Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG PHAN THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN, ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH CỦA LIPASE THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 62 54 01 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴNG – 2021
2. Công trình được hoàn thành tại ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS ĐẶNG MINH NHẬT 2. PGS.TS TRẦN THỊ XÔ Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ tại hội đồng chấm luận văn tiến sĩ họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin- Học liệu và Truyền thông, ĐH Đà Nẵng
3. 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Lipase hay Triacylglycerol acylhydrolases (E.C. 3.1.1.3) là loại enzyme xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol mạch dài tạo thành diacylglycerol, monoacylglycerol, glycerol và các acid béo tự do tại các bề mặt liên pha giữa nước và dung môi hữu cơ. Ngoài ra, lipase còn xúc tác các phản ứng chuyển vị ester và cả phản ứng tổng hợp ester. Lipase được thu nhận từ vi khuẩn (45%), nấm (21%), động vật (18%), thực vật (11%) và vi tảo (3%). So với lipase từ vi sinh vật, lipase từ thực vật có những ưu điểm quan trọng như: dễ được người tiêu dùng chấp nhận trong thực phẩm, dược phẩm hơn, ngay ở cả dạng enzyme thô; nguồn nguyên liệu để thu nhận có sẵn trong tự nhiên, không độc hại. Lipase thực vật được cho là có tiềm năng ứng dụng tốt trong công nghệ thực phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp các chất hữu cơ, dược phẩm và cả trong sản xuất biodiesel. Lipase thực vật được tìm thấy trong các loại hạt chứa dầu, ngũ cốc cũng như mủ các loại quả. Trên thế giới đến nay chỉ mới 29 loại lipase từ thực vật đã được xác định khối lượng phân tử cũng như trình tự acid amin trong chuỗi protein. Những công trình nghiên cứu trong nước về lipase còn ít, đặc biệt lipase từ thực vật là lĩnh vực hầu như không được quan tâm. Do đó, đề tài được chọn cho luận án: "Nghiên cứu thu nhận, đánh giá đặc tính của lipase thực vật và khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm" có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá hoạt tính lipase thu nhận từ một số nguồn thực vật: hạt có dầu, phụ phẩm nông nghiệp, mủ các loại quả; Xây dựng quy trình công nghệ thu nhận lipase thô từ nguồn thực vật tiềm năng; Xác định đặc tính của lipase thô và lipase tinh sạch; Đánh giá khả năng ứng dụng lipase thô trong công nghiệp thực phẩm.
4. 2 3. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu lựa chọn nguồn nguyên liệu thực vật thích hợp để thu nhận lipase; Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase thu được; Nghiên cứu xây dựng quy trình thu nhận lipase thô có hoạt độ cao từ nguyên liệu đã lựa chọn; Nghiên cứu khảo sát các đặc tính hoá sinh của lipase thô; Nghiên cứu tinh sạch lipase thô và xác định đặc tính hoá sinh; Nghiên cứu ứng dụng lipase thô trong quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA và EPA. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu trong luận án là phương pháp nghiên cứu thực nghiệm kết hợp với phân tích lý thuyết và tổng hợp tài liệu. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Đánh giá được khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn nguyên liệu thực vật, ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt độ của chế phẩm, từ đó xác định được nguồn nguyên liệu thực vật có tiềm năng để khai thác enzyme lipase; Đề xuất được quy trình thu lipase thô từ nguồn thực vật có hiệu quả cao; Xác định được tính đặc hiệu đối với cơ chất lipid của lipase thô thu nhận được từ nguồn thực vật; Đề xuất phương pháp tinh sạch lipase thô từ mủ đu đủ và xác định khối lượng phân tử của lipase. Tận dụng phế phẩm của quá trình thu papain từ mủ đu đủ để sản xuất lipase thô. Ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ để thủy phân dầu cá hồi nhằm thu acid béo tạo tiền đề cho quá trình làm giàu DHA, EPA ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. 6. Cấu trúc của luận án Luận án gồm phần mở đầu; Chương 1. Tổng quan; Chương 2. Phương pháp nghiên cứu; Chương 3. Kết quả và thảo luận; kết luận và kiến nghị.
5. 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về lipase Lipase (Triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) thuộc lớp hydrolase, là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân triglyceride để tạo glycerol và acid béo tự do tại bề mặt liên pha dầu – nước. Ngoài ra, lipase còn xúc tác phản ứng chuyển vị ester và tổng hợp ester. 1.2. Lipase thực vật Lipase thực vật có nhiều ở các hạt có dầu, chứa nhiều triacylglycerol. Đối với các hạt ngũ cốc, lipase được xác định có trong lớp vỏ như cám gạo, phôi lúa mì. Ngoài ra, lipase còn được tìm thấy trong các loại mủ các loại quả như mủ sung, mủ vả, mủ xương rồng và mủ đu đủ. 1.3. Ứng dụng của lipase thực vật Lipase được ứng dụng trong sản xuất thực phẩm để tạo ra các acid béo trong các sản phẩm thực phẩm bằng phản ứng thủy phân chọn lọc chất béo và dầu có trong thực phẩm. Lipase thô từ mủ đu đủ (CPL) đã được nghiên cứu ứng dụng trong tổng hợp các triacylglycerol chuỗi ngắn và chuỗi dài dùng trong sữa công thức cho trẻ sơ sinh, tổng hợp triacylglycerol cấu trúc. CPL còn được sử dụng để tổng hợp bơ ca cao nhân tạo. Từ những ứng dụng trên của CPL cho thấy nó có tiềm năng ứng dụng thương mại lớn trong ngành công nghệ thực phẩm. 1.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới các nghiên cứu về lipase thực vật chủ yếu là chiết tách, xác định đặc tính, tinh sạch và xác định khối lượng phân tử. Trong những năm gần đây, lipase từ mủ đu đủ được quan tâm nghiên cứu nhiều về đặc tính cũng như ứng dụng. Năm 2011, Slim
6. 4 Abdelkafi cũng đã chiết tách enzyme thủy phân từ mủ đu đủ, xác định đặc tính hóa sinh và khẳng định enzyme chiết được thể hiện hoạt tính esterase hơn là lipase. Lipase thô được xem là loại lipase “cố định” tự nhiên trong mủ, mặc dù đã được nghiên cứu nhưng các nhà khoa học chưa thể tách được lipase ra khỏi mủ đu đủ, đó là khó khăn đang cần được nghiên cứu khảo sát. Việc nghiên cứu xây dựng quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ vẫn chưa hoàn thiện. Nghiên cứu ứng dụng lipase từ nguồn thực vật cho ngành công nghệ thực phẩm vẫn còn hạn chế. CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu Đậu nành (Glycine max): giống ĐTDH.02 do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Duyên hải Nam Trung Bộ cung cấp, đậu phộng (Arachis hypogaea L.): trồng ở Đắk Lắk, cám gạo: thu nhận từ nhà máy xay xát lúa ở Quảng Ngãi, phôi lúa mì: thu nhận từ nhà máy bột mì Việt Ý - Đà Nẵng, mủ đu đủ: thu từ một số vườn đu đủ (Carica papaya) trồng tại xã Đại An, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam, Mủ quả vả (Ficus auriculata) và mủ quả sung (Ficus racemosa) được thu nhận từ vườn của các hộ nông dân ở các tỉnh Thừa Thiên Huế. 2.2. Hoá chất para-Nitrophenyl palmitate (p – NPP), p-Nitrophenol (p- NP), n-hexan, Sodium Lauroyl sarcosine (SLS) được cung cấp bởi Sigma- Aldrich; 2-propanol, NaCl của hãng Merck; Triton X-100 của Canada; Ngoài ra, KCl, MgCl2, CaCl2, NaHCO3, Na2CO3, CH3COOH, Gum Arabic, CH3COONa, NaH2PO4.7H2O, NaH2PO4.7H2O, acetone đều đạt tiêu chuẩn phân tích.
7. 5 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phương pháp hóa học xác định thành phần nguyên liệu: độ ẩm và hàm lượng tro được xác định theo phương pháp của AOAC 952.08 và AOAC 938.08 (1990), hàm lượng protein thô được xác định bằng phương pháp Kjeldahl, hàm lượng chất béo được xác định bằng phương pháp chiết Soxhlet. - Phương pháp thu nhận lipase từ các nguồn thực vật: đậu phộng, đậu nành nảy mầm; cám gạo, phôi lúa mì; mủ đu đủ, mủ sung và mủ vả. Mục tiêu: thu lipase, xác định hoạt độ, khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, pH, ion kim loại đến hoạt độ lipase từ đó lựa chọn nguồn nguyên liệu để thu lipase cho nghiên cứu tiếp theo. - Phương pháp xác định hoạt độ lipase: + Phương pháp chuẩn độ: Đơn vị hoạt độ lipase (U/g hoặc U/ml) được xác định là lượng enzyme cần thiết để xúc tác giải phóng ra 1μmol acid béo tự do trong thời gian 1 phút ở điều kiện xác định. Cơ chất sử dụng trong phương pháp chuẩn độ gồm: dầu oliu, dầu cá hồi, triolein, tristearin. + Phương pháp đo quang: Lipase xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất p-nitrophenyl palmitate (p-NPP) tạo ra p-nitrophenol (p-NP) biểu hiện màu vàng đặc trưng. Hoạt độ của lipase được xác định bằng cách đo cường độ màu của dung dịch chứa p-NP trên máy UV- VIS ở bước sóng λ = 410 nm. Đơn vị hoạt độ được tính là lượng enzyme cần thiết để xúc tác giải phóng ra 1 µmol p-NP trong một phút. Hiệu suất thu nhận lipase (mU/g) được xác định bằng tổng hoạt độ lipase (mU) thu nhận được từ 1 gam nguyên liệu ban đầu. Tổng hoạt độ lipase = hoạt độ lipase thô ×khối lượng lipase thô thu được (2.1)
8. 6 (2.2) - Phương pháp xây dựng quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ: xác định phương pháp bảo quản mủ đu đủ bằng phơi nắng, sấy đối lưu, sấy thăng hoa, trữ đông; nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ mủ đu đủ/ nước để rửa lượng tạp chất, nghiên cứu xác định số lần lặp rửa/ly tâm, nghiên cứu xác định phương pháp sấy để thu lipase thô. - Phương pháp chiết tách và tinh sạch lipase từ mủ đu đủ: dùng dung dịch Tris HCl 0,1M pH 8 có chứa SLS 0,5% để hòa tan lipase thô, kết hợp các phương pháp kết tủa phân đoạn lipase với muối amoni sunfat, thẩm tách qua màn Cellophan, sắc ký trao đổi ion trên cột sắc ký HiTrap Q Sepharose Fast flow. Mục tiêu: thu nhận lipase tinh sạch từ mủ đu đủ. - Phương pháp xác định tính chất của lipase tinh sạch: khối lượng phân tử lipase được xác định bằng phương pháp điện di SDS, giá trị Km và Vmax được xác định dựa trên phương trình Lineweaver – Burk. - Phương pháp nghiên cứu ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ: phương pháp thu nhận dầu cá hồi, các chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa, chỉ số iod của dầu cá được xác định lần lượt theo TCVN 6127:2010, TCVN 6126:2015, TCVN 6122:2010; thành phần các acid béo có trong dầu cá hồi được xác định theo phương pháp AOAC 996.06; phương pháp thủy phân dầu cá hồi bằng CPL trong hệ nhũ tương dầu/nước và hệ 2 pha iso-octan/nước được xác định thông qua hiệu suất thủy phân DH % (2.3)
9. 7 - Phương pháp xác định năng lượng hoạt hóa (EA) của phản ứng thủy phân dầu cá hồi bằng CPL được xác định dựa trên đồ thị phương trình Arrhenius. - Các phương pháp toán học: tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay cấp II theo Box và Hunter, sử dụng phần mềm Minitab 18 để xử lý số liệu thực nghiệm. Các thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp để lấy giá trị trung bình và xác định độ lệch chuẩn bằng Microsoft Excel. Sự khác biệt có nghĩa giữa các kết quả thí nghiệm được đánh giá bằng kiểm định Fisher (p 0,05) bằng phần mềm Minitab 18. Các chữ số a, b, c, trên các đồ thị và các bảng thể hiện sự khác biệt có nghĩa của các kết quả nghiên cứu. CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ một số nguồn thực vật 3.1.1. Hoạt tính lipase từ các loại hạt có dầu nảy mầm 3.1.1.2. Ảnh hưởng của thời gian nảy mầm đến hoạt tính lipase của hạt đậu nành và đậu phộng nảy mầm Lipase từ hạt chứa dầu được tìm thấy có hoạt độ cao trong giai đoạn nảy mầm. Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt độ lipase tối đa từ đậu nành nảy mầm thu được sau 3 ngày (0,82U/ml) trên cơ chất dầu oliu. Giá trị này cao hơn so với hoạt độ lipase tối đa từ hạt đậu phộng nảy mầm (0,72 U/ml). Do đó lipase từ hạt đậu nành nảy mầm được lựa chọn để nghiên cứu các đặc tính tiếp theo. 3.1.1.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ hạt đậu nành nảy mầm Từ 20 gam đậu nành nảy mầm thu được 2,08 gam lipase thô.
10. 8 Kết quả nghiên cứu cho thấy lipase từ hạt đậu nành nảy mầm hoạt động tối ưu ở 30 oC, pH 9 trên cơ chất p-NPP. Các ion kim loại Ca2+, Mg2+ ở nồng độ 0,1M làm tăng hoạt độ của lipase từ đậu nành nảy mầm, Na+ và K+ làm giảm hoạt độ của lipase từ đậu nành nảy mầm. 3.1.2. Hoạt tính lipase từ phụ phẩm nông nghiệp: cám gạo và phôi lúa mì Kết quả nghiên cứu cho thấy từ 40 g cám gạo thu được 176,6 ml dịch enzyme thô; từ 40 g phôi lúa mì thu được 182 ml dịch enzyme thô. Lipase từ cám gạo và phôi lúa mì có cùng nhiệt độ tối ưu ở 45 °C. Lipase cám gạo hoạt động tối ưu ở pH 8 với hoạt độ lipase 0,238 mU/ml. Lipase từ phôi lúa mì hoạt động tối ưu ở pH 9,5 với hoạt độ 0,199 mU/ml. Sự có mặt của các ion kim loại như Mg2+, Cu2+, Na+, Mn2+ và EDTA ở nồng độ 0,1M đều làm giảm hoạt độ lipase cám gạo, lipase phôi lúa mì. 3.1.3. Hoạt tính lipase từ mủ của các loại quả Từ 17,25 g mủ đu đủ tươi thu được 0,58 g lipase thô. Lipase thô từ mủ đu đủ (CPL) hoạt động tối ưu ở 45 oC, pH 8,5 với hoạt độ lớn nhất đạt được là 120,43 mU/g trên cơ chất p-NPP. Từ 71,58 g mủ vả thu được 49,34 ml dịch lipase thô. Từ 60,25 g mủ sung thu được 41,69 ml dịch lipase thô. Lipase từ mủ sung và mủ vả có cùng nhiệt độ tối ưu 45 oC trên cùng cơ chất p – NPP. Lipase từ mủ sung hoạt động tối ưu ở pH 8,5 còn lipase từ mủ vả hoạt động tối ưu ở pH 9. Sự có mặt của các ion K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, EDTA ở nồng độ 0,1M đều làm giảm hoạt độ của lipase từ mủ sung và mủ vả.
11. 9 3.1.4. Đánh giá khả năng thu nhận lipase từ các nguồn thực vật khác nhau Từ các kết quả nghiên cứu thu nhận lipase và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ lipase từ các nguồn thực vật khác nhau ở các thí nghiệm trên, khả năng thu nhận lipase thô từ các nguồn thực vật có thể được tổng kết ở Bảng 3.4. Bảng 3.4. Hiệu quả thu nhận lipase từ các nguồn thực vật Hiệu quả Dạng Điều kiện thu nhận Nguồn Hoạt độ riêng STT chế phẩm hoạt động lipase thu nhận của chế phẩm lipase thô tối ƣu (mU/g nguyên liệu) Đậu nành 30 oC, 1 Bột 11,17 mU/g 1,16 nảy mầm pH = 9 45 oC, 2 Mủ đu đủ Bột 120,43 mU/g 4,05 pH = 8,5 45 oC, 3 Cám gạo Dịch lỏng 0,238 mU/ml 1,05 pH = 8 Phôi lúa 45 oC, 4 Dịch lỏng 0,199 mU/ml 0,91 mì pH = 9,5 45 oC, 5 Mủ vả Dịch lỏng 0,079 mU/ml 0,054 pH = 9 45 oC, 6 Mủ sung Dịch lỏng 0,096 mU/ml 0,066 pH = 8,5 Từ Bảng 3.4 cho thấy ở điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu của từng loại lipase thì lipase từ mủ đu đủ có hoạt độ riêng cao nhất (120,43 mU/g). Hiệu quả thu nhận lipase, tức tổng hoạt độ lipase thu được từ 1 gam nguyên liệu của mủ đu đủ là 4,05 mU/g cũng cao nhất. Trong số các nguồn thực vật trên, việc khai thác lipase từ mủ đu đủ là nhiều tiềm năng nhất. Vì mủ đu đủ từ lâu đã được khai thác để thu nhận papain ở quy mô công nghiệp, nên đây là nguồn nguyên
12. 10 liệu dễ kiếm, rẻ tiền. Vì lipase có ở phần rắn không tan của mủ đu đủ, papain có trong phần hoà tan được trong nước của mủ đu đủ, điều này cho phép thu nhận đồng thời lipase và papain từ một nguồn nguyên liệu và trong một quy trình kết hợp. Cho đến nay, chưa có một quy trình thu nhận lipase từ mủ đu đủ với đầy đủ các thông số tối ưu được công bố, do đó mủ đu đủ được chọn là đối tượng để nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất lipase thô và đánh giá khả năng ứng dụng của nó trong các nghiên cứu tiếp theo của luận án. 3.2. Thu nhận enzyme lipase thô từ mủ đu đủ 3.2.1. Nghiên cứu phương pháp sấy để bảo quản mủ đu đủ Từ nguồn mủ thô ban đầu thu nhận trực tiếp từ quả đu đủ vào lúc sáng sớm, mủ đu đủ được đem đi làm khô đến khối lượng không đổi theo 3 phương pháp khác nhau: phơi nắng, sấy đối lưu (55 oC, 36 giờ), sấy thăng hoa (-40 oC, 16 giờ). Bảng 3.5. Ảnh hưởng của các phương pháp sấy khác nhau lên hoạt độ lipase Phương pháp sấy Độ ẩm Hoạt độ lipase nguyên liệu ban đầu (%) (mU/g CK) Phơi nắng 11,8 27,68 ± 1,02 Sấy đối lưu 11,3 18,22 ± 0,78 Sấy thăng hoa 9,13 120,35 ± 4,59 Mủ đu đủ sau sấy thăng hoa có hoạt độ cao nhất (120,35 mU/g CK), cao gần gấp 4 lần so với phương pháp sấy đối lưu và hơn 6 lần so với phơi nắng. Vậy sấy thăng hoa là phương pháp sấy tốt nhất để làm khô mủ đu đủ trước khi bảo quản trong số các phương pháp sấy đã nghiên cứu. b) Nghiên cứu bảo quản mủ đu đu tươi bằng phương pháp lạnh đông
13. 11 Kết quả theo dõi hoạt độ lipase sau các khoảng thời gian trữ đông được thể hiện ở Bảng 3.6. Bảng 3.6. Sự thay đổi hoạt độ lipase của mủ đu đủ theo gian trữ đông Thời gian trữ đông (tuần) Hoạt độ lipase (mU/g CK) Mẫu đối chứng 129,61 ± 7,08a 1 128,88 ± 7,46ab 2 127,00 ± 7,35ab 3 126,08 ± 8,64ab 4 123,51 ± 5,86ab 5 117,37 ± 7,30bc 6 109,74 ± 8,64c Kết quả cho thấy hoạt độ lipase thu được từ mủ đu đủ tươi cấp đông đến 5 tuần có hoạt độ tương đương với hoạt độ lipase thu được từ mủ khô sau khi sấy thăng hoa. Do đó nếu thu lipase từ nguyên liệu mủ tươi thì mủ đu đủ có thể bảo quản trữ đông đến 5 tuần, còn nếu mủ cần để thời gian dài thì chọn phương pháp sấy thăng hoa mủ là tối ưu. 3.2.2. Thu nhận enzyme thô 3.2.2.1. Chọn tỷ lệ mủ đu đủ/ nước Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến hiệu quả thu nhận lipase thô STT Tỷ lệ mủ đu đủ/nước Khối lượng lipase thô Độ ẩm (w/w) (g) (%) 1 1:4 1,9861±0,0343 9,54 2 1:5 1,6927±0,0082 9,56 3 1:6 1,3626±0,0376 9,57 4 1:7 1,1382±0,0125 9,54 5 1:8 1,1315±0,0148 9,55 6 1:9 1,1250±0,0110 9,54
14. 12 Kết quả Bảng 3.7 cho thấy khi tăng dần lượng nước hòa tan mủ đu đủ theo tỷ lệ từ 1:4 đến 1:7 thì lượng lipase thô thu được giảm dần chứng tỏ lượng tạp chất hòa tan được nhiều hơn. Tuy nhiên, khi lượng nước tăng thêm đến tỷ lệ 1:9 thì khối lượng lipase thô thay đổi không đáng kể. 80 85 80 70 75 60 70 50 65 60 40 55 30 50 20 45 40 10 35 0 30 Hoạt độ lipase tổng (mU) tổng lipase Hoạt độ (mU/g) riênglipase Hoạt độ 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 Tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc Hoạt độ riêng lipase (mU/g) Hoạt độ lipase tổng (mU) Hình 3.18. Ảnh hưởng của tỷ lệ mủ đu đủ/nước đến hoạt độ riêng và hoạt độ tổng của CPL Trong khi đó, kết quả ở Hình 3.18 cho thấy hoạt độ riêng của lipase thô cũng tăng dần khi lượng nước hòa tan tăng nhưng hoạt độ tổng vẫn giảm không đáng kể. Điều này chứng tỏ ở tỷ lệ mủ đu đủ/nước là 1:7 là lượng nước thích hợp cho quá trình hòa tan mủ đu đủ thu lipase thô. 3.2.2.2. Chọn số lần lặp rửa-ly tâm Quá trình rửa mủ đu đủ nếu lặp lại nhiều lần có thể làm tăng khả năng hòa tan các enzyme tan trong nước cũng như lượng tạp chất có trong mủ. Dựa vào kết quả nghiên cứu trên, chọn tỷ lệ mủ đu đủ/ nước là 1:7 để rửa lipase.
15. 13 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của số lần lặp rửa – ly tâm đến hiệu quả thu nhận lipase thô STT Số lần lặp rửa - ly tâm Khối lượng lipase thô Độ ẩm 1 1 1,1378±0,0107 9,59 2 2 0,8959±0,0195 9,55 3 3 0,6386±0,0154 9,56 4 4 0,6333±0,0176 9,54 5 5 0,6324±0,0068 9,57 Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy cho thấy nếu số lần lặp rửa ly tâm tăng từ 1 đến 3 lần thì khối lượng lipase thô thu được cũng giảm từ 1,1378g xuống còn 0,6386g. Dễ dàng nhận thấy số lần lặp tăng thì khả năng hòa tan tạp chất trong nước của mủ đu đủ cũng tăng. Nếu tăng số lần lặp rửa – ly tâm lên 4 lần thì lượng lipase thô thu được thay đổi không đáng kể. 140 80 75 120 70 100 65 80 60 55 60 50 40 45 40 20 35 Hoạt độ riêng lipase (mU/g) 0 30 1 2 3 4 5 Hoạt độ lipase tổng (mU) Số lần lặp rửa - ly tâm Hoạt độ riêng lipase (mU/g) Hoạt độ lipase tổng (mU) Hình 3.19. Ảnh hưởng của số lần lặp rửa – ly tâm đến hoạt độ riêng và hoạt độ tổng của CPL. 3.2.2.3. Nghiên cứu phương pháp sấy để thu lipase thô
16. 14 Phần rắn thu được sau ly tâm cần được sấy khô đến độ ẩm bảo quản để thu chế phẩm enzyme thô. Mục đích nghiên cứu nhằm đánh giá hoạt độ của chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ theo 2 phương pháp sấy khô khác nhau. Từ đó đề xuất được quy trình thu nhận chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ. Bảng 3.9. Hoạt độ của chế phẩm lipase thô thu bằng 2 phương pháp sấy khác nhau Phương pháp sấy Độ ẩm Hoạt độ kết thúc (%) (mU/ g enzyme khô) Sấy thăng hoa 9,13 120,349 (-40 oC, 24 giờ) Sấy đối lưu 9,55 32,069 (55 oC, 36 giờ) Kết quả cho thấy hoạt độ lipase thô thu được của mẫu sau khi sấy thăng hoa (120,349 mU/g) cao hơn nhiều so với mẫu lipase thô sau khi sấy đối lưu (32,069 mU/g). Do đó lipase thu nhận được bằng phương pháp sấy thăng hoa sẽ bảo toàn được hoạt tính lipase. 3.2.2.4. Đề xuất quy trình thu lipase thô Dựa vào kết quả nghiên cứu trên, quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ có thể được đề xuất trên Hình 3.21.
17. 15 Mủ đu đủ Bảo quản lạnh đông Rã đông Nƣớc cất Ngâm, rửa tạp chất (5 phút) Tỷ lệ mủ đu đủ/nƣớc Lặp lại 3 lần (1:7; w/w) o Ly tâm (6000 vòng, 20 phút, 4 C) Dịch thải o Sấy thăng hoa (-40 C, 16 giờ ) Lipase thô CPL) Hình 3.21. Quy trình thu lipase thô từ mủ đu đủ 3.3. Tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ 3.3.1. Chiết tách lipase mủ đu đủ bằng muối sodium lauroyl sarcosinate (SLS) Tiến hành hòa tan lipase thô trong dung dịch Tris HCl 0,1M, pH 8 có SLS 0,5%, kết quả của quá trình thu được ở Bảng 3.11. Bảng 3.11. Hoạt tính của CPL sau hòa tan mà không loại lipid Mẫu Lipase thô Phần rắn Phần lỏng Khối lượng/thể tích 1,016 g 0,498g 97mL Hoạt độ riêng 115,07mU/g 20,83mU/g 50,16mU/mL Hoạt độ tổng 116,91mU 10,37mU 4865,5mU
18. 16 Kết quả cho thấy hoạt tính của lipase có cả ở phần rắn và phần lỏng. Hoạt tính còn lại trong phần rắn (10,37 mU) chỉ chiếm 8,87% so với hoạt tính ban đầu của lipase thô. Tuy nhiên, hoạt tính lipase trong phần dịch lỏng cao gấp 40 lần so với dịch lỏng có loại lipid ở phương pháp trước. Sự tăng vượt trội về hoạt độ lipase cho thấy rằng một lượng lipase đáng kể trong mủ đã được SLS hòa tan ra khỏi mủ. 3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ SLS lên hoạt độ lipase Kết quả dung dịch Tris HCl pH 8 có SLS 0,5% sử dụng để hòa tan mủ đu đủ thu lipase có hoạt độ cao nhất. 3.3.3. Tủa lipase bằng dung dịch amoni sunfat (AS) Dịch thu được sau khi hòa tan mủ đu đủ trong dung dịch Tris HCl pH 8 có SLS 0,5% được tủa bằng dung dịch AS ở các nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy ở phân đoạn 50-60% AS có hoạt tính thủy phân tốt và khối lượng lipase tủa lớn nhất nên phân đoạn này được chọn để tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion. 3.3.5. Kết quả tinh sạch enzyme lipase từ mủ đu đủ bằng sắc ký trao đổi ion Mẫu ở phân đoạn tủa 50-60% AS được thẩm tách muối qua màn Cellophan trong 48 giờ sau đó được nạp vào cột sắc ký trao đổi ion. Sử dụng cột Q Sepharose Fast Flow với điều kiện tách phân đoạn như sau: cột được cân bằng trong đệm Tris-HCl 0,01M, pH 9; tốc độ chảy 0,1ml/phút với gradient nồng độ 1M NaCl. Hình 3.27. Sắc ký đồ của phân đoạn lipase tủa ở 50-60% AS
19. 17 Kết quả trên Hình 3.27 cho thấy có xuất hiện 2 peak chứng tỏ có ít nhất 2 loại protein có trong mẫu. Peak đầu tiên được rửa giải từ 2,58 phút đến 6,87 phút, tiếp theo peak thứ 2 xuất hiện từ 6,87 phút đến 11,29 phút. Hoạt độ của lipase được xác định tương ứng với 2 peak là 0,316mU/mL và 0,338mU/mL. 3.4. Nghiên cứu tính chất của lipase tinh sạch 3.4.1. Xác định khối lượng phân tử lipase Kết quả Hình 3.28 cho thấy có 2 loại lipase có khối lượng phân tử trong khoảng 35-55 kDa trong phân đoạn tủa với AS 50-60%. M: standard proteins (10-170 kDa) 1-3: mẫu lặp ở phân đoạn tủa AS 50-60% Hình 3.28. Hình ảnh điện di SDS 3.4.2. Xác định Km và Vmax Theo đồ thị Lineweaver-Burk trên Hình 3.29, giá trị Km và Vmax của lipase tinh sạch từ mủ đu đủ khi thủy phân cơ chất p – NPP được xác định tương ứng là 1,12mM và 1,2×10-6 mM/min.mL. Hình 3.29. Đồ thị Lineweaver-Burk
20. 18 3.5. Đánh giá khả năng ứng dụng lipase mủ đu đủ trong quy trình sản xuất dầu cá giàu DHA và EPA 3.5.3.1. Khảo sát đặc tính thủy phân của CPL trên cơ chất dầu cá hồi Bảng 3.1. Phần trăm acid béo có trong dầu cá hồi trước và sau khi thủy phân % % trong Acid béo methyl ester trong phân đoạn ST mẫu dầu không T Kí ban bị thuỷ Tên thông thường hiệu đầu phân 1 C14:0 Myristic acid methyl ester 3,23 2,64 2 C16:0 Palmitic acid ester 12,17 10,59 3 C16:1 Palmitoleic acid methyl ester 3,22 2,96 4 C18:0 Stearic acid methyl ester 2,99 2,9 5 C18:1 Oleic acid methyl ester 40,89 40,93 6 C18:2 Linoleic acid methyl ester 16,78 15,96 7 C20:0 Arachidic acid methyl ester 0,36 0 8 C18:3 Linolenic acid methyl ester 6,08 5,83 9 C20:1 cis-11-Eicosenoic acid methyl ester 0,99 2,59 cis-11,14-Eicosadienoic acid methyl 10 C20:2 2,52 0,95 ester cis-5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic 11 C20:5 5,1 4,97 acid methyl ester (EPA) Cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic 12 C22:6 5,66 7,73 acid methyl ester (DHA) cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid 13 C20:3 0 0,25 methyl ester cis-11,14,17-Eicosatrienoic acid 14 C20:3 0 0,83 methyl ester 15 C22:1 Erucic acid methyl ester 0 0,32 16 C20:4 Arachidonic acid methyl ester 0 0,56
21. 19 Thành phần của các acid béo có trong dầu cá hồi trước và sau khi thủy phân được xác định bằng phương pháp sắc ký khí thể hiện ở Bảng 3.15. Sau thời gian thủy phân 24 giờ, cho thấy tỷ lệ % của các acid béo còn lại trong mẫu triglyceride không bị thủy phân so với mẫu dầu ban đầu khác nhau không đáng kể. Điều này cho thấy CPL xúc tác thủy phân không đặc hiệu với các acid béo có trong dầu cá hồi. 3.5.3.2. Tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL a. Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hiệu suất của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL Thực hiện tối ưu hóa điều kiện thủy phân dầu cá bởi CPL bằng công cụ tối ưu hoá của phần mềm Minitab 18.0 cho kết quả nhiệt độ tối ưu là 290C và pH tối ưu là 7,6. b. Xác định tỷ lệ nước/cơ chất và nồng độ enzyme tối ưu cho hiệu suất của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL Kết quả tối ưu hóa bằng phần mềm Minitab 18.0 cho biết ở điều kiện thủy phân với tỷ lệ nước/cơ chất 4,36 và nồng độ enzyme 1,34% hiệu suất thủy phân đạt cao nhất 49,4%. c. Thí nghiệm kiểm chứng Tiến hành thủy phân dầu cá hồi bằng CPL với các điều kiện tối ưu: nhiệt độ 29 oC, pH đệm 7,6; tỷ lệ nước/cơ chất 4,36% và nồng độ enzyme 1,34%. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho kết quả hiệu suất thủy phân là 48,2% ± 0,3%. Kết quả này gần giống với tính toán theo lý thuyết. 3.5.3.5. Tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ 2 pha iso-octan/nước Quá trình tối ưu hóa 3 yếu tố: nồng độ enzyme, tỷ lệ dung môi/cơ chất, nhiệt độ đến quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng CPL
22. 20 được thực hiện theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay Box-Hunter. Thời gian thủy phân là 1 giờ, kết quả hiệu suất thủy phân thể hiện ở Bảng 3.21. Bảng 3.21. Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm Hiệu Biến thực Biến mã hoá suất Số thí (%) nghiệm Nồng độ Tỷ lệ dung Nhiệt độ enzyme môi/cơ chất X1 X2 X3 Y (x3) (x1) (x2) 1 1,8 1,5 30 +1 +1 -1 30,8 2 1,6 1,84 35 0 +α 0 32,4 3 1,4 1,5 30 -1 +1 -1 27,5 4 1,6 1 26,6 0 0 -α 25,9 5 1,4 1,5 40 -1 +1 +1 31,3 6 1,94 1 35 +α 0 0 31,9 7 1,8 0,5 40 +1 -1 +1 33,4 8 1,4 0,5 30 -1 -1 -1 26,4 9 1,4 0,5 40 -1 -1 +1 31,9 10 1,26 1 35 -α 0 0 27,1 11 1,6 1 43,4 0 0 +α 32,0 12 1,8 1,5 40 +1 +1 +1 33,1 13 1,8 0,5 30 +1 -1 -1 33,9 14 1,6 0,16 35 0 -α 0 30,4 T1 1,6 1 35 0 0 0 35,0 T2 1,6 1 35 0 0 0 35,5 T3 1,6 1 35 0 0 0 36,1 Kết quả thu được phương trình hồi quy thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố đến mục tiêu như sau: 2 2 2 Y = -265,4 + 189,2x1 + 7,42x3 – 44,8x1 – 4,62x2 - 0,081x3 Sử dụng công cụ tìm điểm tối ưu của phần mềm Minitab, kết quả thu được nồng độ enzyme tối ưu là 1,68% tương ứng với 0,084g
23. 21 enzyme cho 1g dầu cá hồi, tỷ lệ dung môi/cơ chất tối ưu là 0,97 và nhiệt độ tối ưu là 36,4oC. Hiệu suất thủy phân đạt 35,98% ở điều kiện tối ưu sau khoảng thời gian 1 giờ. 3.5.3.6. Xác định các thông số động học của quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ 2 pha iso-octan/nước a. Xác định Km và Vmax Các thông số động học Km và Vmax của CPL khi thủy phân cơ chất dầu cá hồi được xác định tương ứng là 293,3 µmol FAs/ml và 266,4 (µmol FFAs/giờ.ml). b. Xác định năng lượng hoạt hóa EA Năng lượng hoạt hóa (EA) của phản ứng thủy phân dầu cá hồi bằng CPL đã được xác định dựa trên đồ thị phương trình Arrhenius thể hiện ở Hình 3.38. -0.8 0.00315 0.0032 0.00325 0.0033 0.00335 -1 -1.2 lnk y = -4873.6x + 14.646 R² = 0.9811 -1.4 -1.6 1/T (K-1) Hình 3.38. Đồ thị Arrhenius thủy phân dầu cá bằng CPL E Phương trình A tương ứng với lnkA ln 0 RT y = -4873,6x + 14,646. Từ đây, năng lượng hoạt hóa được xác định EA = 40,5 kJ/mol. Một phản ứng có năng lượng hoạt hóa càng nhỏ thì tốc độ phản ứng càng lớn.
24. 22 3.5.3.7. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất của quá trình thủy phân dầu cá trong hệ có iso octan ở điều kiện tối ưu Từ đồ thị Hình 3.39 80 63.9c 64b 63.9a cho thấy, hiệu suất phản ứng 57d 60 thủy phân dầu cá hồi xúc tác 40 bởi CPL ở chế độ thủy phân Hiệu Hiệu suất(%) 20 đã chọn tăng dần theo thời e 0 gian. Sau thời gian này thì 0 24 48 72 96 120 hiệu suất thủy phân tăng rất Thời gian (giờ) ít và gần như không đổi. Hình 3.39. Biểu đồ ảnh hưởng của Nguyên nhân có thể do hệ thời gian đến hiệu suất của quá phản ứng đã đạt trạng thái trình thủy phân. cân bằng. Vì vậy quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ iso- octan/nước không cần kéo dài quá 48 giờ. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ A. KẾT LUẬN 1/ Đã thu nhận được lipase thô từ một số nguồn nguyên liệu thực vật ở Việt Nam và xác định được điều kiện hoạt động tối ưu của chúng trên cơ chất p-NPP. Lipase từ mủ đu đủ có nhiệt độ tối ưu o 45 C, pH tối ưu khoảng 8-9. Kết quả so sánh hoạt độ lipase từ các nguồn nguyên liệu thực vật được khảo sát ở điều kiện hoạt động tối ưu của chúng cho thấy lipase từ mủ đu đủ có hoạt độ cao nhất, có tiềm năng nhất để khai thác ở quy mô công nghiệp. 2/ Đã xây dựng được quy trình sản xuất lipase thô từ mủ đu đủ (CPL). Sản phẩm thu được có độ ẩm 9,13%, hoạt độ riêng 120,349 mU/g, có khả năng thủy phân dầu cá hồi tốt hơn so với dầu đậu
25. 23 nành, triolein, tristearin. 3/ Lần đầu tiên, lipase từ mủ đu đã được chiết tách bằng cách sử dụng dung dịch đệm Tris – HCl chứa SLS 0,5%. Bước đầu phân lập được một phân đoạn chứa 2 loại lipase có khối lượng phân tử khoảng 35 – 55 kDa. Các thông số động học Km và Vmax của phân đoạn lipase này trên cơ chất p –NPP được xác định tương ứng là 1,22mM và 1,2.10-6 mM.min-1.ml-1 4/ Bằng kỹ thuật sắc ký khí đã xác định được CPL thủy phân không đặc hiệu các acid béo có trong dầu cá hồi. 5/ Điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi o CPL trong hệ nhũ tương dầu/ nước đã được xác định ở 29 C, pH tối ưu 7,6, tỷ lệ lượng nước/cơ chất 4,36, nồng độ enzyme 1,34%, hiệu suất thủy phân tối ưu đạt 49,4% sau 24 giờ. Điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ 2 pha iso- octan/nước đã được xác định ở 36,4 oC, nồng độ enzyme 1,68%, tỷ lệ dung môi/ cơ chất 0,97, hiệu suất thủy phân tối ưu đạt 57% sau 24 giờ. 6/ Các thông số động học Km, Vmax và năng lượng hoạt hóa của quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi CPL trong hệ 2 pha iso- octan/nước đã được xác định lần lượt tương ứng là 15,8mol FFAs/ml, 270,6mol FFAs/h.ml và 40,5 kJ/mol. B. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Các kết quả nghiên cứu của luận án đã được xác định có những đóng góp cho khoa học về mặt học thuật và thực tiễn như sau: - Đã chiết được phần lớn lipase ra khỏi cấu trúc mủ đu đủ nhờ vào 3 điểm cải tiến so với các quy trình trước đây được công bố: tiến hành đông khô nhanh mủ đu đủ, không sử dụng dung môi hữu cơ để loại lipid và sử dụng chất hoạt động bề mặt SLS 0,5%. Đã phân lập được 2 lipase từ mủ đu đủ có khối lượng phân tử trong
26. 24 khoảng 35 – 55kDa. - Đã xác định được enzyme lipase từ mủ đu đủ không có tính đặc hiệu với các acid béo có trong dầu cá hồi. Các thông số tối ưu cho quá trình thuỷ phân dầu cá hồi trong hệ nhũ tương dầu nước và hệ hai pha với iso-octan đã được xác định, mở ra khả năng ứng dụng lipase thô từ mủ đu đủ trong quy trình làm giàu DHA và EPA từ dầu cá hồi nói riêng và các loại dầu cá khác nói chung. C. KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 1/ Nghiên cứu thu nhận lipase từ các nguồn nguyên liệu thực vật khác có sẵn ở Việt Nam. 2/ Nghiên cứu ứng dụng lipase từ mủ đu đủ trong các phản ứng ester hóa, phản ứng chuyển ester.
27. 25 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ 1. Phan Thị Việt Hà, Đặng Minh Nhật, Trần Châu Cẩm Hằng (2015), “Nghiên cứu động thái sinh tổng hợp lipase của hạt đậu nành trong quá trình nảy mầm và một số đặc tính của loại enzyme này”, Hội thảo khoa học quản lý chất lượng & An toàn thực phẩm, ISBN 987-604-913-415-9, pp. 17 – 23. 2. Phan Thị Việt Hà, Đặng Minh Nhật, Trần Thị Xô, Phan Thị Luyến (2015), “Nghiên cứu thu nhận và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lipase từ mủ đu đủ”, Tạp chí Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, 53 (6e1,2), p.291- 294. 3. Phan Thị Việt Hà, Đặng Minh Nhật, Trần Thị Bích Hà (2016), “Nghiên cứu thu nhận và khảo sát đặc tính lipase từ mủ đu đủ (carica papaya latex)”, Tạp chí khoa học và công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 108 (11), pp. 82-85. 4. Phan Thị Việt Hà, Huỳnh Thị Tuyết Mai, Đặng Minh Nhật, Trần Thị Xô (2017), “Nghiên cứu chiết tách và khảo sát đặc tính của lipase từ hạt đậu phộng nảy mầm”, Tạp chí Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, (4E23), pp. 118-223. 5. Dang Minh Nhat, Phan Thi Viet Ha (2019), “The isolation and characterization of lipase from carica papaya latex using zwitterion sodium lauroyl sarcosinate as agent”, Potravinarstvo Slovak Journal of Food Sciences, 13 (1), pp. 773-778. 6. Phan Thị Việt Hà, Huỳnh Thị Phương Thu, Đặng Minh Nhật (2020), Tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng lipase từ mủ đu đủ, Tạp chí khoa học và công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 18 (1), pp. 55-59.