Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược

1. VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Thu Hằng NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VIRUS TÁI TỔ HỢP LÀM VACCINE PHÒNG CHỐNG CÚM A/H5N1 BẰNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN NGƯỢC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 9 42 01 21 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. TS. Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học 2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà Viện Công nghệ sinh học học Hà Nội, 2019
2. Luận án được hoàn thành tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Nguyễn Trung Nam, Viện Công nghệ sinh học 2. PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận án phiên chính thức Họp tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi: giờ phút, ngày tháng năm 2019 Có thể tìm đọc Luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trang web của Bộ giáo dục và đào tạo (website: - Thư viện của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
3. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cúm A/H5N1 là bệnh truyền nhiễm cấp tính ở người và gia cầm, do virus cúm A subtype H5N1 thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Trong nhóm virus cúm A, virus A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI H5N1) thường gây chết gia cầm hàng loạt, có thể lây nhiễm sang người nên luôn là mối nguy hiểm tiềm ẩn trong chăn nuôi gia cầm và sức khỏe cộng đồng. Biện pháp phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm hiệu quả là tiêm phòng vaccine. Ở Việt Nam, công tác sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm từ năm 2003 (dịch cúm do virus HPAI H5N1 lần đầu xuất hiện) đến nay vẫn chủ yếu sử dụng chủng virus gốc tái tổ hợp lắp ráp bằng di truyền ngược có nguồn gốc từ nước ngoài. Sự phụ thuộc vào chủng giống nhập ngoại khiến công tác sản xuất vaccine cúm gia cầm ở Việt Nam thiếu tính chủ động và gặp nhiều khó khăn. Để chủ động đối phó với những diễn biến phức tạp của các dịch cúm gia cầm có khả năng bùng phát, Việt Nam cần xây dựng và làm chủ qui trình ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược (Reverse Genetics) để chủ động tạo ra các chủng virus vaccine có hiệu quả bảo hộ cao với những chủng virus đang lưu hành trong nước. Trong số các clade virus cúm HPAI H5N1 đã và đang lưu hành ở Việt Nam, clade 1.1 và clade 2.3.2.1c có tính tương đồng kháng nguyên và đặc tính di truyền với nhiều clade virus gây dịch ở Việt Nam nên đáp ứng yêu cầu của chủng dự tuyển vaccine phòng chống cúm A/H5N1. Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn, luận án tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo chủng virus tái tổ hợp làm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược”. Mục tiêu nghiên cứu Tạo được chủng virus cúm tái tổ hợp làm giống gốc cho sản xuất vaccine phòng chống bệnh cúm gia cầm do virus độc lực cao A/H5N1 clade 1.1 và A/H5N1 clade 2.3.2.1c gây nên bằng ứng dụng kỹ thuật di truyền ngược. Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập cDNA của 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) mã hóa các protein khung của virus cúm A/PR/8/34 và tách dòng riêng rẽ từng gen vào plasmid pHW2000. 2. Thiết kế và tách dòng hai gen H5 HA (đã được loại bỏ các amino acid kiềm ở vị trí vùng độc và tránh lại độc) và hai gen N1 NA của chủng A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) (clade 1.1) và A/duck/Viet Nam/HT- 02/2014(H5N1) (clade 2.3.2.1c) vào plasmid pHW2000. 3. Chuyển nhiễm hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen (6 plasmid mang phân đoạn gen khung + 2 plasmid mang gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c) vào tế bào 293T để tái tạo hai loại virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c. 4. Phân lập và tuyển chọn chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đáp ứng yêu cầu của chủng ứng viên vaccine: Có khả năng thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi với hiệu giá HA cao, có tính ổn định di truyền. 5. Xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu (hiệu giá HI) của hai chủng virus ứng viên vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c ở gà sạch 3 ngày tuổi. Đóng góp mới của luận án 1. Là công trình khoa học đầu tiên chứng minh Việt Nam đã làm chủ công nghệ di truyền ngược để tái tạo hiệu quả chủng virus ứng viên vaccine cúm A. Trong tương lai, trên cơ sở đã nắm vững qui trình công nghệ tạo chủng virus gốc bằng di truyền
4. ngược, có thể kiểm soát kịp thời dịch bệnh cúm A/H5N1 ở gia cầm bằng ứng dụng công nghệ di truyền ngược để lắp ráp nhân tạo nhanh chủng virus ứng viên cho sản xuất vaccine có hiệu quả phòng vệ với các biến chủng virus mới xuất hiện. 2. Đã tối ưu một số yếu tố công nghệ trong qui trình chuyển nhiễm hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen vào tế bào 293T cho tái tạo chủng virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp. 3. Tạo hai chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 (rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg- A/H5N1 clade 2.3.2.1c) có khả năng thích ứng nhân lên với hiệu suất cao trong trứng gà sạch có phôi (hiệu giá HA ≥ 1: 1024 ở thế hệ P1 - P5), có tính ổn định di truyền và kích thích sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tạo kháng thể ở gà sạch 3 ngày tuổi (100% gà tiêm kháng nguyên virus có hiệu giá kháng thể đạt HI ≥ 4 log 2 ở tuần 2 và tuần 4 sau tiêm phòng). Cấu trúc luận án Luận án gồm 150 trang, được chia thành các phần: - Mở đầu: 4 trang - Chương 1. Tổng quan tài liệu: 34 trang - Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 25 trang - Chương 3. Kết quả nghiên cứu: 50 trang - Chương 4. Bàn luận kết quả: 14 trang - Kết luận và kiến nghị: 1 trang - Các công trình đã công bố của tác giả: 1 trang. - Tóm tắt nội dung luận án bằng tiếng Anh: 5 trang - Tài liệu tham khảo: 16 trang Luận án có 20 bảng số liệu, 36 hình và 172 tài liệu tham khảo gồm tài liệu tiếng Việt và tài liệu tiếng Anh. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về virus cúm A/H5N1 Virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có genome RNA sợi đơn, âm (ss(-)RNA), gồm 8 phân đoạn genome, trong đó 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) mã hóa các protein tạo bộ khung và 2 phân đoạn gen mã hóa protein kháng nguyên (HA, NA) định vị trên bề mặt virion. Nhóm virus cúm A được phân thành nhiều subtype khác nhau dựa trên kháng nguyên HA (Hemagglutinin) và NA (Neuraminidase) với 18 subtype HA (H1- H18) và 11 subtype NA (N1 - N11), có khả năng tái tổ hợp để tạo nên hàng trăm subtype khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh. Trong số các subtype virus cúm A, subtype H5N1 đã được chứng minh có khả năng lây nhiễm từ động vật sang người. Các chủng virus cúm A/H5N1 độc lực cao - Highly Pathogenic Avian Influenza (HPAI) H5N1- có thể lây nhiễm nhanh trên nhiều loại gia cầm, động vật có vú và người với khả năng đột biến cao và tái tổ hợp di truyền lớn. Protein HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstrom (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa) nối với nhau bằng một đoạn oligopeptide ngắn giàu các amino acid kiềm arginine (R) và lysine (K) ở vị trí amino acid 338 – 345/346. Đặc điểm của vị trí giàu các amino acid kiềm giữa HA1 và HA2 quy định tính độc của virus nên được gọi là “vùng độc”: Ở vị trí vùng độc, các chủng virus A/H5N1 độc lực cao chứa một nhóm amino acid kiềm, trong khi các chủng virus A/H5N1 độc lực thấp chỉ chứa 1 amino acid kiềm arginin hoặc lysine (Suzuki et al., 2005). Protein NA có hoạt tính enzyme Neuraminidase, xúc tác phản ứng cắt mối liên kết glycoside giữa thụ thể chứa sialic acid trên bề mặt tế bào chủ và gai glycoprotein trên vỏ
5. virus, giúp virus xâm nhiễm vào tế bào chủ (Yano et al., 2008; da Silva et al., 2015). 1.2. Vaccine phòng chống cúm A/H5N1 ở gia cầm Vaccine cúm A cần được làm mới (thay đổi chủng giống) hàng năm để chắc chắn có hiệu lực phòng vệ với các chủng virus đang lưu hành hay mới xuất hiện. Đây là một trong những trở ngại, thách thức và gây khó khăn cho việc sản xuất vaccine, nhưng là cần thiết để thích ứng với khả năng tiến hóa rất nhanh, dễ xuất hiện biến chủng do sự chuyển dịch kháng nguyên, đột biến và tái tổ hợp gen xảy ra phổ biến ở virus cúm (Pronker et al., 2012). Hướng dẫn của WHO cho phát triển nhanh chủng virus vaccine vừa có đặc tính kháng nguyên (quy định bởi phân đoạn gen HA và NA) giống các chủng virus đang lưu hành, vừa có khả năng nhân lên tạo hạt virus với hiệu suất cao là tái tạo chủng virus tái tổ hợp làm ứng viên vaccine có bộ gen được lắp ráp nhân tạo theo công thức 6 + 2 (6 phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/1934(H1N1) và 2 phân đoạn gen mã hóa protein kháng nguyên - HA và NA - của virus hoang dại đang lưu hành). 1.3. Di truyền của các clade virus cúm A/H5N1 ở Việt Nam Quá trình hình thành các clade cúm HPAI H5N1 đã từng gây dịch ở Việt Nam rất phức tạp với các clade xuất hiện phổ biến như sau: - Giai đoạn năm 2003 đến 2006: Clade 1 và clade 2.3.2 xuất hiện và gây dịch trên phạm vi toàn quốc. - Giai đoạn năm 2007 đến 2013: Xuất hiện chủ yếu các biến chủng thuộc ba clade: 1.1, 2.3.4 và 2.3.2.1. Trong đó: Clade 2.3.4 xuất hiện năm 2007 và gây dịch bệnh trên gia cầm giai đoạn 2007 - 2010, từ năm 2011 đến 2013 không thấy xuất hiện; clade 1.1 phát sinh từ clade 1, xuất hiện năm 2007 và gây bệnh chủ yếu ở các tỉnh phía Nam, từ năm 2011 phân nhánh thành clade 1.1.1 và clade 1.1.2; clade 2.3.2 xuất hiện lần đầu năm 2005, từ năm 2009 được phân nhánh thành clade 2.3.2.1, sau đó tiếp tục phân thành các nhánh 2.3.2.1 nhóm A (clade 2.3.2.1a), 2.3.2.1 nhóm B (clade 2.3.2.1b) và 2.3.2.1 nhóm C (clade 2.3.2.1c). Trong số các clade thuộc nhánh 2.3.2.1, virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1c gây dịch trên diện rộng (từ Bắc vào Nam). - Giai đoạn từ năm 2014 đến nay: Clade 2.3.2.1c tiếp tục lưu hành, clade 2.3.4 phân nhánh thành clade 2.3.4.4 và clade 1.1 có nguy cơ bùng phát trở lại (Chu et al., 2016, Nguyen et al., 2017; Mellor et al., 2018). 1.4. Áp dụng kỹ thuật di truyền ngược trong nghiên cứu phòng chống virus cúm A Kỹ thuật di truyền ngược (Reverse Genetics) được ứng dụng phổ biến trên thế giới trong nghiên cứu tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A từ các cDNA của virus đã được tạo dòng vào plasmid. Ưu điểm của kỹ thuật là cho phép thao tác với genome virus ở mức độ phân tử để tạo hạt virus mang đặc tính mong muốn (Chen et al., 2012; Palese & Shaw, 2007; Neumann et al., 2004). Trong số các hệ thống di truyền ngược được ứng dụng hiệu quả và đáp ứng mục tiêu trong thời gian ngắn tạo chủng virus vaccine hiệu quả là hệ thống gồm 8 plasmid pHW2000 mang PolI-PolII của Hoffmann và đtg (2000). Sự có mặt của phức hợp PolI-PolII trên cùng một plasmid cho phép sinh tổng hợp cả mRNA của virus (nhờ PolII) và vRNA (nhờ PolI) trong tế bào động vật từ cùng một phân đoạn cDNA của virus đã được dòng hóa vào plasmid, cho phép hạt virus tái tổ hợp được tái tạo hiệu quả. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Chủng NIBRG-14 Chủng NIBRG-14 do NIBSC (Vương quốc Anh) cung cấp là nguồn vật liệu cho phân lập 6 phân đoạn gen khung (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) nguồn gốc từ virus A/PR/8/34.
6. Plasmid và chủng khuẩn Plasmid pHW2000 được cung cấp bởi Dr. Erich Hoffmann và Dr. Robert G. Webster (Bệnh viện Nhi St. Jude, Mỹ), là plasmid chứa phức hợp PolI-PolII hai chiều. Chủng E. coli DH5α [end A1 rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi-1 relA1 lac U169 (80 lacZM15)] của hãng Invitrogen (Mỹ) được dùng trong chọn dòng và nhân dòng gen. Cặp mồi sử dụng Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu cho nhân bản và xác định trình tự 8 phân đoạn gen của virus cúm A được thiết kế theo Hoffmann và đtg (2001). Tế bào Tế bào 293T và tế bào MDCK được cung cấp bởi ATCC (American Type Culture Collection, Mỹ). Trứng gà sạch có phôi và gà sạch 3 ngày tuổi Trứng gà sạch có phôi 9 - 11 ngày tuổi và gà sạch 3 ngày tuổi được cung cấp bởi Trung tâm Giống gia cầm Thụy Phương (Viện Chăn nuôi), đã được kiểm định sạch virus/kháng thể đặc hiệu với virus A/H5N1 và Newcastle. 2.2. Địa điểm nghiên cứu Tất cả các thí nghiệm biến nạp và tái tạo virus A/H5N1 tái tổ hợp bằng di truyền ngược, nhân giống virus, kiểm tra virus đều thực hiện trong phòng thí nghiệm an toàn cấp 2+ của Viện Công nghệ sinh học. Các thao tác tiến hành với virus (cấy truyền, thu nhận, xác định sự có mặt của virus ) được thực hiện trong box cấy an toàn sinh học cấp 2. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phân lập sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 Tách chiết RNA tổng số của chủng NIBRG-14 (mang 6 phân đoạn gen khung từ virus A/PR/8/34 [PR8] bằng kit Tripure Isolation Reagent (Invitrogen, Mỹ). Nhân bản sáu phân đoạn gen khung của virus PR8 từ các mẫu vRNA tổng số bằng phương pháp RT-PCR hai bước để chuyển hóa vRNA thành cDNA (bước 1) và PCR khuếch đại cDNA (bước 2) theo phương pháp của Hoffmann và đtg (2001). 2.3.2. Thiết kế gen kháng nguyên HA và NA của virus A/H5N1 clade 1.1 và 2.3.2.1c Hai gen HA và hai gen NA của hai clade virus (clade 1.1 và 2.3.2.1c) được thiết kế có cấu trúc: Tương ứng ở hai đầu gen là hai đoạn nucleotide không mã hóa chứa điểm bắt cặp đặc hiệu của mồi xuôi và mồi ngược trong phản ứng PCR nhân gen; ở giữa là vùng mã hóa chứa trình tự nucleotide của gen H5 HA và gen N1 NA tương ứng. Đặc biệt, để đảm bảo virus tái tổ hợp lắp ráp bằng di truyền ngược là virus độc lực thấp, hai phân đoạn gen H5 HA của hai clade virus đều được loại vùng độc (loại các nucleotide mã hóa các amino acid kiềm arginine (R) và lysine (K) ở vị trí giữa HA1 và HA2) và tránh lại độc (Hình 2.1) Hình 2.1. Trình tự nucleotide và amino acid của gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c trước và sau khi xử lý loại vùng độc và tránh lại độc
7. 2.3.3. Ghép nối các phân đoạn gen của virus cúm A vào plasmid pHW2000 tạo hệ thống plasmid đơn gen 10 mẫu DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc đã được chọn dòng (6 dòng dương tính với plasmid tái tổ hợp chứa các phân đoạn gen khung + 2 dòng dương tính với gen kháng nguyên H5 và N1 của clade 1.1 + 2 dòng mang gen kháng nguyên H5 và N1 của clade 2.3.2.1c) được tách và tinh sạch, sử dụng kit High Pure Plasmid Isolation (Roche, Đức). Các plasmid tái tổ hợp được cắt bằng enzyme giới hạn, thu nhận gen đích và ghép nối gen vào plasmid pHW2000 theo phương pháp của Hoffmann và đtg (2001). 2.3.4. Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T để tái tạo virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Thực hiện 2 công thức chuyển nhiễm 6 + 2 plasmid vào tế bào 293T: (i) 6 plasmid mang 6 phân đoạn gen khung từ chủng A/PR/8/34 kết hợp với 2 plasmid mang gen kháng nguyên H5 và N1 từ clalde 1.1; (ii) 6 plasmid mang 6 phân đoạn gen khung từ chủng A/PR/8/34 kết hợp với 2 plasmid mang gen kháng nguyên H5 và N1 từ clalde 2.3.2.1c. Xác định sự có mặt của virus tái tổ hợp trong dịch nuôi cấy bế bào sau chuyển nhiễm plasmid bằng kỹ thuật RT-PCR một bước. Các mẫu có kết quả RT-PCR dương tính với sự có mặt của virus tái tổ hợp thế hệ P0 được thu nhận riêng rẽ và ghi ký hiệu là virus rg- A/H5N1 clade 1.1 hoặc rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c (tương ứng). 2.3.5. Nhân giống virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong trứng gà sạch có phôi Các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c tái tổ hợp được cấy nhân giống trong trứng gà sạch có phôi 9 - 11 ngày tuổi. Ủ trứng trong tủ ấm ở 35°C, độ ẩm 60% trong 48h. Thu hoạch dịch niệu trong từng quả trứng (chứa virus tái tổ hợp thế hệ P1) riêng rẽ vào các ống vô trùng. Xác định sự có mặt của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg- A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong dịch niệu trứng bằng các phương pháp: (i) Xác định hiệu giá HA, (ii) xác định hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) và khả năng tạo plaque trên đĩa nuôi cấy tế bào MDCK trong thí nghiệm plaque assay theo hướng dẫn của WHO (2011). 2.3.6. Phân lập chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c được phân lập từ các mẫu virus thế hệ P1 có kết quả kiểm tra hiệu giá HA và hiệu giá virus cao. Thí nghiệm phân lập virus thực hiện theo hướng dẫn của WHO (2011). 2.3.7. Nuôi cấy và thích nghi chủng virus trong trứng gà sạch có phôi và xác định tính ổn định di truyền của chủng virus Chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1 được cấy truyền vào trứng gà sạch có phôi thêm 4 lần tiếp theo để thu nhận virus thế hệ từ P2 - P5. Xác định hiệu giá HA, tính đầy đủ về di truyền (thể hiện ở sự có mặt của cả 8 phân đoạn gen trong genome virus) và tính ổn định di truyền gen kháng nguyên (thể hiện ở trình tự các gen kháng nguyên H5 HA và N1 NA không bị biến đổi) của các chủng virus thế hệ P5. 2.3.8. Tạo vaccine trong phòng thí nghiệm từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Dịch niệu trứng thu hoạch từ thế hệ P2 đến P5 của hai chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đáp ứng tiêu chí của chủng virus ứng viên vaccine (có khả năng thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi với hiệu giá HA cao, có tính ổn định di truyền gen kháng nguyên H5 và N1) được làm đồng nhất đến cùng hiệu giá HA 1: 1024. Tiến hành vô hoạt virus, tạo hai loại vaccine cúm vô hoạt nhũ dầu từ hai chủng virus. 2.3.9. Xác định khả năng kích thích sinh miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu trên gà sạch 3 ngày tuổi của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Vaccine từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c sau khi đã kiểm tra
8. đảm bảo tính an toàn được tiêm phòng cho gà sạch 3 ngày tuổi theo 2 công thức: (i) Tiêm 1 liều 0,5 ml vaccine cho gà 3 ngày tuổi; (ii) tiêm 2 liều: Liều 1 tiêm 0,2 ml vaccine cho gà 3 ngày tuổi, tiêm nhắc lại (liều 2) 0,5 ml vaccine lúc gà 13 ngày tuổi. Mỗi công thức thí nghiệm tiêm 20 gà. Xác định hiệu quả sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu của từng loại vaccine bằng phương pháp xác định hiệu giá HI (hiệu giá ức chế khả năng gây ngưng kết hồng cầu) sau 2 tuần và 4 tuần tiêm phòng. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tách dòng sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 vào plasmid pHW2000 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số của chủng NIBRG-14 mang sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 Kiểm tra chất lượng các mẫu vRNA tổng số sau tách chiết bằng đo nồng độ và độ tinh sạch trên máy Nanodrop cho kết quả nồng độ vRNA là 30,1 - 46,2 ng/µl và độ tinh sạch thể hiện ở tỷ số A260/280 khoảng 1,86 - 1,92. 3.1.2. Khuếch đại, xác định trình tự và chọn dòng sáu phân đoạn gen khung Sáu phân đoạn gen khung (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 [PR8] được nhân bản bằng kỹ thuật RT-PCR hai bước theo phương pháp của Hoffmann và đtg (2001): Bước 1 - chuyển hóa vRNA → cDNA; bước 2 - PCR khuếch đại cDNA → dsDNA. Trong phản ứng ở bước 1, sử dụng Reverse transcriptase với mồi Uni12 để chuyển toàn bộ các phân đoạn ssRNA sợi âm trong genome virus thành các phân đoạn cDNA. Mồi Uni 12 có chiều dài 12 nucleotide (5’-AGCAAAAGCAGG- 3’), bắt cặp bổ sung với 12 nucleotide bảo thủ có ở tất cả các đầu 3’ của các phân đoạn gen virus. Các phân đoạn cDNA là sản phẩm của bước 1 được sử dụng làm khuôn cho bước 2: Thực hiện 6 phản ứng PCR khuếch đại 6 gen khung với 6 cặp mồi đặc hiệu cho nhân bản từng gen khung. Quá trình RT-PCR hai bước được sơ đồ hóa ở Hình 3.1. Hình 3.1. Khuếch đại sáu phân đoạn gen khung của virus A/PR/8/34 ứng dụng kỹ thuật RT-PCR hai bước với mồi Uni12 Kiểm tra sản phẩm của 6 phản ứng RT-PCR nhân bản riêng rẽ 6 phân đoạn gen khung bằng điện di trên gel agarose 1,5% (Hình 3.2) cho thấy: 6 phân đoạn gen khung - PB2, PB1, PA, NP, M và NS - đã được nhân bản thành công từ mẫu vRNA của chủng NIBRG-14, với sản phẩm RT-PCR của mỗi phân đoạn gen khung đều chứa ít nhất một mẫu nhân bản thành công băng vạch đặc hiệu, sáng, rõ nét, kích thước tương ứng với kích thước tính toán theo lý thuyết của từng gen. Các sản phẩm RT-PCR của sáu phân đoạn gen khung được tách dòng vào plasmid
9. pBT, biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α. Sàng lọc các dòng khuẩn mang plasmid pBT tái tổ hợp bằng phương pháp conoly-PCR. DNA plasmid của các dòng vi khuẩn dương tính với phản ứng conoly-PCR được tách chiết, tinh sạch và xác định trình tự nucleotide gen đích với hai loại mồi là mồi đặc hiệu gen và mồi bắt cặp plasmid. Mỗi phân đoạn gen đều được xác định trình tự nucleotide theo cả chiều xuôi và chiều ngược. Kết quả về trình tự nucletide được so sánh để xác định trình tự đầy đủ và đúng của từng gen. Trên cơ sở về trình tự nucleotide của từng gen đã nhận được, tiến hành so sánh với trình tự nucleotide của phân đoạn gen tương ứng ở virus PR8 trong ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI. Bên cạnh đó, kết quả về trình tự nucleotide được chuyển sang trình tự amino acid suy diễn và so sánh có hay không sự sai khác về trình tự amino acid của từng gen đã tách dòng trong plasmid pBT với trình tự amino acid đầy đủ đảm bảo để thực hiện chức năng của các gen khung từ chủng PR8. A B C D E F Hình 3.2. Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR nhân bản sáu phân đoạn gen mã hóa các protein khung của virus NIBRG-14 Ghi chú: M: Marker 1kb (Fermentas) A. Phân đoạn gen PB2 có 3 mẫu (1, 2, 3) nhân bản băng kích thước tương ứng gen PB2 B. Phân đoạn gen PB1 có 2 mẫu (1, 2) nhân bản băng kích thước tương ứng gen PB1 C. Phân đoạn gen PA có 1 mẫu nhân bản băng đặc hiệu kích thước tương ứng gen PA D. Phân đoạn gen NP có 3 mẫu (1, 2, 3) nhân bản băng kích thước tương ứng gen NP E. Phân đoạn gen M có 2 mẫu (2, 3) nhân bản băng kích thước tương ứng gen M F. Phân đoạn gen NS có 3 mẫu (1, 2, 3) nhân bản băng kích thước tương ứng gen NS Kết quả so sánh về trình tự nucleotide và amino acid làm cơ sở cho chọn dòng plasmid trình bày ở Bảng 3.1 cho thấy: Tương ứng với mỗi phân đoạn gen khung, đều chọn lọc được 1 - 3 dòng khuẩn mang cDNA có trình tự nucleotide mã hóa trình tự amino acid khộng thay đổi (giống 100%) so với trình tự của sáu gen khung của virus PR8 trong NCBI ( Số lượng các dòng khuẩn chuyển nạp plasmid tái tổ hợp mang gen quan tâm có trình tự nucleotide không thay đổi so với trình tự gen tương ứng của chủng PR8 như sau: Gen PB2 - 2 dòng; gen PB1 - 3 dòng; gen PA - 1 dòng; gen NP - 2 dòng; gen M - 2 dòng và gen NS - 2 dòng. Bên cạnh các dòng mang gen đích có trình tự nucleotide không thay đổi so với virus PR8, có một số dòng có trình tự nucleotide xuất hiện đột biến điểm làm thay đổi 1 bp trên gen, dẫn đến sự thay đổi 1 amino acid của
10. protein do gen mã hóa hoặc không thay đổi về trình tự amino acid (trường hợp thay đổi nucleotide nhưng bộ ba nucleotide thay đổi vẫn mã hóa cùng một amino acid). Sự biến đổi này có khả năng xuất phát từ các đột biến điểm xảy ra trong hệ genome của quần thể virus NIBRG-14 trong dịch niệu trứng, và là kết quả của sai sót xảy ra trong sao chép genome của phức hợp polymerase - RdRp - của virus cúm A (loại virus điển hình về khả năng tiến hóa nhanh, dễ biến đổi di truyền và xuất hiện đột biến điểm trong quá trình sao chép genome do polymerase khi hoạt động có tần số xuất hiện đột biến cao). Bảng 3.1. So sánh trình tự nucleotide và amino acid của sáu phân đoạn gen khung đã phân lập với các gen tương ứng của chủng PR8 Gen Ký hiệu Kích thước Vị trí thay đổi so với trình tự gen dòng khuẩn gen tương ứng của chủng PR8 lạc (nucleotide) Vị trí nucleotide Vị trí amino acid thay đổi thay đổi cl1 T1855C F619L PB2 cl2 KTĐ KTĐ cl3 2341+29 KTĐ KTĐ cl4 A1574G E525G cl1 KTĐ KTĐ PB1 cl2 T290C L97S cl3 2341+29 KTĐ KTĐ cl4 KTĐ KTĐ PA cl1 2233+29 G861A, T1879C W627R cl2 KTĐ KTĐ cl1 G567A KTĐ NP cl2 1565+29 KTĐ KTĐ cl3 KTĐ KTĐ cl1 KTĐ KTĐ M cl2 1027+29 C395T T132I cl3 KTĐ KTĐ NS cl1 890+29 KTĐ KTĐ cl2 KTĐ KTĐ KTĐ: Không thay đổi; 29: Các nucleotide thiết kế thêm ở hai đầu của mồi nhân gen Để tạo bộ plasmid tái tổ hợp chứa các phân đoạn gen khung có trình tự nucleotide đầy đủ và không thay đổi so với các trình tự gen khung của virus PR8, luận án lựa chọn tương ứng với mỗi gen khung một dòng DNA plasmid có trình tự nucleotide của gen đích giống 100% so với phân đoạn gen khung tương ứng của virus PR8 trên ngân hàng NCBI để dòng hóa vào plasmid pHW2000. 3.1.3. Ghép nối sáu phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000 Sáu phân đoạn gen khung được cắt thu nhận từ plasmid pBT tái tổ hợp để tách dòng vào plasmid pHW2000 theo phương pháp của Hoffmann và đtg (2001). Sáu plasmid pBT tái tổ hợp được cắt bằng BsmBI hoặc BsaI. Sản phẩm của 6 phản ứng cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 2% (Hình 3.3). Các băng vạch có kích thước đúng với kích thước lý thuyết của từng gen khung trên bản điện di được cắt và thu nhận bằng phương pháp thôi gel, tinh sạch gen. Ghép nối riêng rẽ 6 phân đoạn gen khung vào plasmid pHW2000 đã được cắt mở vòng bằng BsmBI tạo 6 plasmid tái tổ hợp mang 6 phân đoạn gen khung. Kiểm tra sự có mặt của 6 phân đoạn gen khung trong 6 mẫu plasmid pHW2000 tái tổ hợp bằng phương pháp PCR với hai loại mồi là mồi đặc hiệu cho nhân bản từng phân đoạn gen và mồi bắt cặp trên plasmid. Sản phẩm PCR nhân bản 6 phân đoạn gen bằng mồi đặc
11. hiệu gen đều xuất hiện một băng vạch duy nhất có kích thước đúng kích thước theo tính toán lý thuyết của từng gen (gen PB2: ~ 2350 bp, gen PB1: ~ 2350 bp, gen PA: ~ 2250 bp, gen NP: ~ 1600 bp, gen M: ~ 1050 bp và gen NS: ~ 900 bp). Sáu phản ứng nhân gen bằng mồi bắt cặp plasmid đều có kích thước lớn hơn khoảng 0,2 kb so với sản phẩm phản ứng PCR nhân các phân đoạn gen tương ứng bằng mồi đặc hiệu gen. Kết quả nhận được chứng tỏ 6 phân đoạn gen PB2, PB1, PA, NP, M và NS đã được biến nạp thành công và gắn đúng vị trí trên 6 plasmid pHW2000 (mỗi plasmid mang một phân đoạn cDNA mã hóa protein khung của virus (Hình 3.4). . Hình 3.3. Điện di sản phẩm cắt sáu plasmid mang sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 bằng enzyme giới hạn Ghi chú: M: Marker 1kb (Fermentas); M1: Marker High Ranger 1kb DNA Ladder A. Gen PB2 (PB2-K: Plasmid pBT-PB2 không cắt với enzyme; PB2-C: Sản phẩm cắt pBT-PB2) B. Gen PB1 (PB1-K: Plasmid pBT-PB1 không cắt; PB1-C: Sản phẩm cắt plasmid pBT-PB1) C. Gen PA (PA-C: Sản phẩm cắt plasmid pBT-PA; PA-K: Plasmid pBT-PA không cắt với enzyme) D. Gen NP (NP-K: Plasmid pBT-NP không cắt với enzyme; NP-C: Sản phẩm cắt plasmid pBT-NP) E. Gen M (M-C: Sản phẩm cắt plasmid pBT-M; M-K: Plasmid pBT-M không cắt với enzyme) F. Gen NS (NS-K: Plasmid pBT-NS không cắt với enzyme; NS-C: Sản phẩm cắt plasmid pBT-NS) . Hình 3.4. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR của sáu phân đoạn gen khung với mồi đặc hiệu gen và mồi đặc hiệu plasmid pHW2000 M: Marker 1kb (Fermentas); (-): Đối chứng âm; 1, 2: Phân đoạn gen M; 3, 4: Phân đoạn gen NP; 5, 6: Phân đoạn gen NS; 7, 8: Phân đoạn gen PA; 9, 10: Phân đoạn gen PB1; 11, 12: Phân đoạn gen PB2
12. 3.2. Thiết kế và tách dòng gen HA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000 Trình tự nucleotide của hai phân đoạn gen H5 clade 1.1 và H5 clade 2.3.2.1c đã được thiết kế, tổng hợp nhân tạo và lưu giữ trong plasmid (Hình 3.5). Trình tự nucleotide của hai gen H5 có kích thước: Gen H5 clade 1.1 - 1825 bp, gen H5 clade 2.3.2.1c - 1822 bp. Hai gen H5 đều có đặc điểm: Hai đoạn nucleotide ở hai đầu không mã hóa, là vị trí gắn mồi đặc hiệu chứa điểm nhận biết của enzyme BsmBI; ở giữa là vùng mã hóa amino acid tạo protein HA: Gen HA clade 1.1 - 1698 bp (1695 bp mã hóa 565 amino acid và 3 bp là bộ ba kết thúc), gen HA clade 2.3.2.1c - 1695 bp (1692 bp mã hóa 564 amino acid và 3 bp tương ứng với bộ ba kết thúc). Hình 3.5. Trình tự nucleotide của gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c không chứa vùng độc A. Trình tự nucleotide; B. Trình tự amino acid Với hai trình tự gen H5 HA đã thiết kế, khi khuếch đại gen bằng phản ứng PCR sẽ tạo sản phẩm có kích thước 1799 bp (1698 bp + 101 bp) tương ứng với gen HA clade 1.1 và 1796 bp (1695 bp + 101 bp) tương ứng với gen HA clade 2.3.2.1c. Đặc biệt, trình tự amino acid của protein HA được mã hóa bởi gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c đã thiết kế đều được loại bỏ vùng độc (loại bớt các amino acid kiềm ở vị trí nhận biết của protease) và tránh hiện tượng lại độc. Cụ thể, trình tự amino acid mã hóa bởi phân đoạn gen H5 clade 1.1 đã thiết kế, vị trí 338-344 là QREGT-RG, trong khi ở chủng gốc A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1), vị trí 338-347 là QREGRRKK-RG (chứa 4
13. amino acid kiềm –RRKK- ở vị trí nhận biết của protease). Như vậy, so với chủng gốc, trình tự gen H5 clade 1.1 đã thiết kế làm gen ứng viên cho sản xuất vaccine đã được loại vùng độc: Loại 2 arginine (R), 1 lysine (K) và thay thế 1 lysine (K) bằng threonine (T); và tránh lại độc: Hai arginine (R) ở hai đầu ngay sát vùng độc được thay đổi mã bộ ba - AGA thành CGA - cũng mã hóa cho arginine nhưng sẽ giúp chủng virus tái tổ hợp không từ dạng độc lực thấp chuyển thành dạng độc lực cao. Trình tự amino acid mã hóa bởi gen HA clade 2.3.2.1c loại vùng độc đã thiết kế, vị trí 338-343 là QRET-RG, trong khi ở chủng gốc A/duck/Viet Nam/HT-02/2014(H5N1), vị trí 338-346 là QRERRRK-RG (chứa 4 amino acid kiềm -RRRK- ở vị trí vùng độc) (Hoàng Thị Thu Hằng et al., 2008). So với chủng virus gốc, gen ứng viên vaccine HA clade 2.3.2.1c đã được loại vùng độc: Loại 3 arginine (R) và thay thế 1 lysine (K) bằng threonine (T); tránh lại độc: 2 arginine (R) ở hai đầu ngay sát vùng độc được thay đổi 1 nucleotide từ AGA thành CGA. Trình tự amino acid suy diễn được dịch mã từ 2 gen H5 HA đã thiết kế cho thấy: Các vị trí quan trọng đảm bảo việc thực hiện chức năng và thể hiện tính kháng nguyên của protein HA đều có và không thay đổi vị trí so với chủng virus gốc, gồm: Vị trí liên kết với thụ thể của tế bào chủ: QSG ở cả 2 clade (amino acid 238-240); các vị trí có tính kháng nguyên và sinh đáp ứng miễn dịch mạnh: ANPV ở clade 1.1 và PNPA ở clade 2.3.2.1c (amino acid 99-102); SHEASL ở clade 1.1 và NHEASL ở clade 2.3.2.1c (amino acid 140- 145); PYLGKS ở clade 1.1 và SYQGNS ở clade 2.3.2.1c (amino acid 152-157); vị trí glycosyl hóa: NST ở clade 1.1 và DNA ở clade 2.3.2.1c (amino acid 170-172). Gen HA clade 1.1 và gen HA clade 2.3.2.1c tổng hợp nhân tạo đã được ghép nối riêng rẽ vào plasmid pHW2000. Kiểm tra sự có mặt của phân đoạn gen HA trong plasmid pHW2000 bằng các phương pháp: PCR với hai cặp mồi (đặc hiệu gen, đặc hiệu plasmid); cắt bằng enzyme giới hạn và xác định trình tự gen. Kết quả kiểm tra thể hiện ở Hình 3.6. A B Hình 3.6. Kiểm tra sự có mặt của gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c trong plasmid pHW2000 Ghi chú. M: Marker 1 kb A. Kiểm tra bằng PCR nhân gen HA với hai loại mồi là mồi đặc hiệu gen và mồi đặc hiệu plasmid; 1, 2: Sản phẩm PCR nhân gen HA clade 1.1; 3, 4: Sản phẩm PCR nhân gen HA clade 2.3.2.1c. B: Cắt kiểm tra bằng cặp enzyme NheI và SmaI; H1.1: Sản phẩm cắt pHW2000-HA clade 1.1; H2.3.2.1: Sản phẩm cắt pHW2000-HA clade 2.3.2.1c. Kiểm tra sự có mặt của gen đích bằng PCR với hai loại mồi là mồi đặc hiệu gen HA và mồi đặc hiệu plasmid chỉ xuất hiện một băng đặc hiệu duy nhất có kích thước đúng theo lý thuyết: Sản phẩm nhân gen bằng mồi đặc hiệu gen có kích thước khoảng 1800 bp (tương ứng với kích thước gen HA), nhân gen bằng mồi đặc hiệu plasmid có kích thước khoảng 1950 bp (tương ứng với kích thước gen HA và một phần trình tự nucleotide của plasmid pHW2000 ở hai đầu gen HA) (Hình 3.6A).
14. Sản phẩm cắt kiểm tra 2 plasmid tái tổ hợp với cặp enzyme NheI và SmaI trên bản điện di đều xuất hiện 2 băng vạch: Băng thứ nhất có kích thước lớn tương ứng với kích thước plasmid pHW2000 và băng thứ hai kích thước nhỏ hơn tương ứng với kích thước của gen HA (khoảng 1800 bp) (Hình 3.6B). Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen đích cũng chứng minh gen HA clade 1.1 và HA clade 2.3.2.1c đã được tạo dòng thành công vào plasmid pHW2000 với kích thước và trình tự nucleotide chính xác 100% so với các trình tự đã thiết kế. DNA plasmid của các dòng dương tính với gen HA được tách chiết và tinh sạch để sẵn sàng sử dụng cho thí nghiệm tái tạo chủng virus vaccine cúm A/H5N1 tái tổ hợp. 3.3. Thiết kế và tách dòng gen NA của virus cúm A/H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c vào plasmid pHW2000 Trình tự nucleotide gen N1 NA clade 1.1 và clade 2.3.2.1c được thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của gen NA đã phân lập từ hai chủng virus cúm độc lực cao A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) (clade 1.1) và A/duck/Vietnam/HT-02/2014(H5N1) (clade 2.3.2.1c) tương ứng, có kích thước và cấu trúc đều gồm 1453 bp với: 1 vùng mã hóa kích thước 1350 bp, trong đó 1347 bp (bắt đầu bằng bộ ba khởi đầu dịch mã - ATG) mã hóa 449 amino acid, và 3 bp tương ứng với 1 bộ ba kết thúc không mã hóa; 2 vùng không mã hóa nằm ở hai đầu với kích thước và trình tự nucleotide tương ứng là 46 bp - 5’ tagtactaagcatattggtctcagggagcaaaagcaggagttcaaa 3’ và 57 bp - 5’tttgttcaaaaaactccttgtttctactaatacgagaccatattagtactaagcata 3’, trong đó các nucleotide in nghiêng là vị trí gắn đặc hiệu của mồi xuôi và ngược trong phản ứng PCR nhân gen,và các nucleotide gạch chân là vị trí nhận biết/trình tự bổ sung với vị trí nhận biết của BsaI. Với cấu trúc gen NA đã thiết kế của cả hai clade, khi thực hiện phản ứng PCR nhân gen NA sẽ tạo sản phẩm đặc hiệu có kích thước gồm vùng mã hóa và hai đoạn nucleotide không mã hóa ở hai đầu gen, bắt đầu ở vị trí gắn mồi đặc hiệu, với tổng số nucleotide là 1434 bp (1350 bp + 84 bp). So sánh sự tương đồng về trình tự amino acid suy diễn do gen NA clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c mã hóa bằng chương trình ClustalW và BLAST thì độ tương đồng giữa hai trình tự là 92%. Đặc biệt, protein do gen NA clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c mã hóa đều gồm 449 amino acid (Hình 3.7) với đầy đủ các vị trí quan trọng đảm bảo chức năng và tính kháng nguyên của protein NA như: Hình 3.7. Trình tự amino acid của gen NA clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c Các amino acid được đánh dấu trong khung hình bầu dục gồm 7 amino acid tạo thành vị trí thực hiện chức năng xúc tác của neuraminidase, các nucleotide trong khung hình vuông/chữ nhật là các vị trí N- glycosyl hóa trong gen.
15. Vị trí thực hiện chức năng xúc tác (catalytic site) của neuraminidase: Ở cả hai clade đều được hợp thành từ 7 amino acid nằm đúng vị trí, phân bố trên bề mặt của cả 4 tiểu đơn vị hợp thành đầu tetramer dạng cầu của NA, gồm: Arg (R) - 98, Asp (D) - 131, Glu (E) - 258, Arg (R) - 273, Arg (R) - 348, Tyr (Y) - 382, Glu (E) - 405. Các công bố về trình tự gen NA của virus H5N1 clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c trên ngân hàng NCBI đã khẳng định vai trò của những vị trí này trong việc đảm bảo chức năng thực hiện hoạt tính enzyme của protein NA ( Vị trí N-glycosyl hóa (glycosylation site): Ở protein NA clade 1.1 có 2 vị trí glycosyl hóa là 68NSS và 126NGT. Protein do gen NA clade 2.3.2.1c mã hóa có 3 vị trí glycosyl hóa với 2 vị trí có trình tự và thứ tự amino acid giống protein NA clade 1.1 và thêm 1 vị trí là 215NGS. Vùng cuống (stalk region): Ở subtype N1 NA, vùng cuống được tạo thành bởi khoảng gần 50 amino acid, tương ứng với vị trí amino acid 40 - 90 tính từ đầu tận cùng N của protein, và cần có ít nhất 1 gốc Cys (C) và 1 vị trí glycosyl hóa (Reid et al., 2000). Các đặc điểm này đều có ở protein mã hóa bởi hai trình tự gen NA đã thiết kế. Cụ thể, trong vùng amino acid vị trí 40 - 90 mã hóa bởi gen NA clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c đều có 1 gốc Cys ở amino acid 72 và 1 vị trí glycosyl hóa là 68NSS. Sau khi tách dòng và kiểm tra sự có mặt của gen NA trong plasmid pHW2000 bằng PCR với hai loại mồi là mồi đặc hiệu gen và mồi đặc hiệu plasmid, kết quả chỉ ra đã biến nạp thành công hai gen NA tương ứng với hai clade vào hai plasmid pHW2000 (Hình 3.8A). Kết quả tạo dòng cũng được kiểm tra bằng 2 phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp với enzyme giới hạn: Cắt bằng cặp NheI và SmaI, và cắt bằng SacI. Sản phẩm phản ứng cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose cho thấy: Sản phẩm cắt pHW2000-NA clade 1.1 và pHW2000-NA clade 2.3.2.1c bằng cặp NheI và SmaI (Hình 3.8B) hay bằng SacI (Hình 3.8C) cũng đều xuất hiện hai băng vạch: Băng thứ nhất có kích thước lớn tương ứng với kích thước plasmid pHW2000, băng thứ hai kích thước nhỏ tương ứng kích thước gen NA. Bên cạnh đó, do điểm cắt của SacI trên plasmid pHW2000 nằm xa hơn so với điểm cắt của NheI và SmaI trên pHW2000 tính từ vị trí gắn gen NA, nên sản phẩm phản ứng cắt cho băng vạch tương ứng chứa gen NA khi cắt bằng SacI có kích thước lớn hơn so với cắt bằng NheI và SmaI. A B C Hình 3.8. Kiểm tra kết quả tách dòng gen NA vào plasmid pHW2000 M: Marker 1kb; M1: Marker HighRanger 1kb DNA Ladder A. PCR nhân gen NA bằng cặp mồi đặc hiệu gen và cặp mồi đặc hiệu plasmid; 1, 2: Sản phẩm PCR nhân gen NA clade 1.1; 3, 4: Sản phẩm PCR nhân gen NA clade 2.3.2.1c. B. Sản phẩm cắt plasmid mang gen NA clade 1.1 (5) và clade 2.3.2.1c (6) bằng NheI và SmaI. C. Sản phẩm cắt plasmid mang gen NA clade 1.1 (7) và clade 2.3.2.1c (8) bằng SacI Kết quả xác định trình tự nucleotide của gen đích trong plasmid tái tổ hợp cũng khẳng định gen NA clade 1.1 và NA clade 2.3.2.1c đã được tách dòng thành công vào hai plasmid pHW2000.
16. 3.4. Tạo chủng virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c bằng di truyền ngược 3.4.1. Xác định loại hóa chất và thời gian chuyển nhiễm thích hợp cho tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong tế bào 293T Ảnh hưởng của loại hóa chất chuyển nhiễm Kết quả trình bày ở Bảng 3.2 cho thấy: Các công thức chuyển nhiễm sử dụng Lipofectamine-2000 và TransIT-LT đã kích thích các plasmid chuyển nhiễm vào tế bào 293T, từ đó tái tạo thành công virus tái tổ hợp, thể hiện ở hiệu giá HA (log2) đạt 4,5 - 7,0 ở cả 2 công thức bổ sung chất kích thích chuyển nhiễm, trong khi công thức đối chứng (bổ sung đệm PBS thay chất chuyển nhiễm) cho kết quả hiệu giá HA âm tính. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của loại hóa chất chuyển nhiễm đến hiệu quả tái tạo virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Loại hóa chất Hiệu giá HA (log2) của công thức chuyển nhiễm cho tái tạo virus chuyển nhiễm rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Đối chứng (PBS) - - Lipofectamine-2000 6,83a ± 1,17 7,0a ± 0,89 TransIT-LT 4,5b ± 0,84 5,17b ± 0,75 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05; (-): Hiệu giá HA âm tính - không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu. Trong số 2 loại chất chuyển nhiễm, Lipofectamine-2000 cho hiệu quả chuyển nhiễm (HA log2) tái tạo virus rg-A/H5N1 clade 1.1 đạt 6,83 và virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đạt 7,0 - cao hơn so với hiệu quả chuyển nhiễm của TransIT-LT chỉ đạt HA log2 là 4,5 và 5,17 tương ứng với 2 clade virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c. Kết quả so sánh bằng phương pháp thống kê chỉ ra sự khác biệt giữa các công thức là có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05. Do vậy, luận án lựa chọn Lipofectamine-2000 làm yếu tố kích thích chuyển nhiễm plasmid ngoại lai vào tế bào 293T. Ảnh hưởng của thời gian chuyển nhiễm Tối ưu thời gian ủ plasmid với tế bào 293T trong sự có mặt của Lipofectamine-2000 có khả năng nâng cao hiệu quả chuyển nhiễm. Trong nghiên cứu này, các công thức thí nghiệm chuyển nhiễm plasmid vào tế bào được bố trí trong các khoảng thời gian 10 - 60 phút. Số liệu nhận được (Bảng 3.3) cho thấy: Tương ứng với các thời gian chuyển nhiễm khác nhau đã nhận được hiệu quả tái tạo virus tái tổ hợp thông qua hiệu giá HA khác nhau. Thời gian chuyển nhiễm 10 phút là chưa đủ để đạt hiệu quả chuyển nhiễm cao của plasmid vào tế bào - hiệu giá HA của virus là thấp nhất. Công thức có thời gian chuyển nhiễm là 30 phút và 60 phút cho hiệu giá HA (log2) của virus cao. So sánh hiệu quả chuyển nhiễm của hai khoảng thời gian là 30 phút và 60 phút cho phép lựa chọn thời gian chuyển nhiễm plasmid vào tế bào 293T trong sự có mặt của Lipofectamine-2000 là 30 phút: Hiệu giá HA (log2) của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 đạt 7,17 và của virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đạt 7,33. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian chuyển nhiễm đến hiệu quả tái tạo virus tái tổ hợp rg- A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Thời gian chuyển Hiệu giá HA (log2) của công thức chuyển nhiễm cho tái tạo virus nhiễm rg-A/H5N1 clade 1.1 rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c 10 phút 2,33a ± 0,52 2,50a ± 1,75 20 phút 5,33b ± 0,52 5,83b ± 0,75 30 phút 7,17c ± 0,75 7,33c ± 0,82 60 phút 7,00c ± 0,89 7,17c ± 0,98 Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05
17. 3.4.2. Chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào 293T Hai công thức chuyển nhiễm dựa trên nguyên tắc 6 + 2 plasmid được thực hiện để tái tạo virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c. Các đĩa tế bào sau chuyển nhiễm plasmid được ủ ở 37ºC, 5% CO 2 trong 48h để thu nhận dịch sau biến nạp chứa thế hệ P0 của virus tái tổ hợp. Tương ứng với mỗi loại virus rg-A/H5N1 clade 1.1 hoặc rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c, luận án đều thu nhận được các mẫu dịch sau biến nạp có khả năng có sự có mặt của virus. Ký hiệu của các mẫu virus thế hệ P0. Kết quả kiểm tra sự có mặt của virus tái tổ hợp bằng phản ứng RT-PCR nhân gen HA và xác định trình tự gen HA trình bày ở Bảng 3.4 và Hình 3.9 đều khẳng định đã tái tạo thành công virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c. Bảng 3.4. Kiểm tra sự có mặt và đặc điểm di truyền gen HA của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 1.1 thế hệ P0 Công thức Thu Ký hiệu Kết quả kiểm tra sự có mặt của virus tái chuyển nhận từ mẫu tổ hợp nhiễm cho lần virus RT-PCR Xác định Sự có mặt của các tái tạo virus chuyển trình tự gen amino acid kiềm ở nhiễm HA vùng độc P0.1.1 + KTĐ - 1 P0.1.2 + KTĐ - P0.1.3 + KTĐ - rg-A/H5N1 P0.2.1 + KTĐ - clade 1.1 2 P0.2.2 + KTĐ - P0.2.3 + KTĐ - P0.3.1 + KTĐ - 3 P0.3.2 + KTĐ - P0.3.3 + KTĐ - P0.1.1 + KTĐ - 1 P0.1.2 + KTĐ - P0.1.3 + KTĐ - P0.2.1 + KTĐ - rg-A/H5N1 2 P0.2.2 + KTĐ - clade 2.3.2.1c P0.2.3 + KTĐ - P0.3.1 + KTĐ - 3 P0.3.2 + KTĐ - P0.3.3 + KTĐ - (+): Sản phẩm RT-PCR dương tính với một băng đặc hiệu kích thước khoảng 1,8 kb; KTĐ: Trình tự nucleotide gen HA không thay đổi so với các trình tự gen đã thiết kế; (-): Không có các amino acid kiềm ở vị trí vùng độc của gen HA. So sánh trình tự gen HA của các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 2.3.2.1c thế hệ P0 với hai trình tự gen HA đã thiết kế tương ứng với hai clade, nhận được kết quả: Trình tự gen HA của 9 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và 9 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P0 đều đồng nhất (giống 100%) so với trình tự gen HA đã thiết kế. Bên cạnh đó, các trình tự gen HA được nhân bản từ các mẫu dịch virus không chứa vùng giàu các amino acid kiềm độc. Do RT-PCR là phương pháp có độ nhạy và tính chính xác cao, nên kết quả nhận được cho phép khẳng định: (i) Đã tái tạo thành công hạt virus tái tổ hợp ở cả hai công thức chuyển nhiễm, với tỷ lệ chuyển nhiễm thành công đạt 100% (tất cả các mẫu dịch sau chuyển nhiễm đều cho kết quả kiểm tra dương tính với phản ứng RT-PCR nhân gen HA); (ii) các
18. mẫu virus tái tạo là an toàn ở mức độ phân tử (không chứa vùng độc ở gen HA); (iii) các mẫu thế hệ P0 của cả hai clade virus đều thể hiện tính ổn định di truyền gen kháng nguyên. Hình 3.9. Trình tự nucleotide gen HA của thế hệ P0 virus A/H5N1 clade 1.1 và virus A/H5N1 clade 2.3.2.1c không chứa vùng độc A. Trình tự nucleotide gen HA của virus rg-A/H5N1 clade 1.1; HA-H5N1 clade 1.1 ori: Gen HA của chủng A/H5N1 clade 1.1 trên ngân hàng NCBI chứa vùng độc; HA-H5N1 clade 1.1.P0.1.1, HA-H5N1 clade 1.1.P0.1.2, HA-H5N1 clade 1.1.P0.1.3: Gen HA của các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 không chứa vùng độc B. Trình tự nucleotide gen HA của virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c; HA-H5N1 clade 1.1 ori: Gen HA của chủng A/H5N1 clade 2.3.2.1c trên ngân hàng NCBI chứa vùng độc; HA-H5N1 clade 2.3.2.1c.P0.1.1, HA-H5N1 clade 2.3.2.1c.P0.1.2, HA-H5N1 clade 2.3.2.1c.P0.1.3: Gen HA của các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c không chứa vùng độc 3.5. Nhân giống virus trong trứng gà sạch có phôi Tiêu chí để lựa chọn chủng virus ứng viên vaccine cúm A/H5N1 ở gia cầm không chỉ căn cứ vào đặc điểm di truyền và tính kháng nguyên, mà còn xét đến khả năng thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi, vì phương pháp nhân giống virus cho sản xuất vaccine cúm gia cầm hiện nay vẫn chủ yếu là nhân trong trứng. Các mẫu chứa virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P0 thu nhận sau biến nạp, đã được kiểm tra và chắc chắn an toàn về mức độ phân tử (đều là virus có độc lực thấp) được cấy truyền vào trứng gà sạch có phôi. Sau 48h ủ trứng đã cấy giống virus ở 35°C, độ ẩm 60%, nước trứng có chứa virus tái tổ hợp ký hiệu thế hệ P1 trong từng quả được thu hoạch riêng rẽ và tiến hành kiểm tra vô trùng, xác định hiệu giá HA và khả năng tạo thành vết tan trên tế bào MDCK của từng mẫu. Trong số 9 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và 9 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đã khảo sát khả năng thích ứng nhân lên trong trứng, luận án đã sàng lọc được 3 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 (mẫu P1.1.1, P1.2.1 và P1.3.3) có hiệu giá HA ≥ 1: 1024 và 3 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c (P1.1.2, P1.2.2 và P1.3.2 có hiệu giá HA ≥ 1: 512. Các mẫu virus này được lựa chọn cho phân lập chủng virus có khả năng thích ứng nhân lên trong trứng gà có phôi với hiệu giá HA cao (Hình 3.10).
19. A B Hình 3.10. Kết quả xác định hiệu giá HA của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1 thu nhận sau 48h nuôi cấy trong trứng gà sạch có phôi ĐC: Mẫu đối chứng A. Xác định hiệu giá HA của các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 thế hệ P1. B. Xác định hiệu giá HA của các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c thế hệ P1. Kết quả xác định khả năng thích ứng nhân lên của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg- A/H5N1 clade 2.3.2.1c trên tế bào MDCK trình bày ở Hình 3.11. Các đĩa 6 giếng chứa tế bào MDCK đã cấy truyền virus ở các thời điểm sau 24h, 48h nuôi cấy được quan sát dưới kính hiển vi soi ngược để quan sát động thái phát triển của tế bào, và so sánh với mẫu đối chứng (không lây nhiễm virus). Kết quả nhận được cho thấy: Sau 24h cấy truyền virus, bề mặt đáy ở những giếng nhất định của đĩa nuôi cấy của cả 2 loại virus đều xuất hiện các vùng mà ở đó các tế bào bị phá hủy tạo hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE - Cytopathic effect), trong khi mẫu đối chứng (tế bào MDCK không cấy truyền virus) không xuất hiện CPE (tế bào vẫn tiếp tục biệt hóa, phân chia với trên 90% tế bào sống). Bên cạnh đó, diện tích của các vùng có CPE ở khi quan sát dưới kính hiển vi ở thời điểm sau 48h cấy truyền cho thấy các vùng này lan rộng hơn và số lượng CPE cũng nhiều hơn. Các đĩa tế bào MDCK nuôi cấy virus khi được nhuộm với gentian violet đã chỉ ra sự sự xuất hiện các plaque (vết tan tế bào) (Hình 3.11).
20. A B C D E F Hình 3.11. Sự tạo thành CPE và plaque khi nuôi cấy virus trên tế bào MDCK A, B, C. Quan sát đĩa tế bào MDCK lây nhiễm virus để phát hiện hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE) dưới kính hiển vi: Công thức đối chứng (tế bào MDCK không lây nhiễm virus) không xuất hiện CPE (A); tế bào MDCK lây nhiễm virus rg-A/H5N1 clade 1.1 thế hệ P1 xuất hiện các CPE ở vị trí các mũi tên màu đỏ trong các giếng sau 24h (B) và 48h (C) lây nhiễm virus. D, E, F. Nhuộm các đĩa tế bào MDCK với gentian violet để xác định sự tạo thành plaque: Công thức đối chứng (đĩa tế bào MDCK không lây nhiễm virus) không xuất hiện plaque (D); đĩa tế bào MDCK cấy truyền virus xuất hiện plaque sau 24h (E) và 48h (F) cấy truyền virus. Kết quả nhận được của luận án phù hợp với nhiều công bố khoa học trên thế giới khẳng định MDCK là loại tế bào rất thích hợp cho virus A/H5N1 lây nhiễm và nhân lên theo phương thức nhiễm sinh sản (Chen et al., 2012; Milián et al., 2017). 3.6. Phân lập chủng virus và kiểm tra tính ổn định di truyền của giống Các chủng virus tái tổ hợp (rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c) đã phân lập được tiếp tục cấy truyền 4 lần liên tiếp vào trứng gà có phôi để thu nhận các thế hệ virus P2, P3, P4 và P5. Thu hoạch riêng rẽ các thế hệ virus trong dịch niệu trứng để kiểm tra: (i) Hiệu giá HA của mỗi thế hệ tương ứng với từng chủng; (ii) RT-PCR nhân bản 8 phân đoạn gen trong genome virus với mồi đặc hiệu của từng gen và xác định trình tự nucleotide của hai gen kháng nguyên (HA, NA) của virus thế hệ P5; (iii) kiểm tra khả năng thích ứng nhân lên của các chủng virus ở thế hệ P5 trên tế bào MDCK. Kết quả nhận được thống kê ở Bảng 3.5. Kết quả xác định hiệu giá HA của các chủng virus trong dịch niệu trứng cho thấy: Trong số các chủng virus, có 5/6 chủng (chủng 1.1, 2.1 và 3.3 của clade 1.1 + chủng 1.2 và 3.2 của clade 2.3.2.1c) có hiệu giá HA luôn ổn định ở mức HA ≥ 1: 1024 ở các thế hệ virus từ P2 đến P5 (100% dịch niệu trứng có hiệu giá HA ≥ 1: 1024). Yêu cầu về chất lượng giống của chủng virus ứng viên vaccine không những cần thể hiện ở hiệu giá HA cao, mà còn cần đảm bảo đặc điểm di truyền và biểu hiện protein kháng nguyên đúng đặc điểm di truyền qui định bởi gen kháng nguyên ổn định qua các thế hệ và ít bị đột biến. Kết quả kiểm tra nhanh sự có mặt của đầy đủ các phân đoạn vRNA của các chủng virus ở thế hệ P5 khẳng định thế hệ P5 của các chủng virus đều cho kết quả RT-PCR một bước dương tính với cả 8 phân đoạn vRNA.
21. Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra khả năng thích ứng nhân lên trong trứng, tế bào MDCK và tính ổn định di truyền của các chủng virus Clade Ký hiệu Tỷ lệ trứng có hiệu giá RT- Trình Trình Khả năng chủng HA ≥ 1: 1024 ở các thế PCR tự gen tự gen tạo CPE virus hệ (%) nhân 8 HA NA trên P2 P3 P4 P5 gen MDCK 1.1 100 100 100 100 + KTĐ KTĐ + 1.1 2.1 100 100 100 100 + KTĐ KTĐ + 3.3 100 100 100 100 + KTĐ KTĐ + 1.2 100 100 100 100 + KTĐ KTĐ + 2.3.2.1c 2.2 66,7 100 100 66,7 + KTĐ KTĐ + 3.2 100 100 100 100 + KTĐ KTĐ + (+): Sản phẩm PCR dương tính với 8 phân đoạn gen có kích thước đúng theo tính toán/ có khả năng tạo plaque; (KTĐ): Trình tự gen không thay đổi Kết quả xác định trình tự gen H5 và N1 của 3 chủng virus thuộc clade 1.1 và 3 chủng thuộc clade 2.3.2.1c ở thế hệ P5 chỉ ra: Gen kháng nguyên HA và NA của các chủng này không thay đổi so với các trình tự gen HA và NA đã thiết kế tương ứng với hai clade virus. Bên cạnh đó, vị trí qui định độc lực của virus ở trình tự gen H5 của 3 chủng rg-A/H5N1 clade 1.1 ở amino acid 338-344 là QREGTR ↓ G, và ở 3 chủng rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c các amino acid 338-343 là QRETR ↓ G. Kết quả nhận được khẳng định các chủng virus đã kiểm tra đặc điểm di truyền đều có tính kháng nguyên giống chủng gốc, chứa gen H5 mã hóa protein HA không chứa vùng độc và không bị lại độc. Tiếp theo, để kiểm tra tính thích nghi của các chủng virus khi nhân giống trên tế bào MDCK, các chủng virus tái tổ hợp nguồn gốc di truyền ngược thu nhận từ dịch trứng được cấy truyền trên các đĩa 6 giếng nuôi cấy tế bào MDCK. Kết quả nhận được (Bảng 3.5) khẳng định: Các mẫu nước trứng đã thu hoạch sau khi pha loãng trong đệm PBS và cấy truyền trên tế bào MDCK đều cho kết quả xuất hiện hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE - cytopathic effect) do virus nhân lên và phá hủy tế bào MDCK. Hình ảnh thu thập trong quá trình nghiên cứu thể hiện một phần ở Hình 3.12. A B Hình 3.12. Hiệu ứng hủy hoại tế bào xuất hiện khi cấy truyền virus rg-A/H5N1 vào tế bào MDCK A. Quan sát CPE xuất hiện ở các đĩa tế bào MDCK lây nhiễm virus dưới kính hiển vi quang học B. Nhuộm phát hiện CPE với gential violet Kết quả kiểm tra các chủng virus tái tổ hợp về hiệu suất nhân giống qua các thế hệ nhân trong trứng, tính ổn định di truyền và khả năng thích ứng nhân lên trong tế bào MDCK đều chỉ ra luận án đã tái tạo và sàng lọc được các chủng virus đáp ứng yêu cầu của chủng virus ứng viên vaccine phòng chống bệnh cúm A/H5N1 cho gia cầm.
22. 3.7. Sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm ở qui mô phòng thí nghiệm và xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của vaccine Hai loại chế phẩm vaccine được sản xuất từ hai chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1 có màu trắng đục, đồng nhất, không phân lớp. Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu (hiệu giá HA, hiệu giá virus của dịch niệu trứng chứa virus tái tổ hợp trước khi vô hoạt và sau khi vô hoạt, tính vô trùng đối với vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí, nấm men, nấm mốc) của hai chế phẩm vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg- A/H5N1 clade 2.3.2.1c trình bày ở Bảng 3.6. Bảng 3.6. Kiểm tra một số chỉ tiêu của kháng nguyên virus trong vaccine, tính vô hoạt và vô trùng của chế phẩm vaccine Kháng nguyên virus rg-A/H5N1 Nội dung kiểm tra Clade 1.1 Clade 2.3.2.1c Trước vô hoạt 1: 1024 1: 1024 Hiệu giá HA Sau vô hoạt - - Trước vô hoạt 108 108,6 Hiệu giá virus (EID /ml) 50 Sau vô hoạt - - Trước vô hoạt - - Vi khuẩn hiếu khí Sau vô hoạt - - Trước vô hoạt - - Vi khuẩn yếm khí Sau vô hoạt - - Trước vô hoạt - - Nấm Sau vô hoạt - - Trước vô hoạt - - Nấm men Sau vô hoạt - - Số liệu ở Hình 3.13 trình bày kết quả xác định hiệu giá HI của từng cá thể gà trong các công thức tiêm phòng vaccine sản xuất từ virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c. Hình 3.13. Hiệu giá kháng thể (HI log2) của các lô gà tiêm vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c sau 2 và 4 tuần tiêm phòng Gà 3 ngày tuổi ở tất cả các lô trong thí nghiệm trước tiêm phòng đều không có miễn dịch (huyết thanh không chứa kháng thể thụ động) với virus cúm A/H5N1, thể hiện ở hiệu giá kháng thể trung bình hình học (GMT - Geometric mean titer) < 1/2 log2. Sau 2 và 4 tuần
23. tiêm phòng, hiệu giá kháng thể của 100% cá thể gà (20/20) ở các lô tiêm chế phẩm vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1/ rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c (tiêm 1 liều hoặc tiêm 2 liều) và lô chứng dương đều đạt HI ≥ 4 log 2, trong khi 20/20 gà ở lô chứng âm không có đáp ứng tạo kháng thể với HI <1/2 log 2. Theo qui định của Cục Thú y, một loại vaccine cúm gia cầm được công nhận có khả năng bảo hộ đàn gia cầm nếu có tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng đạt ít nhất 70% số cá thể kiểm tra có hiệu giá kháng thể HI ≥ 4 log2 (Cục Thú y, 2009). Như vậy, có thể khẳng định hai chế phẩm vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đã sản xuất đều có khả năng bảo hộ ở mức độ kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu (hiệu giá HI ≥ 4 log 2) cho 100% gà 3 ngày tuổi tiêm phòng 1 liều hoặc 2 liều vaccine (HAU 1: 1024) với bệnh do virus cúm HPAI H5N1 clade 1.1 và HPAI H5N1 clade 2.3.2.1c (tương ứng) gây nên. CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Ưu điểm của hệ thống plasmid pHW2000 trong kỹ thuật di truyền ngược tạo chủng virus ứng viên vaccine cúm A Theo Engelhardt (2012), có nhiều phương pháp phát triển vaccine cúm A, nhưng di truyền ngược (RG - Reverse Genetics) luôn được ưu tiên lựa chọn cho phát triển nhanh chủng virus ứng viên vaccine bởi những ưu điểm: Trong thời gian ngắn (3 - 6 tháng) có thể tái tạo chủng virus vaccine độc lực thấp bằng loại bỏ một số amino acid kiềm ở vị trí cắt của protease trên gen HA, có hiệu suất nhân giống cao (trong trứng gà có phôi, trong tế bào). Trong số các kỹ thuật RG cho tái tạo virus cúm tái tổ hợp, kỹ thuật RG dựa trên plasmid được ứng dụng phổ biến hơn cả. Luận án cũng lựa chọn ứng dụng kỹ thuật RG dựa trên plasmid cho mục tiêu tái tạo virus tái tổ hợp lắp ráp nhân tạo, phục vụ sản xuất chủng virus vaccine cúm A/H5N1 sử dụng cho gia cầm. Căn cứ vào những minh chứng khoa học khẳng định hiệu quả tái tạo virus cúm A bằng RG của hệ thống gồm 8 plasmid pHW2000 của Hoffmann và đtg (2000), luận án đã lựa chọn hệ thống plasmid pHW2000 cho tách dòng các phân đoạn cDNA của virus cúm. Kết quả nhận được trong luận án đã thể hiện hiệu quả chuyển nhiễm cho tái tạo hạt virus của hệ thống plasmid pHW2000 với sự lắp ráp thành công 2 virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c từ hệ thống gồm 6 + 2 plasmid pHW2000 đơn gen: 6 plasmid mang 6 phân đoạn gen khung của virus A/PR/8/34, kết hợp với 2 plasmid mang 2 phân đoạn gen kháng nguyên H5 HA và N1 NA của virus HPAI H5N1 clade 1.1 và clade 2.3.2.1c đang lưu hành. 4.2. Vai trò của sáu phân đoạn gen khung nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 trong việc nâng cao hiệu suất nhân giống của chủng virus ứng viên vaccine cúm A Theo WHO (2018), virus tái tổ hợp tạo bằng kỹ thuật di truyền ngược - ứng viên cho sản xuất vaccine cúm sống nhược độc và vaccine cúm vô hoạt - nên có đặc điểm di truyền với 6 phân đoạn gen khung (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) nguồn gốc từ các chủng cho (donor strain) đã được khẳng định về hiệu suất sinh sản trong trứng và tế bào. Các virus cúm A thuộc loại virus cho có 6 phân đoạn gen khung đảm bảo tiềm năng nhiễm sinh sản của virus được WHO khuyến cáo sử dụng gồm: Virus A/Puerto Rico/8/34 [PR8], virus A/Ann Arbor/6/60 và virus A/Leningrad/134/17/57. Trong số các virus cho, virus PR8 được sử dụng phổ biến hơn cả trong nghiên cứu sản xuất virus vaccine tái tổ hợp. Đến nay, đã có nhiều công trình khoa học khẳng định tính ưu việt của bộ gen khung từ virus PR8: Là yếu tố đảm bảo hiệu suất lây nhiễm theo phương thức nhiễm sinh sản (high-growth) của virus tái tổ hợp (Jung et al., 2010; Verity et al., 2011; Engelhardt et al., 2012; Uchida et al., 2014). Hiệu quả của bộ gen khung từ virus PR8 trong luận án thể hiện ở kết quả xác định hiệu giá HA và hiệu giá virus của các mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade
24. 2.3.2.1c khi cấy truyền vào trứng và tế bào MDCK: Có 4/9 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và 7/9 mẫu virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c có hiệu giá HA thế hệ P0 khi cấy truyền vào trứng luôn đạt trên 1: 512, hiệu giá virus (log10 PFU/ml) đạt 7,91 - 9,16. Tiếp tục sàng lọc để lựa chọn chủng virus có tính ổn định di truyền và có hiệu giá HA cao khi cấy truyền nhiều lần trong trứng, luận án đã lựa chọn được 3 chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và 2 chủng virus rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c có hiệu giá HA luôn đạt trên 1: 1024 ở tất cả các trứng thuộc các thế hệ từ P1 đến P5, và tính ổn định di truyền gen kháng nguyên HA và NA thể hiện với trình tự nucleotide đến thế hệ P5 không thay đổi. 4.3. Tổng hợp nhân tạo phân đoạn gen HA mã hóa protein không chứa các amino acid kiềm độc Trong qui trình tạo chủng virus vaccine cúm A/H5N1 bằng di truyền ngược, cDNA của phân đoạn gen H5 HA trong plasmid cần được xử lý bằng loại bỏ các amino acid kiềm ở vị trí vùng độc (WHO, 2018). Để loại bỏ các amino acid kiềm ở vị trí vùng độc, có một số phương pháp thường được sử dụng: (i) PCR đột biến điểm định hướng sử dụng enzyme giới hạn (site-directed mutagenesis PCR using restriction enzyme); (ii) đột biến sản phẩm PCR sử dụng mồi bắt cặp ở trước và sau vùng độc (PCR mutagenesis using blunt end primers); (iii) sinh tổng hợp gen nhân tạo (artificial gene synthesis) có trình tự nucleotide không chứa vùng độc. Trong số các phương pháp thường được ứng dụng để loại bỏ các amino acid kiềm ở vị trí vùng độc, sinh tổng hợp gen nhân tạo còn được biết đến như phương pháp DNA printing - gen nhân tạo được sinh tổng hợp trong phòng thí nghiệm với kích thước không giới hạn và trình tự chính xác mà không cần sợi khuôn hay primer như phương pháp PCR. Hiện nay, phương pháp sinh tổng hợp gen nhân tạo thường được sử dụng trong nghiên cứu và sản xuất vaccine, và đặc biệt hữu ích trong nghiên cứu tạo vaccine phòng chống vi sinh vật gây bệnh bởi những ưu điểm: Trình tự gen được tổng hợp nhanh, chính xác và an toàn. Khai thác thuận lợi của việc thiết kế gen HA là hai trình tự gen H5 HA của hai clade virus A/H5N1 - clade 1.1 và 2.3.2.1c, đã và đang lưu hành ở Việt Nam - đã được xác định và công bố trên ngân hàng NCBI, luận án đã thiết kế hai gen H5 HA không chứa vùng độc và tránh lại độc dựa trên các trình tự đã công bố, sau đó đặt sinh tổng hợp gen nhân tạo. Việc sử dụng phương pháp sinh tổng hợp gen nhân tạo đã giúp rút ngắn thời gian và tiết kiệm kinh phí thực hiện so với các phương pháp truyền thống khi không phải thực hiện nhiều thao tác và công đoạn như: Thu thập mẫu virus, tách chiết vRNA, sinh tổng hợp cDNA từ vRNA bằng phương pháp RT-PCR, tách dòng sản phẩm RT-PCR vào plasmid, biến nạp plasmid mang gen HA vào E. coli, khuếch đại plasmid tái tổ hợp, tách chiết và tinh sạch plasmid, thực hiện kỹ thuật PCR gây đột biến điểm định hướng trên gen HA. 4.4. Ảnh hưởng của loại tế bào biến nạp đến sự tái tạo virus cúm tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c Các công bố khoa học về ứng dụng di truyền ngược để chuyển nhiễm các cDNA của virus cúm A vào tế bào chủ yếu sử dụng 3 công thức tế bào: (i) Chuyển nhiễm vào đĩa/giếng nuôi cấy tế bào 293T (mật độ 0,2 - 1 x 106 tế bào) (Jung et al., 2010; Milian et al. 2017); (ii) chuyển nhiễm vào đĩa/giếng đồng nuôi cấy 2 loại tế bào 293T và MDCK theo tỷ lệ 1 : 1 với tổng số lượng hai loại tế bào trong môi trường nuôi cấy đạt 0,2 - 1 x 10 6 tế bào (Martínez- Sobrido & García-Sastre, 2010; Verity et al., 2011); (iii) chuyển nhiễm vào tế bào Vero (Nicolson et al., 2005; Neumann et al., 2005, Song et al., 2013). Dựa trên kinh nghiệm nghiên cứu nhiều năm về việc lựa chọn loại tế bào biến nạp phù hợp, nhóm nghiên cứu của Hoffmann và Webster (Bệnh viện St Jude, Mỹ) đã tối ưu quá trình chuyển nhiễm hệ thống plasmid đơn gen vào tế bào động vật và đã xác định được loại tế bào thích hợp nhất cho chuyển nhiễm plasmid cho tái tạo virus tái tổ hợp là chỉ sử
25. dụng dòng tế bào 293T. Do vậy, luận án lựa chọn công thức tế bào cho chuyển nhiễm là sử dụng dòng tế bào 293T nuôi cấy trong các đĩa 6 giếng (mật độ 0,5 x 106 PFU/đĩa). Kết quả nghiên cứu trong thí nghiệm chuyển nhiễm các plasmid mang các phân đoạn cDNA vào tế bào 293T là một minh chứng khẳng định tế bào 293T khi có với mật độ cao trong môi trường chuyển nhiễm đã cho hiệu quả tái tạo hạt virus di truyền ngược cao sau 48h biến nạp: 100% mẫu dịch virus thu nhận trong các giếng biến nạp sau khi tách chiết RNA tổng số và thực hiện phản ứng RT-PCR nhân gen HA đều cho kết quả dương tính với phản ứng RT-PCR. 4.5. Khả năng thích ứng nhân lên của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c trong trứng và tính ổn định di truyền gen kháng nguyên của virus Hiện nay, trên thế giới, công nghệ sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho gia cầm chủ yếu sử dụng phương pháp nhân giống virus trên trứng gà sạch có phôi bởi những ưu điểm: Dễ thực hiện, hiệu suất nhân giống virus cao, giá thành rẻ, không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp Do vậy, tiêu chí để đánh giá tính phù hợp của chủng virus ứng viên vaccine: Là chủng độc lực thấp (LPAI), ổn định về di truyền và có hiệu suất nhân giống cao trong trứng. Luận án đã sàng lọc được 3 chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và 2 chủng virus rg- A/H5N1 clade 2.3.2.1c có độc lực thấp, có khả năng thích ứng nhân lên và ổn định về di truyền gen kháng nguyên khi cấy truyền nhiều lần trong trứng, thể hiện ở đặc điểm: Có hiệu giá HA của các thế hệ virus từ P2 - P5 đạt ≥ 1: 1024, tính ổn định di truyền thể hiện ở protein kháng nguyên được mã hóa bởi trình tự nucleotide của gen HA và NA đến thế hệ P5 không bị biến đổi. 4.6. Khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg- A/H5N1 clade 2.3.2.1c ở gia cầm Vaccine cúm A/H5N1 vô hoạt nhũ dầu thuộc loại vaccine an toàn (kháng nguyên vô hoạt) nên có thể tiêm phòng cho gà ở các lứa tuổi khác nhau: 1 - 3 ngày tuổi (Jang et al.,, 2018), 2 tuần tuổi và 3 tuần tuổi (Uchida et al., 2014). Trong luận án, gà thịt 3 ngày tuổi được lựa chọn cho xác định khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của virus rg- A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c. Kết quả kiểm tra tính an toàn của vaccine sản xuất từ chủng virus ứng viên rg- A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c cho thấy: Vaccine đảm bảo tính an toàn - 100% gà tiêm 2 liều vaccine (ở tất cả các lô thí nghiệm) đều sống sau 4 tuần tiêm phòng và không biểu hiện trạng thái viêm/sưng ở vùng da cổ, không biểu hiện tình trạng bệnh lý cúm gia cầm, trọng lượng cơ thể không khác biệt so với công thức đối chứng. Hiệu quả kích thích sinh đáp ứng miễn dịch của vaccine thể hiện ở kết quả: Gà sạch 3 ngày tuổi chỉ cần tiêm 1 liều 0,5 ml vaccine rg-A/H5N1 clade 1.1/ rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đã đạt hiệu quả bảo hộ cao với 20/20 (100%) gà có hiệu giá kháng thể HI ≥ 4 log2 ở tuần 2 và tuần 4 sau tiêm phòng. Các kết quả nhận được chứng minh luận án đã làm chủ công nghệ di truyền ngược để lắp ráp nhân tạo thành công hai virus tái tổ hợp rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c từ hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen. Sản phẩm khoa học của luận án gồm: (i) Qui trình tái tạo chủng plasmid tái tổ hợp từ hệ thống plasmid đơn gen đã được tối ưu; (ii) 6 plasmid pHW2000 mang 6 phân đoạn cDNA mã hóa các protein khung của virus PR8 đã được chuẩn bị sẵn sàng cho sự phối hợp với 2 plasmid mang gen kháng nguyên của subtype virus cúm A (đang lưu hành hay sẽ xuất hiện) để tái tạo chủng virus ứng viên vaccine; (iii) các chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đáp ứng tiêu chí của chủng ứng viên vaccine (có khả năng thích ứng nhân lên trong trứng với hiệu suất nhân giống cao, có tính ổn định di truyền gen kháng nguyên và có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu đạt hiệu quả bảo hộ cao ở gà thí nghiệm).
26. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Tách dòng thành công 6 phân đoạn gen khung (PB2, PB1, PA, NP, M và NS) nguồn gốc từ virus A/PR/8/34 vào plasmid pHW2000. 2. Thiết kế và tổng hợp nhân tạo gen mã hóa protein kháng nguyên H5 HA và N1 NA của hai clade virus HPAI H5N1 là clade 1.1 và clade 2.3.2.1c. Trong đó, gen HA đã được loại bỏ vùng độc, tránh lại độc. Các gen H5 và N1 đã được tách dòng thành công vào plasmid pHW2000. 3. Tối ưu qui trình chuyển nhiễm hệ thống 6 + 2 plasmid đơn gen vào tế bào 293T và lắp ráp nhân tạo thành công hai chủng cúm A/H5N1 tái tổ hợp (rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg- A/H5N1 clade 2.3.2.1c) đáp ứng yêu cầu của chủng ứng viên vaccine: Có độc lực thấp, thích ứng nhân lên trong trứng gà sạch có phôi với hiệu giá HA ≥ 1: 1024, tính kháng nguyên thể hiện sự ổn định di truyền (trình tự gen HA và NA không thay đổi) khi nhân trong trứng đến thế hệ P5. 4. Vaccine sản xuất từ hai chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c đảm bảo tính an toàn, có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu khi tiêm cho gà sạch 3 ngày tuổi: Ở các thời điểm tuần 2 và tuần 4 sau tiêm phòng, 100% gà có hiệu giá kháng thể HI ≥ 4 log2. KIẾN NGHỊ Đánh giá tính sinh miễn dịch bảo hộ trên gia cầm của hai chủng virus rg-A/H5N1 clade 1.1 và rg-A/H5N1 clade 2.3.2.1c bằng công cường độc với chủng virus cúm độc lực cao A/H5N1 clade 1.1 và A/H5N1 clade 2.3.2.1c tương ứng.
27. CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Hùng Chí, Hoàng Thị Thu Hằng, Vũ Huyền Trang, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Trung Nam (2017) Tách dòng sáu gen khung virus cúm vào vector pHW2000 phục vụ tạo chủng gốc vaccine cúm A/H5N1 bằng kỹ thuật di truyền ngược. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội 33(2): 9-16. 2. Nguyễn Thị Thu Hằng, Hoàng Thị Thu Hằng, Nguyễn Hùng Chí, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Trung Nam (2017) Nhân dòng vector pHW2000 tái tổ hợp mang gen HA làm nguyên liệu tạo chủng gốc ứng dụng sản xuất vaccine cúm A/H5N1. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội 33(1S): 159-167. 3. Nguyễn Thị Thu Hằng, Hoàng Thị Thu Hằng, Nguyễn Hùng Chí, Vũ Huyền Trang, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Trung Nam (2018) Thiết kế và tách dòng gen NA của virus cúm A/H5N1 vào vector pHW2000 làm nguyên liệu tạo chủng gốc vaccine cúm. Tạp chí Công nghệ Sinh học 16(2): 369-376. Abstract tham dự Hội nghị quốc tế Nguyen Thi Thu Hang, Nguyen Hung Chi, Chu Hoang Ha, Nguyen Trung Nam (2019) Generating vaccine candidate strain against A/H5N1 clade 2.3.2.1c virus by reverse genetics. The 6th Academic Conference on Natural Science for Young Scientists, Master and PhD Students from Asean Countries (CASEAN-6), October 23-26, 2019. Thai Nguyen, Vietnam