Nghiên cứu tỷ lệ biểu lộ và đột biến gen LMP1 của Virus Epstein-Barr và HLA trên bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại Thành phố..

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu tỷ lệ biểu lộ và đột biến gen LMP1 của Virus Epstein-Barr và HLA trên bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại Thành phố..

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: 62 42 02 01 TRỊNH THỊ HỒNG CỦA NGHIÊN CỨU TỶ LỆ BIỂU LỘ VÀ ĐỘT BIẾN GEN LMP1 CỦA VIRUS EPSTEIN-BARR VÀ HLA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG TẠI THÀNH PHỐ CẦN THƠ Cần Thơ, 2020
2. CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Trần Ngọc Dung Người hướng dẫn phụ: GS.TSKH. Phan Thị Phi Phi Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Trường Họp tại: ,Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc giờ ngày tháng năm 2020 Phản biện 1: Phản biện 2: Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
3. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Trịnh Thị Hồng Của, Trần Ngọc Dung, Hoàng Đức Trình, Dương Thị Loan. 2017. Đặc điểm lâm sàng và thể mô bệnh học của bệnh nhân ung thư biểu mô vòm mũi họng điều trị tại Bệnh viện Ung Bướu thành phố Cần Thơ. Tạp chí Y học Thực hành - Journal of practical medicine JPM 12 (1064) 2017, ISSN: 1859-1663, trang 42-43. 2. Trịnh Thị Hồng Của, Trần Ngọc Dung, Trần Văn Bé Năm, Phan Thị Phi Phi. 2018. Xác định tỷ lệ biểu lộ gen LMP1 EBV trên mẫu sinh thiết tươi của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại Bệnh viện Ung Bướu thành phố Cần Thơ. Tạp chí Y học Việt Nam, ISSN: 1859-1868, tháng 8-số 1&2, 2018, tập 469, trang 141-142. 3. Trịnh Thị Hồng Của, Trần Ngọc Dung, Tạ Văn Tờ, Phan Thị Phi Phi. 2018. Tần suất và đột biến gen LMP1 của virus Epstein-Barr ở mẫu sinh thiết vòm của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại Bệnh viện Ung Bướu Cần Thơ. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, ISSN: 1859-2333, tập 55, số chuyên đề: Công nghệ sinh học (2019) (1), trang 66-71. DOI: 10.22144/ctu.jsi.2019.008.
4. Chương 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là khối u ác tính xuất phát chủ yếu từ lớp tế bào biểu mô phủ vòm mũi họng (Bùi Diệu, 2012). Việt Nam là nước có tỷ lệ mắc bệnh trung bình (5,4 người/100.000 dân/năm) (Bùi Diệu, 2011). Bệnh UTVMH thường được chẩn đoán muộn, dẫn đến kết quả điều trị kém đi và làm tỷ lệ tử vong tăng cao. Do đó, yêu cầu bức thiết hiện nay là tìm một giải pháp giúp chẩn đoán bệnh ở giai đoạn sớm bệnh UTVMH. Đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 (Latent Membrance Protein 1) của EBV (Virus Epstein-Barr), được xem là yếu tố quyết định trong bệnh sinh học của UTVMH và yếu tố cơ địa gen HLA (Human Leukocyte Antigen) nhạy cảm với UTVMH góp phần giải thích về tỷ lệ bệnh khác nhau giữa các khu vực địa lý. Việc xác định đột biến gen LMP1 ở bệnh nhân UTVMH cũng như tần suất xuất hiện của các HLA nhạy cảm bệnh có thể xem là yếu tố quyết định trong chẩn đoán sớm bệnh hay không? Mối liên quan giữa 2 yếu tố này thế nào trong sinh bệnh học của UTVMH? Đây là những vấn đề còn nhiều bàn luận. Xuất phát từ cơ sở phân tích trên, luận án “Nghiên cứu tỷ lệ biểu lộ và đột biến gen LMP1 của Virus Epstein-Barr và HLA trên bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại Thành phố Cần Thơ” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài (1) Xác định tỷ lệ hiện diện và đột biến gen LMP1 của virus Epstein-Barr. 1
5. (2) Xác định tần suất type HLA phổ biến ở người bệnh ung thư vòm mũi họng. (3) Tìm hiểu giá trị của đột biến gen LMP1 và type HLA trong chẩn đoán xác định bệnh ung thư vòm mũi họng. 1.3 Ý nghĩa của luận án 1.3.1 Ý nghĩa khoa học - Cung cấp dữ liệu khoa học về tỷ lệ hiện diện và các kiểu đột biến gen (kiểu đột biến mất đoạn 30 bp) của gen LMP1 EBV và tần suất các alen HLA ở bệnh nhân (BN) UTVMH tại Đồng bằng sông Cửu Long, miền Nam của Việt Nam. - Là tài liệu khoa học làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu đã góp phần cung cấp thông tin về sinh bệnh học UTVMH, hỗ trợ cho việc chẩn đoán xác định, tiên lượng bệnh nhân được chính xác hơn, từ đó, góp phần mang lại hiệu quả điều trị thiết thực hơn. 1.4 Tính mới của luận án - Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên về bệnh sinh học UTVMH tại Đồng bằng sông Cửu Long. - Có thể ứng dụng triển khai kỹ thuật PCR LMP1 để xác định đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 tại các cơ sở y tế có trang bị phòng xét nghiệm sinh học phân tử tại Thành phố Cần Thơ và vùng Đồng bằng sông Cửu Long. 2
6. Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh ung thư vòm mũi họng 2.1.1 Đặc điểm lâm sàng của bệnh UTVMH: tùy vào vị trí khối u, hướng và mức độ xâm lấn (tai, mũi, mắt, hạch cổ, ). 2.1.2 Phân loại mô bệnh học UTVMH: theo Tổ chức Y tế thế giới năm 2005. 2.1.3 Xếp loại T, N, M và giai đoạn bệnh UTVMH: theo Hiệp hội quốc tế chống ung thư năm 2010. 2.2 Virus Epstein-Barr - Virus Epstein-Barr phân loại thuộc nhóm I (DNA chuỗi kép-dsDNA virus), bộ Herpesvirales, họ Herpesviridae, chi gammaherpesviridae, loài Lymphocryptovirus, loại Human Herpesviridae 4. - Gen LMP1 có kích thước khoảng 2,6 kb, ở vị trí từ 166483- 169088, mã hóa cho protein LMP1 gồm 386 acid amin chia làm 3 vùng hoạt hóa, kích hoạt các con đường tín hiệu nội bào và đây chính là điểm mấu chốt của sự của sự phát triển và tăng sinh các tế bào ác tính của UTVMH (Kang and Kieff, 2015). - Sự hiện diện và đột biến gen LMP1 (kiểu đột biến mất đoạn 30 bp) ở mẫu mô sinh thiết của BN UTVMH đã được khẳng định trên Thế giới và tại Việt Nam: 81% (34/42) LMP1 (+) và 56% (19/34) Del 30 bp (Hui et al., 2008); 85,7% (18/21) Del 30 bp (Tang et al., 2008); 100% (20/20) LMP1 (+) và 90% (18/20) Del 30 bp (Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi và ctv, 2003); 60% Del 30 bp (Nguyen-Van D et al., 2008). 3
7. - Vai trò của đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 giúp cho sự tồn tại của EBV và thoát khỏi sự giám sát của hệ miễn dịch (Tang et al., 2008). 2.3 Yếu tố cơ địa HLA 2.3.1 Cấu trúc gen HLA - Cụm gen HLA là một vùng chứa nhiều gen đa kiểu hình được sắp xếp tương đối gần nhau và nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể thứ 6 (đoạn 6p21.3), riêng gen mã hóa cho β- microglobuline (thành phần cấu tạo HLA lớp I) ở nhiễm sắc thể thứ 15 (15q21-q22.2) (Phan Thị Phi Phi, 2007), trong đó: + HLA lớp I: gồm có các gen HLA-A, HLA-B, HLA-C mã hoá cho các kháng nguyên HLA tương ứng. + HLA lớp II: gồm có các gen HLA-DR, -DQ, -DP mã hoá cho các kháng nguyên HLA tương ứng. - Haplotype: là sự kết hợp alen ở mỗi locus trên một nhiễm sắc thể đơn. Hình 2.1: Vị trí gen HLA trên nhiễm sắc thể số Nguồn: truy cập ngày12/7/2014. 2.3.2 Vai trò của HLA trong bệnh sinh UTVMH Bệnh UTVMH có liên quan đến vai trò trình diện kháng nguyên của các phân tử HLA và làm ảnh hưởng đến vai trò của 4
8. tế bào Tc tham gia trong đáp ứng miễn dịch tế bào chống các kháng nguyên EBV có mặt trên các tế bào ung thư biểu mô vòm họng (đoạn peptid của LMP1) (trích dẫn của Trần Ngọc Dung, 2000; Su et al., 2013). 2.3.3 Tính cảm thụ bệnh lý của HLA với bệnh UTVMH Các nghiên cứu cho thấy, tần suất một kháng nguyên HLA có thể cao (gen dễ mắc bệnh) hay thấp (gen bảo vệ) trong một số bệnh lý, được gọi là tính cảm thụ bệnh. Một số alen HLA có tần suất cao với bệnh là HLA-A*02,-A*11, -A*24, -A*33; - B*07, -B*15, -B*46; -DRB1*04,-DRB1*09, -DRB1*12; - DQB1*03, -DQB1*05, -DQB1*06 (Trần Ngọc Dung, 2000; Yu et al., 2009; Su et al., 2013; Wang and Wang., 2014). 2.4 Các kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng trong chẩn đoán gen LMP1 EBV và HLA Hiện nay, để nghiên cứu về gen LMP1 EBV có hai kỹ thuật sinh học phân tử được ứng dụng rộng rãi là kỹ thuật khuếch đại gen và kỹ thuật giải trình tự gen. Riêng đối với xác định gen HLA, bên cạnh kỹ thuật huyết thanh học thì ngày nay có các kỹ thuật sinh học phân tử có độ phân giải cao hơn như kỹ thuật PCR-SSP, PCR-SSO, PCR-SBT và kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS). 5
9. Chương 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu: - BN có kết quả của mô bệnh học là ung thư biểu mô vòm mũi họng các thể, được điều trị tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ; không giới hạn về tuổi, giới tính và nơi cư trú. - Mẫu mô sinh thiết vòm mũi họng: Mẫu tươi (khối lượng 0,5-4 mg; chưa qua xử lý) và mẫu mô vùi trong nến parafin (sử dụng trong trường hợp mẫu tươi không đạt về khối lượng mẫu trên cùng một bệnh nhân; thời gian thu nhận mẫu không quá 4 tuần; khoảng 10 lát, dầy 5 µm). 3.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ: tái phát; khám định kỳ trong quá trình điều trị; kết quả mô bệnh học là sarcome hay u lympho; không đồng ý tham gia nghiên cứu. 3.1.3 Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2014 đến 12/2018. 3.1.4 Địa điểm nghiên cứu - Thu thập ĐTNC tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ - Thực hiện các kỹ thuật xét nghiệm: Khoa giải phẫu bệnh, Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ; xác chẩn tại Khoa giải phẫu bệnh, Bệnh viện K Hà Nội; Phòng xét nghiệm Sinh học phân tử, Trường Đại học Y dược Cần Thơ; Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ và đơn vị xét nghiệm-miễn dịch, Bệnh viện Chợ Rẫy. 3.2 Phương tiện và phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất: Nghiên cứu sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất để thực hiện các kỹ thuật 6
10. tách chiết DNA, kỹ thuật PCR và điện di; kỹ thuật giải trình tự trên hệ thống máy giải trình tự tự động; kỹ thuật PCR-SSO. 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang phân tích 3.2.2.2 Cở mẫu và phương pháp chọn mẫu - Mục tiêu 1: + Áp dụng công thức ước lượng cho một tỷ lệ để tính cở mẫu cho mục tiêu 1: Trong đó: α là xác suất sai lầm loại 1, chọn α = 0,05 Z: trị số từ phân phối chuẩn p: Tỷ lệ phát hiện đột biến gen LMP1 EBV ở mô sinh thiết vòm họng bằng kỹ thuật PCR là 90% (theo Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi và ctv., 2003). d: sai số tương đối, chọn d = 0,06. Tính ra cở mẫu nghiên cứu là 96 mẫu, làm tròn thành 100 mẫu nghiên cứu. Trong thực tế, luận án đã nghiên cứu là 108 trường hợp. + Chọn mẫu toàn bộ thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu - Mục tiêu 2: + Mẫu BN: cở mẫu 30 BN UTVMH nghiên cứu có sự hiện diện gen LMP1 EBV (mục tiêu 1); chọn ngẫu nhiên đơn. + Mẫu đối chứng: Thu thập kết quả định type HLA từ 30 người bình thường khỏe mạnh, thực hiện xét nghiệm gen HLA tại Bệnh viện Truyền máu huyết học Thành phố Hồ Chí Minh với mục đích hiến tạng; chọn ngẫu nhiên đơn từ kết quả lưu trữ, 7
11. thỏa điều kiện (cùng kỹ thuật xác định alen HLA, tương đương về tuổi, giới tính và nơi cư trú với BN nghiên cứu). 3.2.2.3 Nội dung nghiên cứu a) Nội dung nghiên cứu 1: đặc điểm chung của ĐTNC - Các biến số nghiên cứu cần thu thập: giới tính; nhóm tuổi; dân tộc; nơi cư trú; nghề nghiệp; giai đoạn bệnh; loại mẫu mô sinh thiết; thể mô bệnh học. - Cách thu thập thông tin: phỏng vấn trực tiếp người bệnh hoặc thu thập các thông tin trên của ĐTNC từ bệnh án, ghi nhận vào Bảng thu thập số liệu. b) Nội dung nghiên cứu 2 (mục tiêu 1): - Tần suất hiện diện gen LMP1 EBV: + Hiện diện gen LMP1: là ghi nhận sự có mặt của gen LMP1 EBV ở chuỗi DNA tách chiết từ các tế bào biểu mô ung thư vòm mũi họng (mô sinh thiết vòm) của bệnh nhân đã được xác chẩn UTVMH bằng mô bệnh học, thông qua kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen LMP1 EBV. + Tỷ lệ hiện diện gen LMP1: là tỷ lệ % số mẫu mô sinh thiết được phát hiện có gen LMP1 EBV trên tổng số mẫu mô sinh thiết được nghiên cứu. + Thực hiện kỹ thuật PCR: quy trình gồm các bước sau: (1) Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô sinh thiết bằng bộ kit Invisorb® Spin Tissue Mini Kit. Kết quả DNA sau tách chiết được đo nồng độ DNA (OD260) và đánh giá độ tinh khiết của DNA bằng chỉ số OD260/OD280 (1,6-2,1) trên hệ thống máy BioDrop. (2) Thực hiện phản ứng PCR: Trình tự cặp mồi LMP1: 168373: 5’-CTA GCG ACT CTG CTG GAA AT-3’; 168174: 8
12. 5’-CGC GGA TCC TTA GTC ATA GTA GCT TAG-3’ (Phạm Thị Nguyệt Hằng và ctv., 2003). Thành phần phản ứng PCR: 2,5µl DNA, 3µl dNTPs, 1µl mỗi mồi, 3µl MgCl2, 0,5µl Taq DNA polymerase, 5µl Buffer và 34µl nước cất. Tổng thể tích là 50µl. Chu trình nhiệt: 950C/7 phút; 35 chu kỳ: 940C/1 phút 30 giây, 550C/1 phút, 720C/1 phút 30 giây; 720C/7 phút. Điện di 9µl sản phẩm PCR trên gel agarose 2% trong đệm TBE 1x, điện thế 50 V, thời gian 1 giờ. Sản phẩm PCR LMP1 của mẫu nghiên cứu dương tính (có gen LMP1 EBV) khi có một vạch điện di trên gel với kích thước 230 bp hoặc 200 bp. - Đột biến gen LMP1 EBV: + Đột biến gen LMP1 EBV: là sự thay đổi trình tự nucleotide trên gen LMP1 EBV hiện diện ở mẫu mô sinh thiết vòm của BN UTVMH, so với trình tự nucleotid trên gen LMP1 EBV của chủng EBV B95-8 (Genbank V01555). + Tỷ lệ đột biến gen LMP1 EBV: là tỷ lệ % các kiểu đột biến trên gen LMP1 EBV được phát hiện ở mẫu mô sinh thiết vòm, trên tổng số mẫu mô sinh thiết nghiên cứu có hiện diện gen LMP1 EBV. + Phát hiện đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 EBV bằng kỹ thuật PCR và điện di: Trên hình ảnh điện di, phát hiện sản phẩm khuếch đại có vạch điện di tương ứng với kích thước 230 bp hoặc 200 bp. Theo Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi và ctv., (2003), sản phẩm có kích thước 230 bp là sản phẩm tương ứng với gen LMP1 EBV, còn sản phẩm có kích thước 200 bp là sản phẩm có khả năng đột biến mất đoạn 30 bp của gen LMP1 EBV. 9
13. + Phát hiện đột biến gen LMP1 EBV bằng kỹ thuật giải trình tự đoạn gen LMP1 EBV: Chọn mẫu ngẫu nhiên đơn (n = 33) có LMP1 EBV (+) và có kết quả là một vạch điện di rõ nét, gửi đến phòng thí nghiệm First BASE Laboratory tại Malaysia, thực hiện kỹ thuật giải trình tự gen bằng hệ thống máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3730xl Genetic Analyzer. Phân tích kết quả bằng phần mềm BioEdit Sequence Alignment Editor và phần mềm Geneious/Bioinformatics solutions for the analysis of molecular sequence data. c) Nội dung nghiên cứu 3 (mục tiêu 2): Tần suất type gen HLA phổ biến ở BN UTVMH nghiên cứu - Nghiên cứu chỉ khảo sát gen HLA lớp I (locus HLA-A, HLA-B) và lớp II (locus HLA-DR, HLA-DQ). - Tần suất alen gen HLA được ghi nhận là sự xuất hiện một alen HLA nào đó với tỷ lệ cao so với sự xuất hiện các alen HLA khác, trong tổng các alen HLA ở một locus gen HLA khảo sát. - Thực hiện kỹ thuật PCR-SSO trên hệ thống máy LABScan3DTM (Luminex FLEXMAP 3D), với hóa chất LABTypeTMXR and CWD Typing Test tại đơn vị xét nghiệm- miễn dịch, bệnh viện Chợ Rẫy. Kết quả alen HLA của mẫu máu nghiên cứu được phân tích bằng phần mềm HLA Fusion™ LABType®. - Kết quả về tần suất gen HLA ở bệnh nhân UTVMH được chúng tôi so sánh với kết quả phân tích gen HLA của 30 người chứng bình thường để đối chiếu. d) Nội dung nghiên cứu 4 (mục tiêu 3) Để tìm hiểu về giá trị của đột biến gen LMP1 EBV và gen HLA trong chẩn đoán xác định bệnh UTVMH, chúng tôi phân 10
14. tích và kiểm định chi-square về mối liên quan giữa hai nhóm BN có và không có đột biến mất đoạn 30 bp trên gen LMP1 EBV. Đồng thời, phân tích và kiểm định chi-square về mối liên quan giữa hai nhóm bệnh nhân có và không có xuất hiện các alen HLA được ghi nhận là nhạy cảm với bệnh UTVMH. 3.2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu và phân tích thống kê Dữ liệu nghiên cứu được ghi nhận và xử lý bằng bảng thu thập số liệu; chương trình EpiData 3.1; phần mềm SPSS 20.0; thuật toán thống kê mô tả; chi-square test (test 2); tỷ suất chênh OR (Odds ratio); độ nhạy và độ đặc hiệu của haplotype HLA. 11
15. Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu - Giới tính: Nam giới chiếm đa số (67,6%). Tỷ lệ nam/nữ là 2,1/1. - Nhóm tuổi mắc bệnh cao nhất là 41-60 tuổi (56,5%); độ tuổi mắc bệnh trung bình là 50,73 ± 13,3; nhỏ nhất là 9 tuổi và lớn nhất là 81 tuổi. - Dân tộc Kinh chiếm phần lớn trong các BN nghiên cứu (92,6%), kế đến là dân tộc Khơ me (6,5%), Hoa (0,9%) và không có dân tộc Chăm. - Nơi cư trú: Cần Thơ chiếm tỷ lệ cao nhất (37%), kế đến là Hậu Giang (26,9%), Sóc Trăng (21,3%), Vĩnh Long (10,2%) và thấp dần là các tỉnh Trà Vinh, Bạc Liêu, An Giang, Kiên Giang. - Nghề nghiệp: Đa số bệnh nhân UTVMH là nông dân (76,8%). - Trong 108 mẫu nghiên cứu, có 10 mẫu nghiên cứu không đủ dữ kiện để đánh giá giai đoạn của bệnh theo T, N, M, vì thế đặc điểm này chúng tôi chỉ khảo sát trên 98 mẫu nghiên cứu: giai đoạn III (46,9%), IV (32,7%), II (18,4%) và I (2,0%). - Tỷ lệ mẫu mô vùi trong nến parafin là 64,8% (70/108) và 35,2% (38/108) là mẫu mô sinh thiết tươi. - Có 2 thể mô bệnh học được ghi nhận trong 108 mẫu mô thu được: Ung thư tế bào biểu mô gai không sừng hóa 62% (67/108) và ung thư tế bào biểu mô không biệt hóa 38% (41/108). 12
16. 4.2 Tỷ lệ hiện diện gen LMP1 ở mẫu mô sinh thiết vòm UTVMH M 1 2 3 4 5 6 Giếng M: Thang chuẩn 100 bp Giếng 1 (mẫu 001): LMP1 (-) Giếng 2 (mẫu 010): LMP1 (+) 230 bp Giếng 3 (mẫu 005): LMP1 (+) 200 bp Giếng 4 (mẫu 009): LMP1 (-) Giếng 5 (mẫu 014): LMP1 (-) 230 bp 200 bp Giếng 6 (nước cất - d2 H2O): (-) 200 bp Hình 4.1: Hình ảnh vạch điện di có sự hiện diện gen LMP1 EBV trong mẫu nghiên cứu - Từ kết quả Hình 4.1, chúng tôi tính được tỷ lệ hiện hiện gen LMP1 EBV trong mẫu mô sinh thiết của BN UTVMH nghiên cứu là 64,8% (70/108) và tỷ lệ không có sự hiện diện gen LMP1 EBV là 35,2% (38/108) (Biểu đồ 4.1). So sánh với kết quả các nghiên cứu trong và ngoài nước có cùng phương pháp khảo sát (kỹ thuật PCR cổ điển với thiết kế mồi ở vị trí của gen LMP1), chúng tôi nhận thấy có sự khác nhau tùy theo khu vực địa lý: Kết quả của chúng tôi cao hơn của tác giả Lê Thanh Hà và ctv., (2014) (53,1%); Hussain et al., (2015) (61,3%) nhưng lại thấp hơn Adam et al., (2011) (84,5%), Tan et al., (2003) (83%), Hui et al., (2008) (81%). Sự khác biệt này, theo chúng tôi, có thể do sự khác nhau về loại mẫu mô đưa vào nghiên cứu. 13
17. Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm của BN UTVMH nghiên cứu (n = 108) - Tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm theo một số đặc điểm chung của BN UTVMH nghiên cứu: + Về đặc tính sinh học: tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV trên mô sinh thiết vòm của BN UTVMH không có sự khác biệt ở hai giới (nam, nữ), cũng như không khác biệt ở các nhóm tuổi (< 40 tuổi, ≥ 40 tuổi) và giai đoạn bệnh (sớm, muộn) của BN. Nhận định này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu khác. + Về loại mẫu mô sinh thiết: mặc dù tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV ở mẫu mô tươi là 76,3% (29/38) cao hơn so với tỷ lệ biểu lộ gen LMP1 EBV ở mẫu mô vùi trong nến parafin là 58,6% (41/70), tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p = 0,065, có nghĩa là tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV từ 2 loại mẫu được xem là như nhau. Tuy nhiên, để có nhận định chính xác hơn về điều này cần nghiên cứu thêm ở cở mẫu lớn hơn. 14
18. + Về thể mô bệnh học: tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV ở thể ung thư tế bào biểu mô không biệt hóa là 68,3% (28/41) cao hơn tỷ lệ hiện diện gen này ở thể ung thư tế bào biểu mô gai không sừng hóa là 62,7% (42/67) nhưng sự khác biệt này cũng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). 4.3 Tỷ lệ các loại đột biến gen LMP1 ở mẫu mô sinh thiết vòm của BN UTVMH nghiên cứu 4.3.1 Bằng kỹ thuật PCR và điện di: Trong 70 mẫu mô sinh thiết vòm của bệnh nhân có gen LMP1 EBV (+), bằng kỹ thuật điện di chúng tôi đã phát hiện 27,1% (19/70) sản phẩm khuếch đại có kích thước 230 bp và 72,9% (51/70) sản phẩm khuếch đại có kích thước 200 bp. Như vậy, chúng tôi đã phát hiện 72,9% trường hợp có thể có đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 EBV. Tương tự, khi so sánh với các nghiên cứu trước trong và ngoài nước, chúng tôi nhận thấy: kết quả của chúng tôi cao hơn của tác giả Nurhantari et al., (2003) (25,5%); Zhang et al., (2004) (51,51%); Hui et al., (2008) (55,9%); Boutheina et al., (2006) (66,67%) nhưng lại thấp hơn Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi và ctv, (2003) (90%); Zhang et al., (2002) (84%); Tan et al., (2003) (84%); Dardari et al., (2006) (84%). Sự khác biệt này có thể do sự khác nhau về loại mẫu mô đưa vào nghiên cứu và tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV ở các thể mô bệnh học của BN UTVMH. 4.3.2 Bằng kỹ thuật giải trình tự gen: Trong tổng số 70 mẫu có sự hiện diện gen LMP1 EBV, chúng tôi chọn ngẫu nhiên đơn 33 mẫu có một vạch điện di rõ nét, bao gồm 25 mẫu có kích thước 200 bp và 8 mẫu có kích thước 230 bp (24,25%) để xác định 15
19. kiểu đột biến của gen LMP1 EBV bằng kỹ thuật giải trình tự. Kết quả như sau: Hình 4.2: Kết quả đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 EBV ở mẫu 111 (so với chủng B95-8 (V01555) tại vị trí 168266-168295) - Tỷ lệ đột biến mất đoạn 30 bp tại vị trí 168266-168295 75,8% (25/33) và 24,2% (8/33) không phát hiện kiểu đột biến mất đoạn 30 bp. - Vị trí mất đoạn 30 bp của gen LMP1 EBV là 168266- 168295, thuộc vùng gen exon 3 của LMP1 EBV (168965- 168163), mã hóa cho 10 acid amin từ 343-352 liên quan đến vùng TES2 (313-386) ở đoạn carboxyl của phân tử LMP1 EBV. Dẫn đến khả năng mất tính quyết định kháng nguyên (epitope) của phân tử LMP1 EBV và đoạn này rất quan trọng để giúp tế bào T CD4 nhận biết kháng nguyên và kết quả là EBV tránh sự nhận diện của các tế bào miễn dịch chống ung thư. 16
20. Hình 4.3: Kết quả không có đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 EBV ở mẫu 135 (so với chủng B95-8 (V01555) tại vị trí 168266-168295) nhưng có sự thay đổi nucleotide tại vị trí 168295 (T>A) - Chúng tôi phát hiện thêm một số thay đổi nucleotide: 168295 T>A (8/8), 168225 A>T (33/33), 168308 A>G (33/33), 168320 T>C hay T>G (1/33) (32/33); riêng mẫu 192 có thêm 1 nucleotid (168268 và 168269) (GC → GTC), thêm 2 nucleotide (168276 và 168277) (CA → CGAA), nên tổng chiều dài của đoạn này lên đến 33 bp thay vì 30 bp (phát hiện mới của nghiên cứu). 4.4 Tần suất alen của các gen HLA ở BN UTVMH nghiên cứu 4.4.1 Tần suất alen của các gen HLA lớp I - Phát hiện được 7 loại alen HLA-A, trong đó, -A*02 (40,4%), -A*11 (21,2%) và -A*24 (21,2%) là những alen có tần suất xuất hiện cao, đặc biệt là alen -A*02 có tần suất cao nhất trên BN UTVMH nghiên cứu. Sự khác biệt giữa các alen HLA-A của nhóm bệnh so với nhóm chứng chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). 17
21. 40,4% 21,2% 21,2% 9,6% Biểu đồ 4.2: Tần suất các alen HLA-A ở nhóm bệnh và nhóm chứng 25% 23,1% 9,6% 7,7% Biểu đồ 4.3: Tần suất các alen HLA-B ở nhóm bệnh và nhóm chứng - Phát hiện được 16 loại alen HLA-B, trong đó, các alen có tần suất xuất hiện cao lần lượt là -B*15 (25%), -B*46 (23,1%), -B*38 (9,6%) và -B*07 (7,7%). Tương tự sự khác 18
22. biệt giữa các alen HLA-B của nhóm bệnh so với nhóm chứng chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). 4.4.2 Tần suất alen của các gen HLA lớp II 17,3% 13,8% 12,1% 12,1% 12,1% Biểu đồ 4.4: Tần suất các alen HLA-DRB1 ở nhóm bệnh và nhóm chứng - Phát hiện được 12 loại alen HLA-DRB1 và - DRB1*12 (17,3%), -DRB1*09 (13,8%), -DRB1*04 (12,1%), -DRB1*08 (12,1%), -DRB1*15 (12,1%) là các alen có tần suất xuất hiện cao ở nhóm bệnh. Đặc biệt, alen -DRB1*08 là alen làm tăng nguy cơ mắc bệnh UTVMH với (OR = 8,098, p = 0,025) và ngược lại, alen -DRB1*12 lại là alen làm giảm nguy cơ mắc bệnh UTVMH với (OR = 0,335, p = 0,011). - Phát hiện được 5 loại alen HLA-DQB1 và 5 loại alen HLA- DQA1 với các alen có tần suất xuất hiện cao là HLA-DQB1*03 (44,7%), -DQB1*05 (21,4%) và -DQB1*06 (17,9%); HLA- DQA1*01 (35,7%), -DQA1*03 (28,6%) và -DQA1*06 (21,4%). 19
23. Tương tự, alen DQB1*03 cũng là alen làm giảm nguy cơ mắc bệnh UTVMH với (OR = 0,367, p = 0,014). 4.4.4 Tần suất các haplotype HLA xuất hiện ở BN nghiên cứu - Tần suất các haplotype A*02-B*15, A*24-B*46 và A*11- B*46; DRB1*08-DQB1*03, DRB1*15-DQB1*05 ở nhóm bệnh xuất hiện cao hơn so với nhóm chứng. Ngược lại, một số haplotype A*02-B*46 và A*11-B*15; DRB1*09-DQB1*03, DRB1*12-DQB1*03 ở nhóm chứng lại xuất hiện cao hơn so với nhóm bệnh, tuy nhiên sự khác biệt này chưa có ý nghĩa. 4.5 Giá trị của đột biến gen LMP1 EBV và tần suất các alen HLA trong chẩn đoán bệnh UTVMH 4.5.1 Liên quan giữa tỷ lệ đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 EBV với giai đoạn bệnh, thể mô bệnh học và tần suất các alen HLA ở BN UTVMH nghiên cứu - Chưa tìm thấy sự khác biệt giữa đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 EBV với giai đoạn bệnh (p > 0,05). - Tỷ lệ đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 EBV ở thể mô bệnh học ung thư tế bào biểu mô không biệt hóa (85,7%) cao hơn so với tỷ lệ của đột biến này ở thể ung thư tế bào biểu mô gai không sừng hóa (64,3%) và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê, với p = 0,048. - Trong tất cả các alen HLA xuất hiện cao ở BN nghiên cứu, chúng tôi ghi nhận được mối liên quan giữa tỷ lệ đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 EBV với tỷ lệ xuất hiện alen HLA-B*15 ở BN UTVMH. Người mang alen HLA-B*15 có nguy cơ đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 EBV cao gấp 4,6 lần so với những người không mang alen này (OR = 4,640, p = 0,018), còn các alen khác chưa thấy có sự khác biệt. 20
24. 4.5.2 Liên quan giữa tần suất các alen HLA với giai đoạn bệnh, thể mô bệnh học ở BN nghiên cứu - Trong tất cả các alen HLA xuất hiện ở BN nghiên cứu, chỉ có HLA-A*02 là có sự khác biệt giữa hai nhóm thể mô bệnh học không biệt hóa và không sừng hóa có ý nghĩa thống kê (p = 0,034), còn các alen khác chưa thấy có sự khác biệt. - Tương tự, trong tất cả các alen HLA xuất hiện ở BN nghiên cứu, chỉ có HLA-B*15 làm giảm 12,2% nguy cơ mắc UTVMH ở giai đoạn muộn trên bệnh nhân nghiên cứu. Sự xuất hiện alen HLA-DQA1*03 có thể là yếu tố làm giảm 17,8% nguy cơ mắc UTVMH ở giai đoạn muộn trên bệnh nhân nghiên cứu, còn các alen khác chưa thấy có sự khác biệt. 4.5.3 Độ nhạy, độ đặc hiệu của một số haplotype HLA trong chẩn đoán bệnh UTVMH: Các haplotype HLA có độ đặc hiệu cao với bệnh UTVMH lần lượt là A*11-B*46, A*24-B*46, DRB1*08-DQB1*03, DRB1*15-DQB1*05 và A*02-B*46. 21
25. Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 5.1.1 Tỷ lệ hiện diện gen và đột biến gen LMP1 EBV trên mẫu mô sinh thiết vòm của BN UTVMH nghiên cứu - Tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm của bệnh nhân UTVMH nghiên cứu là 64,8%. Mô sinh thiết tươi cho tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV cao hơn (76,3%) so với mô sinh thiết vùi nến parafin. Tỷ lệ hiện diện gen ở thể mô ung thư tế bào biểu mô không biệt hóa là 68,3%. - Tỷ lệ đột biến mất đoạn 30 bp của gen LMP1 EBV trên mẫu mô sinh thiết vòm của BN UTVMH nghiên cứu bằng kỹ thuật khuếch đại gen là 72,9%. Tỷ lệ đột biến mất đoạn 30 bp của gen LMP1 EBV trên mẫu mô sinh thiết vòm bằng kỹ thuật giải trình tự là 75,8%; có 24,2% mẫu mô có biểu lộ gen LMP1 EBV nhưng không có đột biến mất đoạn 30 bp. Vị trí đột biến mất đoạn 30 bp trên gen LMP1 EBV là 168266 - 168295, mã hóa cho 10 acid amin 343-350 (vị trí của TES2 của CTAR2 của phân tử LMP1 EBV). 5.1.2 Tần suất alen HLA của BN UTVMH nghiên cứu - Đối với HLA lớp I: Tìm thấy 7 loại alen HLA-A và 16 loại alen HLA-B với tần suất alen HLA-A và HLA-B xuất hiện cao của BN UTVMH nghiên cứu lần lượt là -A*02 (40,4%), -A*11 (21,2%), -A*24 (21,2%) và -B*15 (25%), -B*46 (23,1%), - B*38 (9,6%), -B*07 (7,7%). - Đối với HLA lớp II: + Tìm thấy 12 loại alen HLA-DRB1, 5 loại alen HLA-DQB1 và 5 loại HLA-DQA1 với tần suất alen HLA-DRB1, HLA-DQB1 22
26. và HLA-DQA1 xuất hiện cao của BN UTVMH nghiên cứu lần lượt là -DRB1*12 (17,3%) và -DRB1*09 (13,8%); -DQB1*03 (44,7%), -DQB1*05 (21,4%) và -DQB1*06 (17,9%); -DQA1*01 (35,7%), -DQA1*03 (28,6%) và -DQA1*06 (21,4%). + Người mang alen -DRB1*08 có nguy cơ mắc bệnh UTVMH cao gấp 8 lần người bình thường (OR = 8,098, p 0,05). Người mang alen HLA-B*15 có nguy cơ đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 EBV cao gấp 4,6 lần so với những người không mang alen này. - Tần suất alen HLA-A*02 xuất hiện liên quan với thể mô bệnh học ung thư tế bào biểu mô không biệt hóa (p < 0,05). Sự xuất hiện alen HLA-B*15 và HLA-DQA1*03 làm giảm 12,2% và 17,8% nguy cơ mắc UTVMH ở giai đoạn muộn trên bệnh nhân nghiên cứu. - Một số haplotype HLA có độ đặc hiệu cao với bệnh UTVMH là A*11 -B*46, A*24 - B*46, DRB1*08 - DQB1*03, DRB1*15 - DQB1*05 (98,33%) và A*02 - B*46 (93,33%). 23
27. 5.2 KIẾN NGHỊ - Cần tiếp tục nghiên cứu việc ứng dụng kỹ thuật khuếch đại gen LMP1 EBV và điện di sản phẩm khuếch đại (230 bp, 200 bp) trong phát hiện đột biến mất đoạn 30 bp ở BN nghi ngờ UTVMH, góp phần phát hiện sớm bệnh UTVMH. - Cần tiếp tục nghiên cứu về các kiểu đột biến khác ngoài đột biến mất đoạn 30 bp trên gen LMP1 EBV của BN UTVMH thuộc vùng Đồng bằng sông Cửu Long. - Cần thực hiện nghiên cứu với cở mẫu lớn hơn và đi sâu phân tích về các alen HLA liên quan đến vai trò trình diện nhóm quyết định kháng nguyên (epitope) của LMP1 EBV với từng alen HLA lớp I và lớp II trong bệnh sinh học UTVMH. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Diệu, 2011. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng ung thư vòm mũi họng tại bệnh viện K năm 2009. Tạp chí Y học thực hành (751)-Số 2/2011. 24-27. Bùi Diệu, 2012. Ung thư vòm mũi họng. Trong: Nguyễn Thị Xuyên (Chủ biên). Giới thiệu một số bệnh ung thư thường gặp. Hà Nội. 31-47. Dardari, R., K. Meriem, C. Paulo, O. Mohieddine, E. Brahim, H. Mohammad and J. Menezes, 2006. High frequency of latent membrane protein-1 30-bp deletion variant with specific single mutaions in Epstein-Barr-associated nasopharyngeal carcinoma in Moroccan patients. Int. J. Cancer, Vol. 118 (8). 1977-1983. 24
28. Hui, S.S., Y.Y. Yap, W.K. Yip and H.F. Seow, 2008. Epstein- Barr virus latent membrane protein-1 (LMP-1) 30-bp delection and XhoI-loss is associated with type III nasopharyngeal carcinoma in Malaysia. Word Journal of surgical oncology, Vol. 6 (18). 6-18. DOI:10.1186/1477- 7819-6-18. Kang, M.S., E. and E. Kieff, 2015. Epstein-Barr Virus latent genes. Experimental & Molecular Medicine, Vol. 47: e131. 1-16. DOI:10.1038/emm.2014.84. Nguyen-Van D, Enrberg I and Phan-Thi Phi P., 2008. Epstein Barr virus genetic variation in Vietnamese patinets with Nasopharyngeal carcinoma: full-length analysis of LMP 1. Virus Genes. Vol. 37 (2). 273-281. Nurhantari, Y., N. Emoto, P. Rahayu and M. Matsuo, 2003. Nasopharyngeal carcinoma in Indonesia has a low prevalence of the 30-base pair deletion of Epstein-Barr virus latent membrane protein 1. Southeast Asia J Trop Med Public Health. Vol. 34 (1). 98-105. Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi, Nguyễn Văn Đô, Bạch Khánh Hòa và Trần Thị Chính, 2003. Tần suất và sự đột biến mất đoạn gien LMP 1 ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng. Tạp chí nghiên cứu Y học, Bộ Y tế-Đại học Y Hà Nội, volume 23, số 3. Phan Thị Phi Phi, 2007. Vai trò các yếu tố di truyền trong đáp ứng miễn dịch và Cơ chế chống virus của các hạt trong tế bào Tc gây độc. Trong: Phan Thị Phi Phi (Chủ biên), Một 25
29. số vấn đề y sinh học cập nhật cho bác sĩ. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 151-193. Su, W.H., A. Hildesheim and Y.S. Chang, 2013. Human leukocyte antigens and Epstein-Barr Virus-association nasophagyngeal carcinoma: old association offer new clues into the role of immunity in infection-associated cancers. Frontiers in oncology, Vol. 3 (299). 1-9. Tan, E.L., S.C. Peh and C.K. Sam, 2003. Analyses of Epstein- Barr virus latent membrane protein-1 in Malaysian from nasopharyngeal carcinoma: high prevalence of 30-bp deletion, Xho1 polymorphism and evidence of dual infections. Journal of medical virology, Vol. 69. 251-257. Tang, Y.L., J.H. Lu, L. Cao, M.H. Wu, S.P. Peng, H.D. Zhou, C. Huang, Y.X. Yang, Y.H. Zhou, Q. Chen, X.L. Li, M. Zhou and G.Y Li, 2008. Genetic variations of EBV-LMP 1 from nasopharyngeal carcinoma biopsies: potential loss of T cell epitopes. Brazilian Journal of Medicine and Biological Research, Vol. 41. 110-116. Trần Ngọc Dung, 2000. Nghiên cứu các thông số miễn dịch- sinh học giúp tiên lượng, phát triển sớm tái phát ung thư vòm họng và kết hợp viên M sau xạ trị nhằm giảm tái phát. Luận án tiến sĩ Y học. Đại học Y Hà Nội. Hà Nội. Wang, R. and X. Wang, 2014. Association analysis between HLA-A, -B, -C-DRB1, and -DQB1 with nasopharyngeal carcinoma among a Han population in Northwestern China. Human Immunology, Vol. 75 (3). 197-202. 26
30. Yu, K.J., X. Gao, C.J. Chen, X. Yang, S.R. Diehl, A. Goldstein, W.L. Hsu, X. Liang, D. Marti, M.Y. Liu. J.Y. Chen, M. Carrington and A. Hildesheim, 2009. Association of human leukocyte antigen (HLA) with nasopharyngeal carcinoma (NPC) in high-risk multiplex families in Taiwan. Hum Immunol, Vol. 70 (11). 910-914. Zhang, M., Y.S. Zong, J.H. He, S.X. Lin, B.L. Zhong and Y.J. Liang, 2004. Comparison of Epstein-Barr virus infection of 30 bp-deleted gene among four histological types of nasopharyngeal carcinoma. Chinese medical journal, Vol. 117 (4). 608-611. Zhang, X.S., K.H. Song, H.Q. Mai, W.H. Jia, B.J. Feng, J.C. Xia, R.H. Zhang, L.X. Huang, X.J. Yu, Q.S Feng, P. Huang, J.J. Chen and Y.X. Zeng, 2002. The 30-deletion variant: a polymorphism of latent membrane protein 1 prevalent in endemic and non-endemic areas of nasopharyngeal carcinomas in China. Cancer letters, Vol. 176. 65-73. 27