Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ xử lý rong lục Việt Nam và lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ xử lý rong lục Việt Nam và lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu

1. MỞ ĐẦU Khi nhu cầu năng lượng thế giới tiếp tục tăng và nguồn nhiên liệu hóa thạch đang giảm, nhiên liệu sinh học là giải pháp thay thế thích hợp. Ethanol là sản phẩm nhiên liệu được sử dụng phổ biến nhất và được nhiều quốc gia tập trung nghiên cứu. Tuy nhiên nguồn nguyên liệu sản xuất ethanol còn có hạn chế là chiếm một lượng lớn đất nông nghiệp, cũng như nguồn nước, thời gian và công chăm sóc, canh tác, đặt biệt ảnh hưởng an ninh lương thực. Trước tình hình đó, tìm ra một nguồn nguyên liệu mới trong việc sản xuất cồn sinh học được đẩy mạnh. Rong biển là một lựa chọn thích hợp và đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Rong biển có sản lượng tự nhiên lớn, vòng đời sinh trưởng ngắn, dễ thu hoạch, giá thành rẻ và nuôi trồng thu được sinh khối lớn. Hàm lượng carbohydrate cao từ 40 - 79,4 %, rong có lignin thấp dễ thủy phân, thành phần đường chủ yếu là đường 6 carbon nên đễ dàng lên men đạt hiệu suất khoảng 70-90%. Việt Nam có bờ biển dài hơn 3200 km có chứa sinh khối rong biển rất lớn, trong đó rong lục là phổ biến nhất. Ước tính mỗi năm có khoảng 2 triệu tấn khô được tạo thành. Tuy nhiên rong lục chưa được sử dụng hợp lý, chỉ có số ít loài được nghiên cứu chế biến các sản phẩm sinh học, số còn lại tự phân hủy ngoài tự nhiên gây ô nhiễm. Vì vậy nghiên cứu sản xuất ethanol từ rong lục là một giải pháp thích hợp để tạo ra nhiên liệu sạch, giải quyết ô nhiễm môi trường và gia tăng lợi ích kinh tế cho người dân ven biển. Để sản xuất được ethanol nhiên liệu từ rong lục, cần phải tiến hành các bước: lựa chọn đối tượng rong lục thích hợp, đảm bảo sinh khối ổn định bằng tiến hành nuôi trồng gia tăng sinh khối, sử dụng các kỹ thuật xử lý nguyên liệu, tìm các phương pháp thích hợp để đường hóa rong lục và lên men tạo ethanol. Về nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rong lục tại Việt Nam hiện nay mới được đề cập tuy vậy vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ xử lý rong lục Việt Nam và lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu” để đưa ra được một cách hoàn chỉnh công nghệ lên men ethanol nhiên liệu từ nguồn sinh khối rong lục. Mục tiêu Chọn được rong lục thích hợp cho lên men ethanol Chọn được giải pháp công nghệ xử lý và thủy phân rong lục để lên men tạo ethanol Chọn được giải pháp công nghệ lên men ethanol từ dịch thủy phân rong lục Nội dung nghiên cứu
2. 1. Nghiên cứu lựa chọn nguồn rong lục Việt Nam làm nguyên liệu cho lên men ethanol 2. Nghiên cứu chọn giải pháp xử lý và thủy phân rong lục để lên men tạo ethanol 3. Nghiên cứu chọn giải pháp lên men ethanol từ dịch thủy phân rong lục Những đóng góp mới của luận án - Nghiên cứu đầu tiên một cách có hệ thống về rong lục từ khảo sát lựa chọn nguồn rong lục đến thủy phân và lên men ethanol. - Nghiên cứu nguồn rong biển Việt Nam làm nguyên liệu sản xuất ethanol bằng phương pháp thân thiện môi trường là hướng nghiên cứu phù hợp với xu thế của thế giới nhằm thay thế nguồn nhiên liệu hóa thạch Bố cục của luận án Luận án được trình bày trong 115 trang: mở đầu (2 trang), tổng quan tài liệu (27 trang), vật liệu và phương pháp nghiên cứu (21 trang), kết quả và thảo luận (54 trang với 46 bảng và 20 hình), kết luận và kiến nghị (2 trang), danh mục các công trình đã công bố (1 trang) và tài liệu tham khảo (8 trang với 23 tài liệu tiếng Việt và 77 tài liệu tiếng Anh). CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Rong biển bao gồm 03 tiểu mục. 1.1 Rong biển: giới thiệu rong biển, miêu tả ba ngành rong đỏ, lục, nâu và đặc điểm nhận biết của chúng. 1.2 Thành phần hóa học của các loại rong biển: Miêu tả thành phần hóa học và các dạng polysaccharid và monosacharid có trong ba ngành rong đỏ, lục, nâu. 1.3 Rong lục: miêu tả cấu tạo hình thái, đặc điểm tế bào và cơ chế sinh sản. Dựa trên các đặc điểm sinh học và thành phần hóa học của nguyên liệu rong biển nói chung và rong lục nói riêng, chúng tôi tiến hành khảo sát các loài rong lục Việt Nam để chọn được đối tượng thích hợp cho sản xuất ethanol. 1.2 Công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển và sinh khối khác bao gồm 04 tiểu mục. 1.2.1 Tiềm năng rong biển sản xuất ethanol chỉ ra rong biển có năng suất sinh học cao hơn các sinh khối khác nên được nhiều tác giả nghiên cứu. 1.2.1 Quá trình xử lý sơ bộ nguyên liệu rong biển. 1.2.3 Quá trình thủy phân rong biển chỉ ra các công nghệ đường hóa rong biển bằng axit và bằng enzyme được thực hiện bới nhiều nghiên cứu với các đối tượng rong biển khác nhau theo hai phương pháp thủy phân trong axit loãng với nhiệt cao hoặc tiền xử lý rồi đường hóa bằng enzyme, 1.2.4 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển chỉ ra các giống nấm men 2
3. sử dụng cho lên men và các công nghệ lên men dịch thủy phân từ rong biển. Từ công nghệ sản xuất cồn của các nghiên cứu trên thế giới, chúng tối chọn giải pháp đường hóa và lên men rong lục Việt Nam theo hai hướng thủy phân bằng axit và bằng enzyme, rồi sử dụng dịch thủy phân tiến hành lên men với các chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae 1.3 Tình hình sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển trên thế giới và Việt Nam bao gồm 02 tiểu mục. 1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển trên thế giới, phần này nêu các thành tựu trong nghiên cứu ethanol từ rong biển và các dự án đang tiến hành trên thế giới. 1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển ở Việt Nam: khái quát tình hình nghiên cứu tại Việt Nam. Các thành tựu nghiên cứu này sẽ giúp chúng tôi đánh giá được hiệu quả sản xuất ethanol từ rong lục Việt nam và chỉ ra các sự khác biệt của sinh khối rong lục so với các sinh khối khác. CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Rong Lục được thu ở các tỉnh ven biển Thanh Hóa, Thái ình, Ninh ình, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, ến Tre, Cà Mau trong khoảng thời gian từ năm 2011 đến năm 2013. Rong Chaetomorpha linum, Chi Chaetomorpha, Ngành Chlorophyta, Lớp Ulvophyceae, ộ Cladophorales, Họ Cladophoraceae. Rong được sấy khô đến độ ẩm 13% sử dụng cho nghiên cứu. Chế phẩm Enzyme: Viscozyme L (Vis.) có mã số (V2010-50ml) sản xuất bởi công ty Novozyme. Cellulase (Cel.) có mã số (C2605-50ml) sản xuất bởi công ty Novozyme. Chế phẩm nấm men: Chế phẩm Thermosacc hãng sản xuất Lallemand là nấm men Saccharomyces cerevisiae. Chế phẩm Red Ethanol là nấm men Saccharomyces cerevisiae của hãng Fermentis, Pháp. Saccharomyces cerevisiae được sản xuất tại công ty sản xuất Cồn Cây Cày Khánh Hòa (SacCCC). Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 sưu tầm tại Viện Sinh học Nhiệt đới (SacSHNĐ). Chế phẩm Turbo Yeast là nấm men Saccharomyces cerevisiae do hãng Fermtech Wholasale của Anh sản xuất được sưu tầm tại Đại học ách Khoa TP HCM (SacBKHCM). 2.2 Các phƣơng pháp phân tích, toán học và tính hiệu suất, thống kê Xác định độ ẩm, xác định tro, xác định hàm lượng nitơ và protein theo phương pháp Kjeldahl, xác định hàm lượng lipid bằng máy soxhlet. theo tiêu chuẩn AOAC (2007). Xác định thành phần môi trường lên men: nito tổng số, phospho tổng số, lưu huỳnh tổng số bằng phương pháp so màu 3
4. theo Samira và cs (2009). Xác định đường tổng số và đường trong dịch thủy phân theo Wrolstad và cs (2001). Xác định thành phần polysaccharide của rong lục gồm xác định cellulose và ulvan theo Myoung Lae Cho và cs (2010), xác định hàm lượng agar theo Suthasinee và cs (2010). Xác định thành phần monosacharid của dịch thủy phân rong lục bằng hệ thống săc ký lỏng hiệu năng cao áp (HPLC) theo Mitsunori Yanagisawa và cs (2011). Xác định hàm lượng ethanol bằng hai phương pháp HPLC và so màu theo phương pháp ennet của Zahid Anwar và cs (2012). Xác định hoạt độ enzyme hoạt độ endoglucanase, hoạt độ exoglucanase, hoạt độ beta- glucosidase, hoạt độ amylase, hoạt độ ulvanase, hoạt độ beta-glactosidase, hoạt độ xylanase bằng lượng đường khử tạo thành phân tích theo phương pháp Somogyi-Nelson theo Wrolstad và cs (2001). Phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm theo Nguyễn Minh Tuyển (2005). Tính toán mô hình toán học theo phần mền excel 2010 theo Timothy R. (2001) Thực nghiệm tìm điều kiện tối ưu theo ox-willson. Xác định hiệu suất thủy phân, xác định hiệu suất lên men theo Mitsunori Yanagisawa và cs (2011).Thống kê số liệu sử dụng phần mền excel của Microsoft office 2010. 2.3 hảo sát nguồn sinh khối Phương pháp lấy mẫu: thu các đối tượng rong lục tại các trạm nghiên cứu, lưu giữ mẫu và định danh phân loại rong lục để xác định sinh lượng, trữ lượng, tần số bắt gặp, độ bao phủ, theo Nguyễn Hữu Dinh và cs (1999). Phương pháp nuôi khảo sát biến động thành phần hóa học của hai loài rong lục được chọn rong Mền Chaetomorpha linum và rong Nhánh Cladophora socialis trong phòng thí nghiệm theo Lê Như Hậu và cs (2011) 2.4 Nghiên cứu quá trình thủy phân từ rong lục Nghiên cứu phương pháp xử lý nguyên liệu: Nghiên cứu xử lý muối NaCl trong rong và nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước rong. Phương pháp thủy phân axit: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân rong bằng axit sunfuric gồm có nghiên cứu tỷ lệ rong phối trộn 75-200g /l; ảnh hưởng của nồng độ axit 0- 4%(v/v); ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân 90-130o C; động thái quá trình thủy phân rong 20- 80 phút. Tối ưu hóa quá trình thủy phân rong lục bằng axit. Phương pháp thủy phân bằng chế phẩm enzyme: Nghiên cứu quá trình thủy phân sơ bộ bằng axit tại nồng độ 0,1- 0,5 % (v/v) ở nhiệt độ 120oC trong 15 phút. Lựa chọn chế phẩm enzyme từ hai chế phẩm enzyme Viscozyme L (Vis.) và Cellulase (Cel.). Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân bằng chế phẩm enzyme được chọn gồm có: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme là 0-1 ml enzyme/g tương ứng hoạt 4
5. độ 0-50 U/g; ảnh hưởng của pH là 3- 6; ảnh hưởng của nhiệt độ là 30-60 OC; động thái quá trình thủy phân bằng chế phẩm enzyme 6- 36 giờ. Tối ưu hóa quá trình thủy phân rong lục bằng enzyme. 2.5 Nghiên cứu quá trình lên men Tuyển chọn chủng nấm men trên dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit (HaF). Tuyển chọn chủng nấm men trên dịch thủy phân rong Ch.linum bằng chế phẩm enzyme (HeF). Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men của nấm men được chọn gồm có: Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nito bổ sung; ảnh hưởng của pH 3,5-5,0; ảnh hưởng của nhiệt độ 20- 350C; động thái quá trình lên men. Tối ưu hóa quá trình lên men dịch thủy phân rong bằng axit. 2.6 hảo sát quá trình đƣờng hóa và lên men đồng thời (SSF) của dịch rong lục sau tiền xử lý Rong Chaetomorpha linum sau tiền xử lý, tiến hành đường hóa bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L với nồng độ 42,5U/g, nhiệt độ 50oC, pH 5.0, theo các thời gian 0, 6, 9, 12, 15, 18, 21giờ; sau đó giảm nhiệt độ về 30o C rồi bổ sung chế phẩm nấm men Red Ethanol nồng độ 1,2x106 tế bào /m, để tiếp tục đường hóa và lên men đồng thời trong thời gian 120 giờ. Chƣơng 3 ẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 L a chọn rong lục và thành phần hóa học rong lục Việt Nam 3.1.1 Lựa chọn các loài rong l c Việt a Quá trình khảo sát sinh khối rong lục Việt Nam kết quả thể hiện qua bảng 3.1 ảng 3. 1 Khảo sát các loài rong Lục ở Việt Nam S: g Đ L a TT Tên loài Sinh cảnh F (%) (khô/m2) (%) chọn 1 Monostroma nitidum iển 10,7 130±15 30 - 2 lactuca iển 53,6 130±17 55 + 3 papenfussii Ao tôm 57,1 220±22 70 + Ulva 4 reticulata iển 64,3 210±18 60 + 5 clathrata iển 17,9 60±12 10 - 6 torta Mương 100,0 280±25 65 + 7 Entero flexuosa Ao tôm 85,7 190±21 55 + 8 morpha compressa Đầm muối 64,3 120±14 50 + 9 intestinalis Mương 53,6 230±25 45 + 10 Rhizoclon kerneri Ao tôm 25,0 40±5 20 - 5
6. 11 ium kochianum Ao tôm 21,4 45±5 20 - 12 grande Ao tôm 28,6 35±5 15 - 13 gracilis Ao tôm 35,7 180±14 40 - 14 area Ao xử lý nước 75,0 300±21 80 + 15 linum Ao tôm 71,4 340±26 60 + 16 Chaeto antennina Ao tôm 57,1 260±16 35 - 17 morpha capillaris Ao xử lý nước 67,9 210±14 65 + 18 ligustica Ao tôm 64,3 190±16 45 + 19 javanica Ao hoang 60,7 150±15 40 + 20 crassa iển 35,7 120±10 40 - 21 albida iển 35,7 30±3 10 - 22 crispula Ao tôm 75,0 190±16 55 + 23 flexuosa Ao hoang 67,9 110±8 40 + Clado 24 laetevirens iển 28,6 65±4 20 - phora 25 papenfussii iển 32,1 60±5 15 - 26 prolifera iển 25,0 60±5 35 - 27. socialis Ao hoang 96,4 120±8 55 + 28 aegagropila iển 21,4 20±3 10 - Valonia 29 fastigiata iển 21,4 25±2 10 - 30 Boodlea composita iển 25,0 35±3 5 - 31 Cladophor membranacea iển 17,9 35±3 25 - 32 opsis adhaerens iển 14,3 20±2 25 - 33 adhaerens iển 21,4 20±2 15 - Codium 34 repens iển 21,4 20 15 - 35 peltata iển 17,9 50±3 40 - 36 racemosa iển 17,9 110±6 45 - Caulerpa 37 sertularioides iển 17,9 60±5 40 - 38 taxifolia iển 17,9 50±4 35 - 39 indica Biển 17,9 30±2 10 - Bryopsis 40 hypnoides iển 17,9 30±2 10 - 41 gracilis iển 17,9 80±4 25 - Halimeda 42 opuntia iển 17,9 85±4 25 - Chú thích: F: Tần số bắt gặp (%), S: sinh lượng g/m2, Đ: Độ phủ (%), (+) các loài rong thích hợp nghiên cứu ethanol, (-)các loài rong không thích hợp nghiên cứu ethanol. Kết quả của bảng 3.1 cho thấy nhóm khảo sát thu được 42 mẫu rong lục sinh trưởng và phát triển ở các vùng biển, ao tôm, mương nước, ao hoang, đầm muối, ao xử lý nước. Các chi rong Ulva, Enteromorpha, 6
7. Chaetomorpha, Cladophora có sự phân bố rộng, chúng xuất hiện ở tất cả các loại sinh cảnh như biển, ao tôm, đồng muối, ao hoang, mương nước. Trên cơ sở xác định sinh lượng, tần số bắt gặp và độ bao phủ chúng tôi đã lựa chọn được 15 loài rong Lục có sinh lượng > 100 gram khô/m2; tần số bắt gặp > 50% số trạm khảo sát, độ phủ > 40% độ bao phủ/ đơn vị diện tích mặt nước để sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất ethanol. 3.1.2 Thành ph n h a học c a các loài rong c chọn Kết quả xác định thành phần hóa học của 15 loài rong lục thể hiện ở bảng 3.2 ảng 3. 2 Thành phần hóa học của các loài rong lục được chọn Thành phần hóa học (%w chất khô) Carbohyd rate (tính STT Loài rong Protein Tro Lipid theo đường tổng) 1 lactuca 20,24±1,2 17,97±0,6 3,24±0,05 56,06±1,2 2 Ulva papenfussii 21,35±1,1 15,93±0,5 3,32±0,06 56,40±1,4 3 reticulata 22,52±1,2 14,58±0,5 3,28±0,08 56,71±1,5 4 flexuosa 16,83±0,9 12,98±0,4 2,90±0,04 65,59±1,7 5 Entero intestinalis 19,96±1,0 15,84±0,5 2,69±0,04 60,92±1,6 6 morpha torta 14,67±0,6 14,64±0,4 1,98±0,03 65,06±1,6 7 compressa 14,66±0,7 12,17±0,4 3,83±0,08 67,24±1,7 8 area 15,68±0,7 11,80±0,3 2,43±0,06 67,58±1,8 9 capillaris 13,70±0,6 11,96±0,3 2,03±0,02 69,83±1,7 Chaeto 10 javanica 13,45±0,5 17,91±0,5 2,32±0,05 64,21±1,5 morpha 11 ligustica 15,68±0,6 15,32±0,4 3,71±0,08 63,24±1,6 12 linum 21,01±0,9 10,46±0,3 2,53±0,07 64,20±1,5 13 socialis 16,13±0,8 8,72±0,2 2,24±0,06 70,88±1,8 Clado 14 flexuosa 17,06±0,8 8,80±0,2 2,34±0,06 69,99±1,8 phora 15 crispula 18,84±0,9 8,60±0,2 1,70±0,05 65,07±1,6 Qua kết quả ở bảng 3.2, trong thành phần hóa học của rong lục hàm lượng đường tổng là cao nhất, đường dao động trong khoảng 56 - 70%, trung bình đạt 64,10% và đạt giá trị cao nhất 70,88% ở loài Cladophora socialis và thấp nhất 56,05% ở loài Ulva lactuca. Trong suốt quá trình khảo sát chúng tôi thấy rằng hai loài rong lục trong ao đìa Chaetomorpha linum (Ch. linum), Cladophora socialis (Cl.socialis) sinh trưởng, phát triển mạnh và hàm lượng carbohydrate cao. Tại thời điểm thu mẫu sinh khối này chúng tôi thấy rằng rong Ch. linum chiếm tỷ trọng 7
8. cao nhất 45-50% nằm xen lẩn với loại rong này là Cl.socialis 30-35% và Enteromorpha torta (En.torta) 10-15%. Vì vậy chúng tôi tiến hành nuôi trồng và phân tích thành phần hóa học của hai đối tượng rong Ch.linum, Cl.socialis. 3.1.3 ghi n c u i n ng thành ph n h a học c a rong l c Chaetomorpha linum, Cladophora socialis theo chu s ng 3.1.3.1 Nghiên cứu khảo sát biến động sinh lượng rong lục Nuôi ba loài rong Ch.linum, En.torta và Cl.socialis để xác định biến động khối lượng rong lục theo thời gian của một chu kỳ nuôi trồng, kết quả thể hiện bảng 3.3 và bảng 3.4. ảng 3. 3 iến động sinh lượng rong lục trong một vụ trồng Ngày Khối lượng (g tươi/m2) Loài rong 0 7 14 21 28 35 42 49 56 Enteromorpha 500 853 1453 1840 2223 2193 707 197 Cladophora 500 593 833 967 1243 1563 1600 653 230 Chaetomorpha 500 703 977 1273 1630 2000 2043 1540 540 ảng 3. 4 Lịch nuôi trồng luân canh và năng suất rong lục Tháng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Rong lục En. torta Ch. linum Cl. socialis 3 vụ trồng 2 vụ trồng (35- Vụ trồng 4 vụ trồng (35-42 ngày/vụ) (28 ngày/vụ) 42 ngày/vụ) 17,23 tấn Sản lượng 15,34 tấn tươi 11tấn tươi tươi 3 x 17,23+4 x 15,34+2 x 11=117,82 tấn tươi/ha/năm=27,01 tấn Năng suất khô/ha/năm (khô/tươi=1/5) Trong quá trình nuôi trồng cho thấy điều kiện nuôi trồng rong Ch. linum và Cl. socialis ngoài tự nhiên dễ thực hiện hơn rong En. torta. Vì vậy chúng tôi chọn rong Ch. linum và Cl. socialis tiến hành nuôi rồi thu sinh khối để khảo sát biến động thành phần hóa học của Ch. linum, Cl. socialis theo chu kỳ sống. 3.1.3.2 Khảo sát biến động thành phần hóa học của Ch. linum, Cl.socialis theo chu kỳ sống 8
9. Hình 3. 1 iến động protein theo chu kỳ Hình 3. 2 iến động tro theo chu kỳ sống của hai loài rong lục sống của hai loài rong lục Hình 3. 3 iến động lipid theo chu Hình 3. 4 iến động đường và tốc độ sinh kỳ sống của hai loài rong trưởng theo chu kỳ sống của hai loại rong lục iến động hàm lượng protein, biến động hàm lượng tro, biến động hàm lượng lipid có tác động đến biến động hàm lượng đường theo chu kỳ sống của hai loài rong lục. Như vậy cần để thu hoạch rong Ch. linum và Cl. socialis vào tuần 4 hoặc 5 trong chu kỳ sinh trưởng để có hàm lượng đường và sinh lượng cao. 3.1.4 Thành ph n các loại ờng c a rong Chaeto orpha linu và Cladophora socialis Xác định thành phần polysaccharid và thành phần đường của rong Ch.linum và Cl. socialis để lựa chọn điều kiện thủy phân loài rong này một cách thích hợp nhất. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.5 và 3.6 ảng 3. 5 Thành phần carbonhydrat của sinh khối rong Ch.linum Thành phần polysaccharide của Thành phần các loại đường rong sau rong Ch. linum (%w) thủy phân(%) Cellulose 41,1 Arabinose 1,68 Tinh bột 4,1 Glucose 65,16 Agar 4,9 Galactose 11,58 Rhamnose 18,56 Ulvan 12,9 Xylose 1,63 9
10. ảng 3. 6 Thành phần các loại đường của rong Cladophora socialis STT Thành phần các loại đường rong sau thủy phân(%) 1 Arabinose 2,5 2 Glucose 27,3 3 Galactose 49,4 4 Rhamnose 18,2 5 Xylose 0,9 ảng 3.5 và 3.6 cho thấy rong Ch. linum có đường glucose cao hơn rong Cl. socialis. Chính vì vậy rong Ch. linum là nguyên liệu sản xuất ethanol có ưu thế hơn trong lên men so với Cl. socialis. 3.2 Nghiên cứu quá trình thủy phân rong Chaetomorpha linum 3.2.1 ghi n c u xử lý nguy n liệu rong Ch.linu tr ớc th y phân 3.2.1.1 Nghiên cứu xử lý muối NaCl trong rong đến quá trình thủy phân ảng 3.7 Ảnh hưởng của muối NaCl trong rong đến quá trình thủy phân Hàm lượng đường (g/l) Thí nghiệm Thủy phân bằng Thủy phân bằng chế phẩm axit enzyme Vis. 1 Không tách muối 42 ± 0,21 33 ± 0,18 2 Tách muối 53 ± 0,30 50 ± 0,20 Theo kết quả bảng 3.7 cho thấy kết quả thủy phân rong khi không tách muối, đường tạo thành thấp hơn. Và kết quả rong khi không tách muối quá trình thủy phân bằng enzyme bị ảnh hưởng lớn hơn là quá trình thủy phân bằng axit. 3.2.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước rong đến quá trình thủy phân Các khảo sát ảnh hưởng của kích thước rong được thể hiện trong bảng 3.8 ảng 3. 8 Ảnh hưởng của kích thước rong đến quá trình thủy phân TN Kích thước rong Hàm lượng đường (g/l) 1 Rong đối chứng (d=0,5-1 m) 36,8 ± 0,2 2 Rong cắt nhỏ (d=2-3 cm ) 40,2 ± 0,3 3 Rong xay nhỏ (d= 0,2-0,4 mm) 53,0 ± 0,3 Kết quả bảng 3.8 cho thấy cần phải xay nhỏ rong về kích thước 0,2- 0,4 mm bằng máy nghiền búa để cho quá trình thủy phân diễn ra thuận lợi. 3.2.2 ghi n c u quá trình th y phân rong l c ằng axit. 3.2.2.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng quá trình thủy phân rong lục bằng axit 10
11. ảng 3. 9 Ảnh hưởng của tỷ lệ rong đến quá trình thủy phân Tỷ lệ Đường Đường Hiệu suất rong thủy phân tổng số thủy phân (g/l) (g/l) (g/l) (%) 200 59 116 50,8 150 55 87 63,2 100 53 58 91,3 75 39 43 90,0 Hình 3. 5 Động thái của quá trình thủy phân. Hình 3. 6 Ảnh hưởng nồng độ axit đến Hình 3. 7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình thủy phân quá trình thủy phân Qua khảo sát các điều kiện thủy phân rong lục bằng axit cho thấy lượng đường tạo thành cao nhất ở các điều kiện: tỷ lệ rong trong dung dịch 100g/l, nồng độ axit sunfurit 3%, nhiệt độ 120oC, thời gian thủy phân 60 phút. 3.2.2.2 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong lục bằng axit để thu nhận dịch thủy phân có hàm lượng đường cao Sau khi tiến hành khảo sát các điều kiện thủy phân, chúng tôi tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong lục bằng axit theo phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm. Các yếu tố tối ưu và khoảng biến đổi của các yếu tố (K Đ): nồng độ axit X1[2-4 (%v/v)] có K Đ: 1 ; Nhiệt độ X2 [110-130 (oC)] có K Đ: 10; Thời gian X3 [40-60 (phút)] có K Đ:10 Lập ma trận thực nghiệm. ảng 3. 10 Ma trận thực nghiệm Stn X1 X2 X3 Y1 Y2 Y3 Y 1 2 110 40 32,5 32,1 32,3 32,30 11
12. 2 4 110 40 40,8 40,2 40,8 40,60 3 2 130 40 43,1 43,7 44,0 43,60 4 4 130 40 51,2 52,3 51,9 51,80 5 2 110 60 39,8 41,1 39,4 40,10 6 4 110 60 50,3 50,6 50,6 50,50 7 2 130 60 46,7 46,2 46,0 46,30 8 4 130 60 53,2 53,8 53,5 53,50 Phương trình hồi quy: YXXX 44.8 4.3 1 4.0 2 2.8 3 F lý thuyết = 0,0088 < 0,05. Vậy mô hình đã lập được là thích hợp. Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân theo phương pháp ox-wilson ảng 3. 11 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong theo ox-wilson Hàm lượng đường sau Số TN X1(%v/v) X2(oC) X3 (phút) thủy phân (g/l) 1 3 120 50 48,3 2 3.3 123 54 53,2 3 3.6 126 58 53,2 4 3.9 129 62 53,3 5 4.2 132 66 53,3 Qua kết quả của bảng 3.11, cho thấy điều kiện tối ưu khi thủy phân rong lục bằng axit là : Thời gian: 54 (phút), Nhiệt độ: 123 (oC), Nồng độ axit 3,3 (%v/v). Xác định thành phần đường của dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ảng 3. 12 Thành phần và hàm lượng của các loại đường trong dịch thủy phân rong Ch. linum bằng axit stt Các loại đường được xác định trong Hàm lượng đường dịch dịch thủy phân bằng axit thủy phân (g/l) 1 Arabinose 0 2 Glucose 32,1 3 Galactose 7,8 4 Rhamnose 12,6 5 Xylose 0 3.2.2.3 Thành phần dịch thủy phân rong lục bằng axit Chúng tôi tiến hành phân tích thành phần dịch thủy phân để từ đó thấy được các yếu tố dinh dưỡng tác động đến quá trình lên men, kết quả thể hiện ở bảng 3.13 ảng 3. 13 Thành phần dịch thủy phân rong lục bằng axit 12
13. Thành phần Phot Lưu Đường Nito Kali Natri Canxi Magie Sắt dịch thủy phân Pho huỳnh 1,8 ± 0,3± 8,2± 0,81 Hàm lượng (g/l) 53 11,2 1,17 1,82 1,34 0,1 0,02 0,2 mg/l 3.2.3 ghi n c u quá trình th y phân rong l c ằng ch phẩ enzy e 3.2.3.1 Nghiên cứu điều kiện tiền xử lý rong lục trước khi thủy phân bằng enzyme Ảnh hưởng nồng độ axit đến quá trình thủy phân sơ bộ rong lục. ảng 3. 14 Ảnh hưởng của nồng độ axit đến thủy phân sơ bộ rong lục Hàm lượng Nồng độ axit Stt đường trong dịch pH Độ nhớt cP (%v/v) sau xử lý (g/l) 1 0,1 3,4 7,2 3500 2 0,3 5,1 4,6 8000 3 0,5 6,2 4,1 11000 Qua kết quả bảng 3.14, chọn nồng độ axit 0,3% v/v sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2.3.2 Lựa chọn chế phẩm enzyme cho quá trình thủy phân rong lục Hoạt độ các loại enzyme của hai chế phẩm kết quả thể hiện ở bảng 3.15. ảng 3. 15 Hoạt độ các loại enzyme của chế phẩm Viscozyme và Cellulase Chế phẩm Hoạt độ enzyme (U/g) Các loại enzyme Chế phẩm Vis. Chế phẩm Cel. endoglucanase 81 ± 3 112 ± 3 exoglucanase 158 ± 5 208 ± 4 beta glucosidase 362 ± 8 498 ± 6 ulvanase 0 0 glucoamylase 146 ± 3 0 beta galactosidase 118 ± 3 0 xylanase 133 ± 2 179 ± 2 Tổng hoạt độ 998 997 Chúng tôi thấy rằng chế phẩm Vis.có chứa nhiều loại enzyme hơn chế phẩm Cel Sau khi khảo sát hoạt độ của các loại enzyme trong hai chế phẩm chúng tôi sử dụng chúng để thủy phân Ch.linum, kết quả thể hiện ở bảng 3.16 ảng 3. 16 Kết quả thủy phân rong Ch.limum của các enzyme thương mại 13
14. Enzyme Hàm lượng đường (g/l) Vis. Vis.L+ Cel. Cel. Thời gian 40 U/g 30:10 U/g 20:20 U/g 10:20 U/g 40 U/g 24 h 42,5 ± 1,0 39,2 ± 1,1 35,6 ± 1,2 30,8 ± 0,8 26,8 ± 0,7 30 h 49,3 ± 1,3 42,5 ±1,2 38,3 ±1,2 33,7 ± 0,9 31,7 ± 0,8 36 h 49,2 ± 1,3 44,1 ± 1,2 40,8 ± 1,2 37,2 ± 0,9 31,2 ± 0,8 Kết quả cho thấy chế phẩm Vis.tạo thủy phân rong Ch. linum tốt hơn chế phẩm Cel. Vì vậy chúng tôi sử dụng chế phẩm Viscozyme L để tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân. 3.2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân rong lục bởi chế phẩm enzyme Vis. Hình 3. 8 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Hình 3. 9 Ảnh hưởng của pH Hình 3. 10 Ảnh hưởng của nhiệt độ Hình 3. 11 Động thái của quá trình đến quá trình thủy phân thủy phân 14
15. Qua khảo sát điều kiện thủy phân rong lục bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L cho thấy hàm lượng đường tạo thành cao nhất ở các điều kiện: nồng độ enzyme 0,8 ml/g (40U/g), nhiệt độ 50oC, thời gian 30 giờ, pH 5,0. 3.2.3.4 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong lục bằng enzyme để thu nhận dịch có hàm lượng đường cao Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong lục bằng enzyme theo phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm. Các yếu tố tối ưu và khoảng biến đổi của các yếu tố (K Đ): Nồng độ enzyme: X1 [0,6-1 (ml/g)] có K Đ: 0,2 ; pH: X2 [4.5-5.5)] có K Đ: 0,5; Thời gian X3 [24-36 (giờ)] có K Đ:6 Lập ma trận thực nghiệm ảng 3. 17 Ma trận thực nghiệm trong tối ưu thủy phân bằng enzyme Stn X1 X2 X3 Y1 Y2 Y3 Y 1 0,6 4,5 24 32,2 32,5 32,5 32,40 2 1 4,5 24 36,8 36,3 36,1 36,40 3 0,6 5,5 24 39,5 39,9 39,4 39,60 4 1 5,5 24 43,6 43,2 43,1 43,30 5 0,6 4,5 36 42,2 42,1 43,2 42,50 6 1 4,5 36 45,8 46,5 46,3 46,20 7 0,6 5,5 36 44,2 44,9 44,7 44,60 8 1 5,5 36 49,2 48,9 49,2 49,10 Tìm được phương trình hồi quy: YXXX 41.76 1.9 1 2.39 2 3.84 3 F lý thuyết = 0,00048 < 0,05. Vậy mô hình đã lập được là thích hợp. Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân theo phương pháp ox-wilson ảng 3. 18 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong Ch. linum bằng enzyme. Hàm lượng đường sau Số TN X1(ml/g) X2(pH) X3 (giờ) thủy phân (g/l) 1 0,8 5 30 49,1 2 0,85 5,2 33 50.3 3 0,9 5,4 36 49,5 4 1 5,6 39 47,1 5 1,05 5,8 42 46,6 Qua kết quả bảng 3.18 cho thấy điều kiện tối ưu để thủy phân rong lục bằng enzyme Viscozyme L là: Thời gian: 33 giờ, Nhiệt độ: 50oC, pH 5.2, Nồng độ 0,85 ml/g (42,5U/g). Xác định thành phần đường của dịch thủy phân rong Ch.linum bằng chế phẩm Vis. theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ảng 3. 19 Thành phần đường dịch thủy phân rong Ch. linum bằng chế phẩm Vis. 15
16. Các loại đường được xác định trong Hàm lượng đường dịch Stt dịch thủy phân bằng enzyme thủy phân (g/l) 1 Celllobiose 2,46 2 Glucose 20,6 3 Galactose 8,05 4 Arabinose 0 5 Xylose 0 6 Rhamnose 0 Qua bảng 3.19 cho thấy quá trình thủy phân rong lục bằng enzyme Viscozyme L cho thành phần hỗn hợp đường có ba loại chính là galactose, glucose và cellobiose, trong đó glucose là đường được tạo thành lớn nhất. 3.2.3.5 Thành phần dịch thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme Phân tích thành phần dịch thủy phân rong bằng enzyme kết quả thể hiện ở bảng 3.20 ảng 3. 18 Thành phần dịch thủy phân rong lục bằng enzyme Thành phần Phot Lưu Đường Nito Kali Natri Canxi Magie Sắt dịch thủy phân Pho huỳnh 1,6± 0,2± 0,9±0 0,62 Hàm lượng (g/l) 50 0,4 1,07 1,1 1,12 0,1 0,02 ,06 mg/l 3.2.3.6 So sánh thủy phân bằng axit, chế phẩm Viscoenzym L Từ các kết quả nghiên cứu quá trình thủy phân rong lục bằng axit và chế phẩm enzyme, chúng tôi xác định hiệu suất của chúng. ảng 3. 19 Hiệu suất thủy phân phân bằng axit, chế phẩm enzyme thương mại HL H tính H tính Phương HL đường HL đường tp tp đường theo theo Các loại pháp thủy phân lên men của tổng của đường đường đường lên thủy từ 100g dịch thủy 100 g thủy phân lên men men phân rong (g) phân (g) rong (g) (%) (%) Chế glucose, phẩm 50 31,5 86 54 galactose, 58 Enzyme cellobiose glucose, Axit 53 39,9 91 68 galactose Kết quả ở bảng 3.21 cho thấy hiệu suất thủy phân bằng axit cao hơn thủy phân bằng chế phẩm enzyme. Phương pháp thủy phân rong Ch.linum bằng axit được triệt để, các loại đường tạo thành ở dạng đường đơn như glucose, rhamnose, galactose. Phương pháp thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme sản phẩm đường tạo thành là glucose, galactose, cellobiose. 16
17. Kết quả nghiên cứu thủy phân rong lục Ch. linum bằng phương pháp thủy phân bằng axit và bằng enzyme đưa ra số liệu sau: Để tạo ra 1 lít dịch rong lục được thủy phân bằng axit, cần 100g rong khô, 30ml sunfuric, phối trộn 970 ml nước, gia nhiệt 120 oC trong 1 giờ, sau đó cần khoảng 10 ml KOH 50% trung hòa. Hàm lượng đường thủy phân 53g/100g rong. Thành phần đường trong dịch gồm glucose, galactose, rhamnose. Hiệu suất thủy phân bằng phương pháp axit 91%. Để tạo ra 1 lít dịch rong lục được thủy phân bằng chế phẩm enzyme cần 100g rong khô, 5 ml axit sunfuric, phối trộn 1 l nước, gia nhiệt 120 oC trong 15 phút. Sau đó để nguội bổ sung 4 ml enzyme Viscozyme L, trong 36 giờ ở 50°C. Hàm lượng đường thủy phân 50g/100g rong. Thành phần đường trong dịch gồm glucose, galactose, cellobiose. Hiệu suất thủy phân bằng phương pháp enzyme 86%. Như vậy qua số liệu phân tích trên cho thấy :Quá trình thủy phân rong lục Ch. linum bằng axit cho thấy thời gian thủy phân nhanh và hiệu suất cao hơn 5% so với phương pháp thủy phân bằng enzyme, tuy vậy phương pháp này so với phương pháp thủy phân bằng enzyme có nhiều nhược điểm như hao tốn năng lượng để đun lên 120 oC, phải có thiết bị chịu áp lực và chống chịu ăn mòn bởi hóa chất, lượng axit tiêu hao cao hơn gấp 6 lần, tốn xút để trung hòa ; sản phẩm thủy phân không kiểm soát được dễ ảnh hưởng đến quá trình lên men, ngoài ra tạo ra lượng đường rhamnose nấm men không sử dụng được. Quá trình thủy phân rong lục Ch. linum bằng enzyme có nhiều lợi thế hơn, đây là phương pháp thủy phân nhẹ nhàng, áp suất thường, không tốn nhiên liệu cho gia nhiệt, không tốn hóa chất, thiết bị; sản phẩm dịch thủy phân tạo ra các loại đường dễ lên men và không tạo ra các sản phẩm khác ảnh hưởng đến quá trình lên men. Đối với thời gian đường hóa có thể rút ngắn khi kết hợp đường hóa và lên men đồng thời. Hơn nữa công nghệ enzyme ngày càng phát triển sẽ tạo ra được các chế phẩm có hoạt tính cao và nâng cao được hiệu suất thủy phân. Vì vậy kết quả nghiên cứu phương pháp thủy phân rong bằng enzyme sẽ được áp dụng rộng rãi cho các nhà máy sản xuất ethanol từ rong. 3.3 Nghiên cứu quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Ch. linum 3.3.1 Tuyển chọn nấ en từ dịch th y phân rong Ch.linu ằng axit Tiến hành lên men với 5 chủng nấm men với dịch thủy phân bằng axit kết quả thể hiện trong bảng 3.22 ảng 3. 20 Khả năng lên men ethanol dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit bởi các chủng nấm men khác nhau 17
18. Hàm lượng ethanol g/l Thời Red Thermo Sac Sac Sac gian Ethanol -sacch SHNĐ BKHCM CCC 24 h 6,7±0,09 4,9±0,08 7,3±0,09 7,3±0,1 6,7±0,09 48 h 11,0±0,14 8,8±0,12 11,3±0,12 11,2±0,11 11,0±0,14 60 h 15,0±0,18 12,0±0,16 14,7±0,17 14,7±0,15 15,0±0,18 72 h 17,4±0,23 14,5±0,18 15,1±0,21 16,1±0,19 17,4±0,23 84 h 17,4±0,22 15,1±0,22 15,1±0,21 15,9±0,21 17,0±0,22 96 h 17,3±0,21 15,0±0,22 15,0±0,21 15,9±0,21 16,8±0,21 HLM 67 55 50 55 59 ảng 3.22 cho thấy khi lên men dịch thủy phân rong Ch.linum bởi chủng nấm men Sac SHNĐ tạo ra hàm lượng ethanol thấp. Các chủng nấm men Red Ethanol, Thermosacch, Sac KHCM, SacCCC tạo ra hàm lượng Ethanol cao hơn. Hiệu suất lên men (HLM) của các chủng 52-67%. Red Ethanol là chế phẩm nấm men tạo ra lượng ethanol cao nhất 17,4 g/l, hiệu suất lên men 67%. 3.3.2 Tuyển chọn nấ en từ dịch th y phân rong Ch.linum ằng ch phẩ enzyme Khảo sát quá trình lên men của các chủng nấm men với dịch thủy phân rong lục bằng chế phẩm enzyme, kết quả thể hiện trong bảng 3.23 ảng 3. 21 Khả năng lên men ethanol dịch thủy phân rong Ch.linum bằng chế phẩm enzyme bởi các chủng nấm men khác nhau Hàm lượng ethanol g/l Red Thermo Sac Sac Sac Thời gian ethanol Sacch SHNĐ BKHCM CCC 24 h 2,0±0.04 4,9±0,05 4,1±0,05 5,7±0,05 5,0±0,06 48 h 8,1±0,08 8.8±0,9 6,6±0,06 8,9±0,07 8,8±0,09 60 h 10,4±0,09 10,7±0,9 10,4±0,11 10,7±0,11 12,3±0,13 72 h 12,0±0,12 12,9±0,12 11,9±0,12 12,9±0,12 13,5±0,14 84 h 14,3±0,14 13,8±0,13 12,1±0,12 13,6±0,13 13,7±0,14 96 h 14,4±0,14 13,2±0,13 11,8±0,12 14,0±0,14 13,5±0,14 108 h 14,3±0,15 13,0±0,13 11,7±0,12 13,8±0,13 13,3±0,14 HLM 59 58 49 56 56 ảng 3.23 cho thấy hiệu suất lên men của các chủng 49-59% và trên môi trường dịch thủy phân bằng enzyme, Red Ethanol cũng là chế phẩm nấm men tạo ra lượng ethanol cao nhất 14,4 g/l, hiệu suất lên men 59%. 18
19. 3.3.3 Các y u t ảnh h ng n quá trình l n en c a dịch th y phân ằng axit và enzy e i ch phẩ nấ en Red ethanol 3.3.3.1 Ảnh hưởng của nito đến quá trình lên men ảng 3. 22 Ảnh hưởng của nito đến quá trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum Nguồn nito Các chỉ tiêu Dịch lên men (NH4)2SO4 (NH2)2CO2 Hàm lượng đường 53 g/l 53 g/l 53 g/l Nito bổ sung 0 2 g/l 2 g/l pH 4,5 4,5 4,5 Ethanol (g/l) 17,4 ± 0,1 17,4 ± 0,1 17,4 ± 0,1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nito đến quá trình lên men, cho thấy khi không bổ sung nito và việc bổ sung thêm 2 g/l đạm sulphate hoặc ure, hàm lượng ethanol thu được là như nhau. Điều này cho thấy hàm lượng nito trong dịch thủy phân đã đủ để nấm men sinh trưởng phát triển. Hình 3. 12 Động thái nito trong Hình 3. 13 Ảnh hưởng pH quá trình lên men Hình 3. 14 Ảnh hưởng nhiệt độ Hình 3.15Động thái quá trình lên men 3.3.3.2 Ảnh hưởng pH đến quá trình lên men Tiến hành lên men dịch thủy phân rong Ch.linum với chế phẩm nấm men Red Ethanol trong điều kiện thay đổi pH 3,5-5, kết quả thể hiện ở hình 19
20. 3.13. Lên men dịch thủy phân rong bằng axit, tại pH 4,5 nồng độ ethanol đạt cao nhất 17,4g/l. Lên men dịch thủy phân rong bằng chế phẩm enzyme tại pH 4 - 4,5 nồng độ ethanol đạt cao 14,1-14,4 g/l. Như vậy, pH thích hợp cho quá trình lên men tạo ethanol của chế phẩm nấm men Red Ethanol từ dịch thủy phân rong lục là 4-4,5. 3.3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình lên men Tiến hành lên men dịch thủy phân rong Ch.linum với chế phẩm nấm men Red Ethanol trong điều kiện thay đổi nhiệt độ 20-35 oC. Kết quả hình 3.14 cho thấy lên men dịch thủy phân rong bằng axit, tại nhiệt độ 30oC, nồng độ ethanol đạt cao nhất là 17,4 g/l. Lên men dịch thủy phân bằng chế phẩm enzyme, tại nhiệt độ trong khoảng 30-35 oC nồng độ ethanol đạt cao 14,3-14.4g/l. Như vậy, nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men tạo ethanol của chế phẩm nấm men Red Ethanol từ dịch thủy phân rong lục là 300C. 3.3.3.4 Động thái quá trình lên men Kết quả hình 3.15 cho thấy lên men dịch thủy phân rong bằng axit bởi chế phẩm nấm men Red Ethanol với thời gian 72 giờ quá trình lên men kết thúc. Lên men dịch thủy phân rong bằng chế phẩm enzyme bởi chế phẩm nấm men Red Ethanol cho thấy thời gian lên men kết thúc vào thời điểm 96 giờ. 3.3.4 T i u h a iều iện l n en dịch th y phân rong Ch.linu ằng axit i ch phẩ nấ en Red ethanol Sau khi tiến hành khảo sát các điều kiện lên men, chúng tôi tối ưu hóa điều kiện lên men dịch thủy phân rong Ch.linum theo phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm. Các yếu tố tối ưu và khoảng biến đổi của các yếu tố (K Đ): Thời gian: X1[60-84 (giờ)] có K Đ: 12 ; Nhiệt độ: X2 [25- 30(oC)]có K Đ: 5; pH [4 -5]] có K Đ: 0,5 - Lập ma trận thực nghiệm: ảng 3. 23 Ma trận thực nghiệm trong lên men dich thủy phân bằng axit Stn X1 X2 X3 Y1 Y2 Y3 Y 1 60 25 4 15,6 16,3 15,9 15,9 2 84 25 4 18,3 18,6 18,5 18,5 3 60 35 4 13,6 13,3 14,4 13,8 4 84 35 4 14,4 14,6 14,4 14,5 5 60 25 5 14,2 14,3 14,4 14,3 6 84 25 5 17,6 17,4 18 17,7 7 60 35 5 12,9 13,2 13,2 13,1 8 84 35 5 12,9 13,1 12,5 12,8 20
21. Phương trình hồi quy: YXXX 15.07 0.8 1 1.52 2 0.6 3 F lý thuyết = 0,034 < 0,05. Vậy mô hình đã lập được là thích hợp. ảng 3. 24 Tối ưu hóa điều kiện lên men dịch thủy phân bằng axit rong theo Box-wilson Số TN X1(h) X2(oC) X3 (pH) EtOH (g/l) 1 72 30 4,5 17,8 2 74 28 4,4 18,1 3 76 26 4,3 18,2 4 78 24 4,2 17,6 5 80 22 4,1 17,2 Vậy điều kiện lên men tối ưu cho hàm lượng ethanol cao ( 18,2 g/l) là: Thời gian: 76 giờ, nhiệt độ: 26oC, pH 4.3 3.3.4.1 Kết quả chuyển hóa đường của dịch thủy phân rong lục bằng axit thành ethanol của chế phẩm nấm men Red Ethanol ảng 3. 25 Hàm lượng các loại đường và ethanol biến đổi trong quá trình lên men từ dịch thủy phân axit Hàm lượng (g/l) Thành phần dịch lên men Thời điểm lên Thời điểm lên Thời điểm lên Thời điểm lên men 0 giờ men 24 giờ men 48 giờ men 76 giờ Glucose 32,1 12,1 2,09 0,02 Galactose 7,8 7,55 5,8 0,8 Rhamnose 12,6 12,6 12,6 12,6 Ethanol 0 9 15,1 18,2 3.3.4.2 Kết quả chuyển hóa đường của dịch thủy phân rong lục bằng enzyme thành ethanol bởi chế phẩm nấm men Red Ethanol ảng 3. 26 Hàm lượng các loại đường và ethanol biến đổi trong quá trình lên men từ dịch thủy phân rong lục bằng enzyme Hàm lượng (g/l) Thành phần Thời điểm lên Thời điểm lên Thời điểm lên men dịch lên men men 0 giờ men 48 giờ 96 giờ Celobiose 2,46 0 0 Glucose 20,6 5,06 0 Galactose 8,05 8,01 0 Ethanol 0 8,03 14,4 3.3.4.3 Hiệu suất của quá trình lên men từ dich thủy phân rong Ch. linum 21
22. ảng 3. 27Hiệu suất lên men của dịch thủy phân axit và chế phẩm enzyme Dịch ĐTP ĐLM EtOH HLM (%) HLM theo HLM (g/kg TP (g/l) (g/l) (g/l) theo ĐTP ĐLM (%) rong khô) Axit 53 39,9 18,2 67 89,3 182 Enzyme 50 31,5 14,4 56,4 89,7 144 Chú thích bảng 3.28: ĐTP: Đường dịch thủy phân, ĐLM: Đường lên men Theo kết quả bảng 3.28 hiệu suất lên men từ dịch thủy phân rong Ch.linum tính theo hàm lượng đường của dịch thủy phân (ĐTP) là: hiệu suất lên men của dịch thủy phân rong bằng axit 67%, của dịch thủy phân rong bằng enzyme 56,4%; tính theo hàm lượng đường lên men (ĐLM) là: hiệu suất lên men dịch thủy phân rong bằng axit 89,3%, của dịch thủy phân rong bằng enzyme 89,7%, thu được 144-182g ethanol/1kg rong Ch.linum khô. Quá trình lên men của hai loại dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit và bằng enzyme có một số điểm khác nhau, nguyên nhân thành phần đường của hai loại dịch thủy phân là khác nhau. Thành phần của dịch thủy phân bằng enzyme là đường glucose, galactose và celobiose đây là nguồn carbohydrate khi lên men nấm men sử dụng triệt để và thích hợp cho lên men. Trong khi đó thành phần của dịch thủy phân bằng axit là đường glucose, galactose, rhamnose, khi lên men nấm men không sử dụng được đường rhamnose, Tuy nhiên hàm lượng ethanol tạo thành trong quá trình lên men từ dịch thủy phân bằng enzyme thấp hơn so với dịch thủy phân axit vì lượng đường tạo thành của dịch thủy phân bằng axit cao hơn lượng đường trong dịch thủy phân bằng enzyme (không tính đường rhamnose). Thời gian kết thúc lên men của dịch thủy phân bằng axit 76 giờ ngắn hơn dịch thủy phân enzyme là 96 giờ, vì thành phần của dịch thủy phân bằng axit chỉ chứa đường monosaccharid, còn dịch thủy phân bằng enzyme chứa đường monosaccharid và disaccharid nên cần có thời gian chuyển hóa disaccharid thành đường monosaccharid. 3.4 hảo sát quá trình đƣờng hóa và lên men đồng thời (SSF) dịch rong lục sau tiền xử lý Khảo sát quá trình đường hóa và lên men đồng thời dịch rong Ch.linum sau tiền xử lý với điều kiện đường hóa bằng chế phẩm Viscozyme nồng độ 42,5U/g, ở nhiệt độ 500C, thời gian thay đổi 0, 6, 9, 12, 15, 18, 21 giờ, sau đó tiếp tục đường hóa và lên men ở nhiệt độ 300C trong thời gian 120 giờ. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.27. 22
23. ảng 3. 28 Quá trình lên men đồng thời tiến hành tại các thời điểm khác nhau. Thời gian đường Hàm lượng Độ nhớt tại thời Ethanol sau thời hóa và thời điểm đường hòa điểm lên men gian lên men 120 bổ sung nấm men tan (g/l) (cP) giờ (g/l) 0 3,9 ± 0,3 8300 ±125 0 6 giờ 8,3 ± 0,5 8100 ± 110 0 9 giờ 18,6 ± 0,8 6200 ± 90 5,1 ± 0,05 12 giờ 30,4 ± 0,9 5400 ± 73 11,5 ± 0,11 15 giờ 35,8 ± 0,9 3700 ± 52 13,4 ±0,14 18 giờ 40,5 ± 1,1 3100 ± 50 13,5± 0,14 21 giờ 42,5 ± 1,2 2000 ± 45 13,5± 0,15 Kết quả ở bảng 3.27 cho thấy tại thời điểm đường hóa ban đầu 15 giờ, quá trình đường hóa và lên men đồng thời diễn ra thuận lợi, kết thúc quá trình này độ cồn thu được là 13,4 g/l. Do vậy chúng tôi chọn thời gian đường hóa ban đầu là 15 giờ và đây cũng là thời điểm bổ sung nấm men để tiến hành tiếp tục đường hóa và lên men đồng thời. 4.1 ẾT LUẬN 1. Tìm ra các loài rong lục là nguyên liệu mới cho sản xuất ethanol gồm 15 loài thuộc bốn chi rong Chaetomorpha, Cladophora, Ulva, Enteromorpha có sinh khối lớn. Đã tiến hành nuôi trồng thành công hai loài rong Chaetomorpha linum và Cladophora socialis 2. Phân tích được thành phần hóa học của hai loại rong Ch. linum và Cl. socialis, trong đó hàm lượng carbohydrate là 68-70% /w chất khô và hàm lượng đường 6 carbon là 95-96% /w đường tổng. Chọn được rong Chaetomorpha linum thích hợp cho nghiên cứu thủy phân và lên men tạo ethanol 3. Xác định được điều kiện tối ưu cho xử lý thủy phân rong Ch. linum bằng axit: tỷ lệ rong 100g/l, nồng độ axit 3,3%v/v, thời gian thủy phân 54 phút, nhiệt độ 123oC. Hàm lượng đường dịch thủy phân 53 g/l, thành phần đường chính trong dịch là glucose 32,1 g/l; galactose 7,8 g/l; rhamnose 12,5 g/l 4. Xác định được điều kiện tối ưu cho xử lý thủy phân rong Ch. linum bằng chế phẩm enzyme Vicozyme L: quá trình tiền xử lý theo tỷ lệ rong 100g/l, nồng độ axit sufurit 0,3%v/v, gia nhiệt 120oC trong 15 phút; 23
24. quá trình đường hóa bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L nồng độ 42,5U/g, thời gian thủy phân 33 giờ, nhiệt độ 50oC, pH 5,2. Hàm lượng đường dịch thủy phân 50 g/l, thành phần đường chính trong dịch là glucose 20,6 g/l, galactose 8,05 g/l, cellobiose 2,46g/l. 5. Xác định được điều kiện tối ưu lên men ethanol với chế phẩm nấm men Red Ethanol từ dịch thủy phân rong Ch. linum bằng axit: thời gian 76 giờ, nhiệt độ 26oC, pH 4,3. Hàm lượng ethanol thu được182 g/kg rong khô. 6. Xác định được điều kiện lên men ethanol với chế phẩm nấm men Red Ethanol của dịch thủy phân Ch. linum bằng chế phẩm enzyme Vicozyme L: thời gian 96 giờ, nhiệt độ 30oC, pH 4,5. Hàm lượng ethanol thu được 144 g/kg rong khô. 7. ước đầu khảo sát được điều kiện đường hóa và lên men đồng thời dịch rong Ch. linum sau tiền xử lý: thủy phân sơ bộ thời gian 15 giờ, ở nhiệt độ 50oC bằng chế phẩm enzyme Vicozyme L nồng độ 42,5U/g; đường hóa và lên men đồng thời với chế phẩm Red Ethanol ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 120 giờ, hàm lượng ethanol thu được 134 g/kg rong khô 4.2 iến Nghị Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất ethanol từ sinh khối rong lục Việt Nam. Tiến hành sản xuất ethanol từ rong lục trên quy mô pilot làm cơ sở phát triển sản xuất theo quy mô công nghiệp. 24