Phân lập, tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và đánh giá khả năng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia) ở Đồng bằng sông..

Nội dung tài liệu: Phân lập, tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và đánh giá khả năng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia) ở Đồng bằng sông..

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 62 42 02 01 ĐOÀN THỊ KIỀU TIÊN PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN NẤM MEN CHỊU NHIỆT VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƯỢU VANG TRÁI GIÁC (Cayratia trifolia) Ở VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Cần Thơ, 2020
2. CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: GS.TS. Hà Thanh Toàn PGS.TS. Ngô Thị Phương Dung Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ sở Họp tại: Phòng Bảo Vệ Luận Án Tiến Sĩ, Lầu 2 – Nhà Điều Hành, Trường Đại Học Cần Thơ. Vào lúc 14 giờ 00 ngày 03 tháng 04 năm 2020 Phản biện 1: PGS.TS.Nguyễn Đức Hoàng Phản biện 2: PGS.TS.Nguyễn Minh Thủy Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam
3. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Doan Thi Kieu Tien, Ha Thanh Toan and Ngo Thi Phuong Dung, 2016. Exploration of yeasts applied for wine fermentation from Cayratia trifolia in the Mekong Delta. The 12th Young Scientist Seminar; Nov 22nd-23rd, Yamaguchi Prefectural Seminar park, Yamaguchi, Japan, 19. 2. Đoàn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Hoàng Anh, Nguyễn Ngọc Thạnh, Huỳnh Xuân Phong, Hà Thanh Toàn và Ngô Thị Phương Dung, 2017. Tuyển chọn nấm men chịu nhiệt lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia L.) của tỉnh Kiên Giang”. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn. 54-62. 3. Đoàn Thị Kiều Tiên, Viên Thị Hải Yến, Huỳnh Xuân Phong, Bùi Hoàng Đăng Long, Hà Thanh Toàn và Ngô Thị Phương Dung, 2018. Tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và ứng dụng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia L.) từ tỉnh Hậu Giang. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 54(4B): 64-71. 4. Đoàn Thị Kiều Tiên, Lữ Hằng Nghi, Nguyễn Ngọc Thạnh, Huỳnh Xuân Phong, Hà Thanh Toàn và Ngô Thị Phương Dung, 2018. Phân lập và tuyển chọn nấm men chịu nhiệt ứng dụng trong lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia L.), Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông lâm nghiệp. 55-64. 5. Đoàn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Ngọc Mi, Nguyễn Đức Độ, Hà Thanh Toàn và Ngô Thị Phương Dung, 2018. Khảo sát hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa của dịch trái giác (Cayratia trifolia) trước và sau lên men sử dụng nấm men chịu nhiệt Saccharomyces cerevisiae HG1.3, 2018. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 60-64
4. 6. Đoàn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Ngọc Mi, Huỳnh Thị Hoàng Anh, Huỳnh Xuân Phong, Nguyễn Ngọc Thạnh, Bùi Hoàng Đăng Long, Hà Thanh Toàn và Ngô Thị Phương Dung, 2018. Hoạt tính sinh học của trái giác thu ở tỉnh Kiên Giang và lên men rượu vang trái giác sử dụng Saccharomyces cerevisiae AG2.1. Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Báo cáo Khoa học proceeding Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2018. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ. 978-983 7. Đoàn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Ngọc Mi, Lữ Hằng Nghi, Huỳnh Xuân Phong, Nguyễn Ngọc Thạnh, Hà Thanh Toàn và Ngô Thị Phương Dung. Hoạt tính sinh học của trái giác từ tỉnh Cà Mau và lên men rượu vang trái giác sử dụng Saccharomyces cerevisiae CM3.2, 2018. Kỷ yếu Hội thảo Công nghệ Sinh học vùng Đồng bằng sông Cửu Long 2018 “Thành tựu và phát triển”. 104. 8. Doan Thi Kieu Tien, Huynh Xuan Phong, Mamoru Yamada, Ha Thanh Toan and Ngo Thi Phuong Dung, 2019. Characterization of newly isolated thermotolerant yeast and evaluation of their potential for use in Cayratia trifolia wine production, Vietnam Journal of Science,Technology and Engineering. 68-73 9. Đoàn Thị Kiều Tiên, Huỳnh Thị Ngọc Mi, Lữ Hằng Nghi, Huỳnh Xuân Phong, Nguyễn Ngọc Thạnh, Bùi Hoàng Đăng Long, Hà Thanh Toàn và Ngô Thị Phương Dung, 2019. Đánh giá khả năng duy trì hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa khi lên men rượu vang từ trái giác ở tỉnh Cà Mau sử dụng Saccharomyces cerevisiae CM3.2, Tạp chí Khoa học Tường Đại học Cần Thơ. 55 (2019)(2): 285-291
5. Chương 1. GIỚI THIỆU Tính cấp thiết của đề tài Dây giác (Cayratia trifolia) là một loại dây leo mọc hoang dại trong trảng cỏ và rừng thưa thuộc các nước như Trung Quốc, Lào, Campuchia, Ở Việt Nam dây giác phát triển dọc các hàng rào, bụi rậm từ các ở tỉnh miền Trung đến các tỉnh miền Nam. Vùng ĐBSCL, dây giác có hầu hết ở tất cả các tỉnh, thành phố, đặc biệt dây giác là loài thực vật rất phong phú trên đất U Minh. Trong thành phần dây giác có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao (Tsao, 2010), trái giác có màu sắc và hương vị rất đặc trưng nhưng chưa được nghiên cứu và khai thác. Rượu vang có lịch sử hàng ngàn năm, đã và đang được nghiên cứu để đa dạng hóa về chủng loại, cải tiến về chất lượng. Trong quá trình lên men rượu vang, một trong những yếu tố quan trọng nhất chính là nguồn nấm men. Nhiệt độ có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình nấm men chuyển hóa đường thành ethanol. Hiện nay, nhiệt độ trái đất đang ấm dần lên do hiện tượng biến đổi khí hậu. Nhiệt độ tăng cao sẽ ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men trong quá trình sản xuất rượu vang. Do đó, việc ứng dụng chủng nấm men chịu nhiệt sẽ mang lại hiệu quả cho quá trình lên men. Từ đó, yêu cầu về phân lập, tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và đánh giá khả năng lên men rượu vang trái giác (Cayratia trifolia) ở Đồng bằng sông Cửu Long là rất cần thiết. Mục tiêu của đề tài Cung cấp các dữ liệu về trái giác và đề xuất một giải pháp cho quá trình lên men rượu vang trái giác giúp giải quyết vấn đề ấm dần lên của trái đất do sự gia tăng nhiệt độ. Qua đó, người dân ở khu vực có thể vận dụng để thích nghi nhanh với sự biến đổi khí hậu của khu vực và khai thác giá trị nguồn trái giác có trong thiên nhiên để tăng thêm thu nhập. 1
6. Nội dung nghiên cứu (1) Thu thập và đánh giá một số đặc điểm hóa lý và đặc tính kháng oxy hóa của nguyên liệu trái giác vùng ĐBSCL; (2) Phân lập và xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men từ trái giác tự nhiên; (3) Tuyển chọn và xác định mối quan hệ di truyền các chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn và có khả năng lên men rượu vang trái giác tốt; (4) Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rượu vang trái giác sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt tốt nhất được tuyển chọn. Những đóng góp mới của đề tài - Xác định trái giác có chứa hàm lượng polyphenol từ 0,47 đến 1,54 mg GAE/mL và có khả năng kháng oxy hóa từ 16,60 đến 82,86%. - Phân lập được 151 chủng nấm men từ trái giác tự nhiên vùng ĐBSCL thuộc năm giống Saccharomyces, Candida, Clavispora, Pichia và Hanseniaspora. - Xác định có 30 chủng nấm men tự nhiên trên trái giác có khả năng chịu nhiệt từ 37 đến 45ºC, có khả năng phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol từ 9 - 12% và lên men dịch trái giác đạt hàm lượng ethanol từ 6% (v/v) trở lên. - Tuyển chọn được chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae HG1.3 có khả năng chịu nhiệt đến 43ºC, lên men rượu trái giác ở nhiệt độ 35ºC với pH ban đầu 4,5, 20 ºBrix và mật số giống chủng 105 tế bào/mL, sau 6 ngày lên men hàm lượng ethanol đạt 11,68% (v/v). Sản phẩm vang rượu trái giác chứa hàm lượng polyphenol 0,6 mg GAE/mL, khả năng kháng oxy hóa là 57,3% và có tính đặc trưng về màu sắc, hương vị. Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về dây giác Giác là loài thân leo, dây leo nhờ tua cuống mọc đối diện ở lá, dài khoảng 2-3 cm, thường phân ra 3 nhánh 2
7. (Kumar et al., 2011), đôi khi có 4-5 nhánh có màu nâu đỏ có ít lông, gân dọc. Lá mọc cách kép hình lông chim, có 3 lá ghép lại lá ở giữa thường to hơn hai bên, lá có hình trứng thon nhọn dài. Thân cây giác có tiết diện đa giác, thân già màu xanh, thân non màu nâu đỏ, nhiều gân dọc. Hoa phát triển ở nách lá đứng, có thể cao; hoa rộng 6-8 mm, đài hình dĩa, 4 cánh hoa, xanh (Phạm Hoàng Hộ, 2000). Trái giác chứa nhiều nước, trái tròn dẹt, màu tím đen khi chín, đường kính khoảng 1cm (Sesagirriravu, 1986). Trái giác có chứa hàm lượng cao phenolic, mẫu dịch trích bằng ethanol có khả năng kháng oxy hóa cao (Rabeta và Lin, 2015). 2.2. Sơ lược về nấm men Nấm men được định nghĩa là những loại nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi. Tế bào nấm men có cấu tạo gồm: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất và nhân tế bào (Nguyễn Lân Dũng, 1999). Nấm men có thể được tìm thấy ở nhiều môi trường khác nhau như nước, không khí, đất, Nấm men thường có khả năng phát triển ở pH thấp và hoạt động trong môi trường nước để giảm hoặc ức chế sự phát triển của vi khuẩn (Kurtzman et al., 2011). Từ ngày xưa cho đến nay, con người đã biết cách sử dụng nấm men để phục vụ cho cuộc sống từ khoa học, thực phẩm, y tế đến công nghiệp. Đồ uống lên men và thực phẩm được sản xuất thông qua các hoạt động của nấm men đã sớm đóng góp nổi bật cho sự tiến bộ trên toàn thế giới và phát triển bền vững của xã hội loài người (Legras et al., 2007, Ulber và Soyez, 2004) 2.3 Quá trình lên men rượu và ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men Sự phân giải hydratcarbon trong điều kiện kỵ khí được gọi là quá trình lên men (Nguyễn Lân Dũng, 1999). Lên men rượu là một quá trình sinh hoá phức tạp, đòi hỏi có sự tham gia của nấm men hoặc một số vi sinh vật khác. 3
8. Trong quá trình lên men rượu, đường được biến đổi thành ethanol và CO2. Quá trình lên men rượu kèm theo sự hình thành các sản phẩm đồng thời giải phóng ra năng lượng (Nguyễn Thành Đạt, 1986). Nấm men thông thường rất nhạy cảm với nhiệt độ, ở 36oC nấm men bắt đầu bị ức chế. Trong môi trường lỏng, ở nhiệt độ 40-50oC, nấm men hầu như ngưng hoạt động và chết sau 1 giờ 30 phút; ở nhiệt độ 60-65oC, nấm men sẽ chết sau 5 phút. Trong môi trường khô (W=13%), nấm men chịu nhiệt tốt hơn, có thể chịu đến 85-105oC. Nhiệt độ càng cao, sự lên men càng hạn chế, hàm lượng ethanol càng thấp, lượng đường còn lại trong rượu càng nhiều, nồng độ đường cao có thể gây ra sự ngừng quá trình lên men (Bùi Ái, 2003). Nhiệt độ tối ưu cho nấm men rượu vang phát triển là 25-28oC (Casellas, 2005). Khi quá trình lên men diễn ra ở nhiệt độ thấp sẽ kéo dài thời gian hơn, nhưng lên men ở nhiệt độ cao quá sẽ ảnh hưởng đến mùi vị của sản phẩm, hoạt tính của nấm men bị giảm mạnh, dễ bị nhiễm lactic và nấm men hoang dại. Ngoài ra, khi lên men ở nhiệt độ cao, sẽ tạo nhiều ester aldehyde và tổn thất rượu theo CO2 tăng (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005) 2.4 Nấm men chịu nhiệt Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt động của nấm men. Arthur và Watson (1976) đã xác định nhiệt độ phát triển của nấm men ưa lạnh (psychrophilic) trong khoảng 2-20ºC; nấm men ưa nhiệt độ trung bình (mesophilic) là 5-35ºC; nấm men chịu nhiệt (thermotolerant) là 8-42ºC và nấm men ưa nhiệt (thermophilic) là 28- 45ºC. Theo Roehr (2001), nấm men chịu nhiệt có một số thuận lợi trong việc sản xuất ethanol trong điều kiện nhiệt độ cao bao gồm hoạt động trao đổi chất vẫn tốt và tốc độ lên men cao tạo ra nhiều sản phẩm; độ hòa tan của oxy và các khí khác trong nước giảm khi 4
9. nhiệt độ tăng đảm bảo điều kiện kỵ khí cho quá trình lên men; độ nhớt của môi trường lên men giảm khi nhiệt độ tăng nên năng lượng cần thiết cho việc đảo trộn môi trường giảm đi vì vậy cơ hội bị nhiễm được giảm thiểu. Vì vậy, để đạt được quá trình lên men ở nhiệt độ cao, cần có chủng nấm men lên men hiệu quả và khả năng chịu nhiệt cao (Limtong et al., 2007). Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thu thập, đánh giá đặc điểm của trái giác Trái giác được thu từ 53 địa điểm khác nhau thuộc 13 tỉnh, thành phố vùng ĐBSCL. Sau khi thu, chọn trái chín, rửa sạch, để ráo. Xác định đặc điểm về hình dạng, kích thước, màu sắc của trái. Dịch ép trái giác được đo pH, độ Brix; xác định hàm lượng đường, hàm lượng polyphenol và khả năng kháng oxy hóa bởi khả năng bắt gốc tự do DPPH (%) của trái giác. 3.2. Phân lập các chủng nấm men từ trái giác tự nhiên và xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Trái giác thu về được thực hiện phân lập nấm men bằng môi trường nuôi tăng sinh YPD. Dịch tăng sinh được pha loãng rồi cấy trải, cấy chuyền trên môi trường YPD agar nhiều lần đến khi khuẩn lạc ròng, bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC. Các chủng nấm men thuần chủng được xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa như hình thái, khả năng lên men các loại đường như saccharose, maltose và glucose, hoạt tính phân giải urea, thủy phân gelatin, cách nảy chồi, đặc điểm hình thành bào tử để phân loại sơ bộ và đánh giá khả năng lên men ethanol. 3.3. Tuyển chọn, định danh và xác định mối quan hệ các chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn và có khả năng lên men rượu vang trái giác tốt 5
10. 3.3.1. Đánh giá khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men Các chủng nấm men phân lập được sẽ cấy ria được trên petri có chứa môi trường YPD agar. Ủ các đĩa petri ở các nhiệt độ khác nhau: 30ºC, 35ºC, 37ºC, 39ºC, 41ºC, 43ºC, 45ºC và 47ºC trong 48 giờ. Quan sát sự hình thành khuẩn lạc của các chủng nấm men ở điều kiện nhiệt độ cao trong thời gian trong 48 giờ để tuyển chọn những chủng nấm men có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ cao. 3.3.2. Đánh giá khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men Nhằm tuyển chọn những chủng nấm men chịu nhiệt có khả năng phát triển trong môi trường có ethanol. Các chủng nấm men được chịu nhiệt được chọn từ 3.2.3.1 được cấy ria trên môi trường YPD agar có bổ sung ethanol tinh khiết 3%, 6%, 9%, 12%, 15% v/v và mẫu đối chứng 0%. Các đĩa petri được ủ ở nhiệt độ 30ºC trong thời gian 48 giờ. Quan sát sự hình thành khuẩn lạc của các chủng nấm men ở điều kiện môi trường có nồng độ ethanol khác nhau. 3.3.3. Đánh giá khả năng lên men ethanol của nấm men chịu nhiệt Các chủng nấm men được tăng sinh được chủng 1 mL vào ống nghiệm có chuông Durham úp ngược chứa 9 mL dung dịch đường glucose 2% (w/v) đã được khử trùng ở 121ºC trong 20 phút. Tương tự, chủng 1 mL dịch tăng sinh nấm men vào ống nghiệm có chuông Durham úp ngược chứa 9 mL dịch trái giác đã được điều chỉnh về pH=4 và 22ºBrix. Lắc đều để dung dịch đường hoặc dịch trái giác tràn đầy vào chuông Durham bên trong ống nghiệm. Đo chiều cao cột khí trong chuông Durham sau 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42 và 48 giờ ủ ở nhiệt độ phòng (28- 30ºC) để xác định khả năng lên men ethanol. 6
11. 3.3.4. Thử nghiệm lên men rượu vang trái giác sử dụng các chủng nấm men được tuyển chọn Sử dụng 99 mL dịch trái giác và chủng 1 mL dung dịch nấm men được chọn ở mục 3.3.3 đã được tăng sinh. Mật số nấm men sau khi chủng là 106 tế bào/mL. Ủ 5-7 ngày trong điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ 37ºC. Đo pH và độ Brix để xác định sự thay đổi pH và độ Brix của dịch trái giác sau thời gian lên men. Chưng cất để thu ethanol, đo nhiệt độ và nồng độ ethanol thu được, quy về nồng độ ethanol ở 20ºC. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn với nhân tố khảo sát là chủng nấm men, thực hiện 3 lần lặp lại. 3.3.5. Định danh các chủng nấm men có khả năng chịu nhiệt, chịu cồn và khả năng lên men rượu vang trái giác được tuyển chọn Các chủng nấm men có khả năng chịu nhiệt, chịu ethanol và có khả năng lên men dịch trái giác sinh ra ethanol ≥ 6,0% (v/v) được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử với cặp mồi NL1 (5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’) và NL4 (5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’) khuếch đại trình tự 26S rDNA đoạn D1/D2 kết hợp với đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Xây dựng cây phả hệ 26S rDNA của các chủng nấm men chịu nhiệt đã được định danh dựa trên multiple aligment, chương trình MEGA 6 (theo thông số Neighbor – Joining (NJ)). 3.4. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rượu vang trái giác 3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men và pH Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố là nhiệt độ và pH môi trường, với 3 lần lặp lại. Nhân tố nhiệt độ gồm các nghiệm thức nhiệt độ phòng (28-32ºC); 35ºC, 37ºC, 39ºC và 41ºC. Nhân tố pH môi trường gồm 7
12. các nghiệm thức 4; 4,5; 5 và pH tự nhiên trong dịch trái giác. Tổng cộng có 4×5×3=60 nghiệm thức được thực hiện. Mỗi đơn vị thí nghiệm được tiến hành ở thể tích 100 mL dịch trái giác. Chủng nấm được tuyển chọn từ mục 3.3 được nuôi trong môi trường tăng sinh đến khi mật số tế bào nấm men đạt 108 tế bào/mL. Trái giác được rửa sạch, ép và lọc để đo pH và độ Brix ban đầu của dịch trái. Cho 99mL dịch trái giác vào bình tam giác, điều chỉnh dịch trái về 22oBrix, pH ở các mức 4; 4,5; 5 và pH tự nhiên, thanh trùng dịch trái giác bằng 140mg/L NaHSO3 trong 2 giờ. Chủng 1 mL dung dịch nấm men đã được nuôi cấy vào, ủ ở nhiệt độ phòng (28-32oC), 35oC, 37oC, 39oC và 41ºC từ 5-7 ngày trong điều kiện kỵ khí (đậy bằng waterlock). Theo dõi giá trị pH, độ Brix và xác định hàm lượng ethanol sinh ra từ đó chọn nhiệt độ và pH lên men cho khảo sát tiếp theo. 3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của mật số nấm men, độ Brix và thời gian lên men Nhằm xác định mật số nấm men, độ Brix và thời gian lên men thích hợp cho quá trình lên men. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 3 nhân tố, mỗi nhân tố 3 mức độ với 3 lần lặp lại. Nhân tố mật số giống chủng lần lượt là là 103, 105, 107 tế bào/mL, độ Brix: 20, 22, 24 ºBrix, thời gian lên men: 5, 7, 9 ngày. Tổng cộng có 3×3×3×3=81 nghiệm thức được thực hiện. Mỗi đơn vị thí nghiệm được tiến hành ở thể tích 100 mL dịch trái giác. Tiến hành tương tự như mục 3.4.1. Điều chỉnh pH của dịch trái giác và nhiệt độ lên men được chọn ở mục 3.4.1. Thí nghiệm được theo dõi bằng cách đo pH và độ Brix để theo dõi quá trình lên men, chưng cất để thu ethanol, đo hàm lượng ethanol và quy về nồng độ ethanol ở 20ºC. 3.5 Xử lý số liệu 8
13. Kết quả được xử lý bằng chương trình Microsoft Office Excel 2010 và phần mềm thống kê Statgraphics Centurion XV. Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Đặc điểm của trái giác ở ĐBSCL Kết quả quan sát về hình dạng bên ngoài của 53 mẫu trái giác thu được ở 13 tỉnh, thành phố thuộc ĐBSCL cho thấy có hai dạng chủ yếu là trái tròn hoặc trái dẹp, ở một số vùng có trái tròn hơi dẹp. Bề mặt trái bóng hoặc hơi nhám, kích thước trung bình khoảng 1,5 – 2 cm, màu đen sậm (Hình 4.1). Bảng 4.1: Đặc điểm của 2 dạng trái giác ở vùng ĐBSCL STT Hình Đặc điểm 1 Trái dạng tròn, bề mặt trái hơi nhám, có màu đen sậm, kích thước khoảng 1,5 – 2,0 cm Bề mặt lá không có lông, bìa lá có ít răng cưa 2 Trái có dạng hình dẹp, có màu đen sậm, kích thước khoảng 1,5 - 1,7 cm Bề mặt lá có lông, bìa lá có nhiều răng cưa Trái giác có giá trị pH và ºBrix khác nhau tùy thuộc vào vị trí thu mẫu trái; điều kiện tự nhiên, khí hậu của từng địa điểm thu trái giác khác nhau thì giá trị pH và ºBrix khác nhau. 9
14. Giá trị pH trong khoảng từ 3,01- 4,75, ºBrix tương đối từ 3,5- 10,0. Trong trái giác, hàm lượng đường tổng từ 0,41-2,17 g/100 mL, hàm lượng đường khử trong mẫu trái giác nằm trong khoảng từ 0,22 - 0,96 g/100 mL. Dịch trái giác chứa hàm lượng polyphenol từ 0,47 - 1,54 mg GAE/mL và có khả năng bắt gốc tự do từ 16,6 - 82,86%. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Rabeta và Lin (2011), khả năng bắt gốc tự do DPPH trong dịch trái giác tươi là 61,47% 4.2. Phân lập các chủng nấm men từ trái giác tự nhiên và xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Từ 53 nguồn trái giác khác nhau ở 13 tỉnh, thành phố vùng ĐBSCL đã phân lập được bộ chủng nấm men tự nhiên gồm 151 chủng. Kết quả này cho thấy, sự phong phú và đa dạng của nấm men tự nhiên trên trái giác, đồng thời cũng có sự tương đồng với các công trình đã được công bố như đã phân lập được 50 chủng nấm men từ viên men rượu ở ĐBSCL (Ngô Thị Phương Dung, 2009), 40 chủng nấm men từ phụ phẩm nông nghiệp là vỏ ca cao, vỏ khóm, bã mía, rơm và mùn cưa, 28 chủng nấm men từ trái, lá cây có múi (Dung Phong et al., 2016; Nuanpeng et al., 2016; Phong et al., 2016; Techaparin et al., 2017). Đặc điểm hình thái của 151 chủng nấm men có 7 nhóm hình dạng: hình cầu nhỏ, hình cầu lớn, hình ovan nhỏ, hình ovan lớn, hình elip ngắn, hình elip dài và hình elip nhọn. Đặc điểm hình thành bào tử cho thấy từ nhóm 1 đến 6 đều cho bào tử hình tròn, trừ nhóm 7. Kết quả về khả năng lên men các loại đường glucose, saccharose và maltose; hoạt tính phân giải urea, thủy phân gelatin của các chủng nấm men cho thấy có 140 chủng có khả năng lên men đường glucose, 104 chủng có khả năng lên men đường saccharose, 108 chủng có khả năng lên men đường maltose, 24 chủng có hoạt tính phân giải urea và 30 chủng có khả năng phân giải gelatine. Theo mô tả phân loại sơ 10
15. bộ đến giống của Kurtzman và Fell (1998), cho thấy 151 chủng nấm men có thể phân loại thuộc 4 giống là Saccharomyces, Hanseniaspora, Pichia và Cadida. 4.3. Tuyển chọn, định danh và xác định mối quan hệ các chủng nấm men chịu nhiệt, chịu cồn và có khả năng lên men rượu vang trái giác tốt 4.3.1. Khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men Sự phát triển của 151 chủng nấm men cho thấy ở mức nhiệt độ 30ºC và 35oC, tất cả các chủng nấm men đều phát triển tốt. Trong 151 chủng nấm men có 141 chủng nấm men có khả năng phát triển ở 37oC. Ở nhiệt độ 39oC, có 121 chủng nấm men có khả năng phát triển. Khi nhiệt độ môi trường tăng lên 41oC, có 89 chủng nấm men có khả năng phát triển, đến mức nhiệt độ môi trường 43oC thì chỉ có 48 chủng có thể phát triển. Ở mức nhiệt độ 45oC thì chỉ còn 10 chủng phát triển. Tất cả các chủng nấm men phân lập được đều không thể phát triển ở 47oC. Kết quả chọn được 141 chủng có khả năng phát triển ở 37oC. 4.3.2 Khả năng chịu ethanol của những chủng nấm men chịu nhiệt Hầu hết các chủng nấm men đều phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol 3%, trừ một chủng VL4.4 được phân lập từ trái giác ở huyện Trà Ôn tỉnh Vĩnh Long. Khi tăng nồng độ ethanol trong môi trường thì khả năng phát triển của nấm men giảm, có 128 chủng nấm men có khả năng phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol 6%, 64 chủng nấm men có khả năng phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol 9%. Ở giá trị nồng độ ethanol là 12% thì chỉ còn 27 chủng có thể phát triển. Khi nồng độ ethanol là 15% thì tất cả các chủng đều không phát triển. Theo Casey và Ingledew (1986), khả năng chịu đựng hàm lượng ethanol của đa số các chủng nấm men trong sản 11
16. xuất rượu bia vào khoảng 5-10 % (v/v) ethanol. Kết quả, tuyển chọn được 64 chủng có khả năng chịu cồn từ 9% đến 12% v/v ethanol để đánh giá khả năng lên men ethanol. 4.3.3 Tuyển chọn những chủng nấm có khả năng lên men ethanol Theo Lương Đức Phẩm (2005), trong quá trình sống của nấm men sinh ra một lượng khí CO2 khá lớn. Sản phẩm này được tạo thành trong điều kiện kỵ khí của nấm men để sinh ra rượu ethylic, CO2 và các sản phẩm phụ khác. Lượng CO2 sinh ra sẽ đẩy ống Durham nên giá trị chiều cao cột khí CO2 giúp đánh giá sơ bộ khả năng lên men của các chủng nấm men. Sáu mươi bốn chủng nấm men hầu hết đều có khả năng chuyển hóa glucose thành ethanol với chiều cao cột khí sinh ra trong ống Durham tăng theo thời gian. Chủng KG2.2, KG3.1, DT1.2, CM3.2 và BT1.2 đạt chiều cao cột khí 30 mm chỉ trong 6 giờ. Hai chủng nấm men KG4.1 và AG3.2 hầu như không có khả năng lên men. Kết quả đánh giá khả năng lên men ethanol trong dịch trái giác đã sơ tuyển được 57/64 chủng có khả năng lên men ethanol, sinh khí chiếm đầy thể tích chuông Durham 30 mm trong 48 giờ. 4.3.4 Lên men rượu vang trái giác Thử nghiệm lên men rượu vang trái giác của 57 chủng nấm men được đánh giá bằng khả năng lên men rượu vang trái giác trong 100 mL dịch trái giác. Sau khi lên men, pH và độ Brix của dịch trái giác đều giảm so với pH và độ Brix ban đầu (pH=4,5; Brix=22o) do trong quá trình lên men, nấm men sử dụng đường làm nguồn carbon. Vì vậy, đường bị chuyển hóa qua một chuỗi phản ứng enzyme để tạo thành sản phẩm cuối cùng của sự lên men là ethanol và CO2 (Lê Ngọc Tú et al., 2005). Hàm lượng ethanol là một trong những chỉ 12
17. tiêu quan trọng nhất để đánh giá khả năng lên men rượu của các chủng nấm men. Kết quả cho thấy chủng nấm men HG1.3 có khả năng lên men sinh ra hàm lượng ethanol là 9,9% (v/v). 4.3.5 Tên khoa học và mối quan hệ di truyền của các chủng nấm men có khả năng chịu nhiệt, chịu ethanol và khả năng lên men rượu vang trái giác Từ kết quả khảo sát khả năng lên men ở mục 4.3.4 tuyển chọn được 30/57 chủng nấm men có khả năng lên men đạt nồng độ ethanol từ 6,0% (v/v) trở lên. Kết quả định danh 30 chủng nấm men được thể hiện ở Bảng 4.2. Bảng 4.2: Kết quả định danh 30 chủng nấm men STT Giống Loài Chủng Số lượng chủng Candida Candida KG1.1,n ấm KG3.2,men 5 1 Candidatropicalis CM3.3,DT1.2, HG3.3,ST2.1, 3 TG1.1 Candidanivariensis glabrata BL2.1, BT1.2 CT1.1, 4 2 Pichia Pichia KG5.1,CT1.3, AG2.3,CT2.3 8 3 Clavispora kudriavzeviiClavispora AG4.2, TG4.2 CM4.4, 1 BT2.1, BT3.3, 4 Saccharomyces Saccharomyceslusitaniae HG1.3, CM3.2, 9 CT4.2, VL1.1 Tổngcerevisiae số AG2.1, TV4.2, 30 DT3.2, LA1.3, Mối quan hệ di truyền của 30 chủngKG2.1, nấm TG3.1, men Xây dựng cây phát sinh loài dựa bằngHG2.1 phần mềm MEGA 6 (Neighbor-Joining). Cây phát sinh loài của 30 chủng nấm men tuyển chọn được thể hiện ở Hình. 4.1. Kết quả định danh thể hiện sự đa dạng về giống, loài của các chủng nấm men chịu nhiệt được tuyển chọn từ trái giác. Kết quả cũng có sự phù hợp với các nghiên cứu của Nguyễn Lân Dũng và ctv. (2019 hay theo Basso et al. (2008), Saccharomyces cerevisiae là chủng nấm men truyền thống được ứng dụng phổ biến trong lên men rượu. 13
18. Hình 4.1: Mối quan hệ phát sinh loài của 30 chủng nấm men Ghi chú: Chỉ số trên mỗi nhánh: chỉ số boostrap là 1.000 : khoảng cách di truyền 4.4. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho quá trình lên men rượu vang trái giác 4.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men và pH Kết quả về sự thay đổi độ Brix, pH và hàm lượng ethanol khi lên men sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt S. cerevisiae HG1.3 cho thấy ở nhiệt độ và pH khác nhau thì khả năng lên men rượu của chủng HG1.3 cũng khác nhau (Bảng 4.3). Nghiệm thức pH 4,5 ở nhiệt độ phòng và 35oC cho kết quả hàm lượng ethanol cao (12,82-12,53% v/v), khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Arthur và Watson (1976) đã xác định nấm men chịu nhiệt có nhiệt độ phát triển trong khoảng 8-42oC. Nấm men chịu nhiệt có các khoảng nhiệt độ tối o thiểu (Tmin), tối ưu (Topt), tối đa (Tmax) tương ứng là 20-26 C, 26-35oC và 37-45oC và có thể phát triển ở nhiệt độ trên 45oC. Như vậy, cho thấy kết quả lên men với giá trị pH 4,5 ở mức nhiệt độ 35°C được lựa chọn đáp ứng mục đích tuyển chọn nấm men chịu nhiệt và có sự phù hợp với các nghiên cứu đã công bố. Nhiệt độ và pH này được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. 14
19. Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến quá trình lên men Hàm lượng STT pH Brix ethanol (% Nhiệt độ-pH sau lên men Sau lên men v/v) quy về 20ºC 1 nhiệt độ phòng –TN 3,57 8,17 11,68c 2 nhiệt độ phòng -4,0 3,95 6,33 11,85bc 3 nhiệt độ phòng -4,5 4,42 7,33 12,82a 4 nhiệt độ phòng -5,0 4,64 7,50 10,53ef 5 35-TN 3,55 9,00 11,55cd 6 35-4,0 3,95 9,00 11,68c 7 35-4,5 4,24 9,00 12,53ab 8 35-5.0 4,62 9,00 9,79fg 9 37-TN 3,55 11,17 9,57g 10 37-4,0 3,93 11,00 9,87fg 11 37-4,5 4,31 10,67 10,78de 12 37-5,0 4,90 12,00 9,14gh 13 39-TN 3,46 13,00 7,98ij 14 39-4,0 3,84 12,00 7,99ij 15 39-4,5 4,22 12,00 8,45gh 16 39-5,0 4,07 11,00 7,21ij 17 41-TN 3,23 14,67 5,98k 18 41-4,0 3,41 15,00 5,98k 19 41-4,5 4,04 16,00 5,98k 20 41-5,0 4,22 16,00 5,19k Ghi chú: Các số liệu trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại; Các chữ số mũ trên các số liệu giống nhau, khác biệt không có ý nghĩa thống kê 5%. 4.4.2 Ảnh hưởng của mật số giống chủng, độ Brix và thời gian lên men đến quá trình lên men rượu vang trái giác Trong lên men, hàm lượng ethanol có liên quan hàm lượng chất khô trong môi trường. Hàm lượng chất khô thấp, nấm men bị thiếu nguồn dinh dưỡng dẫn đến giảm số lượng sản phẩm nhưng nếu tăng hàm lượng đường quá cao nồng độ ethanol cũng bị giảm vì hàm lượng đường quá cao sẽ làm tăng áp suất thẩm thấu, mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men (Tahir et al., 2010). Mật số nấm men và thời gian lên men cũng là những yếu tố ảnh hưởng đến sự lên men. Ảnh hưởng của mật số giống chủng, oBrix và thời gian lên men sử dụng chủng S. cerevisiae HG1.3 được thể hiện ở Bảng 4.4. 15
20. Bảng 4.4: Ảnh hưởng của mật số giống chủng, oBrix và thời gian lên men STT Ngày- oBrix-Mật số oBrix Hàm lượng nấm men sau lên men ethanol ở 20 oC (% v/v) 1 5 - 20 - 103 8,67 11,40bc ở 20oC (% v/v) 2 5 - 20 - 10⁵ 7,33 13,47a 3 5 - 20 - 10⁷ 7,00 12,00bc 4 5 - 22 - 103 8,67 11,40bc 5 5 - 22 - 10⁵ 8,33 12,30ab 6 5 - 22 - 10⁷ 8,67 11,67bc 7 5 - 24 - 103 11,67 11,40bc 8 5 - 24 - 10⁵ 10,76 11,07bc 9 5 – 24 - 107 11,33 10,83cd 10 7 - 20 - 103 7,67 11,40bc 11 7 - 20 - 10⁵ 8,33 12,30ab 12 7 - 20 - 10⁷ 9,33 11,07bc 13 7 - 22 - 103 9,00 11,40bc 14 7 - 22 - 10⁵ 9,00 12,30ab 15 7 - 22- 10⁷ 11,67 10,83cd 16 7 - 24 - 103 10,33 10,77cd 17 7 - 24 - 10⁵ 10,33 11,07bc 18 7 - 24 - 10⁷ 11,67 10,83cd 19 9 - 20 - 103 8,33 10,83cd 20 9 - 20 - 10⁵ 8,67 10,77cd 21 9 - 20 - 10⁷ 9,67 10,77cd 22 9 - 22 - 103 9,33 10,83cd 23 9 - 22 - 10⁵ 10,00 10,87c 24 9 - 22 - 10⁷ 10,67 9,53de 25 9 - 24 - 103 9,00 8,86ef 26 9 - 24 - 10⁵ 10,33 8,05f 27 9 - 24 - 10⁷ 12,67 8,05f Ghi chú: Các số liệu trong bảng là kết quả trung bình của 3 lần lặp lại; Các chữ số mũ trên các số liệu giống nhau, khác biệt không có ý nghĩa thống kê 5%. 16
21. Phân tích bằng chương trình Statgraphics Centurion XV với độ tin cậy 95%. Phương trình hồi quy (1) được thiết lập như sau: H= -27,4471 + 1,58638Z+ 3,66409Y+ 5,10075X - 0,019213Z2 - 0,124219ZX - 0,0769965ZY- 0,124352Y2 - 0,181007YX - 0,174352X2 + 0,00619792ZYX (1) Trong đó: H= hàm lượng ethanol, X= ngày, Y=mật số, Z= ºBrix. Cố định ºBrix 20 ( Z= 20), lấy đạo hàm theo từng biến số. Giải hệ phương trình H(X’) = 0 và H(Y’) = 0, được giá trị X= 5,8; Y= 5,04. Thay các giá trị vào phương trình (1) được H = 12,37% (v/v). Vậy điều kiện tối ưu để lên men dịch trái giác của chủng S.cerevisiae HG1.3 là 6 ngày lên men, mật số nấm men 105 tb/mL, 20 oBrix, và pH ban đầu là 4,5 ở 35ºC với hàm lượng ethanol đạt được theo lý thuyết là H= 12,37%. Phương trình hồi quy được kiểm chứng sự tương tích bằng lên men rượu vang trái giác ở quy mô 1 L. Kết quả nhận được hàm lượng ethanol 12,0% (v/v) (Bảng 4.5). Như vậy, kết quả kiểm chứng cho thấy sự phù hợp của phương trình hồi quy và cũng tương đương với các nghiên cứu lên men rượu vang dưa hấu (Ngô Thị Phương Dung và ctv, 2011), rượu vang khóm (Huỳnh Xuân Phong và ctv, 2017). Chất lương rượu vang trái giác được kiểm nghiệm 15 chỉ tiêu được thể hiện ở Bảng 4.5. So sánh kết quả các chỉ tiêu kiểm nghiệm với QCVN 6-3:2010/BYT về đánh giá chất lượng rượu vang cho thấy các chỉ tiêu đạt theo quy định. Đặc biệt, sản phẩm rượu vang trái giác có chứa 0,60 mg GAE/mL, có khả năng bắt gốc tự do DPPH là 57,3% nên rượu sẽ có khả năng kháng oxy hóa giúp bảo vệ cơ thể. 17
22. Bảng 4.5: Kiểm nghiệm rượu vang trái giác QCVN Nhận xét STT Chỉ tiêu Kết quả 6-3:2010/BYT 1 Ethanol 12,0% v/v ở 20°C ≥ 8% v/v ở 20°C Đạt 2 Methanol 2,534 g/L rượu 100° 10g/L rượu 100° Đạt 3 SO2 1,4 mg/L 350 mg/L Đạt 4 pH 4,17 - Tự công bố 5 ºBrix 12 - Tự công bố 6 Hàm lượng đường khử 0,26 g/100 mL - Tự công bố 7 Acid hydrocyanic 0 g/L 0,1 mg/L Đạt Rượu bậc cao, tính theo Tự công bố 8 2,425 g/L rượu 100° - methyl 2-propanol 9 Aldehyde 0,638 g/L rượu 100° - Tự công bố 10 E. coli 0 CFU/ mL sản phẩm 0 CFU/ mL Đạt 11 Coliforms 10 CFU/ mL sản phẩm ≤ 10 CFU/ mL Đạt 12 Tổng số vi sinh vật hiếu 7,2 x 102 CFU/g 10hẩm3 CFU/g Đạt 13 Tkhíổng số nấm men – mốc 3,6 x 101 CFU/g 102 CFU/g Đạt 14 Hàm lượng polyphenol 0,60 mg GAE/mL - Tự công bố Khả năng bắt gốc tự do Tự công bố a 15 DPPH 57,3 ±3,73% - Đánh giá cảm quan rượu vang trái giác được thực hiện theo thang điểm từ 0-5 với 4 tiêu chí (độ trong và màu sắc, mùi, vị, ý thích đối với mẫu thử) dựa theo các chỉ tiêu trong phương pháp đánh giá cảm quan bằng phương pháp cảm quan cho điểm theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN-3217:79. Rượu vang trái giác sử dụng chủng HG1.3 có độ trong và màu sắc của rượu đạt 4,9 điểm, mùi đạt 4,6 điểm, vị đạt 4,0 điểm, ý thích đối với rượu đạt 4,2 điểm. 18
23. CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Trái giác ở vùng ĐBSCL có hai dạng là trái tròn và trái dẹt, trái chín màu tím đen, đường kín trung bình của trái là 1,5 cm. Dịch trái giác có màu tím rất đặc trưng, giá trị pH 3,01-4,75, giá trị độ Brix 3,5-10,0, hàm lượng đường tổng số 0,47-2,17 g/100mL, hàm lượng đường khử 0,22-0,96 g/100mL. Đặc biệt, dịch trái giác chứa hàm lượng polyphenol 0,47-1,54 mg GAE/mL và khả năng kháng oxy hóa là 16,6-82,86%. Đây là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho ngành sản xuất rượu vang và giúp tăng thu nhập cho người dân ở vùng nguyên liệu. Phân lập được bộ chủng nấm men tự nhiên gồm 151 chủng từ 53 nguồn trái giác khác nhau ở vùng ĐBSCL. Kết quả phân loại sơ bộ các chủng nấm men từ đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa cho thấy 151 chủng nấm men thuộc giống nấm men là Saccharomyces, Hanseniaspora, Pichia và Cadida. Trong đó giống Saccharomyces phân bố rộng rãi và hiện diện với số lượng lớn trên nhiều mẫu trái giác. Xác định được 64/151 chủng có khả năng phát triển ở nhiệt độ 370C trong môi trường có nồng độ ethanol từ 9 đến 12% v/v. Tuyển chọn được 30/64 chủng nấm men chịu nhiệt từ 37 đến 45◦C, có khả năng phát triển ở nồng độ ethanol trong môi trường từ 9 - 12% và lên men sinh ra ethanol đạt từ 6% (v/v) trong điều kiện chưa tối ưu hóa. Kết quả giải tình tự cùng với kết quả phân tích về hình thái, sinh hóa của 30 chủng nấm men cho thấy các chủng thuộc bốn giống Saccharomyces, Candida, Pichia và Clavispora. Trong đó, Saccharomyces cerevisiae HG1.3, CM3.2, AG2.1, TV4.2, DT3.2, LA1.3, KG2.1, TG3.1 và HG2.1 là những chủng có quan hệ gần nhất với nhau vì có mức độ tin cậy cao với chỉ số bootstrap 100%. 19
24. Điều kiện thích hợp lên men rượu vang trái giác sử dụng chủng nấm men chịu nhiệt S. cerevisiae HG1.3 là 20 oBrix, pH là 4,5, mật số 105 tb/mL, thời gian 6 ngày ở 35ºC. Rượu vang trái giác có tính đặc trưng về màu sắc, và đạt các yêu cầu chất lượng theo quy định. Đặc biệt, rượu chứa hàm lượng polyphenol 0,6 mg GAE/mL, khả năng kháng oxy hóa là 57,3% có thể giúp ích cho sức khỏe. Quy trình lên men rượu vang trái giác được đề nghị ở Hình 4.2. Trái giác chín Rửa sạch, để ráo Ép Điều chỉnh 20º Brix và pH = 4,5 Thanh trùng bằng NaHSO3 (140 mg/L) trong 2 giờ Bổ sung 1% giống nấm men S. cerevisiae HG1.3 Ủ kỵ khí ở 35ºC trong 6 ngày Lọc Sản phẩm Hình 4.2: Quy trình lên men rượu vang trái giác 20
25. 5.2 Đề xuất Nghiên cứu tác dụng dược học của một số thành phần khác ngoài polyphenol. Nghiên cứu đặc điểm, cơ chế biểu hiện đặc tính chịu nhiệt của bộ gen của các chủng nấm men chịu nhiệt. Đánh giá đặc tính của các chủng nấm men được phân lập, tuyển chọn theo thời gian và điều kiện tồn trữ. TÀI LIỆU THAM KHẢO Arthur, H. and K. Watson, 1976. Thermal adaptation in yeast: growth temperatures, membrane lipid, and cytochrome compositionof psychrophilic, mesophilic and thermophilic yeast. Journal of Bacteriology, 128(1): 58-68. Bùi Ái, 2005. Công nghệ lên men ứng dụng trong Công nghệ thực phẩm. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Casellas, I. G., 2005. Effect of low temperature fermentation and nitrogen content on wine yeast metabolism. Tarragona. Casey, G.P. and W. M. Ingledew, 1986. Ethanol tolerance in yeast. Crit Rev Microbiol, 13(3):219–280. Dung, N. T. P., Thanonkeo, P., and Phong, H. X., 2012. Screening useful isolated yeasts for ethanol fermentation at high temperature. International Journal of Applied Science and Technology. 2(4): 65-71. Kumar D. S. K., 2011. A review on chemical and biological properties of Cayratia trifolia Linn. (Vitaceae). Pharmacognosy Reviews, 10:184-188. Kurtzman, C. P. and J. W. Fell, 1998. The Yeasts, a Taxonomic Study, 4th ed, Elsevier, Amsterdam. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn và Lê Doãn Diên, 2002. Hóa sinh công nghiệp. NXB Khoa học và kỹ thuật. Hà Nội. 389 trang. Limtong S., Sringiew C., and Yongmanitchai W., 2007. Production of fuel ethanol at high temperature from sugar 21
26. cane juice by a newly isolated Kluyveromyces marxianus. Bioresource Technology 98: 3367-3374. Lương Đức Phẩm, 2006. Nấm men công nghiệp. NXB Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội. 331 trang. Ngô Thị Phương Dung, 2009. Khảo sát khả năng lên men và tính chịu cồn của nấm men. Tạp chí Khoa học Trường ĐHCT 2009: 11 374-382. Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005. Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic. NXB Khoa học và Kỹ thuật. Hà Nội. 281 trang. Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Phạm Thành Hổ, Lê Văn Hiệp, Chung Chí Thành và Lê Thị Hòa, 2019. Vi sinh vật học. NXB Khoa học và Kỹ thuật. Nuanpeng S., Thanonkeo S., Yamada M., and Thanonkeo P., 2016. Ethanol production from sweet sorghum juice at high temperatures using a newly isolated thermotolerant yeast Saccharomyces cerevisiae DBKKU Y-53. Energies 9(4): 253. Phạm Hoàng Hộ, 2000. Cây cỏ Việt Nam quyển II. Nhà xuất bản trẻ. 952 trang. Phong, H. X., N.T.C. Giang, S. Nitiyon, M. Yamada, P. Thanonkeo and N.T.P. Dung, 2016. Ethanol production from molasses at high temperature by thermotolerant yeasts isolated from cocoa. Can Tho University Journal of Science 3: 32-37. Quy chuẩn Việt Nam 6-3:2-2010/BYT, 2010. Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với các sản phẩm đồ uống có cồn. Hà Nội. Rabeta, M.S. and S.P. Lin, 2015. Effects of different drying methods on the antioxydant activities of leaves and berries of Cayratia trifolia. Sains Malaysiana, 44(2): 275–280. Roehr, M., 2001. The Biotechnology of Ethanol: Classical and Future Applications. Federal Republic of Germany. Page: 203 – 210. 22
27. Sesagirriravu R., 1986. Flora of Srikakulam district, Andhra Pardesh. The Journal of Indian Botanical Society, 147. Tahir, A., M. Aftab and T. Farasat, 2010. Effect of cultural conditions on ethanol production by locally isolated Saccharomyces cerevisiae bio-07. Journal of Applied Pharmaceutical, 3(2): 72-78pp. Techaparin, A., P. Thanonkeo and P. Klanrit, 2017. High- temperature ethanol using thermotolerant yeast newly isolated from Greater Mekong Subregion. Brazilia Journal of Microbiology. 48:461-475. Tiêu chuẩn Việt Nam 3217:1997 (TCVN 3217:1997), (1997). Rượu - Phân tích cảm quan – Phương pháp cho điểm. Hà Nội. 23