bách của sản xuất nông nghiệp ở nước ta; Xây dựng được 02 quy trình sử dụng chế phẩm AVG tạo ra: (i) để kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) trồng tại Hưng Yên, (ii) để kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish) trồng tại Thái Nguyên. Chế phẩm AVG đảm bảo chất lượng và ATTP. Mặt khác, sử dụng chế phẩm AVG không ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển cũng như năng suất của cây trồng, chất lượng của quả. 6. Bố cục của Luận án Luận án gồm 118 trang (không kể phụ lục và tài liệu tham khảo), 29 bảng, 39 hình và 185 tài liệu tham khảo, được trình bày gồm 3 chương, 6 phần chính: Mở đầu (4 trang); Tổng quan (30 trang); Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (19 trang); Kết quả và thảo luận (62 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình đã công bố của luận án (1 trang). CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ quả tươi: gồm 02 tiểu mục là 1.1.1. Trên thế giới và 1.1.2. Ở Việt Nam, trong đó trình bày về thực trạng sản xuất, tiêu thụ, nhu cầu quả tươi và tổn thất sau thu hoạch trên thế giới và Việt Nam, đặc biệt là cam (Citrus sinensis) và chuối tiêu (Musa cavendish). 1.2. Đặc điểm quá trình sinh trưởng, phát triển, lão hóa của quả trước và sau thu hoạch: trình bày về quá trình đồng hóa, dị hóa và các biểu hiện trong quá trình hình thành, tăng trưởng, phát triển và suy thoái chất lượng của quả. 1.3. Tác động của ethylene nội sinh đến quá trình sinh trưởng, phát triển và lão hóa của quả: trình bày về các tác động sinh học của ethylene đến các giai đoạn trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật bậc cao như nảy mầm của hạt, rụng lá, quả, chín và già hóa của quả, màu sắc trái cây, độ cứng, chất bay hơi, tinh bột, đường và axit hữu
6. -4- cơ trong quá trình chín quả; con đường và các yếu tố tham gia chính trong sinh tổng hợp ethylene, chu trình sinh tổng hợp, các nhân tố tham gia và cơ chế tác động của ethylene, sự tác động của ethylene trong quả có hô hấp đột biến và không đột biến. 1.4. Các nghiên cứu ức chế hoạt động của ethylene nội sinh trước và sau thu hoạch: gồm 03 tiểu mục là 1.4.1. Ức chế sinh tổng hợp (kìm hãm enzyme ACS, ức chế enzyme ACO, cạnh tranh cơ chất SAM), 1.4.2. Kìm hãm các thụ thể nhận biết ethylene và 1.4.3. Loại bỏ ethylene (hấp phụ, oxy hóa, xúc tác phân hủy, bộ lọc sinh học). Phân tích ưu nhược điểm của các hợp chất, các phương pháp đã nghiên cứu và đang ứng dụng. So sánh với phương pháp sử dụng AVG. 1.5. Hoạt chất AVG: gồm 03 tiểu mục là 1.5.1. Cấu tạo phân tử AVG, 1.5.2. Tính chất hóa lý của AVG và 1.5.3. Cơ chế kìm hãm sinh tổng hợp ethylene của AVG (ACS và các tác nhân kìm hãm ACS, cơ chế ức chế ACS của AVG). Trong đó trình bày đầy đủ các thông tin về công thức phân tử, phân tích cấu tạo và các tính chất lý, hóa và sinh học của phân tử AVG. Phân tích cấu trúc và phân nhóm của enzyme ACS và các công trình, kết quả nghiên cứu sử dụng phương pháp, các hoạt chất trong ức chế hoạt động của enzyme ACS. Qua các công trình nghiên cứu, phân tích cơ chế ức chế ACS của AVG và phân tích tính ưu việt của AVG trong ức chế hoạt động của ACS. 1.6. Công nghệ sản xuất chế phẩm chứa hoạt chất AVG: gồm 03 tiểu mục: 1.6.1. Sản xuất AVG bằng xạ khuẩn Streptomyces spp. (đặc điểm của xạ khuẩn Streptomyces spp., lên men xạ khuẩn Streptomyces spp. để sản xuất AVG, tách và tinh sạch AVG, công nghệ tạo chế phẩm AVG), 1.6.2. Sản xuất AVG bằng tổng hợp hóa học và 1.6.3. Kỹ thuật tạo các sản phẩm điều hòa sinh trưởng. 1.7. Các công trình nghiên cứu ứng dụng hoạt chất AVG: gồm 02 tiểu mục: 1.7.1. Giai đoạn trước thu hoạch (trên thế giới, ở Việt Nam) và 1.7.2. Giai đoạn sau thu hoạch (trên thế giới, ở Việt Nam). Trong đó trình bày và phân tích các công trình nghiên cứu ứng dụng hoạt chất
7. -5- AVG cho trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản quả tươi trên thế giới và ở Việt Nam. 1.8. Những ý kiến rút ra từ tổng quan: điểm qua các kết quả nghiên cứu có trước từ đó xác định các vấn đề cần nghiên cứu cụ thể cho luận án là: 1. Phân lập và tuyển chọn chủng Streptomyces sp. có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AVG; 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến sinh trưởng và sinh tổng hợp hoạt chất AVG của chủng Streptomyces sp. đã lựa chọn; 3. Nghiên cứu làm sạch, thu hồi và tạo chế phẩm AVG có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene cho trì hoãn quá trình chín quả; 4. Nghiên cứu khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG tạo được trong trì hoãn sự chín để kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis), kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish). CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu: Các mẫu đất có độ mùn cao tại các vùng trồng cam, chuối và các loại cây ăn quả khác trên địa bàn Hà Nội, Hòa Bình, Hưng Yên, Thái Nguyên; Các loại cây, quả: chuối tiêu hồng (Musa cavendish) trồng tại Thái Nguyên, cây cam chanh (Citrus sinensis) trồng tại Hưng Yên 7 năm tuổi; Chủng xạ khuẩn S. cellolosae VTCC 41913; Sản phẩm Retain 15% AVG (Valent BioSciences Corporation, Úc). 2.1.2. Môi trường, hóa chất: Gause I cải tiến; Gause II (cao thịt - 1, pepton - 5, NaCl - 5, glucose - 10, agar - 20); Môi trường SC nuôi cấy xạ khuẩn S. cellulosae VTCC 41913; Môi trường ISP2 cho nuôi cấy, phân tích hình ảnh bào tử xạ khuẩn; Môi trường ISP4 cho phân tích hình thái xạ khuẩn; Kit tách DNA tổng số; thang DNA chuẩn; các cặp mồi để khuếch đại gen 16S rRNA; Chuẩn AVG tinh khiết phục vụ phân tích (Sigma) và các hóa chất phục vụ nghiên cứu phân lập, nuôi cấy, lên men, tách chiết, tinh sạch và tạo chế phẩm AVG khác.
8. -6- 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ: các thiết bị, dụng cụ phục vụ nghiên cứu vi sinh vật, nuôi cấy, lên men, tách chiết, làm sạch, thu hồi, tạo chế phẩm AVG, thử nghiệm đồng ruộng và phân tích. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Các phương pháp nghiên cứu chung Phân tích hàm lượng AVG bằng HPLC; xác định pH dịch lỏng bằng máy đo pH; xác định sinh khối chủng xạ khuẩn trong dịch lên men bằng phương pháp khối lượng không đổi; xác định hàm lượng chất khô tổng số trong dịch lỏng bằng khúc xạ kế cầm tay. 2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu theo nội dung 2.2.2.1. Phân lập và tuyển chọn chủng Streptomyces sp. có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AVG: phân lập chủng có đặc điểm của chi Streptomyces theo phương pháp của Vinorgadski. Các đặc điểm phân loại xạ khuẩn được xác định theo Shirling và cộng sự (1966, 1968), có so sánh với khóa phân loại Waksman, Gause và Bergey’s Manual. Phân tích hình ảnh bào tử bằng kính hiển vi điện tử quét JSM-5410 LV; Sàng lọc sơ bộ chủng có khả năng sinh tổng hợp AVG qua khả năng ức chế xạ khuẩn S. cellulosae VTCC 41913; Xác định chủng sinh tổng hợp AVG bằng phân tích HPLC; Định tên và dựng cây phân loại chủng có khả năng sinh tổng hợp AVG bằng giải trình tự 16S rDNA. 2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và các điều kiện lên men đến sinh trưởng và sinh tổng hợp hoạt chất AVG của chủng Streptomyces sp. đã lựa chọn: Chủng sử dụng cho nghiên cứu là chủng S6 có khả năng sinh tổng hợp AVG cao nhất trong các chủng đã phân lập được và môi trường nghiên cứu xuất phát là Gause II. Các thành phần khác nhau của môi trường dinh dưỡng được khảo sát là nguồn carbon, nguồn nitơ, các nguyên tố vi lượng với nồng độ tương đương các chất trong môi trường Gause II, đa lượng (1g/l); các điều kiện lên men được khảo sát là tỉ lệ tiếp giống (2x106-1,6x107CFU/ml), nhiệt độ (26- 32oC), nồng độ oxy hòa tan (mg/l theo tốc độ lắc từ 220-300 vòng/phút), pH của môi trường lên men (6,2-7,4), thời gian lên men (<48 giờ), theo dõi biến đổi pH, tích lũy sinh khối, tiêu thụ glucose, tiêu thụ nitơ tổng số,
9. -7- phot pho và sinh tổng hợp AVG theo thời gian. Nghiên cứu tối ưu hóa thành phần một số nguồn dinh dưỡng và một số điều kiên lên men quan trọng bằng phần mềm Design expert 11, thí nghiệm được thiết kế kiểu hỗn hợp trung tâm (Central Composite Design) theo phương pháp đáp ứng bề mặt ngẫu nhiên (Response surface) để xác định thành phần dinh dưỡng và điều kiện lên men thích hợp cho sinh tổng hợp hiệu quả hoạt chất AVG bằng chủng S6. 2.2.2.3. Nghiên cứu làm sạch, thu hồi và tạo chế phẩm AVG có khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene cho trì hoãn quá trình chín quả Các thông số công nghệ được nghiên cứu cho làm sạch và thu hồi AVG là xác định điều kiện li tâm thích hợp cho tách loại bỏ xác tế bào và một số tạp chất trong dịch lên men (5000-10000 vòng/phút); xác định các chế độ tách, tinh sạch AVG bằng trao đổi ion (pH hấp phụ 2, pH rửa giải 12) là thời gian lưu và tốc độ dòng tháo đến hiệu quả hấp phụ AVG (0-60 phút, 7,5-500 ml/phút); thời gian lưu và tốc độ dòng rửa giải đến hiệu quả thu hồi AVG (0-60 phút, 7,5-500 ml/phút); pH thích hợp cho quá trình hấp phụ AVG trên cột trao đổi ion (pH 2-5); pH thích hợp cho dịch rửa giải AVG khỏi cột trao đổi ion (pH 10-12); nghiên cứu tăng cường khả năng tinh sạch AVG bằng nhiều cột trao đổi ion (3 lần); xác định nhiệt độ cô đặc dịch sau tinh sạch thích hợp (60-90 oC). Thực nghiệm sản xuất chế phẩm AVG ở quy mô lên men 100 lít/mẻ với thông số được nghiên cứu bổ sung là tốc độ khuấy (240-300 vòng/phút). Lựa chọn tốc độ khuấy cho sinh tổng hợp AVG ở mức cao nhất. Các điều kiện lên men, quy trình tách, thu hồi và cô đặc AVG được tiến hành dựa trên kết quả nghiên cứu ở điều kiện thí nghiệm. Xác định các thông số công nghệ của quá trình tạo chế phẩm AVG bằng phương pháp sấy phun: Phụ gia gồm maltodextrin, Polyvinyl pyrrolidone được phối trộn vào dịch chứa AVG cô đặc theo tỉ lệ khối lượng là 10% hoạt chất AVG. Xác định nhiệt độ thích hợp đầu vào của không khí sấy (145-165oC); nhiệt độ đầu ra (60-80oC); tốc độ bơm dịch nguyên liệu (15-35 vòng/phút). Đánh giá cảm quan, hiệu suất thu hồi của sản phẩm.
10. -8- Đánh giá chất lượng của chế phẩm AVG: * Các chỉ tiêu vật lý của chế phẩm AVG được đánh giá theo yêu cầu kỹ thuật của thuốc bảo vệ thực vật sinh học trong Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng thuốc bảo vệ thực vật theo thông tư số 12/2018/TT-BNNPTNT. So sánh với sản phẩm Retain. * Các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh (Salmonella, Escherichia coli, Coliforms), kim loại nặng (asen, chì) và chỉ số LD50 phân tích để đánh giá tính an toàn của chế phẩm AVG. * Hoạt tính ức chế sinh tổng hợp ethylene của chế phẩm AVG được đánh giá trên chuối tiêu hồng trong điều kiện bảo quản 20±0,5oC bằng phương pháp nhúng chế phẩm AVG ở nồng độ 124,5mg AVG/l trong túi LDPE 20µm và thùng carton. Theo dõi độ chín và sinh tổng hợp ethylene. So sánh với Retain. 2.2.2.4. Nghiên cứu khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG - Nghiên cứu khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG trong trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis): được thực hiện trên giống cam chanh (Citrus sinensis) trồng tại Hưng Yên. Thời điểm phun là trước khi thu hoạch dự kiến 15 ngày, số lần phun là 01 lần và không lặp lại. Nồng độ chế phẩm AVG sử dụng là 124,5mg/l tính theo lượng hoạt chất AVG. Đánh giá khả năng làm chậm chín, ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh hóa (hàm lượng nước, đường tổng số, acid tổng số, TSS, tỉ lệ TSS/acid, vitamin C), các chỉ tiêu cảm quan (màu sắc vỏ quả, màu sắc tép quả, mùi, vị quả), các chỉ tiêu sinh trưởng và năng suất cam của chế phẩm AVG. So sánh với kết quả sử dụng Retain ở điều kiện tương tự. - Nghiên cứu khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG trong trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish) Trước thu hoạch: thực hiện trên chuối tiêu hồng (Musa cavendish) trồng tại Thái Nguyên. Nồng độ chế phẩm AVG sử dụng là 124,5mg/l tính theo lượng hoạt chất AVG. Thời điểm phun: 75 ngày sau bẻ hoa. Theo dõi độ chín theo thời gian. Độ góc, độ cứng, tỉ lệ bột/vỏ, hàm lượng TSS của các mẫu chuối được đánh giá 10 ngày 1 lần từ ngày
11. -9- phun chế phẩm AVG đến khi chuối đạt độ chín 3. So sánh kết quả với Retain ở điều kiện tương tự. Sau thu hoạch: chuối sử dụng cho thí nghiệm là chuối được thu hoạch tại thời điểm 85 ngày sau bẻ hoa, độ chín 1. Nhúng chế phẩm AVG ở nồng độ 124,5mg/l tính theo lượng hoạt chất AVG. Bảo quản ở nhiệt độ 13,0±0,5oC túi LDPE 20µm và thùng carton. Theo dõi quá trình chín, độ cứng quả, hô hấp, sinh tổng hợp ethylene và độ ngọt (TSS/acid). Độ chín được theo dõi hàng ngày, hô hấp và ethylene theo dõi 2 ngày 1 lần và tại thời điểm có mẫu đạt độ chín 6, độ cứng của các mẫu chuối bảo quản được đo 1 tuần 1 lần và tại độ chín 6. Các chỉ tiêu TSS và acid được xác định ở độ chín 6. 2.3.4. Các phương pháp xử lý số liệu Xử lý thống kê bằng phần mềm Excel 2010, Data Analysis và SAS 9.1; Tối ưu hóa bằng phần mềm Design Expert 11. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng Streptomyces sp. có khả năng sinh tổng hợp hoạt chất AVG 3.1.1. Kết quả phân lập chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp AVG: Phân lập được 05 chủng ký hiệu S1, S2, S6, S7 và S8 có khả năng sinh tổng hợp AVG, trong đó chủng S6 cho khả năng sinh tổng hợp AVG cao nhất, đạt 51,53±0,62mg/l trên môi trường Gause II. Chủng S6 là chủng phân lập từ đất trồng cam ở Cao Phong, Hòa Bình. Hình 3.1. Khả năng sinh tổng hợp AVG của các chủng xạ khuẩn phân lập được trên môi trường Gause II
12. -10- 3.1.2. Đặc điểm hình thái chủng S6: Trên môi trường ISP4, khuẩn lạc chủng S6 dạng chắc, xù xì, có nếp nhăn, dạng nhung tơ, đường kính khuẩn lạc khoảng 1-5mm. Khuẩn ty khí sinh từ trắng xám đến vàng khi non và xám khi già, khuẩn ty cơ chất màu vàng cam, cuống sinh bào tử phân nhánh, chuỗi bào tử có cấu trúc xoắn và bào tử nhẵn, đường kính bào tử khoảng 1µm. a) b) c) d) Hình 3.2. Ảnh khuẩn lạc sau 7 (a), 14 (b), 21 (c) ngày nuôi cấy và ảnh bào tử của chủng S6 (d) 3.1.2. Định tên chủng S6: Phân tích trình tự gen 16S rARN của chủng S6, kết quả xác định cây phát sinh chủng loại cho thấy loài gần gũi với chủng S6 là chủng Streptomyces rochei NRRL B-2410 (T) với tỉ lệ tương đồng là 100%. Theo phân nhóm an toàn sinh học của các vi sinh vật có nhân thật - Prokaryotes năm 2010 của cộng hòa liên bang Đức (TRBA 466), chủng S. rochei NRRL B-2410 (T) thuộc nhóm các tác nhân sinh học an toàn sinh học cấp độ 1, an toàn để sản xuất. 3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến sinh trưởng và sinh tổng hợp hoạt chất AVG của chủng S6 3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn carbon: trong các nguồn carbon khảo sát, glucose cho khả năng sinh tổng hợp AVG cao nhất của chủng S6, đạt 51,53±1,74mg/l. Thấp nhất khi nguồn carbon là tinh bột. Hình 3.3. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến sinh tổng hợp AVG của chủng S6
13. -11- 3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ: nguồn nitơ hữu cơ cho khả năng sinh tổng hợp AVG của chủng S6 cao hơn so với các nguồn nitơ vô cơ và trong các nguồn nitơ khảo sát, pepton vẫn là nguồn nitơ là thích hợp nhất cho lên men sinh tổng hợp AVG từ chủng S6. Hình 3.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh tổng hợp AVG của chủng S6 2+ 3.2.3. Ảnh hưởng của các nguyên tố vi lượng: Fe (FeSO4.7H2O) là khoáng cho sinh tổng hợp AVG của chủng S6 cao nhất so với các nguyên tố khoáng còn lại nhưng không nhiều. Hình 3.5. Ảnh hưởng của một số nguyên tố vi lượng đến khả năng sinh tổng hợp AVG của chủng S6 3.2.4. Ảnh hưởng của các nguyên tố đa lượng bổ sung MgSO4 và CaCO3 cho khả năng tăng cường sinh tổng hợp AVG của chủng S6 tăng lên rõ rệt, đạt lần lượt 126,43±1,74mg/l và 162,06±2,00mg/l.
14. -12- Hình 3.6. Ảnh hưởng của một số nguyên tố đa lượng đến sinh tổng hợp AVG của chủng S6 3.2.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống: tỉ lệ tiếp giống 8x106 CFU/ml là cần thiết và thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG bằng chủng S6. Tỉ lệ tiếp giống thấp hơn cho tăng sinh chậm và lượng AVG tạo thành cũng thấp hơn, tỉ lệ tiếp giống cao hơn không cải thiện thêm lượng AVG. Chú thích: 2E+6 CFU/ml = 2x106CFU/ml và tương tự Hình 3.7. Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống đến sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG của chủng S6 3.2.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ: lượng AVG đạt cao nhất ở khoảng nhiệt độ 28oC-30oC, lần lượt là 243,93±3,94mg/l và 242,5±2,48mg/l theo thứ tự sau 48 giờ lên men. Nhiệt độ ngoài khoảng này là kém phù hợp hơn cho sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG của chủng S6.
15. -13- Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG của chủng S6 3.2.7. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan (DO): sinh tổng hợp AVG đạt cao nhất 258,20±0,24mg/l ở độ oxy hòa tan 7,5mg/l tương ứng với tốc độ lắc 250 vòng/phút trong bình tam giác ở điều kiện thí nghiệm. Hình 3.9. Ảnh hưởng của độ oxy hòa tan đến sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG của chủng S6 3.2.8. Ảnh hưởng của pH môi trường: sinh tổng hợp AVG đạt cao nhất trong khoảng pH 6,8-7,0 tuy ở pH 7,0 có thấp hơn nhưng không đáng kể, lần lượt đạt 258,36±1,99mg/l và 256,53±2,63mg/l. Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG của chủng S6
16. -14- 3.2.9. Động học sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG của chủng S6: AVG sinh tổng hợp nhanh và mạnh ngay trong pha log sau khi cấy chủng S6, đạt giá trị cực đại là 579,30±1,87mg/l sau 30 giờ lên men và giảm nhanh sau đó. Mặc dù kết quả phân tích cho thấy, sinh khối chủng S6 vẫn tiếp tục tăng và đạt cực đại 8,26±0,02g/l sau 36 giờ lên men và gần như ổn định nhiều giờ sau đó. Glucose tiêu hao chậm hơn và tốc độ tiêu hao khá tương ứng với sự hình thành sinh khối và gần như cạn kiệt sau 36 giờ lên men. Hàm lượng nitơ tổng số tiêu hao nhanh hơn và tương ứng với tốc độ sinh tổng hợp AVG. Hình 3.11. Động học sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG của chủng S6 3.2.10. Tối ưu hóa một số thông số kỹ thuật cho lên men sinh tổng hợp AVG bằng chủng S6: từ kết quả thực nghiệm kết hợp với phương trình tìm được điểm tối ưu cho hàm lượng AVG cao nhất. Nuôi cấy thực nghiệm với các điều kiện như xác định được từ mô hình tối ưu, với các giá trị o thực tế là nhiệt độ 29,5 C; pH 6,8; pepton 6,78g/l; CaCO3 1,35g/l; thời gian 31,1 giờ kết hợp với các yếu tố đã xác định còn lại là glucose 10g/l; cao thịt 1g/l; NaCl 5g/l; oxy hòa tan 7,5mg/l; tỉ lệ tiếp giống 8x106 CFU/ml. Kết quả thu được dịch lên men có hàm lượng AVG đạt 655,16±2,82mg/l. Hình 3.12. Sinh khối chủng S6 trước (CT1) và sau tối ưu (CT2)
17. -15- 3.3. Tinh sạch, thu hồi và tạo chế phẩm AVG 3.3.1. Tinh sạch dịch chứa AVG bằng li tâm: tế bào chủng S6 bị loại bỏ hoàn toàn từ tốc độ li tâm là 8000 vòng/phút khi kiểm tra dịch nổi và lượng AVG trong dịch được đảm bảo ở các tốc độ 8000 vòng/phút và 9000 vòng/phút với độ tinh sạch AVG lần lượt đạt 3,63 và 3,65%. Ở tốc độ li tâm 10000 vòng/phút, tổn thất đáng kể AVG đã xảy ra, chỉ còn 583,86±0,75mg trong tổng số 655,26±1,99mg ban đầu trong dịch lên men trước khi li tâm. 3.3.2. Tinh sạch dịch chứa AVG sau li tâm bằng trao đổi ion 3.3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian lưu dịch chứa AVG và tốc độ dòng tháo đến hiệu quả hấp phụ AVG trên cột trao đổi ion: lưu dịch chứa AVG trong cột từ 30 phút là cần thiết cho hấp phụ hoàn toàn AVG trên cột và tốc độ dòng tháo tương ứng thích hợp 15ml/phút trong điều kiện lượng hạt nhựa trao đổi là 450ml để AVG hấp phụ hiệu quả trên cột. Thời gian lưu thấp hơn gây tổn thất AVG trong dịch tháo. 3.3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian lưu và tốc độ dòng rửa giải đến hiệu quả thu hồi AVG từ cột trao đổi ion: hiệu quả thu hồi tăng dần khi giảm dần tốc độ rửa giải và tăng thời gian lưu dịch, đạt cao nhất khi dịch rửa giải được lưu trong 30 phút trước khi rửa giải với tốc độ 15ml/phút với lượng AVG thu hồi đạt 93,62%. Tăng thời gian lưu và giảm tốc độ rửa giải, hiệu quả thu hồi không tăng. 3.3.2.3. Ảnh hưởng của pH dịch cấp đến khả năng hấp phụ AVG của cột trao đổi ion: trong khoảng pH ≤3,5, AVG hầu hết được giữ lại trên cột. Để an toàn trong sản xuất, đề tài lựa chọn pH thích hợp của dịch cấp chứa AVG là 3,0. 3.3.2.4. Ảnh hưởng của pH dịch rửa giải đến hiệu suất thu hồi AVG từ cột trao đổi ion: ở pH càng cao thì hiệu suất thu hồi AVG từ cột trao đổi ion càng lớn và cao nhất từ pH = 11. Với pH >11, hiệu suất thu hồi không được cải thiện. 3.3.2.5. Mức độ tinh sạch AVG của dịch thu hồi sau trao đổi ion: AVG đã xuất hiện trong 100ml dịch đầu tiên, tăng dần và đạt cực đại 172,40±1,86mg ở phân dịch 301-400ml của dịch rửa giải và kết thúc ở
18. -16- phân dịch 800ml. Tổng lượng AVG và chất khô tổng số của dịch rửa giải được xác định lần lượt là 612,10±11,30mg và 764,53±10,07mg theo thứ tự, tương ứng với độ tinh sạch trung bình của dịch rửa giải là 80,06%. 3.3.2.6. Tăng cường tinh sạch AVG bằng nhiều cột trao đổi ion: trao đổi qua cột lần thứ 2, độ tinh sạch tăng, đạt 82,82%. Ở lần tinh sạch thứ 3, độ tinh sạch của AVG không được cải thiện. Hình 3.13. Sắc ký đồ chuẩn AVG 100ppm, cột Amino_axit_Xbrige Hình 3.14. Sắc ký đồ dịch lên men sau li tâm, cột Amino_axit_Xbrige Hình 3.15. Sắc ký đồ dịch lên men sau trao đổi ion lần 1, cột Amino_axit_Xbrige Hình 3.16. Sắc ký đồ dịch lên men sau trao đổi ion lần 2, cột Amino_axit_Xbrige
19. -17- 3.3.3. Cô đặc dịch sau tinh sạch bằng trao đổi ion: nhiệt độ dưới 70oC ít ảnh hưởng đến sự thay đổi hàm lượng của AVG. Ở nhiệt độ 75oC, màu sắc dịch ít biến động nhưng một phần AVG đã bị tổn thất, 4,27%. Ở nhiệt độ 80oC và 85oC, dịch cô đặc đã bị chuyển màu, AVG đã bị tổn thất đáng kể, 17,60 vaf 36,31% theo thứ tự. Lựa chọn nhiệt độ cô đặc dịch chứa AVG cho các nghiên cứu tiếp theo là 65oC. 3.3.4. Thực nghiệm lên men, tinh sạch và cô đặc dịch chứa AVG ở quy mô lên men 100 lít/mẻ: sử dụng các thông số công nghệ đã nghiên cứu ở phần tối ưu môi trường dinh dưỡng và các điều kiện lên men ở nội dung 3.2, tốc độ khuấy 260 vòng/phút cho sinh khối và lượng AVG được tạo ra cao nhất, đạt lần lượt 8,47±0,35g/l và 655,33±2,72mg/l với các pellet nhỏ và mịn. Tốc độ khuấy nhỏ hơn hoặc lớn hơn cho sinh khối thấp hơn và lượng AVG được sinh tổng hợp cũng thấp hơn. Độ tinh sạch của AVG sau các cột trao đổi ion đạt 82,7±0,44%, nồng độ AVG trong dịch sau cô đặc đạt 29,67 g/l. Bảng 3.1. Kết quả sản xuất, tinh sạch và cô đặc dịch chứa AVG quy mô 100 lít/mẻ TT Thông số dịch Đơn vị Kết quả tính 1 Hàm lượng AVG trong dịch lên men mg/l 655,33±2,72 2 Lượng dịch lên men l 98,03±1,45 3 Lượng dịch sau trao đổi ion l 80,30±1,38 4 Lượng dịch sau cô đặc l 2,05±0,89 5 Tổng lượng chất khô hòa tan (TSS) g 73,53±3,35 6 Hàm lượng AVG g 60,83±3,10 7 Tạp chất (6)-(7) g 12,70±0,24 8 Độ tinh sạch dịch chứa AVG (7):(6) % 82,7±0,44 9 Nồng độ AVG trong dịch cô đặc (6): (4) 3.3.5. Tạo chế phẩm AVG: 12% dịch AVG cô đặc tính theo tổng lượng chất khô được phối trộn với 87% maltodextrin, 1% polyvinyl pyrrolidone theo tỉ lệ khối lượng để dự kiến có được chế phẩm dạng bột chứa 10% hoạt chất AVG bằng phương pháp sấy phun.
20. -18- 3.3.5.1. Ảnh hưởng nhiệt độ đầu vào của không khí sấy đến hiệu suất o o thu hồi chế phẩm AVG: nhiệt độ T v là 155 C là cho chất lượng sản phẩm tốt nhất, bột khô ráo, độ ẩm thấp, 4,24%, hiệu suất thu hồi đạt 95,38%. Nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn cho cảm quan kém hơn và hiệu suất thu hồi thấp hơn. 3.3.5.2. Ảnh hưởng nhiệt độ đầu ra của không khí sấy đến hiệu suất thu hồi chế phẩm AVG: khoảng nhiệt độ 65oC-70oC cho sản phẩm có chất lượng bột tốt, hạt tơi, màu vàng sáng, hiệu suất thu hồi cao, đạt trên 95%. Nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn cho cảm quan kém và hiệu suất thu hồi cũng thấp hơn. Nhiệt độ đầu ra của tác nhân sấy là 65oC được lựa chọn tạo chế phẩm AVG. 3.3.5.3. Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi chế phẩm AVG: tốc độ bơm dịch ≤30 vòng/phút cho bột thu hồi tốt, hiệu suất thu hồi đạt trên 95%, hàm lượng AVG được đảm bảo. Tốc độ bơm dịch thấp hơn không cải thiện khả năng thu hồi, tốc độ bơm dịch cao hơn làm sản phẩm bị bết dính, hiệu suất thu hồi giảm. Tốc độ bơm dịch 30 vòng/phút được lựa chọn để tạo chế phẩm AVG. Hình 3.17. Chế phẩm AVG 3.3.6. Chất lượng của chế phẩm AVG 3.3.6.1. Các chỉ tiêu vật lý của chế phẩm AVG: các chỉ tiêu vật lý của chế phẩm AVG khá tương đồng với Retain, đáp ứng yêu cầu của một sản phẩm sinh học dạng bột ứng dụng trong nông nghiệp.
21. -19- Bảng 3.2. Chỉ tiêu vật lý của chế phẩm AVG TT Chỉ tiêu Thông tư số Chế phẩm Retain 12/2018/TT- AVG BNNPTNT 1 Trạng thái vật lý Dạng bột tơi Dạng bột tơi 2 Màu Màu vàng Màu vàng nhạt nhạt 3 Hàm lượng AVG 100,19±3,01 148,5±2,25 g/Kg g/Kg 4 Mức sai lệch phân <6% 3% 2% tích AVG (%) 5 Tỷ suất lơ lửng ở Hàm lượng 99,4±0,5% 99,2±0,7% 30±2oC trong 30 AVG trong dịch phút ≥60%. 6 Độ thấm ướt ở Hoàn toàn Hoàn toàn Hoàn toàn nhiệt độ thường và ở 54±2oC 7 Độ mịn thử rây Lượng cặn trên 0% 0% ướt 75µm ở nhiệt rây ≤2% độ thường và ở 54±2oC 8 Độ bọt ≤60ml 5,5±0,3ml 5,4±0,4ml 9 Độ bền bảo quản ở Hàm lượng 97,8±1,5% 98,1±2,3% nhiệt độ 54±2oC AVG còn lại ≥ trong 14 ngày 95% 10 Khối lượng riêng 0,82±0,13 0,78 ± 0,15 (g/cm3) 11 pH ở nồng độ 1% 6,9±0,2 6,9±0,4 12 pH ở nồng độ 10% 5,6±0,1 5,6±0,2 3.3.6.2. Các chỉ tiêu sinh học của chế phẩm AVG: hoạt tính ức chế S. cellulosae VTCC 41913 của chế phẩm AVG được cải thiện khi so sánh với dịch lên men chứa AVG ban đầu. Chế phẩm AVG không phát hiện Salmonella, E. Coli và Coliform. Hàm lượng As và Pb dưới mức cho phép 9 lần đối với chì và kém 357 lần đối với As, hoàn toàn đáp ứng yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm về hai kim loại asen và chì. Theo theo phân lớp độc tính, LD50 = (19,167 ± 0,539) g/kg của chế phẩm AVG được coi là vô hại.
22. -20- 3.3.6.3. Khả năng ức chế sinh tổng hợp ethylene trên quả tươi của chế phẩm AVG: chế phẩm AVG đã ảnh hưởng rất tích cực đến hoạt động sinh tổng hợp ethylene của chuối trong quá trình bảo quản, duy trì mức độ sinh tổng hợp ethylene rất thấp trong 12-13 ngày sau bảo quản, trong khi mẫu đối chứng chỉ duy trì được 3-4 ngày. 3.3.7. Quy trình tạo chế phẩm AVG dạng bột Chủng Cô đặc (65oC, 108 phút) Streptomyces sp. S6 Phối trộn phụ gia (1% Ho ạt hóa (môi trường CT2; o polyvinyl pyrrolidone; 87% 28,0 C; 07 ngày) malto dextrin và 12% dịch sau cô đặc) Nhân giống cấp 1 (4 lít; môi trư ờng CT2; 28-30oC; 250 Sấy phun (To 155oC; To vòng/phút; 24 giờ) v r 65oC; bơm dịch 30 vòng/phút) Lên men sinh tổng hợp Đóng gói (túi OPP trong bao AVG (100 lít; môi trường thiếc) CT2; tỉ lệ tiếp giống 8x106 CFU/ml ; 29,5oC; pH 6,8; DO 7,5mg/l; 31,1 giờ) Chế phẩm AVG 10% Ly tâm (8000-9000 vòng/phút, 4oC, 15 phút) Tách trao đổi ion (2 lần; pH hấ p phụ 3,0; pH rửa giải 11; tốc độ tháo, rửa 15ml/450ml hạt nhựa/phút Hình 3.18. Sơ đồ quy trình tạo chế phẩm AVG dạng bột
23. -21- 3.4. Khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG 3.4.1. Khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG trong trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch cam (Citrus sinensis) 3.4.1.1. Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến các chỉ tiêu sinh hóa của cam: chế phẩm AVG đã trì hoãn sự chín của cam, giúp kéo dài thời gian thu hoạch cam 45-55 ngày so với đối chứng và các chỉ số chất lượng như acid tổng số, vitamin C, đặc biệt hàm lượng nước trong quả vẫn ở mức cao (đạt 86,61±1,01%). Kết quả tương đương trong trường hợp sử dụng Retain ở cùng điều kiện. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến các chỉ tiêu sinh hóa của cam Số Hàm Đường Axit Tỉ lệ VTM C ngày Công lượng TSS tổng số tổng số TSS/ (mg/ sau thức nước (%) (%) (%) axit 100g) phun (%) ĐC 86,94±0,20 5,48±0,31 8,76±0,37 0,75±0,02 11,68 31,63±1,78 0 AVG 87,05±0,36 5,62±0,21 8,86±0,37 0,74±0,01 11,97 31,17±0,82 Retain 86,94±1,64 5,41±0,27 8,90±0,49 0,73±0,05 12,19 32,13±0,54 ĐC 87,05±0,47 7,87±0,19 10,36±0,94 0,59±0,03 17,56 36,04±0,93 15 AVG 86,79±0,47 5,86±0,36 9,4±0,49 0,72±0,02 13,06 30,52±0,86 Retain 87,29±0,35 5,27±0,11 9,33±0,37 0,73±0,01 12,78 31,09±1,76 ĐC 83,00±1,73 7,22±0,39 9,10±0,25 0,52±0,06 17,50 29,83±1,45 30 AVG 87,23±0,76 6,54±0,12 9,56±0,37 0,71±0,04 13,46 32,41±1,62 Retain 87,03±1,83 6,32±0,16 9,50±0,25 0,72±0,06 13,19 32,35±1,91 ĐC - - - - - - 40 AVG 87,42±0,79 6,54±0,29 9,73±0,51 0,67±0,06 14,31 32,85±0,62 Retain 86,88±0,34 6,67±0,90 9,66±0,62 0,69±0,07 14,00 33,00±0,65 ĐC - - - - - - 50 AVG 87,47±0,63 7,55±0,51 10,00±0,49 0,66±0,09 15,15 33,70±1,43 Retain 87,65±0,62 7,78±0,41 9,86±0,75 0,65±0,06 15,17 33,43±1,23 ĐC - - - - - - 60 AVG 87,49±0,64 7,51±0,42 10,03±0,51 0,64±0,07 15,67 34,72±0,86 Retain 87,50±0,44 7,81±0,45 9,90±0,49 0,65±0,06 15,23 34,66±0,53 ĐC - - - - - - 65 AVG 87,13±1,67 7,51±0,24 10,16±0,62 0,62±0,04 16,39 35,83±0,49 Retain 87,15±0,62 7,69±0,49 10,03±0,51 0,61±0,02 16,44 35,52±0,81 ĐC - - - - - - 70 AVG 86,61±1,01 7,83±0,29 10,06±0,51 0,57±0,10 17,65 36,36±0,61 Retain 86,58±0,70 7,94±0,53 10,03±0,75 0,58±0,05 17,29 36,11±0,54
24. -22- 3.4.1.2. Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến các chỉ tiêu cảm quan của cam: biến đổi các chỉ tiêu cảm quan là khá tương đồng với biến đổi các chỉ tiêu sinh hóa. Chế phẩm AVG giúp duy trì và cải thiện khá tốt mẫu mã quả. Các chỉ tiêu cảm quan là tương đương với công thức phun chế phẩm Retain ở hầu hết các thời điểm. 3.4.1.3. Ảnh hưởng của chế phẩm AVG đến sinh trưởng và phát triển của cây cam: xử lý chế phẩm AVG để kéo dài thời gian thu hoạch cam không làm ảnh hưởng đến sinh trưởng, các chỉ tiêu về quả và năng suất. Kết quả là tương đương với trường hợp sử dụng sản phẩm Retain. 3.4.2. Khả năng ứng dụng của chế phẩm AVG trong trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch và bảo quản chuối tiêu hồng (Musa cavendish) 3.4.2.1. Khả năng trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian thu hoạch chuối: xử lý chế phẩm AVG trì hoãn sự chín chuối từ 14-18 ngày so với chuối trong công thức đối chứng không được phun chế phẩm AVG. Chuối được phun chế phẩm AVG có độ tròn, độ cứng cao hơn và vỏ bóng hơn so với chuối trong công thức đối chứng. Kết quả là tương đương với trường hợp sử dụng sản phẩm Retain. Hình 3.19. Khả năng kéo dài thời gian thu hoạch chuối 3.4.2.2. Khả năng trì hoãn sự chín, kéo dài thời gian bảo quản chuối: sử dụng chế phẩm AVG đã cải thiện đáng kể khả năng bảo quản chuối, trong đó công thức phun trước thu hoạch kết hợp nhúng sau thu hoạch cho kết quả tốt nhất, giúp kéo dài thời gian bảo quản chuối lên đến 44 ngày so với 28 ngày ở công thức đối chứng, giảm hô hấp và sinh ethylene trong suốt quá trình bảo quản. Chế phẩm AVG không ảnh
25. -23- hưởng đến các chỉ tiêu chất lượng khác của chuối sau bảo quản như độ cứng, hàm lượng TSS, axit tổng số, độ ngọt và kết quả là tương đương với Retain trong hầu hết các chỉ tiêu theo dõi, phân tích. Hình 3.20. Tốc độ chín của chuối ở 13±0,5oC KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1. Đã phân lập và tuyển chọn được chủng xạ khuẩn S6 từ đất trồng cam ở Cao Phong, Hòa Bình có khả năng sinh tổng hợp AVG đạt 51,53±0,62mg/l trên môi trường Gause II. Trên môi trường ISP4, khuẩn lạc chủng S6 dạng chắc, xù xì, có nếp nhăn, dạng nhung tơ, đường kính khuẩn lạc khoảng 1-5mm. Khuẩn ty khí sinh từ trắng xám đến vàng khi non và xám khi già, khuẩn ty cơ chất màu vàng cam, cuống sinh bào tử phân nhánh, chuỗi bào tử có cấu trúc xoắn và bào tử nhẵn, đường kính bào tử khoảng 1µm. Dựa trên phân tích trình tự gen 16S rARN, chủng S6 có mức độ tương đồng 100% với chủng xạ khuẩn Streptomyces rochei NRRL B-2410 (T). 2. Đã xác định và tối ưu hóa được môi trường, điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp AVG của chủng S6 bằng kỹ thuật lên men là: pepton 6,78g/l; CaCO3 1,35g/l; glucose 10g/l; cao thịt 1g/l; NaCl 5g/l; nhiệt độ 29,5oC; pH 6,8; oxy hòa tan 7,5mg/l; tỉ lệ tiếp giống 8x106 CFU/ml, thời gian 31,1 giờ. Hàm lượng AVG trong dịch lên men đạt 655,16±2,82mg/l.
26. -24- 3. Đã nghiên cứu được quy trình tách, tinh sạch AVG từ dịch lên men chủng S6 đạt độ tinh sạch AVG 82,7%. Thông số kỹ thuật tách chiết, tinh sạch gồm: tốc độ li tâm 8000 - 9000 vòng/phút, tách trao đổi ion 02 lần, pH hấp phụ 3, pH rửa giải 11, thời gian lưu dịch trên cột ≥30 phút, tốc độ tháo, rửa 15ml/450ml hạt nhựa/phút, cô đặc ở nhiệt độ 65oC. 4. Đã tạo được chế phẩm AVG dạng bột chứa 10% hoạt chất AVG với phụ gia gồm 87% maltodextrin, 1% polyvinyl pyrrolidone và 12% dịch AVG cô đặc tính theo tổng lượng chất khô bằng sấy phun với nhiệt độ đầu vào của không khí sấy là 155oC; nhiệt độ đầu ra của không khí sấy là 65oC, tốc độ bơm dịch là 30 vòng/phút. Chế phẩm AVG đạt yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm với LD50 = (19,167 ± 0,539) g/kg và đáp ứng các yêu cầu kỹ thuật của thuốc bảo vệ thực vật sinh học. 5. Xử lý chế phẩm AVG với nồng độ 124,5mg AVG/l tại thời điểm trước thu hoạch 15 ngày giúp trì hoãn sự chín của cam chanh (Citrus sinensis) trồng tại Hưng Yên 45-55 ngày so với đối chứng, không ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của cam. Kết tương đương với sản phẩm Retain (Úc) khi ứng dụng cùng hàm lượng AVG. 6. Xử lý chế phẩm AVG với nồng độ 124,5mg/l ở thời điểm 75 ngày sau bẻ hoa giúp trì hoãn sự chín của chuối tiêu hồng (Musa cavendish) trồng tại Thái Nguyên 14-18 ngày so với không sử dụng chế phẩm. Phun kết hợp nhúng giúp tăng thời gian bảo quản chuối tiêu hồng lên 44 ngày so với 28 ngày ở mẫu đối chứng ở nhiệt độ 13,0±0,5oC. Kết quả sử dụng chế phẩm AVG là tương đương với Retain trong hầu hết các chỉ tiêu theo dõi, phân tích. Kiến nghị Cần tiếp tục nghiên cứu khả năng phối hợp của AVG với các chất khác và các phương pháp sẵn có để tăng cường phạm vi và hiệu lực ứng dụng của AVG. Cần tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm AVG ở quy mô lớn hơn để có thể sản xuất được số lượng đủ lớn với chất lượng đảm bảo, đáp ứng nhu cầu thực tiễn sản xuất chuối, cam cũng như nhiều loại sản phẩm rau, hoa, quả khác, góp phần thực hiện tái cơ cấu ngành nông nghiệp, nâng cao giá trị gia tăng trong sản xuất rau, hoa, quả phục vụ nội tiêu và xuất khẩu.
27. DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Nguyen Nguyen Van, Quang Trinh Khac, Tuan Pham Anh, (2017), “The influence of some nutrient sources on growth and Aminoethoxyvinyl glycine (AVG) production by Streptomyces sp. S6”, Proceedings of the 15th ASEAN Conference on Food Science and Technology, November 14-17, 2017 Ho Chi Minh City, Viet Nam, Volume 1, pp. 212-217. 2. Nguyễn Văn Nguyện, Trịnh Khắc Quang, Phạm Anh Tuấn, (2019), “Ứng dụng chế phẩm AVG (Aminoethoxyvinyl glycine) kéo dài thời gian thu hoạch cam chanh (Citrus sinensis) tại Hưng Yên”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số 18, tr. 44-49. 3. Nguyễn Văn Nguyện, Trịnh Khắc Quang, Phạm Anh Tuấn, (2019), “Nghiên cứu xác định thông số công nghệ của quá trình tạo chế phẩm AVG bằng phương pháp sấy phun”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số 21/2019, tr. 43-49.