Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam

1. 1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết của đề tài Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những cây trồng quan trọng trong chương trình an ninh lương thực thế giới chỉ sau ngô, lúa mỳ và gạo. Theo thống kê của tổ chức Nông lương thế giới (FAOSTAT, 2019), diện tích khoai tây trên thế giới năm 2017 đạt 19,30 triệu ha, năng suất trung bình đạt 20,11 tấn/ha, với tổng sản lượng 388,2 triệu tấn. Tại Việt Nam, khoai tây là cây trồng lý tưởng cho vụ Đông ở Đồng bằng Sông Hồng, tuy nhiên diện tích trồng hiện nay của cả nước chỉ là 20.480 ha với năng suất 14,8 tấn/ha, sản lượng 303 nghìn tấn (FAOSAT, 2017). Có nhiều nguyên nhân cả về mặt kinh tế lẫn kỹ thuật dẫn đến sự hạn chế phát triển khoai tây ở Việt Nam. Về mặt kinh tế, nguyên nhân chính là do trồng khoai tây kém hiệu quả so với các cây trồng khác và đầu ra hạn chế. Về mặt kỹ thuật, nguyên nhân chủ yếu là do hiện tượng thoái hóa giống gây ra do virus. Bệnh virus hại khoai tây rất phổ biến, dễ lan truyền thông qua môi giới truyền bệnh. Khoai tây được trồng và nhân giống bằng củ, khi cây bị nhiễm virus toàn bộ củ cũng bị lây nhiễm. Đây chính là hiện tượng thoái hóa giống khoai tây gây ra do virus. Có nhiều loại virus hại khoai tây, trong đó PVY là một trong 10 loại virus phổ biến gây tổn thất năng suất nghiêm trọng nhất trong các nước nhiệt đới trồng khoai tây. Việc sản xuất giống sạch virus phải qua nhiều công đoạn phức tạp như nuôi cấy mô nguyên liệu sạch bệnh, nhân và trồng vật liệu trong điều kiện cách ly, sản xuất củ giống ở các vùng chuyên sản xuất giống rất tốn kém. Trong các giải pháp khắc phục bệnh virus, có thể nói biện pháp hiệu quả và có tính bền vững nhất là việc tạo và sử dụng giống kháng virus. Phương pháp chọn tạo giống khoai tây kinh điển là phương pháp lai tạo. Phương pháp này vấp phải những khó khăn về mặt di truyền do bộ NST của khoai tây là tứ bội (2n=4x=48). Bộ genome tứ bội tạo ra tỷ lệ phân ly lớn sau lai tạo, quá trình chọn lọc gặp khó khăn với một quần thể rất lớn trước khi tìm được một con lai có tính trạng mong muốn để phát triển thành giống. Thông thường tạo ra một giống khoai tây mới thời gian chọn lọc đòi hỏi 10-12 năm. Chuyển gen kháng bệnh, gen mang các tính trạng mong muốn vào cây trồng cũng đã và đang được áp dụng trong chương trình chọn tạo giống của nhiều cây trồng. Công nghệ này có thể rút ngắn thời gian chọn tạo giống khoai tây so với phương pháp chọn tạo giống kinh điển. Tuy nhiên, do những lo ngại về an toàn sinh học của các thể GMO nên hiện nay kỹ thuật chuyển gen đang là vấn đề còn nhiều tranh luận. Trước bối cảnh này, việc sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để có thể chuyển và tích hợp các gen mong muốn nổi lên như một giải pháp có tính khả thi cao. Dung hợp tế bào trần trong tạo giống khoai tây đã được Wenzel et al., vào năm 1979 trải qua hơn 40 năm phát triển, kỹ thuật này đang ngày một hoàn thiện. Với kỹ thuật này có thể i) tạo ra các con lai soma có thể duy trì những tính trạng mong muốn cho đời sau và là nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống, ii) chuyển 1 gen hoặc tích hợp nhiều gen từ các vật liệu dung hợp, iii) tái tổ hợp được genome nhân tế bào và tế bào chất, iv) tránh được những luật lệ liên quan đến chuyển gen. Nhằm góp phần nghiên cứu tạo giống khoai tây mang tính kháng bệnh virus PVY, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần để chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam” đã được thực hiện. Mục tiêu của đề tài Ứng dụng thành công kỹ thuật tách, dung hợp, nuôi cấy tái sinh tế bào trần, xác định con lai soma, chọn lọc con lai backcross (BC) để tạo nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY có đặc tính nông sinh học mong muốn. Ý nghĩa khoa học của đề tài Đề tài đã chứng minh và góp phần khẳng định khả năng duy trì tính kháng virus và cải thiện đặc tính nông sinh học của các dòng nhị bội qua dung hợp tế bào trần và khả năng
2. 2 chuyển đặc tính kháng bệnh virus PVY từ các loài khoai tây dại Solanum tarnii, Solanum pinatisectum, Solanum bulbocastanum sang khoai tây trồng tứ bội Solanum tuberosum khi dung hợp tế bào trần. Con lai soma có thể làm vật liệu khởi đầu trong công tác chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh virus và mang đặc tính nông sinh học mong muốn. Đây là những dẫn liệu khoa học quý, mới mẻ phục vụ nghiên cứu, giảng dạy công nghệ tế bào thực vật, công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài luận án đã tạo ra các dòng khoai tây 47/7, 47/26, 81-2, 131/11 là sản phẩm dung hợp của hai dòng nhị bội Solanum tuberosum và các dòng BC1 13.1300.3; BC1 13.1305.6 là sản phẩm lai lại của con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng. Các dòng này vừa có khả năng kháng bệnh virus, vừa mang các đặc tính nông sinh học quí có thể sử dụng cho chương trình tạo giống khoai tây kháng virus có năng suất cao, phẩm chất tốt. Ngoài ra, đề tài cũng hình thành được quy trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY, mang được những đặc tính nông sinh học mong muốn thông qua việc sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần. Những đóng góp mới của đề tài • Khẳng định được các thông số tách, nuôi cấy, dung hợp, tái sinh, xác định con lai soma phục vụ cho các nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào trần trên các vật liệu khoai tây nhị bội (A15, A16, A56, B186, B208), khoai tây dại (S. tarnii, S. pinatisectum, S. bulbocastanum) và khoai tây tứ bội (Rasant, Delikat, Atlantic). • Chứng minh và góp phần khẳng định được khả năng duy trì tính kháng bệnh virus PVY từ các dòng nhị bội của khoai tây trồng Solanum tuberosum và khả năng chuyển đặc tính kháng bệnh virus từ các loài khoai tây dại S. tarnii, S. pinatisectum, S, bulbocastanum sang khoai tây trồng tứ bội Solanum tuberosum qua dung hợp tế bào trần. • Đã tạo ra các dòng khoai tây 47/7, 47/26, 81-2, 131/11 là sản phẩm dung hợp của hai dòng nhị bội Solanum tuberosum và các dòng BC1 13.1300.3; BC1 13.1305.6 là sản phẩm lai lại của con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng. Các dòng này vừa có khả năng kháng bệnh virus PVY vừa mang các đặc tính nông sinh học quý có thể sử dụng cho chương trình tạo giống khoai tây kháng virus PVY có năng suất cao, phẩm chất tốt. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần Tổng quan tài liệu tập hợp tất cả các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề: tình hình sản xuất khoai tây; tìm hiểu về virus hại cây khoai tây và các hướng khắc phục; các phương pháp chọn tạo giống khoai tây kháng virus. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Bảng 2.1. Các vật liệu đã thu thập, nguồn gốc, độ bội và các tính trạng mong muốn phục vụ cho lai soma Dạng Ký Độ Nguồn gốc (Ngân hàng Các tính trạng mục tiêu Kiểu gen vật liệu hiệu bội gen, công ty, Viện NC) cho chọn tạo giống Solanum Khoai Ngân hàng gen Khoai tây pnt2G 2x Kháng PVY, mốc sương pinnatisectum tây dại quốc tế IPK, Đức Ngân hàng gen Khoai tây Solanum tarnii Khoai tây dại trn3G 2x Kháng PVY, mốc sương quốc tế IPK, Đức Solanum Khoai Ngân hàng gen Khoai tây blb2G 2x Kháng PVY, mốc sương bulbocastanum tây dại quốc tế IPK, Đức Atlantic Khoai tây trồng 4x Mỹ Năng suất, chất lượng Delikat Khoai tây trồng 4x Công Ty NORIKA, Đức Năng suất, chất lượng Rasant Khoai tây trồng 4x Công Ty NORIKA, Đức Năng suất, chất lượng A15 Dòng nhị bội 2x Viện nghiên cứu tài nguyên Kháng PVY, PVX
3. 3 Dạng Ký Độ Nguồn gốc (Ngân hàng Các tính trạng mục tiêu Kiểu gen vật liệu hiệu bội gen, công ty, Viện NC) cho chọn tạo giống cây trồng-Bavaria – Đức Viện nghiên cứu tài nguyên A16 Dòng nhị bội 2x Kháng PVY cây trồng-Bavaria- Đức Viện nghiên cứu tài nguyên A56 Dòng nhị bội 2x Kháng PVY, PVX cây trồng-Bavaria – Đức Viện nghiên cứu tài nguyên B186 Dòng nhị bội 2x Kháng PVY, PVX cây trồng-Bavaria - Đức Viện nghiên cứu tài nguyên B208 Dòng nhị bội 2x Kháng PVY, PVX cây trồng-Bavaria - Đức 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Nội dung 1: Xác định các thông số tối ưu cho quá trình dung hợp khoai tây từ các nguyên liệu nhị bội, tứ bội và khoai tây dại 2.2.2. Nội dung 2: Xác định và đánh giá các thể lai soma của các tổ hợp dung hợp khoai tây nhị bội 2.2.3. Nội dung 3: Xác định các thể lai soma của các tổ hợp dung hợp giữa khoai tây dại nhị bội và khoai tây trồng tứ bội. Đánh giá khả năng kháng PVY của chúng 2.2.4. Nội dung 4: Đánh giá con lai backcross (BC1) của thể lai soma (khoai tây dại và khoai tây trồng) với khoai tây trồng 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Tách tế bào trần Theo quy trình E.C.Cooking (1960) cải tiến theo Thach et al. (1993) và Thieme (1997) 2.3.2. Dung hợp tế bào trần • Trộn huyền phù tế bào trần của 2 dòng bố mẹ theo tỷ lệ 1:1 • Sử dụng máy xung điện (electrofusion machine) của công ty Krϋss, Đức. Đặt buồng dung hợp vào dưới kính hiển vi trong một tủ cấy vô trùng; hút 400 µm hỗn hợp tế bào trần trong dung dịch dung hợp (Fusion Solution) vào buồng xung điện. • Khởi động máy xung điện với các thông số như sau: Trường AC Xung Lần xung Trước-AC-Sau V kHz V µs No s s s 0,0 800-1000 120 10-15 2 2,0 10 20 Khi bật AC 18-20 800 120 10 2 2,0 10 20 • Sau một pha cực nhanh theo một chương trình đã được cài đặt sẵn, dưới tác dụng của luồng xung điện, các tế bào trần kết hợp với nhau (có thể quan sát được dưới kính hiển vi), khi chương trình ngừng lại, dùng pipet hút dịch tế bào trần vào đĩa petri (Ø = 3,5 cm) và bổ sung 1,8 ml môi trường nuôi: VKM II hoặc VKM II + BSA; quấn parafilm rồi đem nuôi cấy ở điều kiện 250C và tối. 2.3.3. Xác định con lai bằng đếm độ bội flow cytometry Phương pháp đánh giá độ bội bằng máy Cell Lab QuantaTM Flow cytometry theo phương pháp của Viện nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng (CHLB Đức). 2.3.4. Chiết tách DNA tổng số DNA tổng số của các mẫu được tách từ lá theo phương pháp CTAB cải tiến theo. 2.3.5. Xác định con lai bằng sinh học phân tử Khi sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi SSR không thể hiện sự đa hình giữa bố mẹ và con lai của chúng, tiếp tục sử dụng phản ứng SSR có gắn huỳnh quang (Biomers net GMbD cung
4. 4 cấp) và sử dụng hệ thống GenomeLab GeXP 8800 Beckman GenomeLab Coulters) để phân tích kết quả. 2.3.6. Lây nhiễm nhân tạo PVY Phương pháp lây nhiễm nhân tạo virus PVY theo mô tả của Kado (1972) và Hill (1984) 2.3.7. Kiểm tra gen kháng PVY của các con lai soma bằng chỉ thị phân tử Tính kháng bệnh virus PVY của các con lai soma được đánh giá bằng phương pháp chỉ thị phân tử CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic sequences). 2.3.8. Đánh giá các đặc tính nông sinh học Trong điều kiện chậu vại: Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (RCB) với 9 cây/lần lặp, thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Trên điều kiện đồng ruộng: Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (RCB) với 3 lần nhắc lại, diện tích mỗi ô thí nghiệm 30 m2. 2.3.9. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh. Phương pháp định lượng đường khử (phương pháp iod-Ixekutz); Phương pháp định lượng tinh bột; Phương pháp xác định hàm lượng chất khô. 2.3.10. Lai lại (backcross) giữa một số tổ hợp khoai tây có triển vọng với khoai tây trồng. Thu hạt phấn của khoai tây trồng (dòng bố) → Khử đực các dòng nhận phấn (dòng mẹ) → Thụ phấn → Bảo quản quả lai và thu hạt lai. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định các thông số tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần giữa các dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại và khoai tây trồng 3.1.1. Nghiên cứu các thông số tách tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại, khoai tây trồng phục vụ cho dung hợp tế bào trần 3.1.1.1 Ảnh hưởng của dung dịch enzyme khác nhau đến hiệu suất tách tế bào trần Các dòng khoai tây nhị bội, khoai tây dại và khoai tây trồng khác nhau sẽ có cấu tạo thành phần mô và vách tế bào khác nhau. Vì vậy, việc xác định loại dung dịch enzyme có tỷ lệ enzyme phân giải cellulose và pectine phù hợp với từng dòng để cho hiệu suất tế bào trần thu được tối đa là rất cần thiết. Các kết quả thí nghiệm được thể hiện trên Bảng 3.1: Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng đội macerozyme và cellulase trong dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội (Tế bào trần/ml môi trường) Dung dịch enzyme Tên dòng Dạng vật liệu E1 E2 E3 E4 (TB x105/ml) (TB x105/ml) (TB x105/ml) (TB x105/ml) A15 Nhị bội 3,69 ± 0,24 2,54 ± 0,09 0,55 ± 0,05 0,12 ± 0,01 A16 Nhị bội 4,12 ± 0,16 1,15 ± 0,07 2,65 ± 0,09 0,35 ± 0,03 A56 Nhị bội 1,09 ± 0,05 1,59 ± 0,09 2,95 ± 0,05 0,74 ± 0,05 B186 Nhị bội 3,60 ± 0,16 2,35 ± 0,11 0,68 ± 0,05 0,22 ± 0,01 B208 Nhị bội 3,55 ± 0,08 1,07 ± 0,04 0,43 ± 0,02 0,10 ± 0,00 pnt2G Khoai tây dại 1,61 ± 0,11 3,12 ± 0,09 0,86 ± 0,04 1,21 ± 0,04 trn3G Khoai tây dại 3,73 ± 0,08 1,62 ± 0,10 1,04 ± 0,06 0,34 ± 0,01 blb2G Khoai tây dại 3,65 ± 0,09 1,52 ± 0,04 1,01 ± 0,07 0,33 ± 0,01 Delikat Khoai tây trồng 2,86 ± 0,12 3,01 ± 0,11 1,14 ± 0,09 0,10 ± 0,00 Rasant Khoai tây trồng 3,80 ± 0,05 1,91 ± 0,11 0,78 ± 0,01 0,10 ± 0,00 Atlantic Khoai tây trồng 0,92 ± 0,05 1,24 ± 0,06 2,81 ± 0,08 1,11 ± 0,08 Ghi chú: Dung dịch enzyme 1: 0,2% Macerozyme, 0,8% Cellulase Dung dịch enzyme 2: 0,2% Macerozyme, 0,6% Cellulase Dung dịch enzyme 3: 0,1% Macerozyme, 0,8% Cellulase Dung dịch enzyme 4: 0,1% Macerozyme, 0,6% Cellulase
5. 5 Từ kết quả Bảng 3.1 cho thấy: Các loại dung dịch enzyme khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến hiệu quả tách tế bào trần. Để tách tế bào trần có hiệu suất cao nhất, mỗi dòng khoai tây nhị bội cần một loại dung dịch enzyme phù hợp. 3.1.1.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzyme đến hiệu suất tách tế bào trần Các kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian ủ mẫu lá trong dung dịch enzyme có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả tách tế bào trần. Thí nghiệm đã tiến hành ủ các mẫu lá ở các thời gian ủ trong dung dịch enzyme khác nhau dao động trong khoảng 13-16h. Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ trong dung dịch enzyme đến mật độ tế bào trần thu được Thời gian 13h 14h 15h 16h Dòng (TB x105/ml) (TB x105/ml) (TB x105/ml) (TB x105/ml) A15 1,44 ± 0,06 2,86 ± 0,05 3,39 ± 0,11 2, 61 ± 0,05 A16 1,09 ± 0,04 2,93 ± 0,03 4,01 ± 0,06 3,45 ± 0,05 A56 1,24 ± 0,03 2,98 ± 0,02 3,40 ± 0,12 3,35 ± 0,07 B186 2,45 ± 0,05 4,56 ± 0,04 3,81 ± 0,07 2,76 ± 0,12 B208 2,08 ± 0,05 4,38 ± 0,05 3,95 ± 0,06 2,54 ± 0,10 pnt2G 0,52 ± 0,01 1,74 ± 0,03 2,81 ± 0,06 3,46 ± 0,15 trn3G 1,01 ± 0,04 2,33 ± 0,04 3,62 ± 0,12 2,91 ± 0,08 blb2G 1,24 ± 0,04 2,63 ± 0,05 3,43 ± 0,11 2,41 ± 0,09 Delikat 1,24 ± 0,03 2,84 ± 0,04 3,55 ± 0,05 3,04 ± 0,07 Rasant 3,18 ± 0,04 4,13 ± 0,10 3,83 ± 0,07 2,83 ± 0,16 Atlantic 1,92 ± 0,02 2,52 ± 0,04 3, 59 ± 0,04 2,77 ± 0,10 Kết quả cho thấy, thời gian ủ mô lá trong dung dịch enzym có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả tách tế bào trần, thời gian ủ thích hợp với các dòng dao động từ 15 ±1 giờ. Thời gian ủ thích hợp cho các mô lá của các dòng khác nhau là khác nhau. 3.1.1.3. Ảnh hưởng của tuổi cây in vitro đến mật độ tế bào trần thu được từ mẫu lá Các dòng được nhân in vitro trên môi trường MS (Murashige and Skoog 1962) sau đó được tách tế bào trần ở các độ tuổi khác nhau (2 tuần, 3 tuần, 4 tuần, 5 tuần). Kết quả như sau: Bảng 3.3. Ảnh hưởng của tuổi cây in vitro đến mật độ tế bào trần thu được từ mẫu lá Tuổi cây 2 tuần 3 tuần 4 tuần 5 tuần (TB x105/ml) (TB x105/ml) (TB x105/ml) (TB x105/ml) Dòng A15 0,14 ± 0,02 3,69 ± 0,02 3,39 ± 0,08 2,45 ± 0,06 A16 1,59 ± 0,04 4,12 ± 0,06 4,01 ± 0,07 2,01 ± 0,07 A56 0,34 ± 0,02 2,95 ± 0,03 3,40 ± 0,03 1,55 ± 0,04 B186 0,85 ± 0,03 3,60 ± 0,09 2,91 ± 0,05 1,87 ± 0,02 B208 0,28 ± 0,02 3,55 ± 0,09 3, 94 ± 0,07 2,06 ± 0,04 pnt2G 0,47 ± 0,01 2,54 ± 0,20 3,27 ± 0,05 2,14 ± 0,10 trn3G 0,47 ± 0,01 2,98 ± 0,10 3,48 ± 0,02 2,55 ± 0,22 blb2G 0,28 ± 0,01 2,99 ± 0,10 3,74 ± 0,08 2,72 ± 0,12 Delikat 1,95 ± 0,03 2,60 ± 0,12 3,91 ± 0,07 2,37 ± 0,07 Rasant 1,28 ± 0,02 2,59 ± 0,28 3,14 ± 0,04 2,02 ± 0,05 Atlantic 1,26 ± 0,04 2,94 ± 0,13 4,02 ± 0,27 2,09 ± 0,03 Kết quả cho thấy: lá từ cây có thời gian nuôi cấy in vitro khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả tạo tế bào trần. Độ tuổi lá của cây in vitro thích hợp nhất để tách tế bào trần cho tất cả các dòng là 3 - 4 tuần tuổi. 3.1.2. Xác định các thông số dung hợp tế bào trần 3.1.2.1 Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần xung điện đến chất lượng tế bào sau dung hợp Do có nhiều tổ hợp lai nên khối lượng công việc là lớn và thu được nhiều kết. Trong khuôn khổ thời gian cho phép, luận án đã chọn ra 2 tổ hợp lai từ các tổ hợp bố mẹ nhị bội là B186 (+) B208 và tổ hợp lai khoai tây dại và khoai tây trồng trn3G (+) Delikat để trình bày.
6. 6 Tiến hành dung hợp tế bào trần ở mật độ 3x 105 tế bào/ml, chất lượng tế bào thu được sau xung được thể hiện qua Bảng 3.4: Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tần số dung hợp và số lần tạo xung điện đến khả năng tạo mô sẹo của tổ hợp B186 (+) B208 và tổ hợp trn3G (+) Delikat Thời gian tế Thời gian xuất hiện Số lượng STT CT bào phân chia (ngày) microcallus (ngày) macrocallus/đĩa Tổ hợp B186 (+) B208 1 CT1 3 29,8 21,5 2 CT2 2 18,9 73,4 3 CT3 4 22,5 37,6 4 CT4 4 28,3 29,2 Tổ hợp trn3G (+) Delikat 1 CT1 5 27,3 19,5 2 CT2 2 18,2 70,8 3 CT3 4 28,7 24,6 4 CT4 4 30,3 28,8 Chú thích: CT1: 700 kHz + 2 lần xung; CT2: 800 kHz + 2 lần xung; CT3: 900 kHz + 2 lần xung; CT4: 1000KHz + 1 lần xung Từ kết quả Bảng 3.4 cho thấy: tần số và số lần xung hợp ảnh hưởng rõ rệt đến chất lượng tế bào sau dung hợp. Với thông số 800 kHz và 2 lần xung là thích hợp nhất cho dung hợp xung điện trên đối tượng là các dòng khoai tây nhị bội và giữa khoai tây dại và khoai tây trồng. 3.1.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ ion Ca2+ của dịch dung hợp tới hiệu suất dung hợp Ion Ca2+ là ion dẫn truyền điện tích và là ion không thể thiếu được trong quá trình dung hợp bằng xung điện. Ion Ca2+ giúp tế bào xếp thành hàng, giúp cho hiệu suất dung hợp tế bào cao hơn. Kết quả nghiên cứu được thể hiện qua Bảng 3.5: Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ Ca2+ đến khả năng kết dính thành hàng của tế bào trong quá trình dung hợp (tế bào/hàng) và khả năng tế bào phân chia sau dung hợp. STT Tổ hợp lai Nồng độ Ca2+ (M) CT1 (10-5) CT2 (10-4) CT3 (10-3) CT4 (10-2) Tế Thời Tế Thời Tế Thời Tế Thời bào/hàng gian bào/hàng gian bào/hàng gian bào/hàng gian phân phân phân phân chia chia chia chia (ngày) (ngày) (ngày) (ngày) 1 B186 (+) B208 3,1 5 14,2 3 21,7 3 10,2 4 2 Trn3G(+)Delikat 3,7 4 13,6 3 21,6 3 10,8 5 Qua Bảng 3.5 cho thấy nồng độ của Ca2+ có ảnh hưởng rõ rệt đến sự tạo hàng của tế bào trong quá trình dung hợp xung điện. Số tế bào/ hàng tăng khi tăng nồng độ Ca2+ tăng 10- 5 M đến 10-3 M trong dung dịch dung hợp. 3.1.2.3 Ảnh hưởng của mật độ tế bào đến hiệu suất dung hợp Tiến hành thí nghiệm dung hợp xung điện tế bào ở mật độ khác nhau để xác đinh mật độ thích hợp nhất. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.6. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của mật độ protoplast đến kết quả dung hợp của tổ hợp nhị bội B186 (+) B208 Mật độ Thời Số Số cây Tỷ lệ cây 2x Tỷ lệ cây 4x Tỷ lệ cây xung hợp gian macrocallus/ tái sinh (%) (%) hỗn bội (%) (tế phân đĩa* bào/ml) chia (ngày) 1 x 105 3 28,5 ± 0,3 16 ± 1,0 56,25 ± 1,5 25,00 ± 1.5 18,75 ± 2,9 2 x 105 2 75,7 ± 1,5 35 ± 3,8 37,14 ± 0,6 34,29 ± 0,9 28,57 ± 1,5 3 x 105 2 85,6 ± 0,6 46 ± 1,7 13,88 ± 0,1 45,65 ± 0,7 40,47 ± 0,8
7. 7 4 x 105 2 68,3 ± 1,0 47 ± 3,1 14,90 ± 0,6 31,91 ± 1,0 53,19 ± 0,4 5 x 105 2 62,6 ± 1,0 29 ± 2,0 10,31 ± 0,5 24,13 ± 2,0 65,56 ± 2,4 Chú thích: *sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường Cul-medium, sau 2-3 tháng nuôi cấy trên môi trường RJM Từ kết quả Bảng 3.6 cho thấy: mật độ ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian bắt đầu phân chia tế bào và tỷ lệ con lai tứ bội tạo thành. Mật độ tế bào tối ưu nhất để tạo cây tứ bội là 3x 105 tế bào/ ml. Bảng 3.7. Ảnh hưởng của mật độ protoplast đến kết quả dung hợp bằng xung điện của tổ hợp khoai tây dại và khoai tây trồng Trn3G (+) Delikat Thời Tỷ lệ cây Mật độ gian Số Số cây 2x (%) Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ dung hợp phân macrocallus/đĩa tái sinh cây 4x cây 6x cây hỗn (tế chia Sau 4 tuần Sau 8 tuần (%) (%) bội (%) bào/ml) (ngày) 15,3 ± 1 x 105 3 32,5 ± 0,5 21 ± 1,2 25,3 ± 0,9 45,0 ± 1,0 14,4 ± 1,2 1,6 2 x 105 2 65,7 ± 0,8 55 ± 1,5 16,2 ± 1,4 30,9 ± 1,0 32,3 ± 1,4 20,7 ±1,8 3 x 105 2 74,6 ± 0,6 66 ± 2,0 10,3 ± 0,7 10,6 ± 0,1 58,4 ± 1,6 20,7 ±1,4 4 x 105 2 88,3 ± 0,5 81 ± 0,6 2,3 ± 0,4 9,6 ± 0,4 61,9 ± 0,8 26,2 ±0,7 5 x 105 2 72,6 ± 0,8 68 ± 2,3 0,0 ± 0,0 10,8 ± 0,2 48,2 ± 1,5 41,0 ±1,7 Như vậy mật độ tế bào tối ưu cho hiệu quả dung hợp tạo con lai 4x là 3 x 105 tế bào/ml; con lai 6x là 4 x 105 tế bào/ml. 3.1.3. Nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai sau dung hợp 3.1.3.1. Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy lỏng sau dung hợp đến sự phân chia và tái sinh microcallus của các tổ hợp lai sau dung hợp Tế bào trần của các tổ hợp lai sau khi dung hợp được nuôi cấy trên các loại môi trường lỏng khác nhau: môi trường VKM II (Thieme et al., 1997), Medium A* (Ehsanpour et al., 2001), KM8P* (Paula Conde et al., 2006) được trình bày ở bảng Bảng 3.8. Sự phân chia của các tổ hợp lai nhị bội và tổ hợp lai giữa khoai tây dại và khoai tây trồng trên các môi trường nuôi cấy khác nhau Thời gian xuất hiện tế Thời gian xuất hiện Số lượng microcallus Môi bào phân chia (ngày) microcallus (ngày) trung bình/đĩa petri trường trn3G(+)Delikat B186(+)B208 trn3G(+)Delikat B186(+)B208 trn3G(+)Delikat B186(+)B208 VKM II 2 3 12 18 35,7 33,8 A* 9 7 21 - 5,8 - KM8P* 5 6 - 28 - 4,7 Chú thích: - là tế bào không phân chia Như vậy, môi trường VKM II là môi trường thích hợp để nuôi cấy tạo microcallus của tế bào trần sau khi dung hợp. 3.1.3.2. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến sự tái sinh chồi của các tổ hợp lai Các tổ hợp lai sau khi dung hợp phân chia tạo microcallus trên môi trường lỏng VKM II sau 3-4 tuần nuôi cấy, được chuyển sang nuôi cấy trong các đĩa peptri lớn ( 9cm), chứa môi trường rắn Cul-medium (Moller et al, 1992) đặt trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng, cường độ ánh sáng 4000 lux và nhiệt độ 210C để tạo macrocallus. Sau 3-8 tuần, chuyển các macrocallus vào môi trường tái sinh khác nhau. Thí nghiệm theo dõi 10 đĩa petri/tổ hợp lai, mỗi đĩa petri cấy 10 macrocallus. Mỗi callus chỉ lấy 1 chồi đầu tiên và lấy số lượng chồi trung bình/đĩa. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.9. Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường tái sinh khác nhau đến khả năng tạo chồi của các tổ hợp lai Số lượng chồi tái sinh/chất lượng chồi Tổ hợp lai Môi trường RJM Môi trường MSO Môi trường K8P
8. 8 B186 (+) B208 7,4/++ 2,6/+ 0,0/ trn3G (+) Delikat 8,4/++ 0,0/ 1,8/- Chú thích: (-) Chồi yếu, màu trắng; (+) Chồi phát triển trung bình, màu vàng nhạt; (++) chồi tốt, mập, xanh Từ kết quả Bảng 3.9 cho thấy môi trường khác nhau có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tái sinh tạo chồi của các tổ hợp lai. Môi trường tối ưu để tạo chồi của cả 2 tổ hợp lai là RJM. Kết luận: Từ các thí nghiệm dung hợp, tái sinh đã khẳng định được các thông số tối ưu sau: + Tần số dung hợp số 800 kHz và 2 lần xung. + Nồng độ Ca2+ trong dung dịch dung hợp xung điện thích hợp nhất là 10-3 M. + Mật độ tế bào dung hợp thích hợp với tổ hợp khoai tây nhị bội là 3 x 105 tế bào/ml; với tổ hợp khoai tây dại và khoai tây trồng 4 x 105 tế bào/ml. + Các tế bào sau dung hợp được nôi cấy trên môi trường VKM II để tạo microcallus và tái sinh trên môi trường RJM. 3.2. Xác định và đánh giá các thể lai soma của tổ hợp dung hợp khoai tây nhị bội (2n = 2x) 3.2.1. Tạo con lai Có 10 tổ hợp lai được tạo thành từ các nguyên liệu nhị bội chọn lọc (A15, A16, A56, B186, B208). Tuy nhiên, khả năng tái sinh của các tổ hợp này không đồng đều. Trong khuôn khổ thời gian cho phép, luận án trình bày kết quả 3 tổ hợp lai có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt nhất để báo cáo. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.10 Bảng 3.10. Kết quả dung hợp, nuôi cấy và tái sinh các tổ hợp lai nhị bội sau dung hợp TT Sự tái sinh các tổ hợp lai Tổ hợp lai Số lượng callus đem tái sinh Số lượng cây Tỷ lệ tái sinh cây (callus) tái sinh (cây) cây (%) 1 A15 (+) A56 1026 ± 11,4 25 ± 1,5 2,43 2 A16 (+) B186 375 ± 8,1 53 ± 3,2 14,13 3 B186 (+) B208 175 ± 9,6 25 ± 2,1 14,28 Tổng 1576 103 6,54 Kết quả tái sinh của các Bảng 3.10 cho thấy tỷ lệ tái sinh thành cây phụ thuộc vào các tổ hợp genotype khác nhau. Tổ hợp B186 (+) B208 có tỷ lệ tái sinh cây/ callus cao nhất đạt 25 cây/ 175 callus đem tái sinh đạt 14,28%; tổ hợp A15 (+) A56 có tỷ lệ tái sinh cây/ callus thấp nhất, đạt 2,43%. Từ 1576 callus của 3 tổ hợp dung hợp đem tái sinh cây thu được 103 cây, đạt tỷ lệ tái sinh trung bình là 6,54%. Các con lai ngẫu nhiên có thể là đồng hợp nhân (homozygous) hoặc dị hợp nhân (heterozygous). Một khâu quan trọng tiếp theo của kỹ thuật lai soma là phải chọn lọc được chính xác có kiểu gen dị hợp nhân. Nghiên cứu này thực hiện các phương pháp xác định khác nhau để từ một quần thể cây lai tái sinh tìm ra con lai soma và từ đó cung cấp nguồn vật liệu quan trọng cho công tác chọn tạo giống khoai tây. 3.2.2. Xác định độ bội thể của cây tái sinh Sử dụng máy Flow cytometry để đo độ bội của các con lai. Kết quả được thể hiện trên Bảng 3.11, Hình 3.6. Bảng 3.11. Kết quả xác định độ bội các con lai sau dung hợp Số cây tái sinh Tổ hợp lai Cây nhị bội (cây) Cây tứ bội (cây) Cây hỗn bội (cây) (dòng) A15 (+) A56 25 ± 0,6 7 ± 0,6 13 ± 0,6 5 ± 0,6 A16 (+) B186 53 ± 1,7 15 ± 1,0 17 ± 1,0 21 ± 1,7 B186 (+) B208 25 ± 1,2 5 ± 0,6 20 ± 0,6 0 ± 0 Tổng 103 27 60 26 Kết quả Bảng 3.11 cho thấy: trong 103 chồi tái sinh từ callus của 3 tổ hợp lai thì tỷ lệ các cây lai có độ bội 2n = 4x đạt 60 cây (chiếm 58,3%). Trong 3 tổ hợp dung hợp thì tổ hợp B186 (+) B208 có tỷ lệ con lai tứ bội cao nhất, đạt 80%. Tỷ lệ con lai có độ bội 2n=4x thu được chiếm đa số, đạt 58,3% so với tổng số cây tái sinh.
9. 9 Mẫu đối chứng chuẩn (2n=2x) Dòng bố mẹ (2n=2x) Con lai tứ bội (2n=4x) Con lai lục bội (2n=6x) Hình 3.6. Hình ảnh độ bội của dòng khoai tây “bố mẹ” và con lai Sử dụng máy flow cytometry đã xác định được 60/103 dòng là con lai tứ bội. Tuy nhiên, đây chỉ là kết quả bước đầu trong việc khẳng định con lai soma sau dung hợp. Các con lai tứ bội có thể được tạo thành do 2 tế bào trần của cùng một dòng “bố” hoặc “mẹ” dung hợp tạo thành, tức là không phải là con lai có kiểu gen dị hợp nhân. Chính vì thế cần xác định chính xác con lai soma bằng phương pháp dùng chỉ thị phân tử. 3.2.3. Xác định con lai soma bằng chỉ thị phân tử Kết quả xác định con lai soma với mồi STM 3023 bằng hệ thống GenomeLab GeXP 8800 được thể hiện ở Bảng 3.12 Bảng 3.12. Kết quả xác định con lai soma của các tổ hợp dung hợp Tổ hợp lai Số cây tứ bội (2n= 4x) (cây) Số cây lai soma (cây) Tỷ lệ cây lai soma (%) A15 (+) A56 13 12 92,31 A16 (+) B186 17 8 47,06 B186 (+) B208 20 16 80,00 Tổng 60 36 60 Kết quả Bảng 3.12 cho thấy trong tổng số 60 cây tứ bội có 36 cây tái sinh là con lai dị hợp nhân chiếm 60%. Tổ hợp A15 (+) A56 có 13/60 cây là cây tứ bội nhưng lại là tổ hợp có 12/13 cây là cây lai soma, chiếm tỷ lệ cao nhất (92,31%) trong tổ hợp dung hợp. Một lượng lớn cây tứ bội tái sinh nhưng lại không phải là cây lai soma, chúng là kết quả của sự dung hợp giữa hai tế bào trần của cùng dòng “bố” hoặc dòng “mẹ”.
10. 10 Hình 3.9. Xác định con lai soma của tổ hợp B186(+)B208 với cặp mồi STM 3023 Hình 3.9 biểu thị kích thước của các alen của dòng “bố”, dòng “mẹ” và dòng con lai soma được phát hiện bằng hệ thống điện di mao quản này với mồi STM 3023. Có thể nhận thấy kích thước các alen của dòng nhị bội “bố mẹ” chỉ hơn kém nhau hai cặp base: tổ hợp B186 (+)B208 cho kết quả các dòng “bố mẹ” cũng chỉ hơn kém nhau hai cặp base và các con lai soma được xác định cũng có các peak có kích thước alen tương tự với peak của “bố mẹ”.
11. 11 3.2.4. Đánh giá phẩm chất củ của các của các con lai soma trong điều kiện chậu vại Trong nội dung chọn lọc con lai, đã chọn lọc được 36 con lai dị hợp tử tetraploid (4x). Tuy nhiên, khi tách dòng và đánh giá chọn lọc trong điều kiện in vitro chỉ có 15 dòng của một số tổ hợp cho khả năng sinh trưởng phát triển tốt. Các dòng này được đánh giá phẩm chất củ trong điều kiện chậu vại. Các chỉ tiêu hóa sinh được thể hiện qua Bảng 3.13 Bảng 3.13. Một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng lai soma khoai tây và dòng nguyên liệu STT Kí hiệu Hàm lượng chất khô (%) Đường khử (%) Tinh bột (%) Các dòng bố mẹ 1 A15 20,52 0,25 94,88 2 A16 17,41 0,25 88,45 3 A56 20,13 0,18 94,43 4 B186 18,31 0,21 88,69 5 B208 17,70 0,20 87,63 Con lai của tổ hợp lai A15 (+) A56 6 47/7 20,47 0,14 92,97 7 47/11 20,11 0,45 95,18 8 47/14 20,35 0,13 92,14 9 47/24 20,23 0,18 90,01 10 47/26 22,78 0,13 96,95 Con lai của tổ hợp lai A16 (+) B186 11 81-2 20,06 0,15 97,46 Con lai của tổ hợp lai B208 (+) B186 12 21-1 20,57 0,19 90,35 13 130/2 20,81 0,25 96,68 14 131/1 16,62 0,39 86,40 15 131/3 15,97 0,22 89,04 16 131/4 20,85 0,27 92,76 17 131/5 19,78 0,42 92,52 18 131/10 14,03 0,56 88,24 19 131/11 20,91 0,14 97,42 20 131/12 20,02 0,41 95,90 Hàm lượng đường khử là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng của các giống khoai tây chế biến. Chỉ tiêu này càng thấp thì càng tốt vì khi chế biến miếng khoai tây không bị đổi màu và nâu hóa. Bên cạnh đó, hàm lượng tinh bột cũng là yếu tố rất được quan tâm. Củ khoai tây có hàm lượng càng cao thì khi chế biến chip càng giòn, khó gãy, vỡ. Kết luận: Như vậy qua đánh giá các tổ hợp lai, những con lai có củ phù hợp với hướng chế biến khoai tây chip hiện nay là 47/7; 47/26; 81-2; 131/11. Đây là những dòng có triển vọng về phẩm chất chế biến, cần tiếp tục đánh giá để phục vụ công tác chọn giống. 3.2.5. Kiểm tra sự có mặt của gen kháng trong các con lai soma từ vật liệu nhị bội Trong nghiên cứu này sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Rysto là GP 122406 nhân được đoạn DNA có kích thước 406 bp, sau dùng enzym EcoV để cắt. Kết quả được thể hiện qua hình 3.10, 3.11:
12. 12 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu GP 122406 liên kết chặt với gen Rysto trong bố mẹ nhị bội và con lai soma Chú thích 1: A15; 2: A16; 3: A56; 4: B208; 5: B186; 6: 47/7; 7: 47/11; 8: 47/14; 9: 47/24; 10: 47/26; 11: 81-2; 12: 21-1; 13: 130/2; 14: 131/1; 15: 131/3; 16: 131,4; 17: 131/5; 18: 131/10; 19: 131/11; 20: 131/12 Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR được cắt với enzym cắt giới hạn EcoRV Chú thích 1: A15; 2: A16; 3: A56; 4: B208; 5: B186; 6: 47/7; 7: 47/11; 8: 47/14; 9: 47/24; 10: 47/26; 11: 81-2; 12: 21-1; 13: 130/2; 14: 131/1; 15: 131/3; 16: 131,4; 17: 131/5; 18: 131/10; 19: 131/11; 20: 131/12 Từ các kết quả điện di hình 3.10 và 3.11 cho thấy tất cả các dòng bố mẹ và các dòng con lai soma khoai tây đều chứa gen siêu kháng Rysto. Từ đây, có thể khẳng định rằng con lai soma tạo ra bằng dung hợp tế bào trần có chứa gen kháng virus từ “bố mẹ” của chúng. 3.3. Xác định các thể lai soma của tổ hợp dung hợp giữa khoai tây dại (2n=2x) và khoai tây trồng (2n = 4x). Đánh giá khả năng kháng virus PVY của chúng Các dòng khoai tây dại và khoai tây trồng tách và tạo các tổ hợp dung hợp với các thông số đã được xác định từ nội dung tách, dung hợp, tái sinh tế bào trần của các dòng nghiên cứu. Có 9 tổ hợp được kết hợp từ 3 dòng khoai tây dại và 3 dòng khoai tây trồng. Tuy nhiên, sau quá trình dung hợp, chỉ có 6 tổ hợp lai cho kết quả tái sinh tốt. Sáu tổ hợp lai này và tỷ lệ tái sinh của các tổ hợp được thể hiện qua Bảng 3.14 Bảng 3.14. Kết quả nuôi cấy tái sinh chồi của các tổ hợp lai sau dung hợp STT Tên tổ hợp lai Số lượng callus Số lượng chồi Tỷ lệ tái tái sinh tái sinh sinh (%) 1 trn3G (+) Rasant 97 25 25,8 2 trn3G (+) Delikat 250 64 25,6 3 trn3G (+) Atlantic 395 2 0,50 4 pnt2G (+) Atlantic 193 23 11,9 5 pnt2G (+) Delikat 53 26 49,06 blb2G + Delikat 250 31 12,4
13. 13 Tổng 1238 171 Từ Bảng 3.14 cho thấy các tổ hợp lai khác nhau thì khả năng tạo callus, tái sinh chồi cũng khác nhau. Các tổ hợp lai trn3G (+) Delikat, pnt3G (+) Delikat, trn3G (+) Rasant có khả năng tái sinh cao lần lượt là 49,06%, 25,6%, 25,8%. Các chồi này phát triển tốt. Các chồi này sẽ được tách dòng, phân tích độ bội và sinh học phân tử để xác định con lai dị hợp tử. 3.3.1. Xác định con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng bằng đo độ bội thể Sử dụng phương pháp phân tích độ bội thể Flow cytometry để đo độ bội của các con lai tái sinh của 6 tổ hợp lai. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.15, Hình 3.13. Bảng 3.15. Kết quả tái sinh và phân tích độ bội thể của các tổ hợp lai khoai tây dại và khoai tây trồng sau dung hợp Độ bội (dòng) 2n = Số lượng STT Tên tổ hợp lai Hỗn bội chồi tái sinh 2x 4x 6x (2n>6) 1 trn3G (+) Rasant 64 13 5 25 21 2 trn3G (+) Delikat 25 0 3 20 2 3 trn3G (+) Atlantic 2 0 1 0 1 4 pnt2G (+) Atlantic 23 5 9 9 0 5 pnt2G (+) Delikat 26 5 10 11 0 6 blb2G (+) Delikat 31 0 14 15 2 Tổng 171 23 42 80 26 Hình 3.12. Hình ảnh độ bội thể của dòng khoai tây “bố mẹ” và con lai Chú thích: A- Giống khoai tây trồng (4x), B- Dòng khoai tây dại (2x), C- con lai soma lục bội (6x) Kết quả cho thấy từ 171 chồi tái sinh sau dung hợp chỉ có 80 cây có độ bội 2n = 6x. Tỷ lệ cây lục bội (2n = 6x) phụ thuộc vào các tổ hợp dung hợp khác nhau. Trong 6 tổ hợp dung hợp thì tổ hợp lai trn3G (+) Delikat cho tỷ lệ cây tái sinh có độ bội 6x là cao nhất (20/25 dòng) trong khi đó tổ hợp lai giữa trn3G (+) Atlantic không cho kết quả tạo con lai lục bội. 3.3.2. Xác định con lai soma giữa khoai tây dại, khoai tây trồng bằng chỉ thị phân tử SSR Các con lai 6x được xác định bằng chỉ thị phân tử SSR (Dinu and Thieme, 2001), sử dụng cặp mồi theo Song et al. (2005). Hình 3.13 minh họa kết quả điện di cho phân tích chỉ thị SSR sử dụng cặp mồi STM2022 nhằm xác định kiểu gen dị hợp nhân của các dòng lục bội của tổ hợp lai trn3G+ Rasant. 25 dòng con lai tái sinh có khả năng phát triển tốt không bị biến dị của tổ hợp lai dòng dại trn3G và giống Rasant được phân tích có 6 con lai lục bội có kiểu gen dị hợp nhân.
14. 14 Hình 3.13. Kết quả điện di cho phân tích chỉ thị phân tử STM2022 để xác định kiểu gen dị hợp nhân của tổ hợp lai trn3G (+) Rasant Chú thích: giếng 1- trn3G; giếng 2- Rasant; giếng 3-27 là 25 dòng lai tái sinh của tổ hợp lai trn3G (+) Rasant. Trong đó, có 6 con lai lục bội dị hợp nhân gồm: giếng 6- con lai, giếng 12- con lai, giếng 20: con lai, giếng 21- con lai, giếng 22- con lai, giếng 24- con lai. Bảng 3.16. Kết quả sử dụng marker phân tử trong xác định con lai soma Số cây Số dòng Số dòng lai Tỷ lệ con Tên mồi xác định Tổ hợp lai xác định lục bội soma lai/dòng con lai độ bội (2n= 6x) (Hetezygous) tái sinh (%) trn3G (+) Rasant 64 25 6 9.4 STM2022, STIIKA trn3G (+) Delikat 25 20 18 72.0 STM2022 trn3G (+) Atlantic 2 0 0 0.0 STM1104 pnt2G (+) Atlantic 23 9 6 26.1 STM3023 pnt2G (+) Delikat 26 11 9 34.6 STM3023 blb2G (+) Delikat 31 15 14 45.2 STM2022 Tổng 171 80 53 Kết quả Bảng 3.16 cho thấy trong số 171 con lai tái sinh có 80 con có độ bội 6x nhưng chỉ có 53 con có kiểu gen dị hợp nhân. 3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen kháng PVY trong các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng Từ 53 con lai thu được ở trên, chọn lọc được 13 con lai dị hợp tử có khả năng sinh trưởng phát triển tốt, không bị biến dị trong điều kiện in vitro. Các con lai này được kiểm tra sự có mặt của gen kháng Rysto, sử dụng cặp mồi đặc hiệu GP 122406. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR của các mẫu phân tích với cặp mồi GP 122406 được thể hiện trên Hình 3.14. Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi GP 122406 của ADN các con lai soma và các dòng bố mẹ khoai tây dại và khoai tây trồng Chú thích: Ladder, 1- pnt2; 2- trn3; 3- blb2G; 4- 838/11; 5- 851/2; 6- 2195/2; 7- 2196/4; 8-2235/1; 9- 2044/1; 10- 1/6; 11- 3/9; 12- 248/1; 13- 2281/10; 14- 2283/5; 15- 2292/4; 16- 2295/1; 17- Delikat; 18- Rasant; 19- Atlantic Kết quả điện di kiểm tra cho thấy toàn bộ các dòng khoai tây phân tích đều thu được băng ADN có kích thước 406bp. Sản phẩm PCR thu được trên được tinh sạch và tiếp tục ủ với enzyme giới hạn EcoRV, sau đó điện di kiểm tra. Kết quả thể hiện qua hình 3.15.
15. 15 Hình 3.15. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY của các dòng lai soma và dòng bố mẹ khoai tây dại và khoai tây trồng Chú thích: Ladder, 1- pnt2; 2- trn3; 3- blb2G; 4- 838/11; 5- 851/2; 6- 2195/2; 7- 2196/4; 8- 2235/1; 9- 2044/1; 10- 1/6; 11- 3/9; 12- 248/1; 13- 2281/10; 14- 2283/5; 15- 2292/4; 16- 2295/1; 17- Delikat; 18- Rasant; 19- Atlantic Quan sát Hình 3.15 cho thấy sản phẩm ủ với EcoRV đều xuất hiện các vạch băng tương ứng với kích thước 200bp và 206bp ở tất cả các giếng (từ giếng 1 – 16). Như vậy tất cả các mẫu ADN của các các con lai đều có mặt gen kháng virus PVY. Điều đó đồng nghĩa với việc các dòng lai soma đã được chuyển gen kháng bệnh từ dòng khoai tây dại thông qua dung hợp. 3.3.4. Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng bằng lây nhiễm nhân tạo Các con lai soma và bố mẹ của chúng được đánh giá khả năng kháng virus bằng lây nhiễm nhân tạo. Kết quả lây nhiễm được kiểm tra bằng kit test DAS-ELISA. Bảng 3.17. Kết quả mức độ kháng bệnh của các con lai 4x sau khi lây nhiễm nhân tạo Tỷ lệ Tỷ lệ STT Dòng N/B STT Dòng N/B nhiễm% nhiễm% 1 Atlantic 10/10 100 Con lai của tổ hợp blb2G+Delikat 2 Delikat 10/10 100 12 2281/10 0/10 0 3 Rasant 10/10 100 13 2283/5 0/10 0 4 pnt2G 0/10 0 14 2292/4 0/10 0 5 trn3G 0/10 0 15 2295/1 0/10 0 6 blb2G 0/10 0 Con lai của tổ hợp ptn2G (+) Rasant Con lai của tổ hợp trn 3G (+) Delikat 16 2044/1 0/10 0 7 838/11 0/10 0 Con lai của tổ hợp trn3G (+) Rasant 8 851/2 0/10 0 17 1/6 0/10 0 9 2195/2 0/10 0 18 3/9 0/10 0 Con lai của tổ hợp pnt2G (+) Delikat Con lai của tổ hợp pnt2G (+) Atlantic 10 2196/4 0/10 0 19 248/1 0/10 0 11 2235/1 0/10 0 ĐC Thuốc lá 10/10 100 Kết quả đánh giá cho thấy tất cả các dòng lai soma và khoai tây dại (trn3G, pnt2G) không bị nhiễm virus, trong khi đó các dòng khoai tây trồng (100%) đều bị nhiễm với PVY sau khi lây nhiễm nhân tạo. Điều này chứng tỏ gen kháng virus trong khoai tây dại đã được chuyển sang các dòng lai soma. 3.3.5. Đánh giá các con lai soma giữa khoai tây dại và khoai tây trồng về các tính trạng nông sinh học và phẩm chất củ Cùng với khả năng kháng lại các bệnh hại thì khả năng sinh trưởng và phát triển của cây cũng là chỉ tiêu quan trọng ảnh hưởng tới năng suất chất lượng khoai tây thu được khi trồng. Đây là những dữ liệu quan trọng để các nhà chọn tạo giống xem xét để có thể đề xuất các dòng triển vọng có thể làm giống. Kết quả Bảng 3.18 cho thấy đa số các con lai tạo ra đều có hình thái tương tự với khoai tây trồng (tuberosum) trừ các con lai 245/6 của tổ hợp lai pnt2G (+) Atlantic. Khả năng ra hoa của các con lai soma cũng rất khác nhau. Đặc biệt, các con lai của tổ hợp blb2G (+) Delikat đều có khả năng ra hoa cao đạt thang điểm đánh giá từ 5, 7, 9. Đây sẽ là những con lai có triển vọng cho chọn tạo giống vì chỉ những con lai có khả năng ra hoa mới có thể tiếp tục lai trở với khoai tây trồng để chọn tạo được những giống khoai tây mang đặc tính mong muốn.
16. 16 Do các cây được trồng từ cây in vitro chuyển ra trồng trong điều kiện chậu vại nên các dòng đạt năng suất, số củ/khóm và khối lượng củ/khóm đạt không cao. Chỉ tiêu khối lượng trung bình củ/khóm (klc TB/khóm) là một yếu tố quan trọng để đánh giá về năng suất của khoai tây trong điều kiện chậu vại. Từ kết quả Bảng 3.18 cho thấy chỉ có một dòng lai soma 851/2 (185g/khóm) của tổ hợp trn3G (+) Delikat cho năng suất cao hơn so với bố mẹ là khoai tây trồng ở ý nghĩa thống kê, trong khi đó các dòng soma khác đều cho khối lượng củ/khóm thấp. Điều này có thể là do các dòng dại thường cho rất ít củ, trọng lượng củ rất thấp, thậm chí một số dòng không có khả khăng ra củ nên các con lai soma được tạo ra giữa khoai tây dại và khoai tây trồng thường cho trọng lượng trung bình thấp hơn khoai tây trồng. Để cải thiện điều này, các dòng soma sẽ được lai lại với khoai tây trồng. Qua quá trình đánh giá có một số một số con lai soma có xuất hiện các biến dị ở thân, lá, hoa và củ (Hình 3.18). Nguyên nhân của hiện tượng này là do các con lai soma được tạo ra từ phép lai dung hợp khác loài giữa khoai tây dại và khoai tây trồng. Các con lai xa sẽ mang một số đặc điểm hình thái của khoai tây dại, các đặc điểm này khác với khoai tây trồng. Các biến dị này sẽ mất đi khi được lai lại với khoai tây trồng. Các con lai tạo ra sau phép lai lại sẽ dần có các tính trạng hình thái giống với khoai tây trồng mà không bị mất đi các tính trạng mong muốn ở khoai tây dại. A A B C Hình 3.18. Các biến dị ở con lai soma Chú thích từ trái sang phải: A: Hình thái cây của giống Atlantic, 248/1 và 245/6. B: Hoa và nhị của Ransant và các con lai soma 1/6, 3/9 của tổ hợp lai trn3G và Rasant C: Biến dị hình dạng củ của các con lai soma 1/6 và 3/9 của tổ hợp lai trn3G và Rasant. Kêt luận: - Đánh giá về khả năng kháng bệnh virus PVY qua lây nhiễm nhân tạo của các con lai soma cho thấy các con lai soma đều có khả năng kháng bệnh virus PVY. Kết quả này khẳng định rằng đã chuyển thành công gen kháng virus PVY từ khoai tây dại sang các dòng lai soma. - Qua đánh giá về các đặc tính nông sinh học cho thấy nhiều con lai soma có kiểu hình tương đối giống với khoai tây trồng. Tuy nhiên, cũng tìm thấy một số biến dị ở một số con lai. Năng suất của các con lai soma cũng thấp hơn khoai tây trồng là bố mẹ nên cần phải tiếp tục chọn lọc và lai trở lại với các giống khoai tây trồng.
17. 17 Bảng 3.18. Đánh giá các đặc tính nông sinh học của các con lai soma trong điều kiện chậu vại i t ị ủ ủ ỏ ng 8 10 ố ng - - 9 6 9 c sinhc sâu năng u dòng t cao 1 ở - - - t ng ứ ệ ấ ng c 1 1 1 : 1 ộ ả ủ /khóm) ắ ạ (gam) ủ c ra hoa ra ủ Đ trư Màu v Màu c D m 9=r th Màu Hình thái Kh Tên gi (c cây/s 1=tròn, 6=dà 1=tròn, Slc TB/khóm Ký hi Klc TB/khóm Klc Atlantic T,+++ 7 2 2 2 3 3,9a±1,1 128,3a±19,12 Rasant T,+++ - - - - - - - Delikat T,+++ 4 3 2 3 3 8,03b±2,25 169,6b±18,2 S. tarnii trn 3G W,+ - - - - - - - S. pinnatisectum pnt2G W,++ 4 3 8 1 3 4,88c±1,4 88,4c±8,8 S. bulbocastanum blb2G W, ++ - - - - - - - pnt2G (+) Atlantic 248/1 T,++ - 2 4 1 5 5,2d±1,2 108,9d±15,4 pnt2G(+) Rasant 2044/1 T,++ 5 5 2 4 1 4,7e±2 151,1e±19,4 trn3G (+) Delikat 838/11 T, ++ 2 4 2 3 5 4,56e±1,5 102,2d±11,4 trn3G (+) Delikat 851/2 T, ++ 2 5 4 3 5 4,89de±3,6 185,00f±8,3 trn3G (+) Delikat 2195/2 W,+++ 9 2 2 3 3 2,2f±0,44 105,6d±14 pnt2G (+) Delikat 2196/4 T,+++ - 5 2 3 1 4,78de±2,5 141,1g±17,9 pnt2G (+) Delikat 2235/1 T,+++ 9 5 2 3 1 3,6a±0,13 97,6h±14,4 trn3G (+) Rasant 1/6 T, ++ - 5 8 4 5 2,67f±2,5 98,3h±10 trn3G (+) Rasant 3/9 T,++ - 5 8 4 3 2,6f±2,56 125,6i±4,1 blb2G (+) Delikat 2281/10 T,+++ 5 5 2 4 3 3,6a±1,3 97,8h±14,4 blb2G (+) Delikat 2283/5 T,+++ 9 3 2 3 3 4,4de±1,8 142,2g±2,94 blb2G (+) Delikat 2292/4 T,+++ 7 3 2 3 5 4,3e±0,8 118,9i±6,4 blb2G (+) Delikat 2295/1 T,+++ 7 5 2 3 3 2,6f±0,3 106,1d±17,9 LSD0,05 0,47 7,39 CV% 7,6 4,7 Chú thích: (-) không xác định; (+)= yếu, (++)= Trung bình; (+++) = Khỏe; T = dạng khoai tây trồng, W= dạng dại, các chữ cái a, b,c khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức α=0,05
18. 18 3.4. Đánh giá con lai backcross (BC1) của thể lai soma (khoai tây dại và khoai tây trồng) với khoai tây trồng 3.4.1. Lai hữu tính giữa các con lai soma (của khoai tây dại và khoai tây trồng) với các giống khoai tây trồng và chọn lọc các con lai có đặc tính mong muốn 3.4.1.1. Chọn lọc các con lai Con lai soma 6x được tạo ra từ tổ hợp khoai tây dại và khoai tây trồng thường mang nhiều biến dị khác xa so với khoai tây trồng. Để tổ hợp được các đặc tính của khoai tây trồng vào các con lai soma, các con lai soma này thường được lai lại với khoai tây trồng (sử dụng khoai tây trồng làm bố). Lựa chọn 3 con lai có khả năng ra hoa cao nhất để làm cây mẹ. Các phép lai hữu tính được tiến hành trên Sapa – Lào Cai vào năm 2016. Các hạt lai được gieo nảy và tiếp tục được đánh giá, sàng lọc tính kháng PVY và các tính trạng nông sinh học. Kết quả lai tạo được thể hiện qua Bảng 3.19. Bảng 3.19. Kết quả lai hữu tính giữa các con lai soma và khoai tây trồng tứ bội Tổ hợp lai soma Ký hiệu Số quả Số hạt thu STT Cây bố Ký hiệu (dòng mẹ) dòng mẹ thu được được 1 trn3G (+) Delikat 2195/2 Rasant 10 178 13.1300 2 pnt2G (+) Delikat 2235/1 Atlantic 4 62 13.1301 3 trn3G (+) Delikat 2195/2 Delikat 19 484 13.1302 4 blb2G (+) Delikat 2283/5 Delikat 18 352 13.1303 5 pnt2G (+) Delikat 2235/1 Delikat 21 738 13.1304 6 pnt2G (+) Delikat 2235/1 Rasant 23 284 13.1305 Tổng 95 2098 Kết quả lai hữu tính đã thu được 95 quả lai của 6 tổ hợp lai, đếm được tổng số 2098 hạt lai. Một lượng lớn hạt lai đã được tạo ra, mỗi hạt lai sẽ là một dòng lai BC1 cần được đánh giá cả về các đặc tính nông sinh học cũng như tính kháng bệnh virus, nhằm đánh giá hiệu quả của phương pháp chọn tạo giống khoai tây bằng dung hợp tế bào kết hợp lai hữu tính. 3.4.1.2. Chọn lọc các con lai BC1 có khả năng kháng virus PVY Để giảm tải công việc chọn lọc khi đánh giá một số lượng lớn hạt lai BC1 (2098 hạt) thì việc sàng lọc tính kháng ở giai đoạn cây con là rất quan trọng. Sàng lọc những cây con sinh trưởng phát triển yếu, không có khả năng kháng virus sẽ giúp cho việc theo dõi, đánh giá các thí nghiệm tiếp theo được thuận lợi hơn. Các hạt lai BC1 sau khi được xử lý ngủ nghỉ với GA3 qua đêm được gieo trên nền giá thể mùn tơi xốp. Bảng 3.20. Khả năng nảy mầm của hạt lai BC1 Dòng Dòng Ký hiệu Số hạt Số hạt nảy Số cây STT Tổ hợp “mẹ” “bố” dòng lai gieo mầm (hạt) khỏe 1 trn3G (+) Delikat 2195/2 Rasant BC1 1300 70 50 16 2 pnt2G (+) Delikat 2235/1 Atlantic BC1 1301 30 12 9 3 trn3G (+) Delikat 2195/2 Delikat BC1 1302 60 48 11 4 blb2G (+) Delikat 2283/5 Delikat BC1 1303 70 36 10 5 pnt2G (+) Delikat 2235/1 Delikat BC1 1304 50 32 4 6 pnt2G (+) Delikat 2235/1 Rasant BC1 1305 35 12 5 Tổng 315 190 55 Khi cây có 2 lá thật, chuyển những cây sinh trưởng phát triển khỏe sang chậu vại để tiến hành lây nhiễm nhân tạo với PVY. Sử dụng que thử nhanh virus của hãng Agdia để chọn lọc các dòng sạch bệnh. Kết quả trình bày ở Bảng 3.21. Bảng 3.21. Đánh giá khả năng kháng bệnh virus của con lai BC1 ở giai đoạn cây con. Ký hiệu Số cây Số cây Tỷ lệ dòng lai lây nhiễm sạch virus cây sạch virus BC1 1300 16 6 37,5 BC1 1301 9 3 33,3
19. 19 BC1 1302 11 9 81,8 BC1 1303 10 4 40,0 BC1 1304 4 2 50,0 BC1 1305 5 2 40,0 Tổng 55 26 47,3 Trong 55 dòng lai được lây nhiễm virus thì có 26 dòng không bị nhiễm bệnh đạt 47,3%. Hai sáu dòng lai sạch bệnh này sẽ được tiếp tục theo dõi để chọn ra những dòng có tiềm năng năng suất và các đặc tính nông sinh học giống khoai tây trồng. 3.4.1.3. Chọn lọc các con lai BC1 có các đặc tính nông sinh học mong muốn Các dòng lai BC1 sau khi được chọn lọc kháng virus sẽ được chăm sóc, theo dõi các đặc tính nông sinh học để chọn lọc ra các dòng lai triển vọng để khảo nghiệm tiếp vụ sau. Bảng 3.22. Bảng đánh giá hình thái và kiểu sinh trưởng của các con lai BC1 STT Kí hiệu dòng Cấu trúc tán Kiểu sinh trưởng Hình thái/sức sinh trưởng 1 BC1 1300.3 Trung gian Đứng T, +++ 2 BC1 1300.6 Dạng Lá Nửa đứng T, ++ 3 BC1 1300.9 Dạng Lá Nửa đứng T, +++ 4 BC1 1300.13 Trung gian Đứng T, +++ 5 BC1 1300.14 Trung gian Nửa đứng T, +++ 6 BC1 1300.16 Dạng Lá Nửa đứng T, +++ 7 BC1 1301.4 Dạng Thân Đứng T, +++ 8 BC1 1301.5 Trung gian Bò T, ++ 9 BC1 1301.11 Dạng Thân Bò T, ++ 10 BC1 1302.1 Dạng Thân Nửa đứng T, ++ 11 BC1 1302.2 Dạng Thân Nửa đứng T, +++ 12 BC1 1302.3 Trung gian Nửa đứng T, +++ 13 BC1 1302.4 Dạng Thân Nửa đứng T, +++ 14 BC1 1302.5 Dạng Thân Đứng T, ++ 15 BC1 1302.6 Trung gian Nửa đứng T, +++ 16 BC1 1302.7 Trung gian Nửa đứng T, ++ 17 BC1 1302.11 Trung gian Nửa đứng T, +++ 18 BC1 1302.10 Dạng Thân Đứng T, ++ 19 BC1 1303.2 Trung gian Nửa đứng T, +++ 20 BC1 1303.3 Trung gian Đứng T, ++ 21 BC1 1303.4 Dạng Lá Bò T, +++ 22 BC1 1303.6 Trung gian Đứng T, +++ 23 BC1 1303.22 Dạng Lá Nửa đứng T, +++ 24 BC1 1304.1 Trung gian Nửa đứng T, +++ 25 BC1 1304.3 Trung gian Nửa đứng T, + 26 BC1 1305.6 Dạng Thân Nửa đứng T, +++ ĐC Solara (ĐC) Trung gian Nửa đứng T, +++ Chú thích: T: dạng trồng; + yếu; ++ trung bình; +++ khỏe Kết quả Bảng 3.22 cho thấy: Trong cùng một tổ hợp lai các dòng khác nhau có sự khác nhau về cấu trúc tán và kiểu sinh trưởng của các dòng lai. Điều này là do sự phân ly của phép lai hữu tính. Các dòng lai BC1 đều có sức sinh trưởng khá tốt, tương đương với khoai tây trồng là Solara, ngoại trừ dòng BC1 1304.3. Dòng này mặc dù có kiểu hình giống với khoai tây trồng, không còn hình dạng giống với khoai tây dại nhưng sức sinh trưởng lại yếu. Bảng 3.23. Bảng đánh giá năng suất và hình thái củ của các con lai BC1
20. 20 slc/cây Kltbc/cây Màu vỏ Màu thịt Độ sâu STT Kí hiệu Dạng củ (củ) (gam) củ củ mắt ngủ 1 BC1 1300.3 7 130,4 Ovan dài Vàng Vàng nhạt Rất nông 2 BC1 1300.6 8 120,8 Ovan Tím Vàng TB Sâu 3 BC1 1300.9 11 120,1 Ovan dài Nâu đỏ Kem Nông 4 BC1 1300.13 11 60,8 Ovan Vàng Kem Nông 5 BC1 1300.14 16 50,8 Ovan Nâu đỏ Vàng TB Nông 6 BC1 1300.16 3 190,8 Ovan dài Vàng Vàng nhạt Nông 7 BC1 1301.4 5 170,1 Tròn Vàng Vàng TB Sâu 8 BC1 1301.5 7 150,7 Ovan Tím Vàng nhạt Trung bình 9 BC1 1301.11 7 130,4 Ovan Tím đậm Vàng TB Trung bình 10 BC1 1302.1 6 120,1 Ovan dài Kem nhạt Vàng nhạt Nông 11 BC1 1302.2 13 70,1 Ovan Kem nhạt Vàng nhạt Trung bình 12 BC1 1302.3 11 60,8 Ovan Nâu đỏ Kem Nông 13 BC1 1302.4 6 140,8 Ovan ngắn Nâu đỏ Kem Trung bình 14 BC1 1302.5 8 120,8 Ovan dài Nâu đỏ Vàng nhạt Nông 15 BC1 1302.6 5 150,1 Ovan Nâu đỏ Vàng nhạt Trung bình 16 BC1 1302.7 9 100,7 Tròn Vàng Vàng TB Nông 17 BC1 1302.11 9 90,8 Ovan Vàng Vàng nhạt Trung bình 18 BC1 1302.10 12 50,2 Ovan Vàng Vàng nhạt Nông 19 BC1 1303.2 4 180,1 Tròn Kem nhạt Kem Nông 20 BC1 1303.3 18 60,5 Ovan Vàng Vàng nhạt Nông 21 BC1 1303.4 7 150,3 Ovan Tím Trắng kem Nông 22 BC1 1303.6 12 100,4 Ovan Đỏ một phần Vàng TB Trung bình 23 BC1 1303.22 5 180,1 Ovan Vàng Vàng nhạt Rất sâu 24 BC1 1304.1 5 150,6 Ovan Vàng Vàng nhạt Trung bình 25 BC1 1304.3 20 50,4 Ovan Vàng Vàng nhạt Trung bình 26 BC1 1305.6 5 140,1 Ovan Vàng Vàng TB Trung bình Chú thích: slc/cây: số lượng củ/cây; kltbc/cây: khối lượng trung bình củ/cây Số liệu Bảng 3.23 cho thấy các đặc điểm về hình dạng, màu sắc của vỏ củ, thịt củ hay độ sâu mắt ngủ của các dòng con lai BC1 ngày càng hướng về giống trồng xác nhận. Kết thúc vụ thanh lọc đánh giá các dòng lai BC1, kết quả đánh giá qua hai Bảng 3.22, 3.23 bước đầu đã chọn lọc được những dòng triển vọng nhất: tổ hợp 1300 thu được hai dòng 1300.3, 1300.6; tổ hợp 1301 thu được 3 dòng 1301.4, 1301.5, 1301.11; tổ hợp 1302 thu được 3 dòng: 1302.4, 1302.5, 1302.6; tổ hợp 1303 thu được 3 dòng: 1303.2, 1303.4, 1303.22; tổ hợp 1304 thu được duy nhất dòng 1304.1; tổ hợp 1305 thu được một dòng 1305.6. Đây sẽ là nguồn vật liệu được sử dụng đánh giá vụ sau. 3.4.1.4. Đánh giá các con lai BC1 sau thanh lọc 190 dòng nảy mầm từ 315 hạt lai đã được thanh lọc để chọn ra 26 dòng có khả năng sinh trưởng phát triển tốt, đặc điểm nông sinh học giống với khoai tây trồng và sạch virus khi lây nhiễm nhân tạo. Từ 26 dòng này tiếp tục được đánh giá về đặc điểm hình thái và thu được 13 dòng có thể phát triển thành dòng/giống tiếp. Củ của 13 dòng này được trồng trong điều kiện chậu vại (giá thể sơ dừa) để tiếp tục chọn lọc các dòng triển vọng nhất. Bảng 3.24. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây khảo sát Chiều cao cây Số thân STT Dòng/giống Số lá TB/cây TB (cm) TB/khóm 1 BC11300.3 19,36 86,10 5,8
21. 21 2 BC1 1300.6 17,53 82,11 5,0 3 BC1 1301.4 16,57 80,27 4,0 4 BC1 1301.5 19,56 94,32 4,5 5 BC1 1301.11 18,23 89,26 4,4 6 BC1 1302.4 18,26 90,12 5,0 7 BC1 1302.5 17,16 87,56 5,1 8 BC1 1302.6 14,34 87,93 5,0 9 BC1 1303.2 15,48 82,59 5,5 10 BC1 1303.4 20,37 89,68 5,7 11 BC1 1303.22 19,59 93,12 5,1 12 BC1 1304.1 17,23 84,10 4,9 13 BC1 1305.6 19,51 92,21 6,0 14 Rasant 20,37 97,63 5,2 15 Delikat 22,48 92,28 4,5 16 Atlantic 20,67 95,12 5,5 17 Solara 21,13 91,10 5,0 Số liệu Bảng 3.24 cho thấy sự phát triển khá đồng đều giữa các dòng khảo sát và khá tương đồng so với hai giống khoai tây trồng làm đối chứng Bảng 3.25. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây khảo sát Số củ TB/ Khối lượng TB/ Phân Loại Củ (%) STT Dòng/giống khóm (củ) khóm (gam) Φ >5cm 3cm-Φ-5cm Φ <3cm 1 BC1 1300.3 8,2 642,0 42,4 34,5 14,1 2 BC1 1300.6 6,7 440,0 10,3 55,5 34,2 3 BC1 1301.4 7,3 464,7 22,5 51,8 25,7 4 BC1 1301.5 8,0 540,0 44,5 39,6 15,9 5 BC1 1301.11 6,3 386,7 10,4 59,5 30,1 6 BC1 1302.4 4,7 286,7 25,9 32,6 41,5 7 BC1 1302.5 7,0 236,3 5,6 34,6 59,8 8 BC1 1302.6 7,3 316,7 8,3 38,2 53,5 9 BC1 1303.2 6,7 253,3 18,7 38,9 42,4 10 BC1 1303.4 5,3 434,7 43,0 38,1 18,9 11 BC1 1303.22 7,3 420,0 36,6 44,8 18,6 12 BC1 1304.1 6,3 386,7 18,5 49,8 31,7,7 13 BC1 1305.6 8,7 552,6 35,8 39,3 24,9 14 Rasant 5,3 486,7 38,5 34,6 26,9 15 Delikat 8,7 634,0 28,8 46,6 24,6 16 Atlantic 8,0 443,3 27,5 44,2 28,3 17 Solara (ĐC) 9,0 616,7 20,4 54,6 25,0 Kết quả bảng 3.25 cho thấy số lượng củ trung bình trên khóm của các dòng BC1 so với giống trồng không có sự sai khác quá lớn, dao động chung từ 4 - 9 củ/khóm. Qua các thí nghiệm đánh giá về sự sinh trưởng, phát triển, các yếu tố cấu thành năng suất chất lượng giữa các dòng lai lại so với giống “bố” và giống trồng xác nhận bước đầu đã chọn lọc được một số dòng triển vọng nhất: BC1 1300.3, 301.5, 1303.4, 1303.22 và 13.1305.6. Các dòng này sẽ tiếp tục đánh giá ngoài đồng ruộng, kiểm tra gen kháng bằng chỉ thị phân tử 3.4.2. Đánh giá khả năng kháng PVY của các con lai BC1 triển vọng trên đồng ruộng và kiểm gia sự có mặt của gen kháng PVY kháng bằng chỉ thị phân tử Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với gen Rysto là GP 122406 nhân được đoạn ADN có kích thước 406 bp. Mẫu ADN tổng số của các vật liệu sau tách chiết được chạy PCR với cặp mồi GP 122406. Một lượng nhỏ của sản phẩm chạy PCR
22. 22 được lấy ra chạy điện di kiểm tra kết quả trước khi tiến hành ủ với enzyme EcoRV. Kết quả điện di sản phẩm PCR được thể hiện trên Hình 3.20 dưới đây: Hình 3.20. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY khi chạy cặp mồi GP 122406 Chú thích: 1- dòng 13.1300.3; 2- dòng 13.1301.5; 3- dòng 1303.4; 4- dòng 1303.22; 5- dòng 1305.6; 6- Atlantic; 7– Delikat; 8– Rasant Sản phẩm PCR thu được ở trên được tinh sạch và tiếp tục ủ với enzyme giới hạn EcoRV, sau đó điện di kiểm tra. Kết quả thể hiện trên bản điện di sau đây: Hình 3.21. Kết quả điện di kiểm tra gen kháng virus PVY sau khi cắt bằng enzyme giới hạn EcoRV Chú thích: 1- dòng 13.1300.3; 2- dòng 13.1301.5; 3- dòng 1303.4; 4- dòng 1303.22; 5- dòng 1305.6; 6- Atlantic; 7– Delikat; 8- Rasant Như vậy có thể nhận thấy gen kháng bệnh virus được truyền từ dòng dại sang con lai soma thông qua dung hợp tế bào. Các con lai soma được lai lại với giống trồng tạo con lai BC1 và chúng duy trì gen kháng bệnh được truyền từ dòng khoai tây dại sang. 3.4.3. Khảo sát diện hẹp các dòng lai BC1 triển vọng trên đồng ruộng Các dòng lai triển vọng lại được tiếp tục đánh giá chọn lọc trên điều kiện đồng ruộng để đánh giá độ ổn định về hình thái, khả năng sinh trưởng và năng suất. Bảng 3.26. Đặc tính nông sinh học các dòng/giống khoai tây khảo sát trên điều kiện đồng ruộng Sô thân/ Dòng/gi Tỷ lệ Sức sinh Độ đồng đều Dạng Màu sắc khóm Màu sắc lá ống mọc % trưởng của cây giữa các khóm cây thân 1300.3 9 Trung bình Trung bình Đứng 5,5 Xanh đậm Xanh tím 1301.5 91 Kém Trung bình Đứng 4,0 Xanh đậm Xanh tím Nửa Xanh 1303.4 93 Trung bình Trung bình 5,5 Xanh đậm đứng nhạt Nửa Xanh trung Xanh 1303.22 95 Trung bình Trung bình 4,5 đứng bình đậm Nửa Xanh trung Xanh 1305.6 97 Trung bình Trung bình 6,0 đứng bình đậm Nửa Xanh Rasant 100 Trung bình Trung bình 5,0 Xanh đậm đứng nhạt Nửa Xanh Delikat 100% Trung bình Trung bình 4,5 Xanh đậm đứng đậm Atlantic Xanh trung Xanh 100% Trung bình Trung bình Đứng 5,5 (ĐC) bình đậm Solara Xanh 100% Trung bình Trung bình Đứng 5,0 Xanh đậm (ĐC) đậm
23. 23 Theo Bảng 3.26, sự khác nhau lớn nhất nhận thấy ở dòng lai lại so với giống trồng và giống sử dụng làm “bố” trong phép lai backcross chính là tỷ lệ mọc của củ giống được trồng trong điều kiện vụ đông năm 2017 - 2018. Trong khi các giống trồng có tỷ lệ mọc đạt 100% thì các dòng BC1 đạt tối đa là 97%, thấp nhất là dòng 1301.5 đạt 91%. Về sức sinh trưởng và độ đồng đều giữa các khóm thì hầu hết các dòng lai lại đều tương đương với các giống trồng, ở mức độ trung bình như nhau. Bảng 3.27. Thời gian sinh trưởng qua các giai đoạn của các dòng/giống khoai tây Thời gian từ Thời gian từ Thời gian từ hình Tổng thời gian trồng đến hình Dòng/giống trồng đến mọc thành tia củ đến thu sinh trưởng thành tia củ (ngày) hoạch (ngày) (ngày) (ngày) BC1 1300.3 18 28 66 112 BC1 1301.5 16 26 67 109 BC1 1303.4 12 24 67 103 BC1 1303.22 12 23 75 110 BC1 1305.6 13 25 62 100 Rasant 10 23 87 120 Delikat 11 22 88 121 Atlantic (ĐC) 12 25 68 105 Solara (ĐC) 15 24 62 101 Qua kết quả theo dõi ở Bảng 3.27 thì thời gian từ trồng tới mọc của các dòng/giống dao đồng từ trong khoảng 10 - 18 ngày. Trong đó Rasant bắt đầu mọc sớm nhất (sau trồng 10 ngày). Hai dòng 1300.3 và 1301.5 mọc chậm nhất (16 - 18 ngày), còn lại thì mọc trong khoảng từ 11 - 15 ngày. Như vậy, trong khoảng thời gian sinh trưởng khoảng 4 tháng trồng khoai tây, đã thu được một khối lượng sản phẩm lớn, có ý nghĩa và giá trị cao. Theo số liệu trong Bảng 3.27, có thể nhận thấy sự tương đồng của các dòng lai lại so với các giống trồng. Các số liệu này so với số liệu đánh giá vụ xuân năm 2017 ở Sapa cho thấy các dòng BC1 vẫn giữ được các đặc điểm vượt trội về sinh trưởng, phát triển của các giống trồng qua 2 lần đánh giá. Các yếu tố hình thành năng suất, phẩm chất củ thu được của các dòng/giống khảo sát Những dòng lai BC1 được trồng khảo sát cùng giống khoai tây trồng và các yếu tố cấu thành nên năng suất. So sánh đồng thời các tiêu chí này giữa dòng lai BC1 và giống trồng xác nhận để từ đó chọn lọc ra dòng triển vọng nhất giới thiệu cho chương trình chọn tạo. Bảng 3.28. Các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng/giống khoai tây khảo sát Phân loại củ (%) Kltbc/khóm Kltbc/m2 NSLT NSTT Dòng/giống 2 3cm ≤ (g/khóm) (g/m ) (tấn/ha) (tấn/ha) Φ ≤ 3cm Φ ≥ 5cm Φ≤ 5cm BC1 1300.3 750 3570 45,0 35,7 45,0 37,0 18,0 BC1 1301.5 540 2900 32,4 29,0 35,5 45,5 20,0 BC1 1303.4 310 1730 18,6 17,3 22,5 51,8 25,7 BC1 1303.22 390 2530 23,4 25,3 35,5 42,6 21,9 BC1 1305.6 560 3100 33,6 31,0 48,4 39,5 12,1 Atlantic 460 1530 27,6 29,0 25,9 32,6 41,5 Rasant 460 2900 27,6 15,3 35,3 41,2 23,5 Delikat 670 3130 40,2 35,6 32,7 44,9 22,4 Solara (ĐC) 670 3560 40,2 31,3 37,6 32,6 29,8 CV 13,4 10,3 0.47 LSD0,05 120 470 10.3
24. 24 Kết luận: Đã khẳng định được gen kháng của khoai tây dại có thể duy trì sang thế hệ BC1 khi lai lại giữa con lai soma và khoai tây trồng. Các đặc tính nông sinh học của các con lai soma (6x) giữa khoai tây dại và khoai tây trồng được cải thiện, có các đặc tính giống với khoai tây trồng hơn sau phép lai lại với khoai tây trồng. Từ các kết quả thanh lọc, đánh giá ngoài đồng ruộng qua 2 vụ trồng cho thấy con lai BC1 1300.3 và BC1 1305.6 là những con lai triển vọng mang những tính trạng quý và kháng virus. Đây là nguồn vật liệu quý để phát triển thành giống hoặc làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống. KIẾN LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1. Đã xây dựng thành công quy trình tách, dung hợp và nuôi cấy tế bào trần của các dòng khoai tây nhị bội (A16, A15, A56, B186, B208); các dòng khoai tây dại (S.tarnii, S.pinatisectum, S.bulbocastanum); các giống khoai tây trồng tứ bội S.tuberosum (Rasant, Delikat, Atlantic). Tùy theo giống, có thể thay đổi thành phần dung dịch hỗn hợp enzyme macerozyme/cellulase theo tỉ lệ 0,2 – 0,8%; 0,2 - 0,6% là thích hợp để tách tế bào trần; thời gian ủ enzyme 15 ± 1 giờ là tốt nhất với tất cả các dòng nghiên cứu; tuổi cây in vitro từ 3 - 4 tuần tuổi. Dung hợp bằng phương pháp xung điện ở tần số 800 kHz, 2 lần xung và mật độ tế bào thích hợp để tiến hành dung hợp là từ 3 x 105 tế bào/ml đến 4x 105 tế bào/ml; môi trường thích hợp để nuôi cấy, tái sinh tế bào trần sau dung hợp là môi trường VKM II lỏng, môi trường tái sinh là RJM. 2. Đã dung hợp 3 tổ hợp của các dòng khoai tây trồng nhị bội (diploid) và tái sinh cây thành công. Bằng phương pháp xác định độ bội nhờ thiết bị Flow cytometry và xác định con lai dị nhân (heterozygote) qua phân tích chỉ thị SSR có sử dụng thiết bị Beckman Genome lab coulters đã xác định được 36 con lai soma tứ bội (tetraploid) dị nhân. Các con lai đã được đánh giá ở điều kiện chậu vại kết quả chọn được 4 con lai vừa có khả năng kháng virus PVY, vừa có phẩm chất chế biến chip tốt là 47/7; 47/26; 81-2; 131/11. Kết quả đã khẳng định các bước của quá trình dung hợp và chọn lọc con lai soma. 3. Đã tiến hành dung hợp, tái sinh và chọn lọc con lai soma của các tổ hợp giữa khoai tây dại nhị bội (diploid) S. tarnii, S. Pinnatisectum, S. bulbocastanum mang gen siêu kháng PVY Rysto với khoai tây trồng tứ bội có đặc tính nông sinh học quý nhưng mẫn cảm với PVY (Atlantic, Delikat, Rasant), chọn tạo dược 13 con lai soma lục bội (hexaploid). Kết quả lai lại của con lai soma 6x với khoai tây trồng thu được 26 dòng lai sạch bệnh virus. Qua 2 vụ trồng, đã chọn được 02 dòng BC1 có khả năng kháng virus PVY, mang các đặc tính nông sinh học quý là BC1 1300.3 và BC1 1305.6. Đây sẽ là vật liệu khởi đầu có giá trị cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus PVY ở Việt Nam. 4. Bằng việc đánh giá khả năng chuyển đặc tính kháng virus qua lai soma và lai lại hữu tính (Backcross) cho thấy, gen siêu kháng PVY Rysto có mặt trong các dòng khoai tây dại đều được chuyển vào con lai soma qua dung hợp tế bào trần, cũng như hiện diện trong con lai BC1 khi được chọn lọc. Đề nghị 1. Nên đẩy mạnh hướng nghiên cứu dung hợp tế bào trần như một hướng có hiệu quả trong chọn tạo giống khoai tây, nhằm chuyển các đặc tính quý (kháng bệnh và kháng stress phi sinh học) từ khoai tây dại vào khoai tây trồng, điều mà các biện pháp chọn tạo giống truyền thống (lai hữu tính) không thể thực hiện được. Sử dụng các kỹ thuât tách, dung hợp, tái sinh, chọn lọc con lai soma khoai tây mà đề tài đã nghiên cứu thành công. 2. Sử dụng các vật liệu khởi đầu BC1 1300.3 và BC1 1305.6 vào các chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng PVY. Tiếp tục tiến hành lai lại thêm nhiều lần với khoai tây trồng và chọn lọc theo hướng tăng cường các đặc tính nông sinh học quý (năng suất cao, phẩm chất tốt) và duy trì tính kháng PVY .