Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương..

Nội dung tài liệu: Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương..

1. - 1 - MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng ngắn ngày, có giá trị cao về dinh dưỡng, kinh tế và là nguyên liệu cho công nghiệp, có tác dụng cải tạo đất và bảo vệ môi trường. Hiện nay, năng suất và sản lượng đậu tương ở nước ta còn thấp, chất lượng hạt chưa cao do mức độ ổn định của giống, ảnh hưởng của nấm, côn trùng, vi khuẩn, virus gây bệnh và các tác động bất lợi khác từ ngoại cảnh. Đậu tương là một trong số các cây trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, như Soybean mosaic virus – SMV gây bệnh khảm lá, Bean yellow mosaic virus – BYMV gây bệnh khảm vàng hại đậu đỗ, và một số virus gây bệnh khác. Trong đó, SMV và BYMV là những loại virus gây bệnh khảm có tác động xấu lớn nhất đến cây đậu tương. SMV và BYMV được lây nhiễm từ cây bệnh sang cây khoẻ do rệp làm môi giới và virus có thể truyền qua hạt. Khi cây đậu tương bị bệnh, lá cây có những phần xanh nhạt, đậm và biến vàng xen kẽ, lá non ở ngọn bị biến dạng, đọt non xoăn lại, các đốt thân co ngắn, cây chậm phát triển, số lượng quả ít và biến dạng, sần sùi, có vị đắng và thường lép. Bệnh khảm do SMV và BYMV gây thiệt hại đáng kể về năng suất, chất lượng và sản lượng hạt đậu tương. Năng suất đậu tương có thể giảm tới 40% khi các cây bị nhiễm virus trước khi ra hoa và 91% hạt đậu thu được có vết lốm đốm, chất lượng kém [87]. Việc nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ gây thiệt hại lớn về năng suất và chất lượng hạt [95]. Hiện nay, trong sản xuất đậu tương chủ yếu mới dừng ở biện pháp phòng mà chưa có thuốc trị bệnh khảm do SMV và BYMV. Các biện pháp phòng bệnh bao gồm chọn lọc cây sạch bệnh để làm giống, vệ sinh đồng ruộng, luân canh cây trồng, thu dọn tàn dư cây bệnh trên đồng ruộng, diệt trừ côn trùng truyền bệnh. Tuy nhiên, các biện pháp trên thường có hiệu quả thấp và tốn nhiều công sức. Biện pháp có hiệu quả nhất để phòng hai loài SMV và BYMV là sử dụng các giống đậu tương kháng bệnh, nhưng nguồn giống đậu tương kháng bệnh tự nhiên đối với SMV và BYMV là rất hạn chế. Chính vì
2. - 2 - - 27 - vậy hướng tiếp cận tạo cây đậu tương chuyển gen kháng virus được quan tâm nghiên cứu, đó là chuyển các gen có nguồn gốc từ chính loài virus gây bệnh BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO theo nguyên lý của kỹ thuật RNA interference (RNAi). ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN RNAi được xem là một kỹ thuật hiện đại và có hiệu quả được ứng dụng để kháng lại các loài virus gây bệnh ở thực vật. Dựa trên nguyên lý bất hoạt gen sau phiên mã, một số tác giả đã ứng dụng thành công kỹ thuật RNAi trong chiến lược tạo cây chuyển gen kháng virus [3], [31], [98]. LÒ THỊ MAI THU Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành đề tài luận án là: “Phân lập đoạn gen CP từ Soybean mosaic virus và phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi phục vụ tạo cây đậu tương PHÂN LẬP ĐOẠN GEN CP TỪ SOYBEAN MOSAIC chuyển gen kháng bệnh”. VIRUS VÀ PHÁT TRIỂN VECTOR CHUYỂN GEN 2. Mục tiêu nghiên cứu MANG CẤU TRÚC RNAi PHỤC VỤ TẠO CÂY ĐẬU 2.1. Mục tiêu chung: Tạo được dòng cây chuyển gen kháng virus gây bệnh TƯƠNG CHUYỂN GEN KHÁNG BỆNH khảm trên cây đậu tương bằng kỹ thuật RNAi. 2.2. Mục tiêu cụ thể: (i) Xác định được trình tự đoạn gen CP từ SMV gây Chuyên ngành: Di truyền học bệnh khảm ở cây đậu tương Việt Nam; (ii) Phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và cả hai loài SMV và Mã số: 62 42 01 21 BYMV; (iii) Tạo được cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng SMV và BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen; (iv) Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc RNAi . 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Thu thập thông tin về hệ gen và gen CP của SMV, thiết kế cặp mồi nhân TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC đoạn gen CP, tách dòng và xác định trình tự đoạn gen CP từ SMV. Phân tích sự đa dạng về trình tự đoạn gen CP, trình tự amino acid suy diễn của gen CP phân lập từ SMV ở Việt Nam và một số trình tự đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế. 3.2. Phân tích sự tương đồng của gen CP trong hệ gen của SMV và BYMV phân lập từ nhiều nguồn khác nhau. Xác định đoạn bảo thủ của gen CP và Thái Nguyên - 2014 tổng hợp nhân tạo đoạn CPi từ thông tin về gen CP.
3. - 26 - - 3 - 3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện đại, SMV và của hai loài SMV và BYMV bằng kỹ thuật Gateway. Biến nạp Khoa Sinh– KTNN, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên và Phòng vector chuyển gen mang đoạn gen CPi đã thiết kế vào A. tumefaciens. Công nghệ tế bào thực vật, Phòng DNA Ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học 3.4. Biến nạp cấu trúc RNAi vào cây thuốc lá. Phân tích sự có mặt của đoạn gen CPi của hai loài SMV và BYMV trên cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR. Đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV của cây chuyển gen so với cây đối chứng không chuyển gen. Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu 3.5. Chuyển cấu trúc RNAi vào cây đậu tương thông qua A. tumefaciens. PGS.TS. Chu Hoàng Hà Phân tích, xác định sự có mặt của đoạn gen chuyển CPi trên cây đậu tương chuyển gen. 4. Những đóng góp mới của luận án 4.1. Phân lập được đoạn gen CP từ SMV dòng SL1 và SL2 có kích thước Phản biện 1: 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid. Hai trình tự đoạn gen CP của SMV Phản biện 2: đã được đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế với mã số HG965102, Phản biện 2: HG965103. 4.2. Phát triển thành công hai vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả năng kháng đơn loài SMV và khả năng kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV. 4.3. Tạo được 19 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi có khả Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp năng kháng cả hai loài SMV và BYMV. Họp tại Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên 4.4. Chuyển thành công cấu trúc RNAi vào hai giống đậu tương ĐT12 và Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2014 DT2008, thu được 5 dòng cây chuyển gen từ giống ĐT12 và 19 dòng cây chuyển gen từ giống DT2008. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.1. Về khoa học Việc phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc gen RNAi chứa đoạn gen CPi kháng đơn loài SMV và kháng đồng thời cả hai loài Có thể tìm hiểu luận án tại Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên, Thư viện Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên và Thư viện Quốc gia Việt Nam SMV, BYMV để tạo được cây thuốc lá chuyển gen có tính kháng đối với SMV và BYMV cao hơn cây đối chứng không chuyển gen đã khẳng định cơ sở khoa học và tính hiệu quả của biện pháp sử dụng các gen có nguồn gốc từ
4. - 4 - - 25 - chính loài virus gây bệnh để chuyển vào cây trồng nhằm tạo cây trồng CÁC CÔNG TRÌNH chuyển gen kháng virus theo nguyên lý của kỹ thuật RNAi. CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 5.2. Về thực tiễn 1. Lo Thi Mai Thu, Le Van Son, Chu Hoang Ha, and Chu Hoang Mau Kết quả lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp vào mô đậu (2014). Development of RNAi-Based Vector Aims at Creating Antiviral tương đã tổn thương và tái sinh thành công cây đậu tương chuyển gen mang Soybean Plants in Vietnam. International Journal of Bioscience, cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi của SMV và BYMV đã cho thấy khả Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), Vol. 4, No. 3, pp. 208-211. năng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen và kỹ thuật RNAi trong chọn tạo giống đậu tương ở Việt Nam. Kết quả thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen 2. Lò Thị Mai Thu, Phạm Thanh Tùng, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu CPi của SMV và BYMV theo nguyên lý kỹ thuật RNAi để tạo được cây Hoàng Mậu (2013). Thiết kế vector mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen chuyển gen đối với thuốc lá và đậu tương đã khẳng định hướng nghiên cứu CP của SMV và BYMV. Tạp chí sinh học 35 (3), tr. 129-135. ứng dụng kỹ thuật RNAi và mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn 3. Lò Thị Mai Thu, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu chọn giống cây trồng ở Việt Nam. (2014). Chuyển gen qua nách lá mầm ở đậu tương nhờ vi khuẩn A. 6. Cấu trúc luận án: Luận án có 128 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được tumefaciens. Tạp chí khoa học&Công nghệ- Đại học Thái Nguyên, 115 chia thành các chương, phần: Mở đầu 4 trang, Chương 1: Tổng quan tài liệu (01), tr. 3-12. 35 trang, Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 21 trang, Chương 4. Lò Thị Mai Thu, Lê Hồng Trang, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Mậu 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 46 trang, Kết luận và đề nghị 2 trang; (2014). Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen kháng soybean Các công trình công bố liên quan đến luận án 1 trang; Tài liệu tham khảo 19 mosaic virus và bean yellow mosaic virus. Tạp chí khoa học&Công trang. Luận án có 18 bảng, 40 hình và tham khảo 182 tài liệu. nghệ- Đại học Thái Nguyên, 115 (02), tr. 111-115. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5. Lò Thị Mai Thu, Hoàng Hà, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Chu Hoàng Luận án đã tham khảo tài liệu 26 tiếng Việt và 155 tài liệu tiếng Anh để Mậu (2014). Đặc điểm của đoạn gen mã hóa coat protein phân lập từ tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Bệnh khảm do virus ở cây Soybean Mosaic Virus. Tạp chí sinh học 36 (1), tr. đậu tương, (2) Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương, và (3) Kỹ thuật Các trình tự gen đã đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus. 1. Lo MT., Hoang H., Le VS., Chu HH., and Chu HM. (2014). Soybean Bệnh virus đậu tương phân bố rộng khắp trên toàn thế giới và gây thiệt mosaic virus SMV gene for coat protein, isolate SL1. GenBank, hại lớn đến năng suất và chất lượng hạt. SMV và BYMV là hai loài virus Accession: HG965102. gây bệnh khảm và khảm vàng ở cây đậu tương, thuộc nhóm Potyvirus, họ 2. Lo MT., Hoang H., Le VS., Chu HH., and Chu HM. (2014). Soybean Potyviridae. Cây đậu tương có thể bị nhiễm đồng thời SMV và BYMV và mosaic virus SMV gene for coat protein, isolate SL2. GenBank, triệu chứng rất khó phân biệt. Nhiễm cùng lúc nhiều loại virus khác nhau sẽ Accession: HG965103. dẫn tới năng suất đậu tương có thể bị giảm từ 66% - 80%.
5. - 24 - - 5 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ SMV và BYMV có cấu tạo đơn giản, gồm hai thành phần chính là 1. KẾT LUẬN protein và nucleic acid. Hệ gen của SMV và BYMV là RNA sợi đơn dương (RNA (+)). Jayaram và đtg (1992) đã lập bản đồ và xác định trình tự 1.1. Tách dòng và xác định được trình tự đoạn gen CP từ SMV dòng SL1, nucleotide của các chủng SMV G2 và G7 (Hình 1.2). SL2. Đoạn gen CP phân lập được có 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid, trong đó số amino acid của vùng poty-coat là 208. Trình tự đoạn gen Gen CP là gen đặc trưng nhất ở các Potyvirus, mã hóa protein vỏ (CP) được chia thành ba vùng: vùng đầu N, vùng lõi và vùng đầu C. Chức năng CP của SMV dòng SL1 và dòng SL2 đã được đăng ký trên Ngân hàng gen của CP thể hiện trong sự nhân lên, capsid hóa, di chuyển của virus từ tế bào quốc tế với mã số HG965102, HG965103. SMV dòng SL1, SL2 phân bố đến tế bào và trong sự truyền virus của rệp. Sự phân loại các thành viên của cùng nhóm với hai dòng của Trung Quốc. nhóm Potyvirus có thể dựa trên trình tự gen CP và trình tự amino acid của 1.2. Phát triển thành công vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn CP. Gen CP ở SMV có kích thước là 807 nucleotide, trong đó vùng mã hóa gen CPi kháng đơn loài SMV và vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi gồm dài 804 nucleotide mã hóa 267 amino acid, trong đó vùng Poty-coat từ chứa đoạn gen CPi kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV. Tạo được amino acid thứ 33 đến 264; còn ở BYMV, gen CP có kích thước 933 chủng vi khuẩn A. tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc RNAi này. nucleotide, vùng mã hóa gồm 822 nucleotide, mã hóa 273 amino acid, trong 1.3. Tạo được 26 dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi đó vùng Poty-coat từ amino acid thứ 37 đến 272. (SMV-BYMV)] có kết quả dương tính với phản ứng PCR, trong đó có 19/26 dòng cây thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn đồng thời cả SMV và BYMV (chiếm 73,08%). 1.4. Đã chuyển thành công cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào hai giống đậu tương ĐT12 và DT2008. Thu được 5 dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 từ giống ĐT12 và 19 dòng cây chuyển gen từ giống DT2008 dương Hình 1.2. Bản đồ hệ gen của SMV và dự đoán các điểm cắt của protease tính với phản ứng PCR, hiệu suất chuyển gen đạt lần lượt là 1,35% và 2,24%. Bản đồ này được dựa trên cơ sở trình tự gen của SMV chủng G2 và G7 theo Jayaram và đtg, 2. ĐỀ NGHỊ 1992. Các hộp khác nhau đề cập đến các gen khác nhau và vùng 5 'và 3' là vùng chưa dịch mã (UTR). Các số dưới đây bộ gen đề cập đến vị trí amino acid cắt từ polyprotein và các con số 2.1. Cần tiếp tục chọn lọc, phân tích biểu hiện tính kháng đơn loài SMV và trong ngoặc đơn đề cập đến vị trí nucleotide cắt từ trình tự gen của SMV G2 và G7. CP là tính kháng đồng thời cả hai loài SMV và BYMV ở thế hệ đậu tương chuyển protein vỏ của virus, CI là protein hình trụ; HC-Pro là thành phần trợ giúp và protease; NIb là gen T1 và các thế hệ tiếp theo phục vụ công tác chọn giống đậu tương kháng RNA polymerase phụ thuộc RNA; P1, P3, và NIa là protease; VPg là protein liên kết virus. Chuyển gen là biện pháp công nghệ được ứng dụng để tạo dòng đậu 2.2. Nghiên cứu thiết kế cấu trúc RNAi chứa đồng thời hai hoặc một vài gen tương kháng virus. Cho đến nay, phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng súng của SMV, BYMV để tăng hiệu quả kháng virus của cây đậu tương chuyển bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua A. tumefaciens đã được ứng dụng phổ gen. biến và thành công đối với cây đậu tương. Kể từ khi giống đậu tương đầu tiên được chuyển gen bằng phương pháp gián tiếp thông qua A. tumefaciens lây
6. - 6 - - 23 - nhiễm vào nách lá mầm tổn thương trong nuôi cấy in vitro vào năm 1988, đến nay phương pháp chuyển gen này đang được sử dụng, nghiên cứu và 500bp ứng dụng khá phổ biến đối với cây đậu tương và đạt được những thành tựu rất đáng khích lệ. 500bp Virus gây bệnh trên cây đậu tương rất đa dạng về chủng loại, chủ yếu là virus RNA. Các virus thường có phổ gây bệnh rộng, có loài gây hại tới Hình 3.31. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc trên 900 loại thực vật khác nhau với những biểu hiện bệnh phức tạp, khó CPi (SMV-BYMV) trong các dòng cây đậu tương chuyển gen giống DT2008 nhận biết. Ứng dụng kỹ thuật RNAi bằng cách sử dụng nguồn gen của chính (-): Đối chứng âm; 1-32: 32 dòng đậu tương DT2008 chuyển gen virus gây bệnh và chuyển vào cây trồng, các nhà khoa học đã thành công trong M: Marker 50 bp (Thermo Scientific) việc tạo ra cây trồng chuyển gen kháng virus dựa theo nguyên lý bất hoạt gen Cũng bằng phương pháp chuyển gen qua nách lá mầm hạt chín đậu sau phiên mã. tương nhờ A. tumeffaciens, Nguyễn Thị Thúy Hường (2011) chuyển gen P5CSm vào giống đậu tương DT84 với hiệu suất là 0,24%; Nguyễn Thu Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hiền (2011) biến nạp cấu trúc chứa đoạn gen HA1 của virus H5N1 vào 650 2.1. Vật liệu, thiết bị, hóa chất và địa điểm nghiên cứu mẫu lá mầm của giống đậu tương ĐT12 với hiệu suất chuyển gen là 1,23%. Mẫu lá nghi nhiễm bệnh do SMV và BYMV được thu từ một số địa Trong nghiên cứu của chúng tôi, hiệu suất chuyển gen với cấu trúc RNAi phương được sử dụng trong thí nghiệm phân lập gen CP từ SMV. (pK7GW –CPi (SMV-BYMV) ở giống ĐT12 là 1,35%, ở giống DT2008 là 2,24%. Như vậy có thể thấy rằng hiệu suất chuyển gen ở cây đậu tương không Sử dụng giống thuốc lá Nicotiana tabacum C9-1 và hai giống đậu tương chỉ phụ thuộc vào khả năng tiếp nhận gen của kiểu gen cây đậu tương, mà còn ĐT12, DT2008 để thử nghiệm chuyển gen kháng SMV và BYMV do Phòng phụ thuộc vào đặc điểm của cấu trúc gen được chuyển vào cây đậu tương. Công nghệ tế bào, Viện Công nghệ sinh học. Nguồn virus SMV và BYMV sử Bệnh do virus ở cây đậu tương có triệu chứng rất khó phân biệt, cây dụng trong lây nhiễm nhân tạo do viện Bảo vệ thực vật cung cấp. đậu tương có thể nhiễm đồng thời nhiều loại virus, như SMV gây bệnh TM Vector tách dòng pBT và pENTR /D-TOPO, vector chuyển gen khảm, BYMV gây bệnh khảm vàng, virus gây bệnh xoăn lá Hai loài virus pK7GWIWG2(II); Các chủng vi khuẩn E. coli DH5α; E. coli One Shot® Top SMV và BYMV gây bệnh khảm trên cây đậu tương được chúng tôi chọn 10 và A. tumefaciens CV58 pGV 2660 được dùng trong phân lập gen, thiết làm đối tượng để nghiên cứu tạo cây chuyển gen theo nguyên lý của kỹ thuật kế vector chuyển gen và chuyển gen. RNAi. Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi (SMV- BYMV) được chúng tôi thiết kế và chuyển vào cây thuốc lá và cây đậu Hóa chất được mua tại các hãng nổi tiếng trên thế giới; các thí nghiệm tương. Đánh giá tính kháng đối với SMV và BYMV của 26 dòng cây thuốc được tiến hành trên trang thiết bị của Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, lá chuyển gen đã thu được tỷ lệ kháng khá cao (73,08%). Những kết quả này Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ chứng minh tính hiệu quả của chiến lược ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo gen, Viện Công nghệ sinh học và Phòng thí nghiệm Công nghệ gen, Phòng cây chuyển gen kháng virus và là cơ sở cho việc xác định tính khả thi của thí nghiệm Công nghệ tế bào Khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen kháng đồng thời hai loại virus học Sư phạm –Đại học Thái Nguyên. SMV và BYMV.
7. - 22 - - 7 - Bảng 3.10. Kết quả chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào hai giống đậu 2.2. Phương pháp nghiên cứu tương ĐT12 và DT2008 nhờ A. tumefaciens qua nách lá mầm Luận án sử dụng các nhóm phương pháp nghiên cứu như: (1) phân lập Giống Lô thí Số Số Số Số Số cây Số cây Số cây Hiệu gen, (2) thiết kế vector chuyển gen, (3) chuyển gen, (4) phân tích cây chuyển nghiệm mẫu mẫu chồi chồi trồng sống dương suất biến tạo kéo ra rễ trên giá trên tính với chuyển gen và (4) phân tích, xử lý số liệu. Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ nạp chồi dài thể giá thể PCR gen (%) tổng quát như mô tả trong hình 2.3. 1 100 27 10 5 4 3 ĐT12 2 150 48 17 16 12 10 5 1,35 3 120 37 13 10 8 3 MẪU LÁ ĐẬU TƯƠNG NHIỄM SMV Tổng 370 112 40 31 24 16 PHÂN LẬP GEN ĐOẠN GEN 1 250 130 50 30 26 7 CP TỪ SMV Phân tích gen CP bằng 2 180 75 28 19 16 6 BASLT trên DT2008 NCBI 3 220 103 45 29 25 9 19 2,24 THIẾT KẾ ĐOẠN BẢO THỦ 4 200 95 41 27 23 10 CPi-SMV VÀ CPi (SMV-BYMV) Kỹ thuật Tổng 850 403 164 105 90 32 GATEWAY THIẾT KẾ VECTOR RNAi 3.4.2. Phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen ở thế hệ T0 CHỨA ĐOẠN BẢO THỦ CPi (SMV-BYMV) Thông qua A. tumefaciens Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi- R từ DNA hệ gen để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các dòng đậu CHUYỂN CẤU TRÚC CHUYỂN CẤU TRÚC CPi (SMV-BYMV) VÀO CPi (SMV-BYMV) VÀO tương chuyển gen, kết quả PCR nhân bản đoạn gen CPi (SMV-BYMV) có CÂY THUỐC LÁ C9-1 GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT12, DT2008 kích thước là 573 bp từ DNA tổng số của 16 dòng cây chuyển gen từ giống Phân tích đoạn ĐT12 nhận được 5 dòng cây dương tính với PCR (T12-3, T12-10, T12-11, CPi (SMV-BYMV bằng PCR Xác định sự có mặt của đoạn CPi (SMV-BYMV) T12-12. T12-16) (Hình 3.30), với hiệu suất chuyển gen là 1,35%. Đánh giá tính kháng SMV và BYMV Cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi [CPi (SMV-BYMV)] 500 bp  Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.2.1. Nhóm các phương pháp phân lập gen Hình 3.30. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc Thu thập mẫu bệnh và tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá đậu tương nghi CPi (SMV-BYMV) trong các dòng cây đậu tương chuyển gen giống ĐT12 nhiễm SMV: i) Thu thập và bảo quản mẫu lá đậu tương nghi nhiễm SMV, 1-16: 16 dòng đậu tương ĐT12 chuyển gen; M: Marker 50 bp (Thermo Scientific) BYMV; ii) Phương pháp tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá nghi nhiễm SMV. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen CPi Phương pháp tổng hợp cDNA, nhân bản đoạn cDNA của gen CP từ (SMV-BYMV) với cặp mồi đặc hiệu từ DNA tổng số của 32 dòng đậu tương SMV bằng PCR. chuyển gen giống DT2008 nhận được 19 dòng cây dương tính với PCR Kỹ thuật tách dòng gen và xác định trình tự nucleotide: i) Tinh sạch (T08-1, T08-4, T08-5, T08-6, T08-7, T08-8, T08-9, T08-13, T08-14, T08- sản phẩm PCR, ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT, iii) Biến 15, T08-16, T08-17, T08-22, T08-24, T08-25, T08-26, T08-27, T08-29, nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli DH5α; iv) Chọn dòng T08-30) (Hình 3.34), với hiệu suất chuyển gen là 2,24%.
8. - 8 - - 21 - khuẩn lạc bằng colony-PCR, v) Tách chiết plasmid, vi) Xác định và phân Thí nghiệm chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) đối với giống đậu tương tích trình tự nucleotide. ĐT12 ở 3 lần biến nạp trong 370 mẫu thu được 112 mẫu tạo chồi và có 40 2.2.2. Nhóm các phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chồi kéo dài trên môi trường chọn lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, trong Vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa vùng gen CP của SMV đó 31 chồi ra rễ, đem trồng 24 cây trên giá thể và đã nhận được 16 cây T0 và BYMV được thiết kế theo mô hình ihpRNA bằng kỹ thuật Gateway sống và phát triển trên giá thể. Đối với giống đậu tương DT2008 với 850 mẫu (Invitrogen). Các bước chính trong kỹ thuật này theo Karimi và đtg (2002), bao gồm: (1) Thiết kế và tổng hợp nhân tạo đoạn gen CPi (SMV-BYMV) trong 4 lần biến nạp thu được 403 mẫu tạo chồi, chọn được 164 chồi kéo dài của SMV và BYMV) và khuếch đại đoạn CPi(SMV-BYMV), (2) Lai ghép trên môi trường chọn lọc SEM chứa 50 mg/l kanamycin, trong đó 105 chồi đoạn CPi (SMV-BYMV) với vector pETRTM/D-TOPO® và (3) Thực hiện ra rễ, mang 90 cây trồng trên giá thể và đã nhận được 32 cây T0 sinh trưởng TM phản ứng LR để trao đổi đoạn CPi (SMV-BYMV) từ vector pENTR /D- và phát triển trên giá thể (Bảng 3.10). TOPO® sang vector pK7GWIWG(II) (Hình 2.4). Nách lá mầm A B C D Hình 2.4. Sơ đồ mô tả các bước thiết kế vector mang cấu trúc RNAi bằng kỹ E G H thuật Gateway Hình 3.28. Tạo cây đậu tương chuyển gen từ giống DT2008 bằng kỹ thuật lây nhiễm A. tumefaciens tái tổ hợp qua nách lá mầm hạt chín A – Nách lá mầm hạt chín; B - Gây tổn thương nách lá mầm trong dịch khuẩn và lây 2.2.3. Phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens nhiễm 30 – 40 phút; C - Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối trong 5 ngày; D - Cảm ứng Biến nạp pK7GW/SMV-BYMV-CPi vào tế bào A. tumefaciens tạo đa chồi trên SIM lần 1 trong 2 tuần (bổ sung BAP 2 mg/l + kanamycin 50 mg/l); E - Cắt CV58C1 pGV2260 bằng xung điện. bỏ lá mầm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM trong 2 tuần (bổ sung GA3 0,5 mg/l Chuyển cấu trúc RNAi mang vùng gen CPi (SMV-BYMV) vào cây + IAA0,1 mg/l + kanamycin50 mg/l); G - Ra rễ trên môi trường RM (bổ sung IBA 0,1 mg/l) thuốc lá Nicotiana tabacum C9-1 thông qua vi khuẩn A. Tumefaciens. trong 20 ngày; H - Ra cây (giá thể 1 trấu hun : 1 cát vàng). Chuyển vector chứa cấu trúc RNAi mang đoạn gen CPi (SMV-BYMV) vào giống đậu tương ĐT12 và DT2008 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
9. - 20 - - 9 - khảm và xoăn, còi cọc và sinh trưởng kém. Trong khi đó, các dòng cây Phương pháp xác định hiệu suất chuyển gen: Mỗi mẫu biến nạp là kháng hoàn toàn vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường, lá xanh tốt. mảnh lá mầm được tái sinh chồi từ nách lá mầm và qua hai lần chọn lọc bằng kháng sinh. Các chồi sống sót sau chọn lọc được chuyển sang môi Các giống thuốc lá K326 và Longjiang 911 được chuyển cấu trúc mang trường ra rễ và đưa ra trồng trên giá thể. Số cây sống trên giá thể của mỗi gen CP của TMV theo cơ chế RNAi thông qua Agrobacterium tumefaciens mẫu biến nạp dương tính với PCR lập thành một dòng cây chuyển gen. Hiệu có khả năng kháng TMV tương ứng là 83% và 90% (Yan và đtg, 2007). suất chuyển gen được tính theo công thức: Zhang và đtg (2012) đã đề cập đến thiết kế cấu trúc RNA kẹp tóc chứa đoạn Số dòng cây chuyển gen dương tính với PCR lặp lại đảo chiều của cDNA CP của virus Y ở khoai tây (PVY) và chuyển Hiệu suất chuyển gen = 100(%) vào cây thuốc lá, khả năng kháng PVY của các dòng thuốc lá chuyển gen là Tổng số mẫu biến nạp 83,54% Ở Việt Nam, thành công đầu tiên ứng dụng kỹ thuật RNAi trong 2.3.4. Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen tạo cây chuyển gen kháng virus là công trình nghiên cứu tạo các dòng cây Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng CMV là 70,9%, kháng PVY là Phân tích, đánh giá khả năng kháng SMV và BYMV bằng phương 84,1%, kháng TMV là 74,5% và khả năng kháng đồng thời hai loại virus pháp lây nhiễm nhân tạo. TMV và CMV lên tới 70,8%. Trong nghiên cứu này đoạn gen CPi của hai loại SMV và BYMV được sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN pK7GW-CPi (SMV-BYMV) chuyển vào cây thuốc lá và thu được kết quả 3.1. TÁCH DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN CP CỦA SMV khả quan, với 73,08% dòng cây chuyển gen kháng hoàn toàn đối với SMV 3.1.1. Tách dòng và xác định trình tự nucleotide đoạn gen CP từ SMV và BYMV, thuộc nhóm cây chuyển gen có tính kháng cao đối với virus. Kết quả so sánh 96 trình tự gen CP của SMV bằng BLAST trong NCBI Chúng tôi cũng đồng tình với quan điểm của Kumar và Sarin (2013) cho cho thấy các trình tự gen CP trên GenBank có độ tương đồng từ 94% đến rằng, việc sử dụng các can thiệp bằng kỹ thuật RNAi đã cung cấp một cách 100% và kích thước vùng tương đồng được xác định có số lượng hơn 700 tiếp cận thân thiện với môi trường để tạo ra cây trồng kháng virus và côn nucleotide. Từ kết quả so sánh và xác định vùng tương đồng của các trình tự trùng, mà cho đến nay khó có kỹ thuật nào thay thế. gen CP và dựa vào trình tự gen CP có mã số X63771 trên GenBank chúng 3.4. KẾT QUẢ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG MANG CẤU TRÚC RNAi tôi đã thiết kế cặp mồi PCR SMVcp-F/SMVcp-R để nhân đoạn tương đồng của gen CP dự tính có kích thước là 720 nucleotide. 3.4.1. Kết quả chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây đậu tương RNA tổng số được tách chiết từ lá đậu tương, tiến hành phản ứng phiên mã Tiến hành chuyển cấu trúc vector CPi (SMV-BYMV) vào mô đậu tương ngược để tạo cDNA và tiến hành phản ứng PCR. Phản ứng PCR khuếch đại của hai giống ĐT12 và DT2008 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens bằng kỹ đoạn gen CP được thực hiện và kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel thuật lây nhiễm qua nách lá mầm hạt chín theo quy trình chuyển gen ở đậu argarose và nhận được một băng DNA đặc hiệu với kích thước khoảng 0,7kb, tương đã được tối ưu (Hình 3.28). đúng với kích thước được dự đoán khi thiết kế cặp mồi PCR (Hình 3.1).
10. - 10 - - 19 - Sản phẩm PCR được tách khỏi bản gel và tinh sạch và gắn trực tiếp vào Hình 3.27. Hình thái lá của một số vector tách dòng pBT sau đó được biến nạp vào tế bào E. coli DH5 . Tiến dòng thuốc lá chuyển gen và cây hành chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR, kết quả điện di cho thấy sản đối chứng không chuyển gen phẩm colony-PCR xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 0,7kb A. Dòng cây chuyển gen T0-5 kháng A B virus; (Hình 3.2). B: Dòng cây chuyển gen T0-12 nhiễm Kết quả giải trình tự nucleotide cho thấy đoạn gen CP phân lập từ SMV nhẹ virus; C: Dòng cây chuyển gen T0-9 nhiễm dòng SL1 và SL2 gây bệnh khảm trên cây đậu tương thu tại Sơn La có 720 nặng virus; nucleotide. Khi so sánh với trình tự của đoạn gen CP trên Ngân hàng gen D: Cây đối chứng không chuyển gen nhiễm nặng virus. quốc tế có mã số X63771 (trình tự sử dụng để thiết kế cặp mồi nhân đoạn C D gen CP) bằng BLAST trong NCBI cho thấy đoạn gen CP (cDNA) mà chúng tôi phân lập được từ SMV dòng SL1 có độ tương đồng là 100%, còn trình tự Kết quả đánh giá tính kháng bệnh virus khảm của 26 dòng cây thuốc lá đoạn gen CP phân lập từ dòng SL2 có độ tương đồng là 99,3%, và hai trình chuyển gen và 10 cây đối chứng được trình bày ở bảng 3.9. tự đoạn gen CP của dòng SL1 và SL2 có độ tương đồng là 99,3%. Như vậy Bảng 3.9. Kết quả lây nhiễm nhân tạo và khả năng kháng SMV, BYMV có thể kết luận rằng trình tự cDNA mà chúng tôi phân lập được là đoạn gen của các dòng thuốc lá chuyển gen T0 và cây đối chứng CP mã hóa protein CP của SMV dòng SL1 và SL2. không chuyển gen M 1 2 3 4 5 6 1 2 M Lần Các dòng cây chuyển gen Đối chứng không chuyển gen lây Số cây Số cây Số Tỷ lệ Số Số cây Số cây Tỷ lệ nhiễm được kháng cây kháng cây kháng biểu hiện kháng lây hoàn biểu (%) được hoàn nhiễm (%) 1kb nhiễm toàn hiện lây toàn bệnh nặng  0,7kb  0,7kb bệnh nhiễm 1 26 22 4 (++) 84,62 10 3 7 (+++) 30,33 2 22 22 0 100 3 0 3 (+++) 0 Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm 3 22 19 3 (+) 86,36 0 0 phẩm RT-PCR khuếch đại colony- PCR từ khuẩn lạc (M: thang DNA đoạn gen CP (cDNA) của SMV chuẩn 1 kb; 1, 2, 3- Gen CP khuếch đại từ Tổng 26 19 7 73,08 10 10 0 (1, 2: SL1, SL2; M: Thang DNA khuẩn lạc) dòng SL1; 4, 5, 6: Gen CP Ghi chú: (+); (++); (+++) mức độ biểu hiện bệnh nhẹ, trung bình và nặng. chuẩn 1 kb) khuếch đại từ khuẩn lạc dòng SL2) Kết quả thống kê ở bảng 3.9 cho thấy tỷ lệ kháng hoàn toàn của các 3.1.2. Phân tích sự đa dạng của trình tự gen CP của các dòng SMV Tiến hành so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen CP của SMV dòng dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pK7GW-CPi (SMV-BYMV) khá SL1 và SL2 (Việt Nam) với 18 trình tự gen CP đã công bố trên GenBank (8 cao (19 cây kháng/26 cây lây nhiễm), tương ứng với 73,08%). Những cây dòng Nhật Bản, 2 dòng Hàn Quốc, 2 dòng Mỹ, 4 dòng Trung Quốc, 1 dòng đối chứng và các dòng cây chuyển gen nhiễm bệnh đều biểu hiện có lá bị
11. - 18 - - 11 - sản phẩm DNA bằng điện di và cho kết quả DNA đảm bảo chất lượng cho Canada, 1 dòng Ucraina), sơ đồ hình cây được thiết lập (Hình 3.6) cho thấy phản ứng PCR. 20 dòng virus phân bố ở 4 nhóm (I, II, III, IV) với khoảng cách di truyền Tiến hành kiểm tra sự có mặt của cấu trúc CPi (SMV-BYMV) bằng 4,8%; dòng SL1, SL2 (Việt Nam) và hai dòng có mã số X63771, U25673 phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R. Kết quả (Trung Quốc) phân bố trong cùng một nhóm (Nhóm II) với hệ số tương điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn CPi (SMV-BYMV) cho thấy đoạn đồng khoảng 99%. DNA thu được có kích thước là 573 bp ở tất cả 26 dòng cây thuốc lá (Hình 3.28). Kích thước này hoàn toàn phù hợp với kích thước của cấu trúc CPi Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về I (SMV-BYMV). Vì vậy, có thể khẳng định cấu trúc pK7GW-CPi (SMV- mối quan hệ di truyền giữa các dòng SMV thiết lập dựa BYMV) đã được chuyển thành công vào cây thuốc lá giống C9-1. trên trình tự đoạn gen CP II phân lập từ 20 dòng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn III Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada, Ucraina (SL1- dòng SL1; SL2- dòng IV SL1; 18 dòng SMV có mã số trên GenBank) Hình 3.28. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định sự có mặt của cấu trúc CPi (SMV-BYMV) trong các dòng cây thuốc lá chuyển gen Tiếp tục phân tích mối quan hệ dựa trên trình tự amino acid suy diễn cho thấy 20 dòng SMV chia làm hai nhánh, nhánh thứ nhất chỉ có một dòng 1-26: 26 dòng thuốc lá chuyển gen; (+) Đối chứng dương là plasmid pK7GW-CPi (SMV- – nhóm V (AAV48873) và nhánh thứ hai có 19 dòng còn lại (Nhóm I, II, III, BYMV; (-) Đối chứng âm là sản phẩm PCR sử dụng khuôn DNA tách từ cây thuốc lá không IV) với khoảng cách di truyền là 7,1%. Hai dòng SL1, SL2 (Việt Nam) và chuyển gen; M: Marker 1kb (Thermo Scientific) hai dòng Trung Quốc có quan hệ gần nhau, phân bố trong nhóm I. Khoảng cách di truyền được tính trên cơ sở so sánh trình tự nucleotide 3.3.2.2. Kết quả đánh giá khả năng kháng SMV và BYMV của các dòng của của đoạn gen CP giữa 20 dòng SMV là 4,8% (Hình 3.6), còn dựa trên thuốc lá chuyển gen trong điều kiện lây nhiễm nhân tạo trình tự amino acid thì khoảng cách di truyền giữa 20 dòng SMV lại lớn hơn Kiểm tra tính kháng đồng thời hai loài SMV và BYMV của 26 dòng rất nhiều, là 7,1%. Kết quả phân tích phù hợp với nhận xét cho rằng các thuốc lá chuyển gen dương tính với PCR và 10 dòng đối chứng không Potyvirus lây nhiễm trên cây họ đậu và các loài thực vật khác có sự biểu hiện chuyển gen được lây nhiễm nhân tạo với SMV và BYMV bằng dịch chứa sự đa dạng về đặc tính sinh học hơn là sự đa dạng về trình tự nucleotide trong nucleic acid. Để phân biệt các loài, các chủng virus có thể tiến hành so virus qua ba lần, mỗi lần cách nhau 15 ngày. Sau mỗi lần lây nhiễm, các sánh trình tự nucleotide, đặc biệt là vùng đầu 3’ không mã hóa của hệ gen dòng thuốc lá được quan sát sự biểu hiện của virus bằng cảm quan. Hình virus và trình tự gen CP. Cách tiếp cận phân tích trình tự amino acid của CP 3.27 thể hiện hình thái lá cây thuốc lá kháng bệnh, nhiễm bệnh của các dòng và trình tự nucleotide của gen CP từ các Potyvirus đã được coi là công cụ cây chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen.
12. - 12 - - 17 - mạnh, không chỉ để nghiên cứu phân loại các loài virus thuộc chi, mà còn đối được trình bày ở bảng 3.8. Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, với 60 mảnh lá cây với các chủng trong Potyvirrus. McKern và đtg (1993) phân tích sự phát sinh thuốc lá C9-1 biến nạp sử dụng thí nghiệm có 38 mảnh sống sót, tạo ra 82 chồi loài dựa trên trình tự nucleotide của Potyvirus cho thấy, các thành viên có trình và thu được 131 cây con in vitro sống sót trên môi trường MS có bổ sung tự với hệ số tương đồng là 38% - 71% được nhận dạng là các loài virus khác kháng sinh cefotaxim 500 mg/l và kanamycin 50 mg/l. ĐC1 là thuốc lá không nhau; còn các thành viên có trình tự với hệ số tương đồng ít nhất là 90% được chuyển gen được cấy lên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh thu nhận dạng là cùng chủng virus. Các chủng virus riêng biệt cũng đã được phân được 105 cây sống. Các cây thuốc lá sau khi ra rễ trên môi trường có kháng biệt bởi sự thay đổi trong hệ gen của chúng. sinh chọn lọc được chuyển trực tiếp ra bầu đất. Kết quả thu được với 40 cây ra 3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC RNAi bầu đất, có 26 cây sống sót với các biểu hiện xanh tốt, mập mạp. 3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng đơn loài SMV 3.2.1.1. Thiết kế đoạn gen CPi từ vùng bảo thủ của gen CP từ SMV Theo cơ chế RNAi, sự ức chế RNA ngoại lai chỉ xảy ra khi có sự A B C D E F tương đồng cao giữa các siRNA và RNA đích. Chính vì vậy vùng bảo thủ của Hình 3.24. Kết quả tái sinh và chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây gen CP ở SMV được lựa chọn ở SMV để thiết kế và tổng hợp đoạn gen CPi thuốc lá C9-1 của SMV (CPi-SMV), phục vụ thiết kế vector mang cấu trúc RNAi. Đoạn gen A: Mảnh lá sau khi rửa khuẩn được cấy trên môi trường chọn lọc; B: Các cụm chồi được tạo thành CPi của SMV (ký hiệu là CPi-SMV) được thiết kế có số lượng nucleotide là sau hai tuần nuôi cấy trên môi trường chọn lọc; C: Các chồi màu xanh được tách ra trên môi 294 nucleotide và cặp mồi mồi SMV-CPi-Fi/SMV-CPi-Ri được thiết kế để trường chọn lọc; D: Chồi cây chuyển gen sau 3 tuần trên môi trường tạo rễ; E: Hình thái rễ nhân bản đoạn CPi-SMV. của cây thuốc lá chuyển gen trên môi trường chọn lọc; F: Cây thuốc chuyển gen trồng trên 3.2.1.2. Khuếch đại đoạn gen CPi-SMV và tạo vector pENTRTM/D-TOPO bầu đất tái tổ hợp Bảng 3.8. Kết quả biến nạp cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào mảnh thuốc lá C9-1 Khuếch đại đoạn CPi-SMV bằng phản ứng PCR với enzyme Pfu và cặp Cấu trúc RNAi Số mảnh Số mảnh Số cụm Số cây Số cây Số cây lá biến lá sống chồi tạo sống sót ra bầu trồng tại mồi đặc hiệu SMV-CP-Fi/SMV-CP-Ri và sản phẩm PCR được kiểm tra nạp sót thành đất nhà lưới bằng điện di trên gel agarose thu được đoạn CPi-SMV có kích thước 0,294kb pK7GW-CPi 2 x 30=60 38 82 131 40 26 đúng bằng kích thước của đoạn CPi khi thiết kế (Hình 3.9). (SMV-BYMV) Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn CPi-SMV được tinh sạch và gắn vào vector ĐC0* 30 0 - - - - pENTR tạo plasmid tái tổ hợp chứa đoạn CPi-SMV (pEN-CPi-SMV). ĐC1* 30 30 79 105 10 10 Ghi chú: * ĐC0 là thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung Vector tái tổ hợp pEN-CPi - SMV được biến nạp và nhân dòng trong tế bào kháng sinh; * ĐC1 là thuốc lá không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không vi khuẩn E.coli One Shot®. Kết quả tách plasmid (Hình 3.12A) và kiểm tra bổ sung kháng sinh sản phẩm PCR trực tiếp từ plasmid bằng cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi- 3.3.2. Kết quả phân tích cây thuốc lá chuyển gen Fi/SMV-CPi-Ri (Hình 3.12B) cho thấy đoạn CPi-SMV có kích thước 294 bp 3.3.2.1. Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR đã được gắn vào vector nhân dòng pENTRTM/D-TOPO tạo vector tái tổ hợp DNA tổng số được tách từ các mẫu lá non của 26 dòng cây thuốc lá pEN-CPi-SMV. chuyển gen ở thế hệ T0 trồng tại nhà lưới sau 3 - 4 tuần ra cây và kiểm tra
13. - 16 - - 13 - khi tách chiết được kiểm tra bằng enzyme giới hạn Xba I và Hind III và kết M CPi quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt được trình bày ở hình 3.22. 1 2 3 4 M 1 2 3 4 Vector chuyển gen mang cấu trúc pGW/SMV-BYMV-CPi được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens và tiếp tục chọn dòng bằng phản ứng 294 bp colony-PCR với cặp mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri. 0,3kb  0,29kb Hình 3.22. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt 0,2 kb Vector pK7GW bằng enzym Xba I và Hind III A B M: thang DNA chuẩn 1 kb; giếng 1 là pK7GW gốc, cắt Hình 3.9. Hình ảnh điện di Hình 3.12. A: Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả bằng Xba I và HindIII thu được 2 đoạn DNA khoảng sản phẩm PCR đoạn CPi tách plasmid tái tổ hợp pEN-CPi-SMV; B: Sản 1463bp và 3310bp; giếng 2-3: pK7GW-CPi (SMV- của SMV phẩm PCR nhân đoạn CPi – SMV từ plasmid tái tổ 1,0kb  BYMV) cắt bằng Xba I và HindIII thu được 2 đoạn DNA M: Thang DNA 1kb; CPi: hợp pEN-CPi-SMV bằng cặp mồi đặc hiệu SMV- khoảng 1,1kb và 3,0kb Đoạn CPi (0,294 kb) khuếch CPi-Fi/SMV-CPi-Ri (M; Thang DNA chuẩn 1kb; đại từ đoạn CPi -SMV 1, 2, 3, 4: Dòng plasmid tái tổ hợp) Nghiên cứu biện pháp tăng cường quá trình phiên mã của gen chuyển trong cây chủ được tập trung tìm hiểu vùng điều khiển, đặc biệt là promoter- 3.2.1.2. Kết quả tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi CPi- SMV) nhân tố khởi đầu sự phiên mã. Trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật Tiến hành thí nghiệm tái tổ hợp giữa vector pEN- CPi- SMV với vector người ta thường sử dụng một số promoter như 35S, act, mas trong đó 35S nhận pK7GWIWG2(II), trong thành phần phản ứng LR gồm plasmid pEN- là một promoter mạnh. Trong nghiên cứu này, cấu trúc RNAi được thiết kế CPi-SMV, vector pK7GWIWG2(II) và nước khử in on, tiệt trùng tạo vector mang đoan gen CPi và promoter 35S thực nghiệm chuyển vào cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc CPi –SMV (pK7GW-CPi-SMV). Biến nạp vector C9-1 và kết quả bước đầu đánh giá mức độ biểu hiện tính kháng trên cây pK7GW-CPi-SMV vào tế bào E.coli One Shot để khuếch đại plasmid mang thuốc lá chuyển gen đã cho thấy tính khả thi của nghiên cứu này. đoạn CPi-SMV và tiến hành chọn dòng. Kết quả tách plasmid pK7GW-CPi- 3.3. KẾT QUẢ TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN KHÁNG SMV SMV từ những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng PCR. Kiểm tra VÀ BYMV plasmid tái tổ hợp pK7GW-CPi-SMV bằng enzyme giới hạn XbaI và HindIII, 3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây thuốc lá kết quả điện di thu được sản phẩm cắt gồm 3 đoạn DNA tương ứng với kích thước Tiến hành chuyển cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào cây thuốc lá, khoảng 8,1kb, 3,1kb và 0,85kb (Hình 3.14). Kết quả trên đã khẳng định vector thông qua việc biến nạp chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi-SMV (pK7GW-CPi-SMV) pK7GW-CPi (SMV-BYMV) vào tế bào của các mảnh lá cây thuốc lá đã được thiết kế thành công. Nicotiana tabacum C9-1 đã được cắt tổn thương 4 cạnh và nuôi cấy trên 3.2.1.3. Tạo vi khuẩn A. tumefaciens chứa vector chuyển gen môi trường cảm ứng MS trước 2 ngày (Hình 3.24). Vector mang cấu trúc pK7GW-CPi-SMV được biến nạp vào tế bào vi Tiến hành 2 lần biến nạp cấu trúc CPi (SMV-BYMV) vào các mảnh lá khuẩn A. tumefaciens CV58C1. Sự có mặt của vector chuyển gen pK7GW- thuốc lá với 30 mảnh lá/ lần, sau các giai đoạn nuôi cấy và chọn lọc, kết quả CPi-SMV trong vi khuẩn A. tumefaciens được kiểm tra bằng phản ứng
14. - 14 - - 15 - colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-Fi/SMV- CPi (pEN-CPi (SMV-BYMV). Vector tái tổ hợp pEN-CPi (SMV-BYMV) CPi-Ri. Các dòng A. tumefaciens tái tổ hợp dương tính với phản ứng PCR được biến nạp và nhân dòng trong tế bào vi khuẩn E.coli. Sử dụng phản ứng được lưu giữ để phục vụ cho các thí nghiệm tạo cây chuyển gen. colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV- CPi-R và cặp mồi M13-F/M13-R (Hình 3.19). Tách plasmid và kiểm tra Hình 3.14. Kết quả kiểm tra điện di sản 1 2 3 4 5 M phẩm cắt Vector pK7GW bằng enzym plasmid tái tổ hợp pEN-CPi (SMV-BYMV) bằng PCR trực tiếp từ plasmid với Xba I và Hind III (Giếng 1-2-3-4: pK7GW- cặp mồi đặc hiệu SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R. 8,1kb CPi (SMV3310-BYMV ) cắt bằng Xba I và HindIII 3310 M CPi 3,1kb 3,0kb thu được 3 đoạn DNA, trong đó có đoạn 1463 2,0kb với kích thước 0,85kb; M: thang DNA chuẩn 1kb; giếng 5 là pK7GW gốc, cắt 0,85kb 1,0kb bằng Xba I và HindIII thu được 2 đoạn 1,0kb DNA khoảng 1463bp và 3310bp) 0,5kb 3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi kháng hai loài 0,5kb SMV và BYMV A B 3.2.2.1. Thiết kế đoạn gen CPi từ hai loài SMV và BYMV Hình 3.17. Hình ảnh điện Hình 3.19. Sơ đồ ghép nối và kết quả điện di kiểm tra Đoạn gen CPi của cả hai loài SMV và BYMV có ký hiệu CPi (SMV- di sản phẩm PCR vùng sản phẩm colony-PCR đoạn CPi (SMV-BYMV) trong BYMV) với kích thước 573 nucleotide được thiết kế bao gồm đoạn bảo thủ CPi của SMV và BYMV vector pEN-CPi (SMV-BYMV) của gen CP ở SMV có kích thước là 294 nucleotide và đoạn bảo thủ của gen M: Thang DNA 1kb; CPi: A: Sơ đồ ghép nối đoạn CPi (SMV-BYMV) vào vector Đoạn CPi khuếch đại từ đoạn pENTRTM/D-TOPO; B: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm CP ở BYMV có kích thước là 279 nucleotide, dựa trên phân tích đoạn gen CPi (SMV-BYMV) có kích colony-PCR đoạn CPi (SMV-BYMV) (1, 2: Đoạn CPi khuếch CP ở đầu 3’ của SMV và BYMV đã phân lập và các trình tự được công bố thước 573 nucleotide đại với cặp mồi SMV-CPi-F/BYMV-CPi-R; 3: đoạn CPi + trên GenBank. Cặp mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri mà chúng tôi thiết kế attL1, attL2 với cặp mồi M13-F/M13-R; M: thang DNA 1kb) và sử dụng cho phản ứng PCR để khuếch đại đoạn CPi (SMV-BYMV). 3.2.2.2. Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi CPi (SMV-BYMV) 3.2.2.1. Khuếch đại vùng CPi (SMV-BYMV) và tạo vector pENTRTM/D- Trong thí nghiệm này, plasmid pEN-CPi (SMV-BYMV) tiếp tục tham TOPO tái tổ hợp gia phản ứng LR với vector tiếp nhận pK7GWIWG2(II) với sự xúc tác của Khuếch đại vùng CPi từ đoạn gen CPi (SMV-BYMV) bằng PCR với cặp hỗn hợp enzyme LR ClonaseTM II để tạo vector chuyển gen pK7GW-CPi mồi SMV-CPi-Fi/BYMV-CPi-Ri đã thiết kế và sản phẩm được kiểm tra bằng (SMV-BYMV) (Hình 3.22) theo cơ chế tái tổ hợp giữa vector pEN- CPi điện di trên gel agarose cho thấy có một băng điện di DNA có kích thước (SMV-BYMV) với vector pK7GWIWG2(II). Vector chuyển gen pK7GW-CPi 0,573kb đúng như kích thước đoạn CPi như đã thiết kế (Hình 3.17). (SMV-BYMV) được dòng hóa vào tế bào E.coli và được chọn dòng bằng Sản phẩm PCR nhân bản đoạn CPi (SMV-BYMV) được làm sạch và gắn phản ứng colony-PCR. Vector chuyển gen pK7GW-CPi (SMV-BYMV) sau vào vector nhân dòng pENTRTM/D-TOPO tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn