Nghiên cứu tổng hợp vật liệu CeO2 có cấu trúc nano nhằm ứng dụng trong cảm biến ADN.

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu tổng hợp vật liệu CeO2 có cấu trúc nano nhằm ứng dụng trong cảm biến ADN.

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU CeO2 CÓ CẤU TRÚC NANO NHẰM ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN ADN Ngành: Khoa học vật liệu Mã số: 9440122 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU Hà Nộ1 i – 2020
2. Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS Phương Đình Tâm 2. GS.TS Trần Trung Phản biện 1: GS. TS Trần Đại Lâm Phản biện 2: GS. TS Lê Anh Tuấn Phản biện 3: PGS. TS Phạm Đức Thắng Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam 2
3. A. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay, bệnh dịch do vi sinh vật gây ra đang là mối hiểm hoạ không thể lường trước được. Trong những năm qua đã có hàng chục nghìn người chết bởi các loài vi sinh vật gây bệnh như: vi rút H5N1, SARS, vi khuẩn gây bệnh tả, vi rút viêm não Nhật Bản gây ra. Trong số đó, căn bệnh thương hàn do chủng vi khuẩn Salmonella gây ra đã khiến hàng chục triệu người mắc bệnh với số người chết lên tới hàng triệu người. Theo thống kê của Bộ y tế [1] ở Việt Nam tỷ lệ mắc thương hàn tính trên 100.000 dân trong năm: 2010 là 64,4; 2011 là 56,8, trong đó tỷ lệ tử vong là 0,02/100.000 dân; tới năm 2016 là 0,58. Tính riêng cho đối tượng là trẻ em số ca mắc thương hàn do khuẩn Salmonella theo các năm 2012, 2013, 2014, 2015 và 2016 lần lượt là: 613, 706, 469, 492, 374 với số trẻ chết được ghi nhận vào năm 2014 là 3 trẻ. Do đó, việc nghiên cứu các phương pháp phát hiện vi sinh vật gây bệnh đang là yêu cầu cấp thiết đặt ra cho các nhà khoa học cũng như của các hãng công nghiệp. Hiện nay, các phương pháp phân tích nhanh vi sinh vật thường được sử dụng là PCR, ELISA, nuôi cấy tế bào là các phương pháp phân tích truyền thống trong công nghệ sinh học. Trong đó, các xét nghiệm miễn dịch như ELISA chỉ có thể phát hiện được Salmonella ở giới hạn 104 đến 105 CFU/mL, với thời gian làm giàu mẫu mất khoảng 16 h đến 24 h và giới hạn này được cải thiện bằng phương pháp phản ứng chuỗi PCR xuống tới 5 CFU/mL [2]. Việc lấy mẫu xét nghiệm đòi hỏi quy trình khắt khe, các thí nghiệm phải được thực hiện trong phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn của tổ chức Y tế thế giới, trang thiết bị đắt tiền. Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển phương pháp bổ sung cho các phương pháp này là việc hết sức cần thiết. Trong đó, sử dụng cảm biến sinh học được cho là phương pháp hiệu quả, bổ sung cho các phương pháp truyền thống do cảm biến sinh học có độ nhạy, độ chọn lọc cao, dễ dàng sử dụng, thời gian phân tích nhanh và cho kết quả tin cậy [2],[3]. Cảm biến sinh học là một thiết bị phân tích trên cơ sở kết hợp giữa phần tử sinh học và bộ phận chuyển đổi tín hiệu để chuyển đổi các tín hiệu sinh hoá thành tín hiệu dễ dàng cho người quan sát. Do 1
4. các phân tử sinh học không thể tự gắn được lên bề mặt cảm biến, do đó cần có một lớp vật liệu trung gian để cố định giữa bộ chuyển đổi và phân tử sinh học. Lớp vật liệu này không chỉ gắn kết thành phần sinh học và bề mặt cảm biến mà nó còn đóng vai trò chuyển điện tích từ dung dịch đến bề mặt cảm biến. Hiện nay, trên thế giới có nhiều loại vật liệu được sử dụng để gắn kết phân tử sinh học lên bề mặt cảm biến như ống nano cacbon [4][5], polyme dẫn [6], các vật liệu ô xít kim loại bán dẫn [7], các hạt nano kim loại [8], các vật liệu ô xít kim loại đất hiếm [9] v.v. CeO2 cấu trúc nano là một trong các vật liệu hứa hẹn nhất đói với cảm biến sinh học điện hóa do các đặc tính hấp dẫn như là tính bền hóa học, tương thích sinh học, không độc, bề mặt riêng cao, dẫn điện và đặc tính vận chuyển electron cao. CeO2 có năng lượng vùng cấm rộng, Eg = 3,4 eV và điểm đẳng điện cao IEP = 9,2. Điều này rất thích hợp cho việc hấp phụ các phân tử có điểm đẳng điện thấp mà không cần bất kỳ xử lý hóa học nào [10]. Tuy nhiên, các công trình công bố chủ yếu sử dụng điện cực dạng màng cấu trúc đơn pha chỉ bao gồm các hạt oxit kim loại để phát triển cảm biến sinh học sẽ có hiện tượng giảm diện tích bề mặt riêng do sự co cụm và mất biên giới giữa các hạt, dẫn đến làm giảm khả năng hấp phụ các tác nhân. Để tránh được hiện tượng nêu trên, thường là tạo một lớp hấp phụ các phân tử tác nhân trên bề mặt hạt, cũng đồng thời nâng cao hiệu suất của cảm biến: tăng độ nhạy, giảm giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, tác giả đã lựa chọn cách bao phủ các thanh nano CeO2 (vật liệu được nghiên cứu) bằng lớp màng mỏng poly pyrol (Ppy) để tạo vật liệu lai hóa Ppy@CeO2 cấu trúc lõi-vỏ. Điều thú vị ở đây là Ppy với giá trị hàm công (chênh lệch năng lượng giữa mức Fermi và năng lượng chân không) khoảng 5,0 eV [11] và CeO2 có giá trị hàm công là 5,34 eV [12] khi tiếp xúc các electron lẻ của Ppy dễ dàng 9 0 chuyển sang các orbital trống của Ce với cấu hình 3d 4f trong CeO2, tạo điều kiện thuận lợi cho việc hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa “Salmonella ssADN dò” và vỏ PPy. Khi đó cấu trúc lõi-vỏ này đảm bảo được độ xốp, cùng những khoảng trống không gian chứa dung dịch có tác nhân phân tích để tạo ra cảm biến ADN đối với vi khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chẩy cấp ở người. “Nghiên cứu tổng hợp vật liệu CeO2 có cấu trúc nano nhằm ứng dụng trong cảm biến ADN” là đề tài mà nghiên cứu sinh 2
5. hướng tới. Theo đó việc tập trung nghiên cứu tổng hợp vật liệu CeO2 có cấu trúc dạng thanh nano (CeO2 NRs) có kích thước phù hợp và trên bề mặt được che phủ bởi lớp PPy tạo thành cấu trúc lõi-vỏ với lớp hấp phụ “Salmonella ssADN dò”, tạo thành một cảm biến sinh học phát hiện khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chẩy ở người. 2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu Mục tiêu chung của đề tài là phát triển cảm biến sinh học ADN trên cơ sở vật liệu CeO2 có cấu trúc nano nhằm xác định vi khuẩn gây bệnh tiêu chẩy cấp. Mục tiêu cụ thể:  Tổng hợp được vật liệu nano một chiều CeO2, và vật liệu nano composits CeO2/Ppy có cấu trúc lõi vỏ.  Phát triển được cảm biến cảm biến ADN hiệu suất cao trên cơ sở vật liệu nano chế tạo được. 3. Nội dung nghiên cứu của luận án - Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano CeO2 và vật liệu CeO2@Ppy có cấu trúc lõi vỏ. - Nghiên cứu cố định chuỗi ADN lên bề mặt cảm biến. - Phát triển cảm biến ADN trên cơ sở các vật liệu đã chế tạo được nhằm xác vi khuẩn gây bệnh tiêu chẩy cấp. 4. Phương pháp nghiên cứu - Trong quá trình thực hiện luận án này, tác giả đã sử dụng phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, trong đó bao gồm: - Vật liệu thanh nano CeO2 được tổng hợp bằng phương pháp thuỷ nhiệt, vật liệu có cấu trúc lõi vỏ CeO2@Ppy được tổng hợp bằng phương pháp trùng hợp hoá học. - Đặc trưng hình thái, cấu trúc vật liệu đã được nghiên cứu bằng các phương pháp như: Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FESEM- JEOL/JSM-7600F); phổ tán xạ năng lượng tia X (EDS); phương pháp phân tích giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD); phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (FTIR), phương pháp phân tích nhiệt (TGA) thực hiện trên thiết bị Labsys TG/DSC (SETARAM – Pháp). - Đặc trưng của cảm biến đã được nghiên cứu bằng phương pháp quét thế tuần hoàn (CV) và phương pháp đo phổ tổng trở điện 3
6. hóa (EIS) thực hiện trên thiết bị IM6-Thales tại Viện AIST trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Trong bối cảnh ngày càng có nhiều loại dịch bệnh do các loài vi sinh vật gây ra, sự ra đời của các công cụ phát hiện sớm các vi sinh vật như cảm biến ADN là hết sức quan trọng. Trong nghiên cứu này, cảm biến sinh học đã được phát triển trên cơ sở vật liệu CeO2 có cấu trúc dạng thanh nano và vật liệu lai giữa CeO2 và polyme dẫn. Cơ chế phát hiện của cảm biến đã được giải thích rõ ràng trên cơ sở sự tương tác của chuỗi ssADN dò với ssADN đích. Cảm biến ADN sau khi được phát triển sẽ góp phần vào sự phát triển phương pháp phát hiện các vi sinh vật gây bệnh, ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học và môi trường. 6. Những đóng góp mới của luận án Những nghiên cứu của luận án đã mang lại những đóng góp mới bao gồm: - Đã tổng hợp được vật liệu thanh nano CeO2 có kích thước chiều dài ~ 200 nm và đường kính ~20 nm bằng phương pháp thủy nhiệt đơn giản với tiền chất ban đầu là Ce(NO3)3.6H2O và chất khoáng hóa Na3PO4, thời gian thủy nhiệt ngắn (24 h) và nhiệt độ 200 ℃. Đã chế tạo được vật liệu nano composit có cấu trúc lõi vỏ CeO2/Ppy bằng phương pháp hóa học với chế độ tổng hợp tối ưu là tỷ lệ tiền chất CeO2/Py = 1/10, thời gian tổng hợp là 6 h trong dung dịch chứa FeCl3.6H2O. - Đã phát triển được cảm biến ADN điện hóa trên cơ sở vật liệu thanh nano CeO2 nhằm xác định chuỗi ADN của vi khuẩn Salmonella với giới hạn phát hiện và độ nhạy của cảm biến ADN tương ứng là 0,01 µM và 3362,1 ΩµM-1cm-2. Khoảng phát hiện tuyến tính là 0,01 µM đến 2 µM. - Đã phát triển một cảm biến sinh học ADN dựa trên vật liệu nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2-NR@Ppy nhằm phát hiện vi khuẩn Salmonella với khoảng tuyến tính là 0,01-0,4 nM với độ nhạy 4
7. 593,7 ΩnM-1cm-2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của cảm biến ADN thấp tương ứng là 0,084 và 0,28 nM. 7. Cấu trúc của luận án Bản luận án được trình bày theo bố cục như sau: MỞ ĐẦU Chương 1: Trình bày tổng quan về “Cảm biến sinh học điện hóa”. Chương 2: Trình bày về kết quả “Nghiên cứu tổng hợp vật liệu thanh nano CeO2 và nano composit CeO2@Ppy”. Chương 3: Trình bày về kết quả nghiên cứu về “Phát triển cảm biến ADN trên cơ sở các thanh nano CeO2”. Chương 4: Trình bày về kết quả nghiên cứu về “Cảm biến sinh học ADN trên cơ sở vật liệu nano composit CeO2@Ppy”. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO B. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về chuỗi ADN ADN có tên gọi đầy đủ là axit deoxyribo nucleic cấu tạo bởi 2 chuỗi polyme sinh học là các poly nucleotit liên kết với nhau hình thành cấu trúc xoắn kép xung quanh một trục tưởng tượng. Khi đun nóng vượt quá nhiệt độ sinh lý (khoảng 80÷90 ℃) các chuỗi ssADN trong dsADN xoắn kép sẽ tách nhau ra tạo thành hai chuỗi đơn. Do A liên kết với T bằng 2 liên kết hydro nên liên kết A- T sẽ bị đứt trước còn G liên kết với C bằng 3 liên kết hydro bền vững hơn nên sẽ bị đứt sau ở khoảng nhiệt độ lớn hơn 90 ℃. Hiện tượng này được gọi là hiện tượng biến tính của ADN. Nhiệt độ mà tại đó các chuỗi ssADN trong chuỗi dsADN cấu trúc xoắn kép tách nhau ra được gọi là điểm chảy (melting point)-Tm của ADN. Giá trị Tm đặc trưng cho các chuỗi dsADN phụ thuộc vào số liên kết A-T và G-C có trong chuỗi dsADN đó. 5
8. 1.2 Cơ sở lý thuyết các phương pháp điện hóa sử dụng trong nghiên cứu cảm biến ADN Các phương pháp điện hóa sử dụng trong nghiên cứu cảm biến ADN hoạt động dựa trên cơ sở bình điện hóa 3 điện cực bao gồm: điện cực làm việc (WE), điện cực đối hay điện cực tham chiếu (CE), thường sử dụng điện cực Pt hoặc C graphit, và điện cực so sánh (RE) có điện thế điện cực không đổi, thường dùng là điện cực Ag/AgCl. Để thực hiện phép đo điện hóa, các điện cực được kết nối với hệ đo điện hoá có phần mềm điều khiển trên máy tính. 1.2.1 Phương pháp quét thế vòng 1.2.2 Phương pháp quét thế xung vi phân 1.2.3 Phương pháp quét thế sóng vuông 1.2.4 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa 1.3 Các phương pháp cố định chuỗi ssADN 1.3.1 Hấp phụ vật lý 1.3.2 Cố định bằng liên kết cộng hóa trị 1.3.3 Cố định thông qua tương tác Avidin/Streptavidin-Biotin 1.3.4 Cố định bằng phương pháp điện hóa 1.4 Phương pháp phát hiện sự lai hóa ADN 1.4.1 Phương pháp đánh dấu 1.4.2 Phương pháp không đánh dấu 1.5 Ứng dụng của cảm biến sinh học Chương 2: NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU THANH NANO CeO2 & NANO COMPOSIT CeO2@Ppy 2.1 Đặt vấn đề 2.2 Thực nghiệm 2.2.1 Hóa chất, thiết bị 2.2.2 Tổng hợp vật liệu thanh nano CeO2 CeO2 được tổng hợp từ Ce(NO3)3.6H2O với sự có mặt của chất tạo mầm Na3PO4 trong bình thủy nhiệt ở nhiệt độ từ 170 đến 220 ℃, thời gian từ 20 đến 28 h. Nồng độ tiền chất khảo sát từ 0,1 M đến 0,5 6
9. M và nồng độ chất tạo mầm được khảo sát từ 1% đến 6%. Quy trình tổng hợp các thanh nano CeO2 được mô tả như trong Hình 2.1: Hình 2.1: Quy trình tổng hợp vật liệu thanh nano CeO2 bằng phương pháp thủy nhiệt 2.2.3 Tổng hợp vật liệu nano composit CeO2@Ppy Ppy được mọc trực tiếp lên các thanh nano CeO2 bằng cách trùng hợp hóa học từ các monome pyrol với sự có mặt của chất oxy hóa FeCl3 trong dung dịch có sẵn các thanh nano CeO2 đã được tổng hợp ở chế độ tối ưu trong phần 2.2.2. Quy trình tổng hợp vật liệu CeO2@Ppy được mô tả trong Hình 2.2: Hình 2.2: Quy trình tổng hợp CeO2@Ppy 2.3 Kết quả và thảo luận 2.3.1 Kết quả tổng hợp vật liệu thanh nano CeO2 a) Ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mầm Na3PO4 Khi chất tạo mầm là 4 % và 5 % cho thấy, các thanh nano CeO2 có kích thước khá đồng đều, với chiều dài các thanh xấp xỉ 200 nm và đường kính các thanh khoảng 20 nm (Hình 2.3). 7
10. Hình 2.3: Ảnh FESEM CeO2 NRs phụ thuộc nồng độ chất tạo mầm Na3PO4 (a)– 1%; (b)– 2%; (c)– 3%; (d)– 4%; (e)– 5%; (f)– 6% Giản đồ nhiễu xạ tia X (Hình 2.4) cho thấy với nồng độ chất tạo mầm là 4% các thanh nano CeO2 thu được không có lẫn tạp chất nên nồng độ chất tạo mầm tối ưu được lựa chọn là 4 %. Hình 2.4: Phổ nhiễu xạ tia X của CeO2 khi nồng độ các chất tạo mầm là: (a)-4 %; (b)-5 % b) Ảnh hưởng của nồng độ Ce3+ Nồng độ của tiền chất Ce3+ lần lượt được thay đổi là 0,1 M; 0,2 M; 0,3 M; 0,4 M; 0,5 M. Các kết quả nghiên cứu được biểu diễn trên Hình 2.5: 8
11. Hình 2.5: Ảnh FESEM các mẫu 3+ CeO2 khi nồng độ Ce thay đổi (a)- 0,1 M; (b)- 0,2 M; (c)- 0,3 M; (d)- 0,4 M; (e)- 0,5 M. Có thể thấy rằng, khi nồng độ chất tạo mầm lớn hơn 4 % và nồng độ tiền chất Ce3+ ban đầu 0,4 M thì sản phẩm tạo thành là các thanh nano có đường kính khoảng 20÷30 nm và chiều dài khoảng 200 nm. c) Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy nhiệt Nhiệt độ thủy nhiệt được khảo sát lần lượt ở 170 oC, 180 oC, 190 oC, 200 oC và 220 oC, kết quả nghiên cứu được biểu diễn trên Hình 2.6 Khi nhiệt độ đạt 200 ℃ và 220 ℃ [Hình 2.6 (d,e)], sản phẩm thu được chủ yếu là các thanh nano với kích thước khá đồng đều nhau. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nhiệt độ và thời gian thuỷ nhiệt đủ dài thì các thanh nano sẽ có đường kính lớn hơn và có thể hình thành các đám co cụm do đường kính các thanh tăng lên. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn 200 ℃ là nhiệt độ tối ưu để tổng hợp các thanh nano CeO2 bằng phương pháp thủy nhiệt. 9
12. Hình 2.6: Ảnh FE-SEM các mẫu CeO2 thủy nhiệt khi nhiệt độ thay đổi: (a)-170 ℃; (b)-180 ℃; (c)-190 ℃; (d)-200 ℃; (e)- 220 ℃ d) Ảnh hưởng của thời gian thủy nhiệt Thời gian thủy nhiệt được khảo sát lần lượt ở 20, 22, 24, 26, 28 và 48 h. Kết quả chỉ ra ở Hình 2.7: Hình 2.7: Ảnh FESEM các mẫu CeO2 khi thời gian thay đổi: (a)- 20 h; (b – 22 h; (c)– 24 h; (d)- 26 h; (e)- 28 h. 10
13. Khi thời gian thuỷ nhiệt thay đổi từ 20 h đến 26 h thì hình thái bề mặt của vật liệu không có sự thay đổi nhiều [Hình 2.7 (a-d)]. Tuy nhiên, khi tăng thời gian thuỷ nhiệt đến 28 h thì hình thành các thanh có đường kính lớn hơn. Cấu trúc vật liệu cũng được khảo sát thông qua giản đồ nhiễu xạ tia X. Quan sát giản đồ nhiễu xạ tia X trên Hình 2.8 cho thấy, sản phẩm thu được sau 24 h thủy nhiệt có độ kết tinh tốt hơn. Hình 2.8: Giản đồ nhiễu xạ tia X mẫu CeO2 khi thời gian thủy nhiệt: (f-1) 22 h và (f-2) 24 h Phổ tán sắc năng lượng tia X (Hình 2.9) của sản phẩm thu được sau 24 h thủy nhiệt cũng cho thấy sản phẩm tạo chỉ bao gồm các nguyên tố: Au, C, Ce và O. Chứng tỏ sản phẩm thu được không lẫn tạp chất khác. Hình 2.9: Phổ tán sắc năng lượng tia X của các thanh nano CeO2 3+ điều kiện thủy nhiệt: t = 24h, [Na3PO4]= 4 %, [Ce ]= 4 M và T = 200 ℃ Kết luận: chế độ phù hợp nhất để tổng hợp các thanh nano 3+ CeO2 bằng phương pháp thủy nhiệt đó là: Nồng độ tiền chất Ce ban đầu là 0,4 M, nồng độ chất tạo mầm Na3PO4 là 4 %, nhiệt độ là 200 ℃ và thời gian thủy nhiệt là 24 h. 2.3.2 Kết quả tổng hợp vật liệu nano composit CeO2@Ppy 11
14. a) Ảnh hưởng của tỷ lệ CeO2 – pyrol tham gia phản ứng Hình 2.13: Ảnh hưởng của tỷ lệ CeO2/Py đến hình thái của nano composit CeO2- Ppy đặc trưng bởi FESEM: (a) – 1/5; (b) – 1/10; (c) – 1/20 Tỷ lệ CeO2/Py được khảo sát ở các tỷ lệ sau: 1/5; 1/10 và 1/20 như được mô tả trên Hình 2.13. Tỷ lệ CeO2/ Py quyết định đến tương quan tỷ lệ của các thanh CeO2 và Ppy được tạo thành. Tỷ lệ CeO2/Py = 1/10 được lựa chọn là giá trị tối ưu cho quá trình tổng hợp vật liệu nano composit. b) Ảnh hưởng của thời gian polyme hóa Hình 2.14: Ảnh hưởng của thời gian polyme hóa đến hình thái bề mặt của nano composit CeO2-Ppy đặc trưng bởi FESEM: (a) – 1 h; (b) – 2 h; (c) – 4 h; (d) – 6 h; (e) – 8 h; (f) – 10 h 12
15. Quá trình polyme hóa được thực hiện trong các khoảng thời gian khác nhau: 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h và 10 h. Kết quả được chỉ ra ở Hình 2.14. Cấu trúc lõi vỏ thu được là rõ nhất khi thời gian polyme hóa là 6 h. Sản phẩm được quan sát kỹ hơn thông qua ảnh FESEM và TEM Hình 2.15. Hình 2.15: Hình thái cấu trúc của nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2 NR@Ppy đặc trưng bởi: (a)- FESEM và (b) –TEM Quan sát ảnh ta có thể thấy, vật liệu thu được có cấu trúc lõi vỏ với vật liệu lõi là thanh nano CeO2 nằm ở giữa được bao bọc bởi lớp vỏ vật liệu poly pyrol. Độ tinh khiết của vật liệu tạo thành được khảo sát thông qua phổ EDS (Hình 2.16) cho thấy vật liệu tạo thành có một lượng nhỏ P (5,8 % nguyên tử) cho thấy sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao. Hình 2.16: Phổ EDS của nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2 NR@Ppy c) Giản đồ nhiễu xạ tia X và phổ FTIR của vật liệu Thành phần cấu tạo và cấu trúc của vật liệu được đặc trưng bởi giản đồ nhiễu xạ tia X và phổ hồng ngoại FTIR (Hình 2.17): 13
16. Hình 2.17: (A)- Giản đồ nhiễu xạ tia X và (B)- phổ FT-IR của các mẫu vật liệu Các đỉnh nhiễu xạ của CeO2 NRs ở góc 2 là 28,6, 33,1, 47,6, và 56,5 tương ứng với các mặt (111), (200), (220), và (311) trong cấu trúc lập phương flourit [Hình 2.17 (A)]. Các đỉnh này tương ứng với các mẫu nhiễu xạ của CeO2 chỉ ra trong thẻ JCP2.CAT: 04-0593. Các dải hấp thụ đặc trưng cho các liên kết của CeO2, Ppy và CeO2@Ppy lần lượt xuất hiện trên phổ FTIR [Hình 2.17 (B)]. Kết luận chương 2 Chế độ tối ưu để tổng hợp thanh nano CeO2 như sau: nồng độ tiền chất Ce(NO3)3.6H2O là 0,4 M, nồng độ chất tạo mầm Na3PO4 là 4 %, nhiệt độ thủy nhiệt là 200 ℃, thời gian thủy nhiệt là 24 h. Chế độ tối ưu để tổng hợp vật liệu nano composit có cấu trúc lõi vỏ CeO2@Ppy như sau: tỷ lệ CeO2/Py = 1/10, thời gian polyme hoá là 6 h. Chương 3: PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN ADN TRÊN CƠ SỞ CÁC THANH NANO CeO2 3.1 Đặt vấn đề Cảm biến sinh học trên cơ sở vật liệu chức năng là các thanh nano CeO2 và composit của nó với Ppy chưa được nghiên cứu hoặc mới chỉ dừng lại ở cảm biến enzym, cảm biến miễn dịch. Không có nhiều báo cáo về cảm biến ADN sử dụng vật liệu nano CeO2 để phát hiện vi sinh vật gây bệnh. Trong phạm vi luận án, tác giả đã nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa ADN trên cơ sở thanh 14
17. nano CeO2 để phát hiện vi khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chẩy cấp ở người. 3. 2 Thực nghiệm 3.2.1 Hóa chất Các hóa chất sử dụng đều được mua từ hãng Sigma Aldrich. Các chuỗi nucleotid tổng hợp được mua từ Invitrogen Co., Ltd (Bảng 3.1): Bảng 3.1: Các chuỗi nucleotit tổng hợp được dùng trong nghiên cứu Tên Thông tin về chuỗi ssADN ssADN dò 5’-GGC TGG TAC CAC CTC TTC TAC CAT GG-3’ ssADN đích 3’-CCG ACC ATG GTG GAG AAG ATG GTA CC-5’ Herpes vi rút 5’-TTG CTG GCC AAG CTG ACG GAC A-3’ E.coli 5’-AACGC CGATA CCATT ACTTA TACCG CGACG-3’ O157:H7 3.2.2 Cố định ssADN Các chuỗi ssADN được cố định lên bề mặt cảm biến thông qua liên kết cộng hóa trị. 3.2.3 Các phép đo điện hóa Phần mềm phổ tổng trở IM6 với thiết bị IM6 – THALES đã được sử dụng để phát hiện sự lai hóa giữa ADN dò và ADN đích. 3.3 Kết quả và thảo luận 3.3.1 Kết quả cố định chuỗi ssADN Dải hấp thụ đặc trưng của các liên kết có trong các mẫu vật liệu CeO2, chuỗi ssADN và ssADN/CeO2 lần lượt xuất hiện trên phổ FTIR của các mẫu vật liệu Hình 3.3: 15
18. Hình 3.3: Phổ FTIR của: a) CeO2; b) chuỗi ADN và c) ssADN/CeO2 Phổ UV-Vis (Hình 3.4) và ảnh huỳnh quang (Hình 3.5) của điện cực biến tính thanh CeO2 và CeO2/ssADN cũng đã được sử dụng để khảo sát sự cố định các chuỗi ssADN lên điện cực: Hình 3.4: Phổ UV-vis của Hình 3.5: Ảnh huỳnh quang của cảm biến trên cơ sở CeO NRs (a)- ssADN và (b)- ssADN/CeO 2 2 (a)- Chưa cố định ssADN; (b)- Đã cố định ssADN 3.3.2 Đặc trưng của cảm biến ADN Đặc trưng của cảm biến được nghiên cứu thông qua phổ tổng trở điện hóa đo trong dung dịch đệm phốt phát, pH = 7 có chứa 20 mM K3Fe(CN6) là chất dò oxy hóa khử (Hình 3.6). Kết quả chỉ ra, sau mỗi bước xử lý bề mặt điện cực của cảm biến: phủ CeO2, cố định chuỗi ssADN dò và lai hóa các chuỗi ssADN dò với ssADN đích thì điện trở chuyển điện tích Ret có giá trị bằng đường kính phần bán nguyệt của giản đồ Nyquist, của điện cực lại tăng lên. Đây là kết quả của sự cản trở trao đổi chuyển điện tích giữa đầu dò oxy hóa khử với bề mặt điện cực của các lớp màng vật liệu khác nhau trên đó. 16
19. Hình 3.6: Giản đồ Nyquist đo trong dung dịch đệm pH = 7 (a)- Au; (b)- Au/ CeO2; (c)- Au/CeO2/ssADN; (d)- Au /CeO2/dsADN Hình 3.7 mô tả sự phụ thuộc các giá trị điện trở chuyển điện tích Ret với nồng độ ssADN đích. Hình 3.7: Tín hiệu ra của cảm biến ADN phụ thuộc vào [dsADN] Giá trị Ret tăng tuyến tính khi nồng độ của ADN đích tăng từ 0,01 µM đến 2 µM. Giới hạn phát hiện của cảm biến là 0,01 µM và độ nhạy của cảm biến là 3362,1 Ω µM-1cm-2. 3.3.3 Tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm a) Ảnh hưởng của pH b) Ảnh hưởng của nồng độ ion trong dung dịch đệm c) Ảnh hưởng của nồng độ ssADN dò d) Ảnh hưởng của thời gian lai hóa Kết quả tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm được chỉ ra ở Hình 3.8 đến Hình 3.11 cho thấy, điều kiện làm việc tối ưu của cảm biến là pH = 7; [Na+] = 120 mM; [ssADN dò] = 30 µM; thời gian lai hóa là 40 phút. 17
20. Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ đến tín hiệu ra của cảm biến ion đến tín hiệu ra của cảm biến Hình 3.10: Ảnh hưởng của nồng Hình 3.11: Ảnh hưởng của thời độ ssADN dò đến tín hiệu ra của gian lai hóa đến tín hiệu ra của cảm biến cảm biến 3.3.4 Độ lặp lại, độ ổn định, tính chọn lọc và khả năng tái sử dụng Cảm biến cho thấy độ lặp lại, độ ổn định, tính chọn lọc và khả năng tái sử dụng tốt thể hiện thông qua sơ đồ Hình 3.12. Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của các phép đo trong điều kiện thí nghiệm như nhau cho 10 cảm biến là 3,5%, điều này khẳng định rằng cảm biến ADN có độ lặp lại tốt [Hình 3.12- (a)]. Hình 3.12- (b) có thể thấy, tín hiệu ra của cảm biến không thay đổi trong vòng 30 ngày. Sau đó, tín hiệu đáp ứng của cảm biến ADN đã giảm xấp xỉ 2,24%; 8,62% và 10,34% tương ứng với 40, 50 và 60 ngày cho thấy cảm biến có độ ổn định tốt. Cảm biến chỉ cho tín hiệu thay đổi khi tiếp xúc với chuỗi ssADN của khuẩn Salmonella cho thấy cảm biến có độ chọn lọc cao. Ngoài ra cảm biến sau khi đo được biến tính và tiếp tục sử dụng để lai hóa với chuỗi ssADN đích. Tín hiệu tạo ra giảm xấp xỉ 3,5 % so với ban đầu cho thấy cảm biến thu được có khả năng tái sử dụng. 18
21. Hình 3.12: Các đặc trưng của cảm biến trên cơ sở CeO2 NRs (a) Độ lặp lại; (b) Độ ổn định; (c) Tính chọn lọc; (d) Khả năng tái sử dụng Kết luận chương 3 Cảm biến điện hóa ADN trên cơ sở các thanh nano CeO2 ứng dụng cho việc phát hiện lai hóa các chuỗi ssADN của vi khuẩn Salmonella đã được chế tạo thành công. Giới hạn phát hiện và độ nhạy của cảm biến ADN là 0,01 µM và 3362,1 Ω µM-1cm-2. Khoảng tuyến tính của cảm biến từ 0,01 µM đến 2 µM. Thời gian lưu giữ cảm biến cho tín hiệu ra giảm không quá 3% là 40 ngày. Chương 4: CẢM BIẾN SINH HỌC ADN TRÊN CƠ SỞ VẬT LIỆU NANO COMPOSIT CeO2@Ppy 4.1 Đặt vấn đề Các vật liệu cấu trúc lõi vỏ của CeO2@CPs cho các ứng dụng cảm biến sinh học điện hóa đã được công bố bởi nhiều nhóm nghiên cứu. Tuy nhiên, vật liệu cấu trúc lõi-vỏ với lõi là các thanh nano CeO2 và vỏ là Ppy chưa được nghiên cứu ứng dụng trong các cảm biến sinh học ADN nhằm phát hiện các vi khuẩn, vi rút gây bệnh ở người. Đó chính là lý do tác giả nghiên cứu ứng dụng vật liệu cấu trúc lõi vỏ CeO2 NR@Ppy đã được tổng hợp cho cảm biến sinh học ADN nhằm phát hiện chuỗi ssADN của khuẩn Salmonella. 4.2 Thí nghiệm 4.2.1 Hóa chất 4.2.2 Cố định các chuỗi ssADN dò lên bề mặt điện cực Các chuỗi ssADN dò được cố định bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị lên bề mặt điện cực. 19
22. 4.2.3 Phân tích điện hóa Thiết bị phân tích phổ tổng trở với phần mềm IM6-THALES đã được sử dụng để phát hiện sự lai hóa trong dung dịch đệm có chứa 3-/4- 20 mM [Fe(CN)6] làm chất dò oxy hóa khử. 4.3 Kết quả và thảo luận 4.3.1 Kết quả cố định ssADN Ảnh huỳnh quang (Hình 4.1) cho thấy điện cực đã được cố định chuỗi ssADN cho ảnh có các chấm sáng màu xanh chứng tỏ ssADN đã được cố định thành công lên điện cực. Hình 4.1: Ảnh huỳnh quang của cảm biến trên cơ sở CeO2 NR@Ppy (a)- Chưa cố định ssADN dò; (b)- Đã cố định chuỗi ssADN dò 4.3.2 Đặc trưng điện hóa của cảm biến sinh học ADN Phổ tổng trở EIS của các điện cực Au; Au/CeO2 NR@Ppy; Au/CeO2 NR@Ppy/ssADN; Au/CeO2 NR@Ppy/dsADN và mẫu trống Hình 4.3 cho thấy: điện trở chuyển điện tích tăng mỗi khi điện cực được phủ thêm một lớp vật liệu khác nhau. Hình 4.3: Đường cong CV- (A) và đồ thị Nyquist của cảm biến- (B) Độ nhạy của cảm biến sinh học ADN được nghiên cứu bằng cách kiểm tra sự đáp ứng của cảm biến khi thay đổi nồng độ chuỗi ssADN đích (Hình 4.4): 20
23. Hình 4.4: Giản đồ Nyquist (a) và đồ thị ∆Ret (b) phụ thuộc [ssADN đích] Cảm biến cho độ nhạy tốt ở 593,7 Ω.nM-1.cm-2, giá trị LOD và LOQ đạt được tương ứng là 0,084 và 0,28 nM. 4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thông số đến tín hiệu ra của cảm biến a) Ảnh hưởng của nhiệt độ lai hóa b) Ảnh hưởng của thời gian cố định c) Ảnh hưởng của thời gian lai hoá Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu ra của cảm biến được thể hiện thông qua sơ đồ Hình 4.5. Kết quả chỉ ra nhiệt độ lai hóa tối ưu là 50 ℃, thời gian cố định và thời gian lai hóa tối ưu đều là 60 phút. Hình 4.5: Tối ưu các điều kiện thực nghiệm 4.3.4 Độ chọn lọc, độ lặp lại và độ ổn định của cảm biến sinh học ADN Để nghiên cứu độ chọn lọc của cảm biến, chúng tôi đã thực hiện bằng cách so sánh các tín hiệu lai hóa của chuỗi đột biến với các chuỗi bổ sung đầy đủ. Tín hiệu ra của cảm biến là không thay đổi đối với mẫu đối chứng âm. Tuy nhiên, sau khi lai hóa với chuỗi bị đột 21
24. biến gen, giá trị ∆Ret là 18 Ω, tăng 5,86% so với giá trị ∆Ret của điện cực khi chỉ đo trong dung dịch đệm [Hình 4.6- A(c)]. Khi các chuỗi ssADN dò được lai hóa với các chuỗi bổ sung đầy đủ, ∆Ret tiếp tục tăng đạt tới 33 Ω, tương ứng với 10,74% [Hình 4.6- A(d)]. Những kết quả này cho thấy rằng cảm biến sinh học ADN có tính chọn lọc có thể chấp nhận được. Để đánh giá độ lặp lại của cảm biến ADN, 10 cảm biến ADN đã được sử dụng để phát hiện 0,2 nM chuỗi ssADN đích. Như được chỉ ra ở Hình 4.6- (C), độ lệch chuẩn tương đối của các phép đo đối với 10 cảm biến sinh học là xấp xỉ 2,0%, điều này khẳng định độ lặp lại của cảm biến ADN là chấp nhận được. Hình 4.6: Các đặc trưng riêng của cảm biến Để nghiên cứu độ ổn định, điện cực đã được cố định chuỗi ssADN dò được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 ℃ trong thời gian 3 tháng, sau đó được sử dụng để đánh giá độ ổn định thông qua phép đo phổ tổng trở điện hóa EIS. Như được chỉ ra trong Hình 4.6- (D), tín hiệu ra của cảm biến không thay đổi sau 40 ngày được lưu trữ trong tủ lạnh. Sau đó, tín hiệu ra giảm xấp xỉ 23,34%, 47,17% và 91,35%, tương ứng với 60, 70 và 80 ngày. Khi thời gian tăng lên 90 ngày, tín hiệu ra của cảm biến không được ghi nhận bởi phần mềm đo phổ tổng trở EIS. Điều này có thể là do hoạt tính sinh học của 22
25. chuỗi ssADN dò giảm dẫn tới không thể bắt cặp được với các chuỗi bổ sung. 4.3.5 Xác định vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR và so sánh với số liệu phát hiện của cảm biến ADN Cảm biến ADN đã được sử dụng để xác định mẫu thực vi khuẩn Salmonella. Kết quả sau đó được so sánh với phương pháp phản ứng chuỗi polyme PCR. Kết quả điện di gen của 200 bp xuất hiện ở làn số 2 (Hình 4.8-(a)). Không có một dải phổ nào được tìm thấy khi sử dụng phương pháp PCR để xác định mẫu đối chứng âm. Kết quả phát hiện chuỗi ssADN của mẫu thật vi khuẩn Salmonella sử dụng cảm biến ADN được biểu diễn trên Hình 4.8 - (b) cho thấy cả hai phương pháp đều cho kết quả đã xác định được ssADN của khuẩn Salmonella. Hình 4.8: So sánh kết quả phát hiện mẫu vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR với số liệu của cảm biến ADN 4.4 Kết luận chương 4 Với các điều kiện tối ưu, cảm biến sinh học ADN có khoảng phát hiện tuyến tính từ 0,01 nM đến 0,4 nM, với độ nhạy 593,7 Ω.nM-1.cm-2. Chỉ số LOD và LOQ của cảm biến ADN đạt được tương ứng là 0,084 và 0,28 nM. Hơn nữa cảm biến sinh học đã được sử dụng để phát hiện các mẫu ssADN của khuẩn Salmonella trong thực tế. 23
26. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trong khuôn khổ luận án, tác giả đã: Chế tạo được vật liệu thanh nano CeO2 có kích thước chiều dài xấp xỉ 200 nm và đường kính xấp xỉ 20 nm ở chế độ tổng hợp tối ưu là 24 h, nhiệt độ 200 ℃, nồng độ tiền chất ban đầu Ce3+ là 0,4 M và nồng độ chất khoáng hóa Na3PO4 là 4% bằng phương pháp thủy nhiệt. Bọc được Ppy lên các thanh nano CeO2 để tạo vật liệu nano composit có cấu trúc lõi – vỏ ở chế độ tổng hợp tối ưu là tỷ lệ tiền chất CeO2/Py = 1/10, thời gian tổng hợp là 6 h trong dung dịch chứa FeCl3.6H2O với hàm lượng 50 g trong 100 ml dung dịch, bằng phương pháp trùng hợp hóa học. Phát triển được cảm biến ADN điện hóa nhằm phát hiện chuỗi ssADN của vi khuẩn Salmonella trên cơ sở vật liệu thanh nano CeO2. Cảm biến có giới hạn phát hiện và độ nhạy tương ứng là 0,01 µM và 3362,1 ΩµM-1cm-2. Khoảng phát hiện tuyến tính được tìm thấy từ 0,01 µM đến 2 µM. Thời gian lưu giữ cảm biến trong dung dịch đệm Tris HCl (pH = 7) là 40 ngày để tín hiệu ra giảm không quá 3 %. Phát triển được cảm biến ADN dựa trên vật liệu nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2 NR@Ppy để phát hiện đoạn ssADN của Salmonella. Dưới các điều kiện tối ưu, cảm biến sinh học ADN thu được thể hiện khoảng tuyến tính rộng 0,01÷0,4 nM với độ nhạy 593,7 Ω.nM-1.cm-2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của cảm biến ADN tương ứng là 0,084 và 0,28 nM. Hơn nữa, cảm biến sinh học đã được phát triển đã được sử dụng để phát hiện các mẫu ADN của khuẩn Salmonella thực tế. Kiến nghị: Cần có nghiên cứu sâu hơn nữa để mọc trực tiếp các thanh nano CeO2 lên bề mặt của cảm biến nhằm giảm tối đa điện trở tiếp xúc giữa vật liệu và cảm biến. Ngoài ra, cần tiếp tục nghiên cứu, phát triển cảm biến ADN trên cơ sở CeO2 hoặc các vật liệu có cấu trúc nano khác, để phát hiện một số chủng vi khuẩn/virus khác như: Mycobacterium Tuberculosis, Zica virus, H5N1, SARS 24
27. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN A. Tạp chí quốc tế 1. Nguyen Thi Nguyet, Le Thi Hai Yen, Pham Hung Vuong, Phuong Dinh Tam, Tran Trung (2018), “Highly sensitive DNA sensors based on cerium oxide nanorods”, Journal of Physics and Chemistry of Solids, Vol.115, pp. 18-25. IF: 2.207 2. Nguyen Thi Nguyet, Vu Y Doan, Nguyen Luong Hoang, Vu Van Thu, Tran Trung, Pham Hung Vuong, Phuong Dinh Tam (2019), “A label-free and highly sensitive DNA biosensor based on the core-shell structured CeO2-NR@ Ppy nanocomposite for Salmonella detection”, Materials Science and Engineering: C, Vol.96, pp. 790-797.IF: 5.08. 3. Nguyen Thi Nguyet, Vu Van Thu, Hoang Lan, Tran Trung, Anh- Tuan Le, Vuong-Hung Pham, Phuong Dinh Tam (2019), “Simple Label-Free DNA Sensor Based on CeO2 Nanorods Decorated with Ppy Nanoparticles”, Journal of Electronic materials. IF: 1.676. B. Tạp chí trong nước 4. Nguyen Thi Nguyet, Tran Trung, Hoang Lan, Vu Van Thu, Pham Hung Vuong, Phuong Dinh Tam (2019), “Direct synthesis of CeO2 nanospindles on gold electrode by electrochemical method”, Vietnam Journal of Chemistry, Vol.57, pp. 57-63. C. Kỷ yếu hội nghị 5. Nguyễn Thị Nguyệt, Lê Thị Hải Yến, Phương Đình Tâm, Trần Trung (2017), “Nghiên cứu chế tạo hạt nano CeO2 bằng phương pháp điện hóa”, Hội nghị về Vật liệu và Công nghệ Nano Tiên tiến-WANN 2017, pp. 175-179.
28. 6. Le Thi Hai Yen, Nguyen Thi Nguyet, Vu Van Thu, Hoang Lan, Tran Trung, Pham Hung Vuong, Dinh Van Tuan, Nguyen Thi Thuy, Phuong Dinh Tam (2017), “A facile approanch for preparation of core-shell nanostructured Cerium dioxide nanorods@Polypyrrole via in situ Polymerization”, Hội nghị về Vật liệu và Công nghệ Nano Tiên tiến-WANN 2017, pp. 180-186. 7. Nguyen Thi Nguyet, Dang Thi Thuy Ngan, Nguyen Duc Dung, Pham Hung Vuong, Tran Trung, Tuan Duong Anh, Tu Le Manh, Phuong Dinh Tam (2019), “On the electrochemical synthesis of CeO2/Ppy nanocomposite: cyclic voltammetry technique”, Hội nghị Vật lý Chất rắn và Khoa học Vật liệu Toàn quốc – SPMS 2019, No.2, pp. 484-488. 26