Nghiên cứu tính đối kháng của Aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu tính đối kháng của Aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngô và lạc

1. BỘ GIÁO D ỤC VÀ ĐÀO T ẠO TR ƯỜNG ĐẠI H ỌC BÁCH KHOA HÀ N ỘI LÊ THIÊN MINH NGHIÊN C ỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG C ỦA ASPERGILLUS FLAVUS KHÔNG SINH ĐỘC T Ố ĐỂ PHÒNG CH ỐNG AFLATOXIN TRÊN NGÔ VÀ L ẠC Chuyên ngành: Công ngh ệ sinh h ọc Mã s ố: 62420201 TÓM T ẮT LU ẬN ÁN TI ẾN S Ĩ CÔNG NGH Ệ SINH H ỌC Hà N ội – 2014
2. Công trình này đượ c hoàn thành t ại Tr ườ ng Đạ i h ọc Bách khoa Hà N ội Ng ười h ướng d ẫn khoa h ọc: 1. GS. TS. NGUY ỄN THÙY CHÂU 2. PGS. TS. NGUY ỄN TH N XUÂN SÂM Ph ản bi ện 1: PGS. TS. LÊ L ƯƠ NG T Ề Ph ản bi ện 2: PGS. TS. NGUY ỄN TH N HOÀI TRÂM Ph ản bi ện 3: GS. TS. NGUY ỄN V ĂN TU ẤT Lu ận án s ẽ được b ảo v ệ tr ước Hội đồng ch ấm lu ận án ti ến s ĩ cấp Tr ườ ng họp t ại Trườ ng Đạ i h ọc Bách khoa Hà N ội Vào hồi . gi ờ . ngày tháng n ăm Có th ể tìm hi ểu lu ận án t ại th ư vi ện: 1. Th ư vi ện T ạ Quang B ửu – Tr ường Đại học Bách khoa Hà N ội 2. Th ư Vi ện Qu ốc gia
3. NH ỮNG CÔNG TRÌNH C ỦA TÁC GI Ả ĐÃ CÔNG B Ố LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LU ẬN ÁN 1. Lê Thiên Minh, Nguy ễn Ti ến Nam, Nguy ễn Thùy Châu. (2010). Hi ệu qu ả c ủa ch ế ph m Aspergillus flavus (AF) không sinh aflatoxin để phòng ch ống afltoxin trên lạc. Tạp chí Nông nghi ệp và Phát Tri ển Nông thôn, (5/2010). pp (81-85). 2. Lê Thiên Minh, Nguy ễn Thùy Châu. (2010). Tác d ụng c ủa ch ủng A.flavus DA2 không sinh và phòng ch ống aflatoxin trên ngô ở giai đoạn ngoài đồng và trong quá trình b ảo qu ản. T ạp Chí Nông nghi ệp và Phát tri ển Nông thôn, (6/2010). pp (30- 34) 3. Lê Thiên Minh, Nguy ễn H ồng Hà, Nguy ễn Th ị Xuân Sâm, Nguy ễn Thùy Châu. (2011). Nghiên c ứu s ản xu ất ch ế ph m Aspergillus flavus không sinh aflatoxin để phòng ch ống aflatoxin. Hội ngh ị Khoa h ọc Toàn qu ốc v ề C ơ điện Nông nghi ệp và Bảo qu ản Ch ế bi ến Nông s ản, Th ực ph Nm. NXB Khoa h ọc và K ỹ thu ật. (1/2011). pp.213-219.
4. MỞ ĐẦU Aflatoxin là nh ững ch ất chuy ển hóa có độc tính cao, được sinh t ổng h ợp ch ủ y ếu b ới các loài n ấm m ốc Aspergillus . Các độc t ố này t ồn t ại trong nông sản th ực ph Nm, không nh ững làm gi ảm giá tr ị dinh d ưỡng c ủa th ực ph Nm mà còn là m ột trong nh ững nguyên nhân gây nên nh ững c ăn b ệnh nguy hi ểm cho ng ười và động v ật nh ư viêm gan c ấp tính, ung th ư gan, suy dinh d ưỡng ở tr ẻ em. Vi ệc ki ểm soát hàm l ượng aflatoxin có m ặt trong nông s ản th ực ph Nm đã được nghiên c ứu t ừ r ất lâu v ới nhi ều bi ện pháp khác nhau, m ỗi bi ện pháp đều có nh ững ưu nh ược điểm nh ất định nh ưng ch ưa có bi ện pháp nào đạt được hi ệu qu ả nh ư mong đợi. Nh ững n ăm g ần đây, xu h ướng sử dụng chính nh ững ch ủng nấm đối kháng Aspergillus flavu s không sinh độc t ố có tính c ạnh tranh cao làm tác nhân ki ểm soát đang được phát tri ển và t ỏ ra khá hi ệu qu ả. Ch ế ph Nm n ấm Aspergillus flavus đối kháng đã được nghiên c ứu, ứng d ụng và c ấp b ằng sáng ch ế, được s ử dụng r ộng rãi trong nông nghi ệp ở một s ố qu ốc gia nh ư M ỹ, Ấn Độ, Trung Qu ốc Vi ệt Nam n ằm trong mi ền khí h ậu nhi ệt đới nóng, Nm là điều ki ện r ất thu ận lợi cho các loài n ấm m ốc phát tri ển, xâm nhi ễm vào cây tr ồng ngay t ừ giai đoạn canh tác, trong su ốt quá trình b ảo qu ản và ch ế bi ến n ếu không có bi ện pháp ki ểm soát nghiêm ng ặt. Do đó, vi ệc t ạo l ập m ột ch ế ph Nm n ấm A. flavus đối kháng t ừ nh ững ch ủng phân l ập được trên các ngu ồn t ự nhiên b ản địa ch ắc ch ắn sẽ mang l ại hi ệu qu ả gi ảm thi ểu s ự nhi ễm aflatoxin. Xu ất phát t ừ nh ững lý do trên, chúng tôi đã th ực hi ện đề tài: “Nghiên c ứu tính đối kháng c ủa Aspergillus flavus không sinh độc t ố để phòng ch ống aflatoxin trên ngô và l ạc”, v ới các m ục đích và n ội dung nghiên c ứu chính sau đây: Mục đích nghiên c ứu Ki ểm soát s ự nhi ễm aflatoxin trên ngô, l ạc b ằng ch ế ph Nm Aspergillus flavus không sinh aflatoxin. Nội dung nghiên c ứu 1. Phân l ập, tuy ển ch ọn các ch ủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin có kh ả n ăng c ạnh tranh cao và ổn định v ới các ch ủng A. flavus sinh aflatoxin. 2. Nghiên c ứu quy trình nuôi c ấy và t ạo ch ế ph Nm bào t ử t ừ ch ủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin. 3. Nghiên c ứu ứng d ụng ch ế ph Nm Aspergillus flavus không sinh aflatoxin 1
5. nh ằm gi ảm thi ểu s ự nhi ễm aflatoxin trên ngô, l ạc ở quy mô phòng thí nghi ệm và trên đồng ru ộng. Nh ững đóng góp m ới c ủa lu ận án 1. Là công trình nghiên c ứu đầu tiên ở Vi ệt Nam s ử d ụng c ơ ch ế c ạnh tranh sinh h ọc b ằng ch ủng A. flavus không sinh aflatoxin trong ki ểm soát aflatoxin nhi ễm trên ngô và l ạc. 2. Lu ận án nghiên c ứu s ử d ụng k ỹ thu ật multiplex PCR để làm sáng t ỏ b ản ch ất sinh h ọc phân t ử c ủa ch ủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin phân l ập t ừ ngô (Vi ệt Nam). Ch ủng A. flavus DA2 không mang 3 gen ( ver , aflR và nor ) trong cụm gen sinh t ổng h ợp aflatoxin. 3. Lu ận án đã nghiên c ứu t ạo được công ngh ệ nuôi c ấy b ề m ặt cho s ản xu ất ch ế ph Nm bào t ử ch ủng A. flavus DA2 đạt s ản l ượng cao (10 9CFU/g) v ới công ngh ệ đơ n gi ản, giá thành r ẻ. Ch ế ph Nm có tác d ụng gi ảm s ự nhi ễm n ấm m ốc và aflatoxin trên ngô, l ạc ở giai đoạn đồng ru ộng và trong quá trình b ảo qu ản t ừ 86,55% đến 97%, đảm b ảo tính kh ả thi cao khi đư a ra ứng d ụng ở quy mô l ớn. Bố c ục lu ận án Lu ận án g ồm 124 trang, 35 bảng và 26 hình; Mục l ục 3 trang; Mở đầu: 2 trang; Ch ươ ng 1. T ổng quan tài li ệu: 27 trang; Ch ươ ng 2. V ật li ệu và ph ươ ng pháp nghiên c ứu: 11 trang; ch ươ ng 3. K ết qu ả và th ảo lu ận: 51 trang; K ết lu ận và ki ến ngh ị: 1 trang; Tài li ệu tham kh ảo: 12 trang ( Bao g ồm 11 tài li ệu ti ếng Vi ệt, 129 tài li ệu ti ếng Anh); Ph ụ l ục: 15 trang. CH ƯƠ NG I. TỔNG QUAN TÀI LI ỆU 1.1 T ỔNG QUAN V Ề AFLATOXIN Aflatoxin là nhóm các h ợp ch ất có nhân difuranocumarin, là s ản ph Nm trao đổi ch ất ch ủ yếu của hai loài n ấm m ốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus . Aflatoxin là các ch ất có kh ả n ăng gây ung th ư, gây đột bi ến gen, là tác nhân làm gi ảm kh ả n ăng mi ễn d ịch. Ng ười có th ể b ị nhi ễm aflatoxin do ăn ph ải các lo ại ng ũ c ốc b ị nhi ễm ho ặc ăn th ịt các động v ật được nuôi b ằng ng ũ c ốc b ị nhi ễm aflatoxin. Các nghiên c ứu ở nh ững vùng có t ỷ l ệ ung th ư cao trên th ế gi ới đều cho th ấy nhi ễm độc aflatoxin là nguy c ơ chính gây ung th ư gan. 2
6. 1.2 PHÒNG CH ỐNG SỰ NHI ỄM AFLATOXIN Trên th ực t ế, đã có m ột s ố bi ện pháp ki ểm soát aflatoxin được ứng d ụng nh ư: bi ện pháp canh tác nông nghi ệp, bi ện pháp sau thu ho ạch, ph ươ ng pháp sinh h ọc, s ử dụng vi sinh v ật đối kháng Việc s ử d ụng các ch ủng vi sinh v ật đối kháng không có h ại cho con ng ười và th ực ph Nm mà l ại có kh ả n ăng gi ảm s ự tạo độc t ố ho ặc ức ch ế hoàn toàn vi ệc tạo độc t ố là bi ện pháp lý t ưởng. Các nghiên c ứu c ủa Dorner cho th ấy, lạc đã b ị nhi ễm Aspergillus flavus và aflatoxin t ừ giai đoạn tr ước thu ho ạch. Vì v ậy, nhi ều Qu ốc gia nh ư Mỹ, Ấn Độ, Thái Lan, Nigeria đã có chi ến l ược phòng ch ống nh ằm gi ảm t ổn th ất do aflatoxin gây nên trên l ạc ở giai đoạn tr ước và sau thu ho ạch. Vi ệc s ử d ụng ch ủng A. flavus không sinh độc t ố để ức ch ế các ch ủng A. flavus sinh độc t ố nhi ễm trong đất tr ồng l ạc theo c ơ ch ế lo ại tr ừ c ạnh tranh đã được thực hi ện ở các n ước này. C ơ quan b ảo v ệ môi tr ường c ủa M ỹ đã cho phép đư a vào danh m ục ch ủng Aspergillus flavus AF36 nh ư là tác nhân sinh học an toàn để phòng ch ống aflatoxin trên ngô, l ạc và bông. Ch ế ph Nm AF36 sản xu ất t ừ ch ủng A. flavus AF36 được công nhận là thu ốc b ảo v ệ th ực v ật tích cực để gi ảm các aflatoxin trên ngô, l ạc và bông b ằng vi ệc c ạnh tranh và thay th ế ch ủng A. flavus sinh aflatoxin v ốn nhi ễm t ự nhiên trên đất tr ồng ngô, l ạc và bông. Ch ủng A. flavus AF36 ch ứa các gen mã hoá cho s ự t ạo aflatoxin bị đột bi ến và không th ể hi ện s ự trao đổi v ật ch ất di truy ền v ới các ch ủng sinh aflatoxin. Sử d ụng ch ủng n ấm A.flavus không sinh độc t ố phân l ập được để ki ểm soát aflatoxin là d ự án quan tr ọng c ủa B ộ Nông nghi ệp M ỹ. Cách ti ếp c ận này đã được ch ấp nh ận ở Châu Phi và tr ở thành m ột h ợp ph ần c ủa d ự án “ đánh giá mức độ nhi ễm aflatoxin và can thi ệp b ằng cách s ử d ụng các bi ện pháp ki ểm soát sinh h ọc” được tài tr ợ b ởi c ơ quan phát tri ển Đức (BMZ). CH ƯƠ NG II. VẬT LI ỆU VÀ PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊN C ỨU 2.1 VẬT LI ỆU, HÓA CH ẤT VÀ THI ẾT B Ị NGHIÊN C ỨU - 55 m ẫu ngô, 45 m ẫu l ạc và 140 m ẫu đất được thu th ập t ại các t ỉnh Ngh ệ An, Đắc Nông, Vĩnh Phúc và Hà N ội - Chu ột nh ắt tr ắng gi ống Swiss do Vi ện V ệ sinh d ịch t ễ Trung ươ ng cung c ấp - Mẫu ngô s ạch của Vi ện Nghiên c ứu ngô đã được ki ểm tra không b ị nhi ễm độc tố aflatoxin. 3
7. 2.2 PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊN C ỨU Phân l ập phân lo ại A.flavus không sinh độc t ố theo Rapper Fennel; Sàng lọc và xác định kh ả n ăng c ạnh tranh các ch ủng A.flavus không sinh aflatoxin theo ph ươ ng pháp c ủa Tanaka và công sự; Xác định s ự có m ặt c ủa m ột s ố gen tham gia vào quá trình sinh t ổng h ợp aflatoxin theo ph ươ ng pháp c ủa Criseo và cộng s ự; Xác định hàm l ượng aflatoxin b ằng TLC theo ph ươ ng pháp c ủa OAOC, ph ươ ng pháp s ắc ký l ỏng cao áp theo tiêu chu Nn Việt Nam TCVN 6953:2001. CH ƯƠ NG III. KẾT QU Ả VÀ TH ẢO LU ẬN 3.1 PHÂN L ẬP, TUY ỂN CH ỌN CH ỦNG A.FLAVUS KHÔNG SINH AFLATOXIN LÀM CH ỦNG S ẢN XU ẤT CH Ế PH ẨM AF 3.1.1 Phân l ập các ch ủng Aspergillus flavus trên ngô, l ạc Từ 100 m ẫu ngô, l ạc l ấy ở m ột s ố địa điểm khác nhau, chúng tôi đã phân lập được 85 ch ủng n ấm m ốc có hình thái gi ống loài A. flavus . Trong đó, ở Yên Thành, Ngh ệ An s ố ch ủng n ấm m ốc phân l ập được trên s ố m ẫu là 27/30, chi ếm 90%. Ở C ư’Mgar, Đắc Nông s ố l ượng ch ủng n ấm m ốc A. flavus phân l ập được trên s ố m ẫu là 24/30, chi ếm 80% và ở Yên L ạc, V ĩnh Phúc s ố l ượng ch ủng n ấm mốc A. flavus phân l ập được trên s ố m ẫu là 21/25, chi ếm 84%. T ỷ l ệ nhi ễm mốc ở 15 m ẫu ngô Đông Anh, Hà N ội là 86% và t ỷ l ệ n ấm m ốc A. flavus phân lập /t ổng s ố m ẫu trung bình là 85%. K ết qu ả trên cho th ấy, các mẫu ngô, l ạc ở các t ỉnh được kh ảo sát đã b ị nhi ễm A. flavus với t ần su ất cao (80-90%) và không có s ự chênh l ệch đáng k ể gi ữa các vùng. Nh ư v ậy, có th ể nói r ằng A. flavus là loài n ấm m ốc nhi ễm chính trên ngô và l ạc ở Vi ệt Nam. 3.1.2 Sàng l ọc các ch ủng Aspergillus flavus không sinh aflatoxin Theo m ột s ố tài li ệu đã công b ố không ph ải t ất c ả các ch ủng A. flavus đều sinh aflatoxin. Do v ậy, để sàng l ọc các ch ủng không sinh aflatoxin, từ 85 ch ủng A. flavus phân l ập được ở trên ti ến hành nuôi c ấy trên môi tr ường ngô theo ph ươ ng pháp c ủa Tanaka và c ộng s ự. Sau 7 ngày nuôi c ấy, m ẫu được tách chi ết và xác định hàm l ượng aflatoxin B1 t ạo thành b ằng k ỹ thu ật s ắc ký b ản m ỏng (TLC) Từ 85 ch ủng A. flavus phân l ập đã sàng l ọc được 21 ch ủng A. flavus không sinh aflatoxin sử d ụng cho các thí nghi ệm ti ếp sau. K ết qu ả phân tích c ũng ch ỉ 4
8. ra r ằng 70,5% s ố ch ủng phân l ập được có kh ả n ăng t ạo aflatoxin dao động t ừ 80-600 ppb. Dựa trên kh ả n ăng sinh aflatoxin và m ức độ phát tri ển c ủa các ch ủng A.flavus phân l ập, 05 ch ủng A. flavus (DA1, DA2, AL21, AL22 và AL23) không sinh aflatoxin và 01 ch ủng A. flavus AF14 sinh aflatoxin đã được ch ọn sử d ụng cho các nghiên c ứu ti ếp theo. 3.1.3 Khả n ăng cạnh tranh các ch ủng A.flavus không sinh aflatoxin Theo k ết qu ả thu được ở trên, 05 ch ủng A. flavus (DA1, DA2, AL21, AL22 và AL23) sau khi được phân lo ại, sàng l ọc b ằng các khóa phân lo ại và xác định không sinh aflatoxin được đánh giá kh ả n ăng c ạnh tranh v ới ch ủng A. flavus AF14 sinh aflatoxin thông qua s ự gi ảm hàm l ượng aflatoxin trên môi tr ường ngô. Ch ủng A. flavus AF14 sinh aflatoxin được nuôi h ỗn h ợp v ới t ừng ch ủng A. flavus không sinh aflatoxin đã tuy ển ch ọn theo t ỉ l ệ 1:1 (số bào t ử c ủa m ỗi ch ủng là 1,5 x 10 5CFU/g) trên c ơ ch ất ngô s ạch không có aflatoxin ở nhi ệt độ 28 oC, độ Nm 25% trong th ời gian 7 ngày. Sau đó chi ết xu ất và phân tích hàm lượng aflatoxin được t ạo thành. Hình 3.1 Sắc ký đồ th ể hi ện hàm l ượng aflatoxin B1 c ủa h ỗn h ợp các ch ủng A. flavus nuôi c ấy trên môi tr ường ngô Hình 3.1 ch ỉ ra r ằng, khi nuôi riêng ch ủng A. flavus AF14, sau 7 ngày nuôi cấy hàm l ượng aflatoxin B1 là 600 ppb. K ết qu ả phân tích c ũng cho th ấy, các ch ủng A. flavus không sinh aflatoxin kh ảo sát đều th ể hi ện kh ả n ăng canh tranh làm gi ảm hàm l ượng aflatoxin B1 c ủa ch ủng AF14 v ới m ức độ khác nhau, dao động t ừ 42-85%. Hi ệu qu ả gi ảm khác nhau là do các ch ủng A. flavus DA2, A. flavus DA1, A. flavus AL21, A. flavus AL22, A. flavus AL23 có kh ả n ăng c ạnh tranh khác nhau đối v ới ch ủng A. flavus A14. Khi nuôi h ỗn h ợp ch ủng A. flavus 5
9. A14 và ch ủng A. flavus DA2 hàm l ượng aflatoxin trong môi tr ường ngô gi ảm nhi ều nh ất, ch ỉ còn 90 ppb, hi ệu qu ả gi ảm aflatoxin B1 là 85%. 3.1.4 Sự có m ặt một s ố gen thu ộc cụm gen mã hóa cho các enzym tham gia vào quá trình sinh t ổng h ợp aflatoxin c ủa ch ủng A.flavus DA2 Ch ủng A. flavus DA2 được xác định là không sinh aflatoxin d ựa trên các ph ươ ng pháp nuôi c ấy, phân tích b ằng TLC, s ắc ký l ỏng cao áp HPLC và có kh ả n ăng c ạnh tranh cao v ới ch ủng A. flavus AF14 sinh độc t ố. Theo nhi ều tài li ệu nghiên c ứu, các ch ủng A. flavus không sinh aflatoxin có th ể do thi ếu m ột s ố gen mã hóa cho các enzym trong quá trình sinh t ổng h ợp aflatoxin ho ặc v ẫn có đầy đủ các gen mã hóa cho quá trình sinh t ổng h ợp aflatoxin nh ưng không sinh độc t ố do chúng b ị đột bi ến gen. Để hi ểu b ản ch ất không sinh aflatoxin c ủa ch ủng A. flavus DA2 phân l ập được ở m ức độ gen, k ỹ thu ật multiplex PCR đã được s ử d ụng để xác định sự thi ếu h ụt c ủa 4 gen trong c ụm gen sinh t ổng h ợp aflatoxin, đó là: aflR, nor, omt và ver . Kết qu ả hình 3.2 cho th ấy, trong khi ch ủng sinh độc t ố A. flavus AF14 có đầy đủ cả 4 gen c ần thi ết cho s ự tạo aflatoxin thì chủng A. flavus DA2 ch ỉ có gen omt . Ba gen m ục tiêu aflR, ver và nor là các gen quan tr ọng mã hóa cho quá trình hình thành các s ản ph Nm trung gian trong con đường sinh t ổng h ợp aflatoxin hoàn toàn không có. Trong đó, gen aflR là gen điều khi ển và là nhân tố phiên mã quan tr ọng cho h ầu h ết các gen c ấu trúc, ki ểm soát quá trình sinh tổng h ợp aflatoxin. Theo Criseo ch ủng này không có kh ả năng t ạo aflatoxin vì không có đầy đủ 4 gen aflR, nor, omt và ver là c ụm gen đã được ch ứng minh là các gen chìa khóa cho s ự tạo aflatoxin. 1 2 3 1650 bp 1000 bp AflR 1034 bp 850 bp Omt 795 bp 500 bp Ver 537 bp 400 bp Nor 399 bp 300 bp 200 bp 100 bp Hình 3.2 Sản ph m multiplex PCR của ch ủng A. flavus DA2 và AF14 Chú thích: Line 1: A. flavus DA2; Line 2: A. flavus AF14; Line 3: Marker 6
10. 3.1.5 Tính ổn định liên quan đến kh ả n ăng không sinh aflatoxin của ch ủng A.flavus DA2 Ch ủng A.flavus DA2 được nuôi trên môi tr ường ngô qua 15 th ế h ệ, sau m ỗi 5 th ế h ệ kh ả n ăng sinh aflatoxin đã được phân tích bằng TLC. Bên c ạnh đó, sau mỗi 5 th ế h ệ, ch ủng A. flavus DA2 được chi ết tách ADN và s ử d ụng kỹ thu ật multiplex PCR để ki ểm tra s ự có m ặt c ủa các gen aflR, ver, omt và nor thu ộc cụm gen mã hóa cho các enzym liên quan đến quá trình sinh t ổng h ợp aflatoxin. Sau 15 th ế h ệ không h ề có v ết c ủa aflatoxin trên b ản s ắc ký. Kết qu ả PCR (hình 3.4) c ũng ch ỉ ra r ằng, sau khi c ấy chuy ền qua 15 th ế h ệ 3 gen m ục tiêu aflR, verb và nor là các gen quan tr ọng mã hóa cho quá trình hình thành các s ản ph Nm trung gian trong con đường sinh t ổng h ợp aflatoxin vẫn v ắng m ặt. Vì v ậy, có th ể kh ẳng định rằng ch ủng A. flavus DA2 ổn định v ề m ặt di truy ền. Hình 3.3 Sắc ký đồ th ể hi ện kh ả n ăng sinh aflatoxin c ủa ch ủng A.flavus DA2 sau 5, 10 và 15 th ế h ệ Chú thích: Chu n B1 : Aflatoxin B1 chu Nn; Mẫu 1 : A.flavus DA2 th ế h ệ th ứ 5; Mẫu 2 : A.flavus DA2 th ế h ệ th ứ 10; Mẫu 3 : A.flavus DA2 th ế h ệ th ứ 15. 1 2 3 4 5 1650 bp 795 bp 1000 bp 850 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp Hình 3.4 Sự t ồn t ại c ủa các gen aflR, ver, omt và nor của ch ủng A. flavus DA2 sau 5, 10 và 15 th ế h ệ 7
11. Chú thích: Line 1 : Marker; Line 2 : ch ủng A. flavus DA2 g ốc; Line 3 : Ch ủng A. flavus DA2 sau c ấy chuy ền 5 th ế h ệ; Line 4: Ch ủng A. flavus DA2 sau c ấy chuy ền 10 th ế h ệ; Line 5 : Ch ủng A. flavus DA2 sau c ấy chuy ền 15 th ế h ệ. 3.1.6 Tính an toàn c ủa ch ủng A.flavus DA2 th ử nghi ệm trên động vật Ch ủng A.flavus DA2 được th ử độc tính trên chu ột Swiss tr ắng có k ết qu ả nh ư sau: cho chu ột u ống h ỗn d ịch b ột thu ốc pha trong h ồ tinh b ột, v ới m ức li ều từ 10,0g – 30,0g m ẫu th ử/kg/ngày không nh ận th ấy bi ểu hi ện gì khác th ường, không nh ận th ấy bi ểu hi ện ng ộ độc trên chu ột thí nghi ệm trong th ời gian theo dõi. T ất c ả chu ột đều ăn u ống, ho ạt động bình th ường. Không xác đinh được li ều gây ch ết 50% động v ật thí nghi ệm (LD 50 ) vì không tìm được li ều gây ch ết chu ột. Chu ột ở nhóm ch ứng và nhóm th ử t ăng tr ọng l ượng c ơ th ể đều nh ư nhau trong th ời gian theo dõi. 3.2 SẢN XU ẤT CH Ế PH ẨM A.FLAVUS DA2 3.2.1 Xác định đường cong sinh tr ưởng Thời gian nhân nuôi thích h ợp cho thu h ồi sinh kh ối ch ủng A. flavus DA2 là 48h, vì khi ti ếp t ục kéo dài th ời gian nhân nuôi s ẽ x ảy ra hi ện t ượng thi ếu dinh d ưỡng và có bào t ử trên thành bình nuôi c ấy, sinh kh ối n ấm m ốc gi ảm. 3.2.2 Sản xu ất bào t ử ch ủng A.flavus DA2 bằng công ngh ệ nuôi c ấy bề m ặt 3.2.2.1 Lựa ch ọn môi tr ường thích h ợp Môi tr ường thích h ợp cho s ự phát tri ển và s ự t ạo bào t ử c ủa ch ủng A . flavus DA2 là môi tr ường MT1 (môi tr ường cám tr ấu). Ở môi tr ường này m ật độ bào t ử đạt 7,1x10 7CFU/g. Book và c ộng s ự đã nghiên c ứu công ngh ệ s ản xu ất bào t ử ch ủng Aspergillus flavus không sinh độc t ố trên môi tr ường h ạt lúa mì, sau 7 ngày nuôi c ấy ở nhi ệt độ 31 0C s ản l ượng bào t ử đạt 4,9 x10 9 CFU/g. Nh ư v ậy môi tr ường cám tr ấu cho m ật độ bào t ử th ấp h ơn môi tr ường h ạt lúa mì nh ưng môi tr ường cám tr ấu có giá thành r ẻ h ơn nhi ều so v ới môi tr ường h ạt lúa mì và là ngu ồn nguyên li ệu s ẵn có ở Vi ệt nam. Tận d ụng được ngu ồn ph ế ph ụ ph Nm nông nghi ệp khi ứng d ụng s ản xu ất bào t ử ch ủng A. flavus DA2 ở quy mô pilot. Vì v ậy, môi tr ường này được s ử d ụng cho các nghiên c ứu ti ếp theo. 3.2.2.2 Ảnh h ưở ng c ủa nhi ệt độ nuôi c ấy Ch ủng A. flavus DA2 có kh ả n ăng t ạo bào t ử cao nh ất là 7,1 x10 7CFU/g tại 30 0C sau 7 ngày nuôi c ấy. Theo Nguy ễn Lân D ũng và c ộng s ự, nhi ệt độ thích 8
12. hợp v ới đa s ố n ấm m ốc là 30-32 oC. K ết qu ả này c ũng phù h ợp v ới nghiên c ứu của Book và Cotty khi nuôi c ấy A.flavus AF36 ở nhi ệt độ 31 0C m ật độ bào t ử đạt 4,9 x10 9CFU/g sau 7 ngày nuôi c ấy. Kết qu ả thí nghi ệm cho th ấy, nhi ệt độ thích h ợp để nuôi c ấy ch ủng A.flavus DA2 cho s ự t ạo bào t ử là 30 0C. 3.2.2.3 Ảnh h ưởng c ủa độ ẩm của môi tr ường. Khi t ăng độ Nm môi tr ường nuôi t ừ 55% đến 65%, kh ả n ăng t ạo bào t ử của ch ủng A. flavus DA2 tăng d ần và đạt giá tr ị c ực đại là 7,1 x10 7CFU/g khi độ Nm môi tr ường cám tr ấu là 65%. Ở các giá tr ị độ Nm môi tr ường cám tr ấu cao h ơn, kh ả n ăng t ạo bào t ử của ch ủng A.flavus DA2 gi ảm d ần. K ết qu ả này phù h ợp với đặc điểm sinh lý chung c ủa n ấm m ốc th ường sinh tr ưởng và có ho ạt tính sinh h ọc t ốt trên môi tr ường r ắn có độ Nm t ừ 60 – 65%. 3.2.2.4 Ảnh h ưởng c ủa th ời gian nuôi c ấy. Mật độ bào t ử ch ủng A.flavus DA2 nuôi c ấy trên môi tr ường cám tr ấu t ăng nhanh trong kho ảng th ời gian t ừ 4-8 ngày. Ngày th ứ 9 m ật độ bào t ử đạt 2,0 x10 9CFU/g và đạt cao nh ất ở ngày th ứ 10, là 2,2 x10 9 CFU/g. Nh ư v ậy, th ời gian nuôi c ấy phù h ợp cho s ự t ạo bào t ử ch ủng A.flavus DA2 là 9 ngày. N ếu kéo dài th ời gian nuôi c ấy đến ngày th ứ 10 thì s ẽ làm t ăng chi phí trong s ản xu ất, trong khi s ản l ượng bào t ử A.flavus DA2 t ăng lên không nhi ều. 3.2.2 Sản xu ất bào t ử ch ủng A.flavus DA2 ở quy mô pilot 3.2.2.1 Ảnh h ưởng c ủa t ỷ l ệ ti ếp gi ống đến s ản l ượng bào t ử ch ủng A. flavus DA2 Kết qu ả nghiên c ứu cho th ấy t ỷ l ệ n ấm m ốc/nguyên li ệu càng cao thì l ượ ng bào t ử t ạo thành nhi ều h ơn ở giai đoạn s ớm c ủa quá trình nuôi. Với t ỷ l ệ m ốc ban đầ u là 10% thì thu đượ c l ượ ng bào t ử khi k ết thúc quá trình nuôi đạ t 2,1 x10 9 CFU/g. T ỷ l ệ gi ống ban đầu là 5% m ật độ bào t ử thu được th ấp h ơn, ch ỉ đạt 7,5 x10 8 CFU/g. Do v ậy, tỷ l ệ ti ếp gi ống khi nuôi c ấy b ề m ặt ch ủng A.flavus DA2 cho s ản l ượng bào t ử cao là 10%. 3.2.2.2 Ảnh h ưởng c ủa độ dày kh ối ủ đến s ản l ượng bào t ử c ủa ch ủng A. flavus DA2 Kết qu ả nghiên c ứu cho th ấy, kh ối ủ có độ dày 6,0 cm cho m ật độ bào t ử lớn nh ất đạ t 2,1 x10 9cfu/g, các m ẫu có độ dày kh ối ủ là 8 cm và10 cm có h ệ s ợi phát tri ển y ếu h ơn h ẳn, ch ủ y ếu ch ỉ m ọc trên b ề mặt kh ối môi tr ườ ng. Do đó, độ dày kh ối ủ khi nuôi c ấy b ề m ặt ch ủng A. flavus DA2 là 6 cm. 9
13. 3.2.3 Hoàn thi ện ch ế ph ẩm AF t ừ ch ủng A.flavus DA2 3.2.3.1 Nghiên c ứu l ựa ch ọn ch ất mang Mật độ bào t ử c ủa ch ủng A. flavus DA2 h ầu nh ư không gi ảm sau 6 tháng bảo qu ản và ch ỉ gi ảm nh ẹ đối v ới các ch ất b ảo qu ản là canxi alginate và than bùn, t ừ 1x10 9CFU/g xu ống còn 7x10 8CFU/g và t ừ 1x10 9CFU/g xu ống còn 8x10 8CFU/g, theo th ứ t ự sau 12 tháng b ảo qu ản. M ật độ bào t ử gi ảm m ạnh ở ch ất mang là cám g ạo, t ừ 1x10 9CFU/g, xu ống còn 1x10 7CFU/g sau 6 tháng b ảo qu ản và còn 1x 10 5 CFU/g sau 12 tháng b ảo qu ản. Do giá thành ch ất mang canxi alginat đắt h ơn than bùn nên chúng tôi ch ọn than bùn để làm ch ất b ảo qu ản bào t ử ch ủng A. flavus DA2. 3.2.3.2 Quy trình công ngh ệ s ản xu ất ch ế ph ẩm A.flavus DA2 quy mô pilot Từ các k ết qu ả nghiên c ứu thu nh ận được, quy trình công ngh ệ nhân nuôi, thu h ồi và tạo ch ế ph Nm A.flavus DA2 được đư a ra nh ư sau: Ch ủng A.flavus DA2 Trong ống nghi ệm môi tr ường th ạch nghiêng PDA Nhân gi ống c ấp 1 trên bình tam giác 500ml Nhân gi ống c ấp 2 trên h ệ th ống t ăng lên men chìm s ục khí 100 lít/m ẻ Nuôi c ấy b ề mặt Thu h ồi sinh kh ối bào t ử nấm Ph ối tr ộn ch ất mang Đóng gói Ch ế ph ẩm AF 10
14. Thuy ết minh quy trình: + Gi ữ gi ống Ch ủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin được gi ữ gi ống ở ống th ạch nghiêng có môi tr ường PDA sau đó được c ấy sang môi tr ường khoai tây l ỏng trong bình tam giác 500ml. Thành ph ần môi tr ường khoai tây l ỏng: Glucoza 20g/l, d ịch chi ết khoai tây 1000ml, pH điều ch ỉnh đến 5,5. + Nhân gi ống c ấp 1 Nuôi c ấy l ắc ch ủng A.flavus DA2 ở bình tam giác có môi tr ường PDA l ỏng trên máy l ắc điều ch ỉnh nhi ệt độ Sanyo (Nh ật B ản), vận t ốc 200 v/ph, nhi ệt độ 30 0C trong th ời gian 48h. + Nhân gi ống c ấp 2 Sinh kh ối ch ủng A.flavus DA2 được chuy ển sang h ệ th ống t ăng lên men chìm s ục khí 100 lít/m ẻ ch ứa môi tr ường PDA (pH 5,5) đã được kh ử trùng và làm ngu ội đến nhi ệt độ 30 0C ( điều ki ện kh ử trùng là 1atm, trong th ời gian 30 phút). T ỷ l ệ ti ếp gi ống 10%, nuôi c ấy trong th ời gian 48h, v ận t ốc khu ấy 200 v/ph, nhi ệt độ nuôi c ấy 30 0C. + Nuôi c ấy b ề m ặt Chu Nn b ị môi tr ường cám tr ấu: cám tr ấu được tr ộn đều theo t ỷ l ệ 4:1. B ổ sung 1 l ượng n ước để đạt được độ Nm 65% là độ Nm thích h ợp để nuôi c ấy ch ủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin. Cho nguyên li ệu cám tr ấu vào túi nilong ho ặc bao PP d ệt, m ỗi túi ch ứa 5kg cám tr ấu, h ấp kh ử trùng ở nhi ệt độ 121 0C trong 1 gi ờ. Để nguyên li ệu cám tr ấu ngu ội đến 30 0C r ồi đổ vào các khay có kích th ước 80cm x50cm x15cm, độ dày cám tr ấu 6cm/khay, m ỗi khay có 5kg môi tr ường. Ti ếp gi ống v ới t ỷ l ệ 10% vào môi tr ường cám tr ấu, tr ộn th ật đều hỗn d ịch ch ủng gi ống A.flavus DA2 không sinh aflatoxin và cám tr ấu. Nuôi c ấy ch ủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin ở nhi ệt độ 30 0C trong 9 ngày. Các khay nuôi c ấy được đặt trên các dàn s ắt có kích th ước dài 1,2m , rộng 0,6m, cao 1,5m. + Thu h ồi các bào t ử t ạo ch ế ph m AF t ừ ch ủng A.flavus DA2 Sau khi k ết thúc nuôi c ấy, s ấy khô sinh kh ối ở nhi ệt độ 45 0C trong 48h. Ph ối tr ộn l ượng sinh kh ối thu được sau khi s ấy v ới than bùn t ỉ l ệ sinh kh ối ch ủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin và than bùn là 1:1. Đóng gói ch ế ph Nm AF vào túi polyetylen và b ảo qu ản ch ế ph Nm n ơi khô mát. 11
15. 3.3 ỨNG D ỤNG CH Ế PH ẨM AF TRÊN NGÔ VÀ L ẠC 3.3.1 Nghiên c ứu ở quy mô phòng thí nghi ệm 3.3.1.1 Nghiên c ứu t ỷ l ệ gi ữa ch ủng sinh aflatoxin và ch ủng không sinh aflatoxin A. flavus DA2 + Kh ả n ăng c ạnh tranh c ủa ch ế ph m A.flavus DA2 ở các t ỷ l ệ khác nhau Hình 3.5 Sắc ký đồ th ể hi ện kh ả n ăng c ạnh tranh c ủa ch ế ph m A. flavus DA2 ở các t ỷ l ệ khác nhau Chú thích : Chu n: Chu Nn aflatoxin; Mẫu M1 : T ỷ l ệ AF14/DA2 = 3/1 ; M ẫu M2 : T ỷ lệ AF14/DA2 = 2/1 ; M ẫu M3 : T ỷ l ệ AF14/DA2 = 1/1 ; M ẫu M4 : T ỷ l ệ AF14/DA2 =1/2. Chủng sinh độc t ố A.flavus AF14 được ti ến hành nuôi c ấy đồng th ời với ch ế ph Nm ch ứa ch ủng không sinh độc t ố A. flavus DA2 trên môi tr ường ngô hạt đã thanh trùng v ới t ỷ l ệ (ch ủng AF14/DA2): 3/1, 2/1, 1/1 và 1/2 sao cho m ật độ 5 bào t ử t ổng s ố đạt 1,5 x10 CFU/g ngô. Sau 9 ngày nuôi c ấy ti ến hành tách chi ết độc t ố và xác định hàm l ượng aflatoxin b ằng s ắc ký TLC. Kết qu ả phân tích cho th ấy kh ả n ăng ức ch ế s ự t ạo aflatoxin là không cao nếu nh ư t ỉ l ệ ch ủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin được sử d ụng th ấp h ơn ch ủng AF14 sinh aflatoxin. V ết aflatoxin ch ỉ hoàn toàn m ất đi ở các m ẫu ngô khi t ỉ l ệ A. flavus DA2 cao h ơn A.flavus AF14 sinh aflatoxin. + Kh ả n ăng c ạnh tranh c ủa ch ế ph m A. flavus DA2 trên đất tr ồng ngô, l ạc ở quy mô phòng thí nghi ệm Tiến hành nhi ễm đồng th ời ch ủng A.flavus AF14 sinh độc t ố và A. flavus DA2 trên đất tr ồng ngô, l ạc đã ti ệt trùng v ới m ật độ t ổng s ố 2x10 5 CFU/g. Kết qu ả nghiên c ứu kh ả n ăng c ạnh tranh c ủa ch ủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin trong đất tr ồng ngô, l ạc ở các t ỷ l ệ khác nhau được trình bày ở b ảng 3.1. 12
16. Bảng 3.1 Kh ả n ăng c ạnh tranh c ủa ch ủng A. flavus DA2 khi bón vào đất ở các tỷ l ệ khác nhau Tỷ lệ ch ủng AF14/DA2 khi Tỷ lệ ch ủng AF14/DA2 sau khi nhi ễm vào đất (%) nhi ễm vào đất 01 tháng (%) AF14 DA2 AF14 DA2 100 0 100 0 60 40 25,13 74,87 50 50 0 100 40 60 0 100 20 80 0 100 Chủng A.flavus DA2 đã th ể hi ện tính c ạnh tranh cao đối v ới ch ủng A. flavus AF14 sinh aflatoxin. Sau khi nhi ễm vào đất tr ồng ngô, l ạc 1 tháng, t ỷ l ệ ch ủng A. flavus AF14:DA2 t ừ 60:40; 50:50; 40:60 và 20:80 đã chuy ển thành 25,13: 74,87; 0:100; 0:100; 0:100, theo th ứ t ự. V ới t ỉ l ệ 1/1 ch ủng A. flavus DA2 đã có th ể ức ch ế hoàn toàn ch ủng A.flavus AF14 sinh aflatoxin, cao h ơn so với k ết qu ả nghiên c ứu c ủa Brown và c ộng s ự khi nuôi c ấy h ỗn h ợp hai ch ủng sinh và không sinh độc t ố với cùng t ỷ lệ 1/1 (gi ảm aflatoxin trên ngô là 78%). Kết qu ả 3.1 ch ỉ ra r ằng, để đạt được hi ệu qu ả c ạnh tranh cao cần b ổ sung ch ế ph Nm DA2 vào môi tr ường v ới m ật độ b ằng ho ặc l ớn h ơn ch ủng A. flavus sinh độc trong t ự nhiên. 3.3.1.2 Ảnh h ưởng c ủa th ời điểm s ử d ụng đến kh ả n ăng c ạnh tranh c ủa ch ế ph ẩm A. flavus DA2 Chủng A.flavus DA2 không sinh aflatoxin và ch ủng A.flavus AF14 sinh aflatoxin được c ấy đồng th ời ho ặc c ấy cách nhau 24 gi ờ lên môi tr ường ngô h ạt đã được thanh trùng (t ỉ l ệ 1/1 ở m ật độ t ổng 1,5.10 5 CFU/g ngô). Sau 7 ngày nuôi ở 28oC, ti ến hành tách chi ết độc t ố và ki ểm tra hàm l ượng aflatoxin trong môi tr ường nuôi c ấy b ằng s ắc kí b ản m ỏng để xác định được th ời điểm s ử d ụng ch ế ph Nm h ợp lí cho hi ệu qu ả c ạnh tranh cao. 13
17. Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 Chu n Hình 3.6 Sắc ký TLC th ể hi ện kh ả n ăng đối kháng c ủa ch ế ph m A. flavus DA2 ở các th ời điểm c ấy khác nhau Chú thích: Chu Nn: Chu Nn aflatoxin B1; M ẫu 4: Ch ủng A. flavus DA2 c ấy tr ước ch ủng A. flavus AF14 24h; M ẫu 5: C ấy đồng th ời 2 ch ủng A. flavus DA2 và A. flavus AF14; M ẫu 6: Ch ủng A. flavus AF14 c ấy tr ước ch ủng A.flavus DA2 24h. Kết qu ả phân tích aflatoxin ở hình 3.6 cho th ấy, ở m ẫu ngô c ấy ch ế ph Nm A.flavus DA2 tr ước AF14 24h, không phát hi ện đượ c aflatoxin. Ở m ẫu ngô c ấy đồng th ời A.flavus DA2 và AF14 cho hi ệu qu ả gi ảm nhi ễm aflatoxin cao, v ết aflatoxin m ờ đi so v ới m ẫu c ấy ch ủng A.flavus AF14 sinh aflatoxin tr ước ch ế ph Nm A.flavus DA2. Hi ệu qu ả gi ảm nhi ễm aflatoxin đạt được trong 2 tr ường hợp ch ủng A.flavus DA2 c ấy tr ước và c ấy đồng th ời v ới ch ủng AF14 là khá cao. Do đó, có th ể kh ẳng định, khi tri ển khai trên đồng ru ộng nên s ử d ụng ch ế ph Nm A.flavus ngay t ừ đầ u v ụ tr ướ c khi gieo tr ồng để t ạo ưu th ế c ạnh tranh. S ử dụng m ột l ượng l ớn ch ế ph Nm A.flavus DA2 thì hi ệu qu ả c ạnh tranh v ẫn khá cao cho dù trong đất đã b ị nhi ễm A.flavus sinh độc t ố t ừ tr ước đó. 3.3.1.3 Nghiên c ứu ảnh h ưởng c ủa thu ốc b ảo v ệ th ực v ật hóa h ọc đến sinh tr ưởng, phát tri ển và kh ả n ăng c ạnh tranh c ủa ch ủng A. flavus DA2 + Ảnh h ưởng c ủa thu ốc b ảo v ệ th ực v ật hóa h ọc đến kh ả n ăng phát tri ển của ch ủng A.flavus DA2 Thu ốc b ảo v ệ th ực v ật được ng ười dân sử d ụng ph ổ bi ến để di ệt sâu và tr ừ cỏ trên ngô, l ạc là thu ốc tr ừ sâu Sumithion 50EC (ch ứa 95% ho ạt ch ất Fenitrothion do công ty Sumitomo Chem. Co.,Ltd Nh ật B ản s ản xu ất) và thu ốc di ệt c ỏ Saicoba 800EC (ch ứa 80% ho ạt ch ất Acetochlor do công ty C ổ ph ần Bảo v ệ Th ực v ật Sài Gòn s ản xu ất) đã được ch ọn để sử d ụng trong thí nghi ệm này. 14
18. Kết qu ả nghiên c ứu cho th ấy, thu ốc tr ừ sâu Sumithion 50EC và thu ốc tr ừ cỏ Saicoba 800EC đều không ảnh h ưởng đến s ự phát tri ển sinh kh ối c ủa A.flavus DA2 trong điều ki ện phòng thí nghi ệm. Khi t ăng lượng thu ốc b ảo v ệ th ực vật g ấp 6 l ần n ồng độ s ử d ụng ngoài th ực t ế v ẫn không th ấy có s ự ảnh hưởng nào đến s ự phát tri ển sinh kh ối c ủa A. flavus DA2. (N ồng độ khuy ến cáo sử d ụng c ủa Sumithion 50EC là 2,5ml/l, Saicoba 800EC là 1,5ml/l). + Ảnh h ưởng c ủa thu ốc b ảo v ệ th ực v ật hóa h ọc đến kh ả n ăng c ạnh tranh của ch ế ph m A.flavus DA2 Chủng A.flavus DA2 và ch ủng sinh độc t ố A.flavus AF14 được nuôi cấy đồng th ời trong môi tr ường PDA lỏng (t ỉ l ệ 1:1, v ới m ật độ t ổng 1,5 x10 5 CFU/ml), l ắc 200 vòng/phút ở 30 0C để nghiên c ứu s ự ảnh h ưởng c ủa các lo ại thu ốc tr ừ sâu Sumithion 50EC và thu ốc tr ừ c ỏ Saicoba 800EC đến kh ả n ăng cạnh tranh c ủa ch ế ph Nm AF đối v ới A.flavus AF14. Các lo ại thu ốc trên được bổ sung vào các m ẫu thí nghi ệm v ới n ồng độ thông th ường được khuy ến cáo sử dụng (thu ốc tr ừ sâu 2,5 ml/l, thu ốc di ệt c ỏ 1,5 ml/l). Sau 9 ngày nuôi, ti ến hành thu d ịch nuôi, tách chi ết và xác định hàm l ượng aflatoxin b ằng ph ươ ng pháp s ắc kí b ản m ỏng TLC. 1 2 3 4 5 6 7 Hình 3.7 Khả n ăng đối kháng c ủa ch ủng A. flavus DA2 khi có m ặt c ủa thu ốc bảo v ệ th ực v ật b ằng TLC Chú thích: 1 : Aflavus DA2 nuôi c ấy trong môi tr ường có thu ốc tr ừ c ỏ; 2: Aflatoxin B1 chu Nn; 3: Aflavus AF14 nuôi c ấy trong môi tr ườ ng có thu ốc tr ừ c ỏ; 4: H ỗn h ợp DA2 và AF14 nuôi cấy trong môi tr ường có thu ốc tr ừ c ỏ; 5: Aflavus DA2 nuôi c ấy trong môi tr ường có thu ốc tr ừ sâu; 6: H ỗn h ợp DA2 và AF14 nuôi c ấy trong môi tr ường có thu ốc tr ừ sâu; 7: Aflavus AF14 nuôi c ấy trong môi tr ường có thu ốc tr ừ sâu; Kết qu ả ở hình 3.7 cho th ấy, thu ốc di ệt c ỏ Saicoba 800EC và thu ốc tr ừ sâu Sumithion 50EC không làm gi ảm kh ả n ăng c ạnh tranh c ủa ch ủng A.flavus DA2. Khi nuôi c ấy h ỗn h ợp ch ủng DA2 và AF14 trên môi tr ường khoai tây l ỏng có 15
19. bổ sung 2 lo ại thu ốc hóa h ọc này v ết aflatoxin trên b ản m ỏng m ờ đi, ch ứng t ỏ hi ệu qu ả gi ảm nhi ễm aflatoxin đạt được v ẫn khá cao. 3.3.2 Nghiên c ứu ở quy mô đồng ru ộng 3.3.2.1 Đánh giá m ức độ nhi ễm A. flavus trên đất tr ồng ngô, l ạc Một v ấn đề quan tr ọng được nhi ều nhà khoa h ọc quan tâm là s ự có m ặt c ủa loài n ấm gây h ại A. flavus trên đất tr ồng c ủa m ột s ố t ỉnh ở Vi ệt Nam. M ật độ của nó có ảnh h ưởng l ớn đến ch ất l ượng nông s ản nói chung trong giai đoạn sau thu ho ạch. Các ch ủng nấm m ốc A. flavus nhi ễm trong đấ t tr ồng ngô, l ạc t ại các tỉnh V ĩnh Phúc, Ngh ệ An, Đắc Nông được phân l ập theo ph ươ ng pháp c ủa Raper và Fennel. Kết qu ả nghiên c ứu ch ỉ ra r ằng, m ật độ nhi ễm A. flavus trong đất tr ồng ngô, l ạc ở Vi ệt Nam là r ất cao (>10 4CFU/g đất), do đó c ần có bi ện pháp phòng ch ống n ấm m ốc và độc tố c ủa chúng ngay t ừ giai đoạn đồng ru ộng. Nh ững k ết qu ả v ề điều tra kh ảo sát m ức độ nhi ễm các loài A. flavus sinh aflatoxin trong đất tr ồng ngô, l ạc ở các t ỉnh là c ơ s ở quan tr ọng trong vi ệc xây d ựng đượ c li ều s ử dụng thích h ợp c ủa ch ủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin dùng để phòng ch ống aflatoxin trên ngô, l ạc t ại các địa ph ươ ng này. 3.3.2.1 Khả n ăng c ạnh tranh c ủa ch ủng A. flavus DA2 (Ch ế ph ẩm AF) trên đất tr ồng ngô và ngô ở giai đoạn đồng ru ộng và trong quá trình b ảo qu ản + Khả n ăng c ạnh tranh c ủa ch ế ph m AF trong đất tr ồng ngô Kết qu ả ở b ảng 3.2 ch ỉ ra r ằng, ở ru ộng ngô đố i ch ứng không s ử d ụng ch ế ph Nm AF t ổng m ật độ n ấm A.flavus trong đất tr ồng ngô là 2,0 x10 4 CFU/g, trong đó m ật độ ch ủng A.flavus sinh aflatoxin chi ếm 90% số ch ủng A.flavus phân l ập đượ c. Khi s ử d ụng 1 l ần, 2 l ần và 3 l ần ch ế ph Nm AF, t ỷ l ệ ch ủng A.flavus sinh aflatoxin trong đất tr ồng ngô gi ảm t ừ 90% xu ống còn 39,4%, 7,3% và 4,5% theo th ứ t ự. Nh ư v ậy, ch ủng A. flavus DA2 đã có kh ả n ăng c ạnh tranh cao và thay th ế các ch ủng A. flavus sinh aflatoxin t ồn t ại t ự nhiên trong đất, vì v ậy đã làm gi ảm rõ r ệt m ật độ các ch ủng A. flavus sinh aflatoxin trong đất tr ồng ngô. Kết qu ả này c ũng phù h ợp v ới nghiên c ứu c ủa Robert và công s ự khi s ử d ụng ch ủng A. flavus AF36 để phòng ch ống A. flavus và aflatoxin trên ngô, ch ủng này đã có tác d ụng gi ảm 95% A. flavus sinh aflatoxin trong đất tr ồng ngô. 16
20. Bảng 3.2 Kh ả n ăng c ạnh tranh c ủa A. flavus DA2 không sinh aflatoxin trong đất tr ồng ngô s ử d ụng ch ế ph m AF Công th ức thí Mật độ Mật độ ch ủng Tỷ l ệ ch ủng nghi ệm A.flavus tổng A. flavus sinh A.flavus sinh số trong đất aflatoxin trong aflatoxin (%) x10 4 (CFU/g) đất x10 4 (CFU/g) Ngô không s ử d ụng 2,00 ± 0,05 1,800 ± 0,12 90,0 ch ế ph Nm AF ( ĐC) Ngô s ử d ụng 1 l ần 2,10 ± 0,13 0,828 ± 0,04 39,4 ch ế ph Nm AF Ngô s ử d ụng 2 l ần 2,16 ± 0,08 0,158 ± 0,07 7,3 ch ế ph Nm AF Ngô s ử d ụng 3 l ần 2,20 ± 0,11 0,100 ± 0,05 4,5 ch ế ph Nm AF + Kh ả n ăng gi ảm A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin trên ngô b ắp tr ước thu ho ạch c ủa ch ế ph m AF Christensen Clyde đã có nh ững nghiên c ứu công phu v ề nguyên nhân nhi ễm n ấm m ốc trong quá trình b ảo qu ản nông s ản. Tác gi ả cho th ấy, đất là n ơi phát sinh đầu tiên c ủa các n ấm m ốc. Các n ấm này đã nhi ễm vào r ễ c ủa cây, phát tán theo gió, côn trùng nhi ễm vào bên trong các h ạt l ươ ng th ực. Vì v ậy, nông s ản đã b ị nhi ễm A.flavus và aflatoxin ngay t ừ giai đoạn đồng ru ộng. Khi ứng d ụng ch ế ph Nm AF ở quy mô đồng ru ộng, ch ủng A.flavus không độc s ẽ d ần thay th ế các ch ủng độc, k ết qu ả ch ủng gây độc gi ảm, ch ủng không độc t ăng cùng v ới sự gi ảm hàm l ượng aflatoxin. Các b ắp ngô ở th ửa ru ộng s ử dụng và không s ử d ụng ch ế ph Nm AF được lấy m ẫu theo ph ươ ng pháp đường chéo, m ỗi th ửa ru ộng thí nghi ệm l ấy 100 b ắp rồi t ẽ l ấy h ạt sau đó tr ộn đều r ồi l ấy 1kg làm m ẫu đại di ện, sau đó l ấy 100g làm mẫu phân tích aflatoxin bằng s ắc ký b ản m ỏng TLC. Hi ệu qu ả gi ảm n ấm m ốc và aflatoxin trên ngô h ạt tr ước thu ho ạch được th ể hi ện ở b ảng 3.3. 17
21. Bảng 3.3 Hi ệu qu ả gi ảm A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin c ủa A. flavus DA2 trên ngô b ắp ở giai đoạn tr ước thu ho ạch Các ch ỉ tiêu đánh giá Công th ức thí nghi ệm Tỷ l ệ h ạt Hàm l ượng Hi ệu qu ả nhi ễm A. aflatoxin gi ảm flavus sinh trên ngô aflatoxin aflatoxin (%) hạt (ppb) (%) Ngô không s ử d ụng ch ế ph Nm AF 15 ± 1,24 5 ± 0,05 0 Ngô s ử dụng 1 l ần ch ế ph Nm AF 5 ± 1,70 0 100 Ngô s ử d ụng 2 l ần ch ế ph Nm AF 0 0 100 Ngô s ử d ụng 3 l ần ch ế ph Nm AF 0 0 100 Ngô b ắp thu ho ạch t ừ lô không s ử d ụng ch ế ph Nm AF (ĐC), tỷ l ệ h ạt nhi ễm A.flavus sinh aflatoxin trung bình là 15%, hàm l ượng aflatoxin trung bình trên ngô ở lô không bón ch ế ph Nm AF là 5 ppb. Trong khi đó, ở ngô b ắp thu ho ạch t ừ lô thí nghi ệm s ử d ụng 1 lần ch ế ph Nm AF t ỷ l ệ h ạt nhi ễm A.flavus sinh aflatoxin trung bình là 5%, không phát hi ện th ấy aflatoxin trên các m ẫu ngô h ạt được phân tích. Ở ngô b ắp thu ho ạch t ừ lô bón 2 và 3 l ần ch ế ph Nm AF, không phát hi ện ch ủng A.flavus sinh aflatoxin trên các h ạt ngô và không phát hi ện đượ c aflatoxin trên các h ạt ngô đượ c phân tích. Chứng t ỏ ch ủng A. flavus DA2 đã có kh ả n ăng c ạnh tranh cao v ới các ch ủng A.flavus sinh aflatoxin v ốn nhi ễm t ự nhiên trên các h ạt ngô ở giai đoạn tr ước thu ho ạch và ức ch ế s ự t ạo aflatoxin c ủa các ch ủng này. + Kh ả n ăng gi ảm A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin trên ngô b ảo qu ản của ch ế ph m AF Ngô thu ho ạch t ừ m ỗi đợt sử d ụng ch ế ph Nm AF (t ừ đợt th ứ nh ất đến đợt th ứ 3) được đư a vào b ảo qu ản và theo dõi trong th ời gian 6 tháng để đánh giá hi ệu qu ả c ạnh tranh c ủa ch ế ph Nm AF t ừ ch ủng A. flavus DA2 . Toàn b ộ th ử nghi ệm được ti ến hành t ừ tháng 12/2007 - 6/2009 t ại kho b ảo qu ản c ủa xã Tam Hồng, huy ện Yên L ạc, t ỉnh V ĩnh Phúc; quy mô b ảo qu ản 01 t ấn/mô hình. Hi ệu qu ả phòng ch ống n ấm m ốc và aflatoxin trên ngô của ch ế ph Nm AF trong quá trình b ảo qu ản được trình bày ở b ảng 3.4. 18
22. Bảng 3.4 Hi ệu qu ả phòng ch ống A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin c ủa ch ế ph m AF trên ngô sau th ời gian b ảo qu ản 6 tháng Các ch ỉ tiêu đánh giá Công th ức thí Tỷ l ệ h ạt Hàm l ượng Hi ệu qu ả nghi ệm nhi ễm aflatoxin trung gi ảm A.flavus sinh bình trên h ạt ngô aflatoxin (%) aflatoxin (%) (ppb) Ngô không sử d ụng 100 98,0 ± 1,02 ch ế ph Nm AF Ngô sử d ụng 01 l ần 50 55,0 ± 0,75 53,9 ch ế ph Nm AF Ngô sử d ụng 02 l ần 10 12,6 ± 1,05 87,1 ch ế ph Nm AF Ngô sử d ụng 03 l ần 0 3,0 ± 0,93 97,0 ch ế ph Nm AF Sau 6 tháng b ảo qu ản, ngô h ạt thu ho ạch t ừ lô không s ử d ụng ch ế ph Nm AF 100% h ạt b ị nhi ễm A. flavus sinh aflatoxin, hàm l ượng aflatoxin trung bình trên ngô h ạt là 98ppb. Trong khi đó, ngô h ạt thu ho ạch t ừ lô s ử d ụng 1 l ần ch ế ph Nm AF có 50% h ạt b ị nhi ễm A. flavus sinh aflatoxin, hàm l ượng aflatoxin trung bình là 55ppb, hi ệu qu ả gi ảm aflatoxin là 56% so v ới ngô thu ho ạch t ừ lô không sử d ụng ch ế ph Nm AF. Ngô thu ho ạch t ừ ru ộng s ử d ụng 02 l ần ch ế ph Nm AF có 10% h ạt b ị nhi ễm A. flavus sinh aflatoxin, hàm l ượng aflatoxin trung bình trên ngô h ạt là 12,6%, hi ệu qu ả gi ảm aflatoxin so v ới lô đối ch ứng là 87,1%. Ngô hạt thu ho ạch ở lô sử d ụng 3 l ần ch ế ph Nm AF hoàn toàn không có A. flavus sinh aflatoxin, hàm l ượng aflatoxin trung bình là 3ppb, hi ệu qu ả gi ảm aflatoxin so v ới lô đối ch ứng là 97%. K ết qu ả này cho th ấy, ch ủng A. flavus DA2 đã có kh ả n ăng c ạnh tranh cao v ới ch ủng A. flavus sinh aflatoxin vốn nhi ễm t ự nhiên với t ần su ất cao trên ngô trong quá trình b ảo qu ản và ức ch ế s ự phát tri ển c ũng nh ư gi ảm s ự t ạo aflatoxin c ủa các ch ủng này. 19
23. 3.3.2.2 Khả n ăng c ạnh tranh c ủa ch ủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin trong đất tr ồng l ạc và trên l ạc ở giai đoạn đồng ru ộng và trong quá trình b ảo qu ản + Kh ả n ăng gi ảm sự nhi ễm A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin trên l ạc tr ước thu ho ạch c ủa ch ế ph m AF Ch ế ph Nm AF được sử d ụng 3 đợt cho cây l ạc quy mô 01ha ở 3 v ụ l ạc liên ti ếp t ừ 2/2007-12/2008 t ại xã Tam H ồng, huy ện Yên L ạc, t ỉnh V ĩnh Phúc. Li ều sử d ụng là 01 kg/sào, ở giai đoạn l ạc được 15-20 ngày sau khi tr ồng. Sau m ỗi v ụ ti ến hành l ấy m ẫu đất ở lô thí nghi ệm và đối ch ứng, phâp l ập và đánh giá t ỷ l ệ các ch ủng A.flavus sinh và không sinh aflatoxin trong đất. Hi ệu qu ả c ạnh tranh của ch ủng A. flavus DA2 trong đất tr ồng l ạc được trình bày trong b ảng 3.5 Bảng 3.5 Kh ả n ăng c ạnh tranh c ủa A. flavus DA2 không sinh aflatoxin trong đất tr ồng l ạc s ử d ụng ch ế ph m AF Lô thí nghi ệm Mật độ A. Mật độ các Tỷ l ệ ch ủng A. flavus tổng ch ủng A. flavus sinh số trong đất flavus sinh aflatoxin trong tr ồng l ạc aflatoxin trong đất tr ồng l ạc x10 4 (CFU/g) đấ t tr ồng l ạc (%) x10 4 (CFU/g) Lạc không s ử d ụng ch ế 2,50 ± 0,13 2,00 ± 0,15 80,0 ph Nm AF Lạc s ử d ụng 1 l ần ch ế 2,56 ± 0,31 1,48 ± 0,23 58,0 ph Nm AF Lạc s ử d ụng 2 l ần ch ế 2,62 ± 0,16 0,290 ± 0,06 11,0 ph Nm AF Lạc s ử d ụng 3 l ần ch ế 2,70 ± 0,10 0,135 ± 0,02 5,0 ph Nm AF Kết qu ả ở b ảng 3.5 ch ỉ ra r ằng, ở lô l ạc không s ử d ụng ch ế ph Nm AF t ổng mật độ n ấm A.flavus trung bình trong đất tr ồng l ạc là 2,5 x10 4 CFU/g, trong đó mật độ ch ủng A.flavus sinh aflatoxin (ch ủng phát quang màu xanh n ước bi ển trên môi tr ường Czapek c ải ti ến) là 2 x10 4 CFU/g, chi ếm 80% s ố ch ủng A.flavus phân l ập được. Ở lô thí nghi ệm s ử d ụng 01 l ần ch ế ph Nm AF, m ật độ ch ủng 20
24. A.flavus sinh aflatoxin là 1,48 x10 4 CFU/g, ch ỉ chi ếm 58% trong t ổng s ố ch ủng A.flavus phân l ập được trong đất tr ồng l ạc. Khi s ử d ụng 02 l ần ch ế ph Nm AF, mật độ ch ủng A.flavus sinh aflatoxin trung bình là 2,9 x10 3 CFU/g, chi ếm 11% số ch ủng A.flavus phân l ập được. Ở lô l ạc được dùng 03 l ần ch ế ph Nm AF, m ật độ ch ủng A.flavus sinh aflatoxin trung bình là 1,35 x10 3 CFU/g, ch ỉ chi ếm 5% trong t ổng s ố các ch ủng A.flavus phân l ập được trong đất tr ồng l ạc. Điều này ch ứng t ỏ, ch ủng A. flavus DA2 có kh ả n ăng c ạnh tranh cao và đã thay th ế các ch ủng A.flavus sinh aflatoxin t ồn t ại t ự nhiên trong đất tr ồng l ạc ở các lô thí nghi ệm, vì v ậy đã làm gi ảm rõ r ệt m ật độ các ch ủng A.flavus sinh aflatoxin trong đất tr ồng l ạc. K ết qu ả này cũng phù h ợp v ới nghiên c ứu c ủa Cotty và cộng s ự khi s ử d ụng ch ủng không sinh aflatoxin A. flavus 36 để phòng ch ống A.flavus và aflatoxin trên l ạc, ch ủng này đã có tác d ụng gi ảm 80-95% A. flavus sinh aflatoxin trong đất tr ồng l ạc. Bảng 3.6 Hi ệu qu ả gi ảm A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin c ủa ch ủng A. flavus DA2 trên l ạc c ủ ở giai đoạn tr ước thu ho ạch Các ch ỉ tiêu đánh giá Công th ức thí nghi ệm Tỷ l ệ h ạt Hàm l ượng Hi ệu qu ả nhi ễm A.flavus aflatoxin gi ảm sinh aflatoxin trên lạc aflatoxin (%) (ppb) (%) Lạc không s ử d ụng ch ế ph Nm AF 10 ± 1,95 15,24 ± 1,03 0 Lạc s ử d ụng 01 l ần ch ế ph Nm AF 7,0 ± 1,23 9,13 ± 1,48 40,10 Lạc s ử d ụng 2 l ần ch ế ph Nm AF 3,0 ± 0,78 5,62 ± 0,89 63,13 Lạc s ử d ụng 3 l ần ch ế ph Nm AF 0 2,05 ± 0,72 86,55 Lạc h ạt từ các m ẫu l ạc c ủ ở giai đoạn tr ước thu ho ạch t ừ lô không sử d ụng ch ế ph Nm AF t ỷ l ệ h ạt nhi ễm A. flavus sinh aflatoxin trung bình là 10%, hàm lượng aflatoxin là 15,24 ppb. Trong khi đó, l ạc h ạt từ các m ẫu l ạc c ủ ở giai đoạn tr ước thu ho ạch t ừ lô s ử d ụng 01 lần ch ế ph Nm AF có 7% hạt b ị nhi ễm A. flavus sinh aflatoxin, hàm l ượ ng aflatoxin trên l ạc là 9,13 ppb, hi ệu qu ả gi ảm 40,10 %. Ở l ạc h ạt từ các m ẫu l ạc c ủ thu th ập giai đoạn tr ước thu ho ạch t ừ lô s ử dụng 3 l ần ch ế ph Nm AF, không phát hi ện A. flavus sinh aflatoxin. Hàm l ượ ng aflatoxin ở lô thí nghi ệm s ử d ụng 3 lần ch ế ph Nm AF là 2,05 ppb (Hi ệu qu ả 21
25. gi ảm aflatoxin 86,55%). Kết qu ả cho th ấy, ch ủng A. flavus DA2 sau khi bón vào đấ t đã có kh ả n ăng c ạnh tranh cao v ới các ch ủng A. flavus sinh aflatoxin v ốn nhi ễm t ự nhiên trên lạc ở giai đoạn tr ước thu ho ạch và ức ch ế s ự t ạo aflatoxin của các ch ủng này. + Kh ả n ăng gi ảm A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin trên l ạc b ảo qu ản c ủa ch ế ph m AF Lạc thu ho ạch t ừ lô sử d ụng và không s ử d ụng ch ế ph Nm AF được ph ơi khô đến độ Nm 10%, đóng trong bao dứa tráng polyethylen và đư a vào b ảo qu ản tại kho b ảo qu ản c ủa xã Tam H ồng, huy ện Yên L ạc, t ỉnh V ĩnh Phúc ở nhi ệt độ từ 25 0C đến 35 0C. Quy mô b ảo qu ản 01 t ấn/mô hình. Sau 6 tháng b ảo qu ản ti ến hành lấy m ẫu phân tích t ỷ l ệ nhi ễm m ốc và hàm l ượ ng aflatoxin trên h ạt. Hi ệu qu ả c ạnh tranh c ủa ch ủng A. flavus DA2 trên l ạc b ảo qu ản được trình bày trong bảng 3.7. Bảng 3.7 Hi ệu qu ả gi ảm A.flavus sinh aflatoxin và aflatoxin c ủa chủng A. flavus DA2 trên l ạc sau th ời gian b ảo qu ản 6 tháng Các ch ỉ tiêu đánh giá Công th ức thí Tỷ l ệ h ạt Hàm l ượng Hi ệu qu ả gi ảm nghi ệm nhi ễm A.flavus aflatoxin trên aflatoxin (%) sinh aflatoxin lạc h ạt (ppb) (%) Lạc không bón ch ế 100 112 ± 2,08 0 ph Nm AF Lạc bón 1 l ần ch ế 45 62 ± 2,64 45,0 ph Nm AF Lạc bón 2 l ần ch ế 8 25 ± 1,52 77,7 ph Nm AF Lạc bón 3 l ần ch ế 0 5 ± 1,05 95,6 ph Nm AF Sau 6 tháng b ảo qu ản, l ạc t ừ lô không sử d ụng ch ế ph Nm AF đã có 100% hạt b ị nhi ễm A. flavus sinh aflatoxin, hàm l ượ ng aflatoxin trung bình trên l ạc hạt là 112 ppb, trong khi đó l ạc h ạt b ảo qu ản ở lô thí nghi ệm s ử d ụng 01 lần ch ế ph Nm AF t ỷ l ệ h ạt nhi ễm A. flavus sinh aflatoxin 45%, hàm l ượng aflatoxin trung bình là 62 ppb, hi ệu qu ả gi ảm aflatoxin là 45% so v ới lạc thu ho ạch t ừ lô không s ử d ụng ch ế ph Nm AF. 22
26. Lạc thu ho ạch t ừ lô thí nghi ệm s ử d ụng 02 lần ch ế ph Nm AF t ỷ l ệ h ạt nhi ễm A. flavus sinh aflatoxin là 8ppb, hàm l ượng aflatoxin trung bình trên h ạt là 25 ppb, hi ệu qu ả gi ảm aflatoxin so v ới lô đối ch ứng là 77,7%. Lạc thu ho ạch ở lô sử d ụng 03 lần ch ế ph Nm AF, không phát hi ện th ấy nhi ễm A. flavus sinh aflatoxin, hàm l ượng aflatoxin trung bình trên l ạc là 5ppb, hi ệu qu ả gi ảm aflatoxin so v ới lô đố i ch ứng là 95,6%. Kết qu ả trên cho th ấy, ch ủng A. flavus DA2 có kh ả n ăng c ạnh tranh cao v ới ch ủng A. flavus sinh aflatoxin vốn nhi ễm tự nhiên v ới t ần su ất cao ở l ạc b ảo qu ản, đồ ng th ời làm gi ảm hàm l ượ ng aflatoxin trên l ạc trong quá trình b ảo qu ản. KẾT LU ẬN VÀ KI ẾN NGH Ị KẾT LU ẬN 1. Đã phân lập được ch ủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin có kh ả n ăng cạnh tranh cao đối v ới ch ủng A. flavus AF14 sinh độc t ố, hi ệu qu ả gi ảm aflatoxin đạt 85%. A. flavus DA2 không mang ít nh ất 3 gen aflr, verb và nor . A.flavus DA2 ổn định v ề m ặt di truy ền, không sinh aflatoxin sau khi c ấy chuy ền 15 th ế h ệ, không gây độc tính c ấp trên chu ột b ạch, không xác đinh được li ều gây ch ết 50% động v ật thí nghi ệm (LD50). 2. Đã xây d ựng được quy trình nuôi c ấy b ề m ặt ch ủng A.flavus DA2 để thu nh ận t ạo ch ế ph Nm AF đố i kháng không sinh aflatoxin trên môi tr ường nuôi cấy cám tr ấu (t ỷ l ệ 4:1) với độ Nm 65%, pH =5,5, nhi ệt độ nuôi c ấy 30 oC, th ời gian nuôi c ấy 9 ngày, m ật độ bào t ử đạt 2,0x10 9CFU/g. T ạo ch ế ph Nm AF không sinh aflatoxin v ới ch ất mang là than bùn, tỷ l ệ sinh kh ối nấm/than bùn là 1:1 và ch ế ph Nm v ẫn duy trì được ho ạt tính đối kháng sau 1 n ăm b ảo qu ản ở nhi ệt độ th ường trong túi PE. 3. Đã xây d ựng đượ c mô hình th ử nghi ệm ch ế ph Nm AF t ừ ch ủng Aspergillus flavus DA2 trên ngô. Hi ệu qu ả gi ảm aflatoxin trên ngô b ắp ở giai đoạn tr ướ c thu ho ạch là 100% sau khi đấ t tr ồng ngô đượ c bón 3 lần ch ế ph Nm AF. Hi ệu qu ả gi ảm aflatoxin trên ngô h ạt có s ử d ụng ch ế ph Nm AF sau 6 tháng b ảo qu ản là 97%. 4. Đã xây d ựng được mô hình thử nghi ệm ch ế ph Nm AF từ ch ủng Aspergillus flavus DA2 trên l ạc. Hi ệu qu ả gi ảm aflatoxin trên l ạc c ủ ở giai đoạn tr ướ c thu ho ạch 86,55% sau khi đấ t tr ồng l ạc đượ c bón 3 lần ch ế ph Nm AF. Hi ệu 23
27. qu ả gi ảm aflatoxin trên l ạc h ạt có s ử d ụng ch ế ph Nm AF sau 6 tháng b ảo qu ản là 95,6%. KI ẾN NGH Ị 1. Ti ếp t ục nghiên c ứu m ột s ố điều ki ện nuôi c ấy t ạo ch ế ph Nm bào t ử n ấm A.flavus DA2 ở quy mô pilot. 2. Nghiên c ứu đánh giá hi ệu qu ả ch ế ph Nm A.flavus DA2 ở di ện r ộng và trên nhi ều đối t ượng nông s ản t ại các vùng mi ền khác nhau. 24