Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa N và tích lũy Poly-P trong nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho và ứng..

Nội dung tài liệu: Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa N và tích lũy Poly-P trong nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho và ứng..

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã ngành: 62 42 01 07 TÊN NCS: LÊ THỊ LOAN TÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN KẾT TỤ SINH HỌC, CHUYỂN HÓA NITƠ VÀ TÍCH LŨY POLY-P TRONG NƯỚC THẢI SẢN XUẤT HỦ TIẾU MỸ THO VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI Cần Thơ, 2020
2. CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: GS.TS. Cao Ngọc Điệp Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Phòng bảo vệ Luận án tiến sĩ, Nhà Điều Hành, Trường Đại học Cần Thơ. Vào lúc giờ ngày tháng năm Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: (ghi rõ học hàm học vị, họ và tên, font chữ: Times New Roman, cỡ chữ 13) Xác nhận đã xem lại của chủ tịch Hội đồng Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
3. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Le Thi Loan, Tran Vu Phuong, Cao Ngoc Diep. 2018. Isolation and identification of bioflocculant-producing bacteria, heterotrophic nitrogen removal bacteria and poly- phosphate bacteria in wastewater from “My Tho rice noodle” factories, Tien Giang provice. Internation Journal of Innovations in Engineering and Technology (IJIET). 185-198. 2. Le Thi Loan, Tran Vu Phuong, Cao Ngoc Diep. 2019. Application of bioflocculant-producing bacteria heterotrophic nitrogen removal bacteria and poly-phosphate bacteria and water-hyacinth (Eichhornia crassipes) for wastewater treatment of My Tho rice noodle factories, Tien Giang provice, Vietnam. Internation Journal of Innovations in Engineering Agriculture Research (IJOEAR). 16-26. (Volume-5, Issue-1, PP-26, January, 2019). 3. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn số 19, kỳ 1 tháng 10/2019, tên bài báo “Tối ưu hóa khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PRO.01.B và thử nghiệm xử lý nước thải từ cơ sở sản xuất bún”. (Lê Thị Loan1, Cao Ngọc Điệp2) NCS chuyên ngành Vi sinh vật học; Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ). 4. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn số 21, kỳ 1 tháng 11/2019, tên bài báo “Tối ưu hóa khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis PRO.01.C và thử nghiệm xử lý nước thải sau chế biến sữa đậu nành”. (Lê Thị Loan1 , Cao Ngọc Điệp2 ) NCS chuyên ngành Vi sinh vật học; Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ). 1
4. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án Hủ tiếu được sản xuất theo quy trình là gạo được ngâm trong thời gian 24 giờ, sau đó tháo nước rửa chua, kế tiếp là xay bột rồi ủ bột trong khoảng thời gian 48 giờ. Bước tiếp theo là luộc bột và tráng bột trên các vĩ mỏng sau đó phơi khô và dùng máy cắt thành sợi. Hủ tiếu thành phẩm có thể trộn với rau củ quả cùng với thịt và nước súp (nước lèo) được nấu chín từ xương heo là đặc sản nổi tiếng ở Mỹ Tho, Tiền Giang. Tuy nhiên, hầu hết các cơ sở sản xuất hủ tiếu chưa có hệ thống xử lý nước thải hay xử lý không đạt tiêu chuẩn. Nhu cầu nước cho sản xuất tại các cơ sở chế biến nông sản thực phẩm thường rất lớn, nhưng nước thải trong quá trình sản xuất thường không được xử lý mà xả thẳng ra môi trường gây ô nhiễm nặng nề cho nguồn nước sông, rạch. Cụ thể ở Mỹ Tho - Tiền Giang, đa số các cơ sở đều mang tính tự phát, nhỏ lẻ nên chưa thật sự chú trọng đến việc xử lý nước thải bảo vệ môi trường. Nhiều cơ sở sau khi sản xuất đã xả trực tiếp nước thải hủ tiếu chưa qua xử lý ra môi trường khiến nhiều sông ngòi, kênh rạch gây ô nhiễm nghiêm trọng đồng thời gây nguy hại cho sinh vật và người dân sống quanh đó. Nhận thấy được tiềm năng cũng như hiệu quả của các nhóm vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa đạm, vi khuẩn tích lũy poly-P trong việc xử lý nước thải, đồng thời vấn đề cấp bách hiện tại là phải có biện pháp xử lý nước thải hủ tiếu, để ngăn chặn việc ảnh hưởng đến môi trường. Quan trọng hơn là bảo vệ danh tiếng của ẩm thực Việt Nam, danh tiếng 50 năm danh hiệu của hủ tiếu Mỹ Tho và hình ảnh của Việt Nam. Vì vậy đề tài “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ và tích lũy Poly-P trong nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho và ứng dụng xử lý nước thải” được thực hiện là một nghiên cứu vô cùng cấp thiết và mang tính ứng dụng vào thực tiễn rất cao nhằm giải quyết những khó khăn nêu trên. 1.2 Mục tiêu của nghiên cứu 2
5. - Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, loại bỏ nitơ và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu từ các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho. - Nhận diện và tìm hiểu quan hệ phát sinh của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, loại bỏ nitơ và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu có các đặc tính tốt bằng phương pháp sinh học phân tử và công cụ Tin Sinh học kết hợp với một số mô tả hình thái tế bào và khuẩn lạc đã có. - Tuyển chọn một số dòng kết tụ sinh học, loại bỏ nitơ và tích lũy poly-P trong nước thải hủ tiếu tốt nhất để đánh giá hiệu quả xử lý nước thải hủ tiếu trong thùng hay bể chứa có dung tích 100 mL, 1-L, 10-L, 100-L và 1000-L 1.3 Những điểm mới của luận án Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách cơ bản, có hệ thống, từ 08 cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho – tỉnh Tiền Giang đã thải ra một lượng nước thải khá lớn có pH thấp (chua), chứa nhiều độc chất có hàm lượng cao. Từ 08 mẫu thu được từ các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho – tỉnh Tiền Giang, phân lập 109 dòng vi khuẩn bao gồm 59 dòng vi khuẩn chuyển hoá đạm với 15 dòng vi khuẩn trên môi trường nitrite, 18 dòng vi khuẩn trên môi trường nitrate, 15 dòng vi khuẩn trên môi trường ammonium và 11 dòng vi khuẩn trên môi trường nitơ tổng hợp; 42 dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học bao gồm 23 dòng vi khuẩn kết tụ chất protein và 19 dòng vi khuẩn kết tụ chất polysaccharide; 08 dòng vi khuẩn tích luỹ poly-P trên những dòng môi trường chuyên biệt. Tuyển chọn được dòng vi khuẩn kết tụ sinh học là Bacillus subtilis PRO.01.C và Bacillus subtilis PO.03.B; dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ gồm Bacillus altitudinis HNi.01.03.DL, Stenotrophomonas maltophilia HNa.02.03.C, Enterobacter hormaechei HAm.03.05.C và dòng vi khuẩn tích lũy poly-P Bacillus megaterium Poly-P.06.4.B. 1.4 Ý nghĩa thực tiễn và khả năng ứng dụng của luận án 3
6. Kết quả nghiên cứu của luận án là nguồn tài liệu cơ bản, là một bộ sưu tập gồm 109 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa N và tích lũy poly-P. Trong đó: 42 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học (23 dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ protein và 19 dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ polysaccharide), 59 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ (15 dòng vi khuẩn chuyển hóa ammonium, 18 dòng vi khuẩn chuyến hóa nitrate, 15 dòng vi khuẩn chuyển hóa nitrite và 11 dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa ammonium, nitrite, nitrate), 8 dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P. Kết quả cho thấy các dòng vi khuẩn hai nhóm kết tụ sinh học và tích lũy poly-P là đều là họ Bacilaceae trong khi đó vi khuẩn ở nhóm chuyển hóa nitơ có sự đa dạng loài hơn bao gồm vi khuẩn Gram âm và chi Bacillus trong đó chi Bacillus chỉ chiếm tới 12% tổng số dòng vi khuẩn. 4
7. CHƯƠNG 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn 3.1.1. Nuôi cấy 3.1.1.1 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein (Hazana et al., 2008) Bảng 3.1. Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein. Hóa chất Hàm lượng Glucose 20 g L- Acid glutamic 50 g MgSO4.7H2O 0,5 g Yeast extract 0,5 g Agar 20 g (bổ sung khi đổ môi trường thạch) H2O 1 L pH 7 3.1.1.2 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide ( Deng et al., 2002) Bảng 3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học polysaccharide. Hóa chất Hàm lượng Glucose 10 g KH2PO4 5 g K2HPO4 0,2 g MgSO4.7H2O 0,1 g NaCl 0,1 g 5
8. Carbamide 0,5 g Yeast extract 0,5 g Agar 20 g (bổ sung khi đổ môi trường thạch) H2O 1 L 3.1.1.3 Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ (Zhao et al., 2010) Bảng 3.3 Môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ. Môi Môi Môi Môi trườn trường trường bổ Đơn trường g bổ bổ sung sung T Hóa chất vị bổ sung sung Ammoni (Nitrite, tính Nitrite Nitrat um Nitrate, e Ammoniu) NH4Cl g/L 0,12 0,12 NaNO3 g/L 0,04 0,04 NaNO2 g/L 0,04 0,04 NaCl g/L 4 4 4 4 Na2HPO4.12H2O g/L 21,5 21,5 21,5 21,5 KH2PO4 g/L 0,9 0,9 0,9 0,9 Vi lượng * mL/L 3 3 3 3 Glucoze g/L 1 1 3 2 Agar g/L 20 20 20 20 3.1.1.4 Môi trường phân lập vi khuẩn tích lũy poly-P (Wang et al., 2008) Bảng 3.4 Môi trường phân lập vi khuẩn tích luỹ poly-P. Hóa chất Hàm lượng Glucose 0,5 g/L Acetate 5 g/L 6
9. Succinate 0,5 g/L NH4Cl 0,02 g/L KH2PO4 0.088 g/L Pepton 0,02 g/L MgSO4.7H2O 0,01 g/L CaCl2 0,005 g/L Dung dịch khoáng vi lượng 0,5 mL/L Agar 20 g/L 3.1.2. Phân lập vi khuẩn 3.2 Tuyển chọn và nhận diện các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa Nitơ N và vi khuẩn poly-P Sau khi phân lập được các dòng vi khuẩn từ nước thải của các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho, tiến hành tuyển chọn các dòng có độ hữu hiệu cao và tiếp đến nhận diện (xác định) các dòng vi khuẩn này để làm cơ sở cho việc xử lý nước thải sau này. 3.2.1. Tuyển chọn 3.2.1.1. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học trên môi trường protein và polysaccharide Kiểm tra khả năng kết tụ của vi khuẩn: lấy 90 mL dung dich Kaolin (5g/l) thêm vào 10 mL dung dịch CaCl2 (1%) trong bình 7
10. tam giác 250 mL, sau đó thêm 0,1 mL dung dịch vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học, mẫu đối chứng thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học. Khuấy hỗn hợp trên trong 30 giây ở 60 vòng/phút bằng máy lắc, giữ yên hỗn hợp trong 1 giờ, lấy phần trong đo OD ở độ bước sóng 550 nm. Tỷ lệ kết tụ % = (OD đối chứng – OD mẫu)/OD đối chứng x 100 Phương pháp tiến hành bằng cách nhân sinh khối chủng vi khuẩn trong 20 mL môi trường với sự phối hợp của ba nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ ở trên, với giá trị pH đã chọn, nhiệt độ 30oC, lắc 150 vòng/phút, sau thời gian một ngày tiến hành xác định hiệu quả kết tụ với dung dịch kaolin theo như mô tả. Phối hợp ba nguồn dinh dưỡng (03 nguồn carbon + 04 nguồn nitrogen + 04 nguồn khoáng vô cơ) có 48 nghiệm thức khác nhau và mỗi nghiệm thức được thực hiện 03 lần lặp lại. Kết quả cuối cùng chọn ra được môi trường tối ưu có nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ thích hợp cho vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cho tỷ lệ kết tụ cao nhất. Ở dòng vi khuẩn kết tụ sinh học thì nguồn khoáng là nguồn lô phụ bậc 2, còn nguồn carbon là lô chính hay ngược lại để tìm ra kết quả tối ưu. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến hiệu quả tổng hợp chất kết tụ sinh học. Nhân sinh khối chủng vi khuẩn trong môi trường gồm 03 nguồn carbon, nitrogen và khoáng đã được chọn ở thí nghiệm trên. Mỗi nguồn dinh dưỡng sẽ được chia thành 03 mức độ khác nhau và phối hợp tạo ra 27 nghiệm thức với tỷ lệ carbon, nitrogen và khoáng vô cơ bổ sung khác nhau. Chủng vi khuẩn được nhân sinh khối trong ống fancol 50 mL chứa 20 ml môi trường tổ hợp từ 03 nguồn dinh dưỡng với tỷ lệ khác nhau, điều chỉnh về giá trị pH cho tỷ lệ kết tụ cao nhất đã chọn, ủ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 300C. Đánh giá khả năng kết tụ với dung dịch kaolin, phân tích hồi quy tuyến tính 03 nhân tố từ đó chọn ra nghiệm thức có tỷ lệ bổ sung thích hợp cho vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cho tỷ lệ kết tụ cao nhất. 3.2.1.2. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn chuyển hóa Nitơ 8
11. Chọn những dòng vi khuẩn phát triển được trên môi trường có 4+ 2- + - - có bổ sung NH , NO3- , NO và T (NH4 , NO3 , NO2 ) trong đó NH4+ và NO3- ở nồng độ 100mM, NO2- ở nồng độ 10 mM để tiếp tục kiểm tra khả năng phát triển của chúng trên môi trường có bổ + - + -, - sung NH4 , NO3 , NO2- và T (NH4 , NO3 NO2 ) ở nồng độ cao hơn + - trong đó NH4 và NO3 ở nồng độ tăng dần 200 mM, 300 mM, 400 - mM, 500 mM và NO2 ở nồng độ tăng dần 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM. Chủng nào phát triển mạnh, có vi khuẩn phát triển trên dĩa, với số lượng lớn (ký hiệu: +++): là chủng được xem là có khả năng chuyển hóa mạnh. 3.2.1.3. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (không có màu xanh) làm mẫu blank để điều chỉnh giá trị về 0, tiến hành đo OD của 05 ống còn lại. 05 ống theo thứ tự từ 1 - 5 có màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với giá trị OD tăng dần (Hình 3.3). Đo hàm lượng lân hòa tan có trong mẫu: Mẫu được lọc qua giấy lọc trước khi đo lân, chuẩn bị ống nghiệm (20 mL) cho mỗi mẫu, cho vào ống nghiệm lần lượt: 08 mL nước khoáng + 0,5 mL dung dịch mẫu + 04 mL dung dịch B. Trộn đều dung dich trong ống nghiệm bằng máy Vortex, ổn định ở nhiệt độ phòng 20 phút và tiến hành đo. Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị để xác định phương trình đường chuẩn của P2O5. Phương trình đường chuẩn có dạng Y=a*X +b. Trong đó: Y: là độ hấp thụ quang (OD) X: là nồng độ P2O5 (mg/L). Dựa vào phương trình đường chuẩn P2O5 và giá trị OD của mẫu đo được để tính hàm lượng P2O5 có trong mẫu theo công thức 3- Y=a*X + b. Sau khi có kết quả, tính hàm lượng PO4 dựa theo 3- công thức: PO4 = C * MPO4/MP2O5, (C là hàm lượng Lân có trong mẫu tương ứng với hàm lượng P2O5 , MPO4 = 95; MP2O5 = 142). 9
12. Hàm lượng lân hòa tan có trong mẫu được đo dựa trên phương pháp Blue-molypden (so màu Oniani) ở bước sóng 880 nm (OD880nm). Giá trị OD được đo ở 6 ống nghiệm đường chuẩn, sau đó mới tiến hành đo OD của các mẫu thí nghiệm. Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (không có P2O5, không có màu xanh) làm mẫu blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo giá trị OD của 05 ống còn lại. Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn của P2O5. Phương trình đường chuẩn có dạng: y = ax + b. Trong đó: x là nồng độ của mẫu (mg/L), y là độ hấp thu quang (OD880nm). Dựa vào phương trình đường chuẩn P2O5 và giá trị OD880nm của mẫu để tính hàm lượng P2O5 theo công thức: x = (y-b)/a. Từ kết quả trên đánh giá sơ bộ về lượng lân hòa tan của các mẫu nước thải. 3.2.2 Nhận diện Thực hiện phản ứng PCR nhận diện vi khuẩn: Sau khi ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn, thực hiện phản ứng PCR gen 16S rDNA được tiến hành với từng cặp mồi chuyên biệt. Trích DNA - Theo Breugelmans và Uyttebroek (2004) mô tả 3.3. Ứng dụng các dòng vi khuẩn tốt trên nước thải hủ tiếu 3.3.1. Ứng dụng các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học vào xử lý nước thải hủ tiếu Mỹ Tho * Chọn pH thích hợp Do pH nước thải hủ tiếu có pH thấp (từ 4 - 5) nên cần có thí nghiệm để chọn pH thích hợp cho vi khuẩn kết tụ sinh học hoạt động tốt. Xây dựng qui trình xử lý nước thải sau bằng cách bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 03 nghiệm thức sau: pH = 5, pH = 6, pH = 7 (đo bằng pH kế) vì 02 dòng vi khuẩn có 02 dãy pH thích hợp khác nhau nên cần có thí nghiệm này. 10
13. * Tuyển chọn dòng vi khuẩn kết tụ sinh học Sau khi chọn được pH tối hảo cho từng dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, tiến hành kết hợp 02 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học protein và polysaccharide: Trong điều kiện có kaolin Trong điều kiện nước thải 100 mL, 1 L, 10 L Đánh giá khả năng kết tụ hay % kết tụ và hàm lượng TSS của nước thải được tại trung tâm Đo lường và Chất lượng Cần Thơ Hình 3.7 Sơ đồ đánh giá khả năng kết tụ hay % kết tụ và hàm lượng TSS của nước thải. 3.3.2. Ứng dụng các dòng Vi khuẩn chuyển hóa Nitơ và dòng vi khuẩn Poly-P vào xử lý nước thải hủ tiếu Mỹ Tho * Khả năng xử lý ammonium của các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ ở 100 mL Chọn vi khuẩn chuyển hoá Nitơ tốt nhất bằng cách bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 05 nghiệm thức. NT1: Đối chứng (không bổ sung vi khuẩn chuyển hóa Nitơ). 11
14. NT2: Bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa nitrite. NT3: Bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa nitrate. NT4: Bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa amoni. NT5: Bổ sung 0,1% hỗn hợp vi khuẩn chuyển hóa amoni, nitrate, nitrite. Tiến hành sục khí trong 6 giờ mỗi ngày, sau đó để yên trong 24 giờ → Lấy các mẫu trên để đo lại các chỉ tiêu ammonium và orthophosphate, khảo sát trong 3 ngày. * Khả năng xử lý ammonium của các dòng vi khuẩn poly-P ở 100 mL Chọn vi khuẩn tích luỹ Poly-P tốt nhất bằng cách bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 03 nghiệm thức. NT1: Đối chứng (không bổ sung vi khuẩn tích luỹ Poly-P) (sục khí). NT2: Bổ sung 0,1% vi khuẩn tích luỹ Poly-P (sục khí). NT3: Bổ sung 0,1% vi khuẩn tích luỹ Poly-P (không sục khí). Tiến hành sục khí trong 6 giờ mỗi ngày ở NT1 và NT2, sau đó để yên 24 giờ → Lấy các mẫu trên để đo lại các chỉ tiêu ammonium và orthophosphate, khảo sát trong 03 ngày. * Khả năng xử lý orthophosphate của các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ ở 100 mL Chọn vi khuẩn tích luỹ Poly-P tốt nhất bằng cách bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 03 nghiệm thức. NT1: Đối chứng (không bổ sung vi khuẩn tích luỹ Poly-P) (sục khí). NT2: Bổ sung 0,1% vi khuẩn tích luỹ Poly-P (sục khí). NT3: Bổ sung 0,1% vi khuẩn tích luỹ Poly-P (không sục khí). Tiến hành sục khí trong 06 giờ mỗi ngày ở NT1 và NT2, sau đó để yên trong 24 giờ → Lấy các mẫu trên để đo lại các chỉ tiêu ammonium và orthophosphate, khảo sát trong 03 ngày. 12
15. * Khả năng xử lý orthophosphate của các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P ở 100 mL Như thí nghiệm trên nhưng đo hàm lượng orthophosphate. 3.3.3 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 1- L Chọn vi khuẩn chuyển hoá Nitơ tốt nhất bằng cách bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 05 nghiệm thức. NT1: Đối chứng (không bổ sung vi khuẩn chuyển hóa Nitơ). NT2: Bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa nitrite. NT3: Bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa nitrate. NT4: Bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa amoni. NT5: Bổ sung 0,1% hỗn hợp vi khuẩn chuyển hóa amoni, nitrate, nitrite. Tiến hành sục khí trong 06 giờ mỗi ngày, sau đó để yên trong 24 giờ → Lấy các mẫu trên để đo lại các chỉ tiêu ammonium và orthophosphate, khảo sát trong 03 ngày. Chọn vi khuẩn tích luỹ Poly-P tốt nhất bằng cách bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 03 nghiệm thức. NT1: Đối chứng (không bổ sung vi khuẩn tích luỹ Poly-P) (sục khí). NT2: Bổ sung 0,1% vi khuẩn tích luỹ Poly-P (sục khí). NT3: Bổ sung 0,1% vi khuẩn tích luỹ Poly-P (không sục khí). Tiến hành sục khí trong 06 giờ mỗi ngày ở NT1 và NT2, sau đó để yên trong 24 giờ → Lấy các mẫu trên để đo lại các chỉ tiêu ammonium và orthophosphate, khảo sát trong 03 ngày. Ứng dụng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P để xử lý nước thải hủ tiếu ở thể tích 1 lít. Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên với 03 lần lặp lại gồm 02 nghiệm thức: NT1 là đối chứng (không bổ sung vi khuẩn chuyển hóa Nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P) và NT2 bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa Nitơ tốt nhất và 0,1% vi khuẩn tích lũy poly-P tốt nhất. 13
16. Tiến hành sục khí trong 06 giờ mỗi ngày, sau đó để yên trong 24 giờ → Lấy các mẫu trên để đo lại các chỉ tiêu ammonium và orthophosphate, khảo sát trong 03 ngày. + Mẫu nước thải thu được sau khi lọc đem đo các chỉ tiêu: ammonium, orthophosphate và so sánh với cột B của bảng 9 QCVN40:2011/BTNMT. 3.3.4 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 10-L Sau khi thử nghiệm khả năng xử lý của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P chọn được dòng chuyển hóa N và dòng vi khuẩn tích lũy poly- P có khả năng xử lý đạt hiệu quả cao. Tiến hành ứng dụng kết hợp 02 dòng vi khuẩn này để xử lý nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho ở dung tích 10 L với 03 lần lặp lại, phương pháp thí nghiệm và lấy mẫu đo các chỉ tiêu như thí nghiệm 1 L. 3.3.5 Khả năng xử lý nước thải của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất ở thể tích 100-L Trong hai thí nghiệm 100-L và 1000-L, để đánh giá cụ thể và hiệu quả của từng nhóm vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa nitơ và tích lũy poly-P. Thí nghiệm chia ra hai giai đoạn: Xử lý vi khuẩn kết tụ sinh học; Xử lý vi khuẩn chuyển hoá nitơ + vi khuẩn poly-P. Thí nghiệm thực hiện tại hộ ông Nguyễn văn Thuận và mẫu nước thải của mỗi lần thí nghiệm được thu và phân tích tại Trung tâm Kỹ thuật và Công nghệ sinh học tỉnh Tiền Giang. Vi khuẩn kết tụ sinh học được tăng sinh trong môi trường thích hợp và tương ứng cho từng nhóm protein (Hazana et al., 2008) hay polysaccharide (Deng et al., 2002) đạt >109 CFU/ml. Vi khuẩn chuyển hóa Nitơ và vi khuẩn tích lũy poly-P được tăng sinh trong môi trường thích hợp và tương ứng cho từng nhóm nitơ (Zhao et al., 2010) và phosphate (Wang et al., 2008). 14
17. Tăng sinh khối các dòng vi khuẩn Thu mẫu nước Vi khuẩn kết tụ sinh học thải Protein, vi khuẩn kết tụ sinh học Polysaccharide Bổ sung 0,1% hai Đối chứng NT 1 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học Khuấy trộn Để yên trong 3 giờ Bổ sung 0,1% hai dòng vi khuẩn chuyển hóa Nitơ, Lọc lấy phần trong tích lũy Polyphosate Sục khí 8 tiếng chia 2 lần/ ngày: 7h đến 11h và 13h đến 17h Thu mẫu và tiến hành đo các chỉ tiêu amomonium, orthophsphate Hình 3.8 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá hiệu quả Vi khuẩn kết tụ sinh học, chuyển hóa N và vi khuẩn poly-P trên nước thải hủ tiếu Mỹ Tho. 15
18. CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập, nhận diện vi khuẩn kết tụ sinh học Đề tài đã phân lập được 42 dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ sinh học, trong đó 23 dòng trên môi trường protein và 19 dòng trên môi trường polysaccharide. * Trên môi trường protein đã phân lập tổng cộng 23 dòng vi khuẩn, phần lớn có khuẩn lạc màu trắng đục, dạng bìa nguyên và độ nổi mô (Hình 4.1). Đặc điểm khuẩn lạc và vi khuẩn phân lập trên môi trường protein: Tất cả 23/23 dòng khuẩn lạc phân lập được có dạng hình tròn, màu trắng đục, bìa nguyên và mô, chiếm tỷ lệ 100%. * Trên môi trường polysaccharide, phân lập được tổng cộng 19 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học có khuẩn lạc màu trắng đục, dạng bìa nguyên và độ nổi mô. Hình dạng: khuẩn lạc dạng tròn chiếm 89,5%, và khuẩn lạc dạng không đều chiếm 10,5%. Màu sắc: khuẩn lạc có màu trắng đục có 16/19 dòng chiếm 84,2%, trắng trong là 2/19 dòng chiếm 10,5% và trắng vàng 1/19 dòng chiếm 5,3%. Dạng bìa: 17/19 dòng vi khuẩn có dạng bìa nguyên chiếm 89,5%, và 2/19 dòng vi khuẩn có dạng bìa răng cưa chiếm 10,5%. Độ nổi: tất cả đều có độ nổi mô. Kích thước: phần lớn khuẩn lạc có kích thước tương đối lớn, hơn 80% có kích thước lớn hơn 01 mm và 01 khuẩn lạc có kích thước lớn hơn 02 mm chiếm 5,3%. Đặc điểm khuẩn lạc: Trong 19 dòng phân lập được, khuẩn lạc hình tròn có 15/19 dòng chiếm 78,9%, khuẩn lạc có hình dạng que ngắn là 4/19 dòng chiếm 21,1%, phần lớn có khả năng chuyển động chiếm 18/19 dòng chiếm 94,7%. Trong 23 dòng vi khuẩn phân lập từ môi trường protein, dòng PRO.01.C có tỷ lệ kết tụ cao nhất 67,09% và PRO.05.02 có tỷ lệ kết tụ thấp nhất 7,44% trong điều kiện có kaolin, trong 19 dòng vi khuẩn trên môi trường polysaccharide, chỉ dòng PO.03.B có tỷ lệ 16
19. kết tụ cao nhất 59,8% và PO.06.03 có tỷ lệ kết tụ thấp nhất 29,79% trong điều kiện có kaolin. Kết quả cho thấy tất cả 07 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học có độ tương đồng với chi Bacillus đến 97 – 99%. Tiến hành vẽ giản đồ phả hệ của các dòng đã giải trình tự (Hình 4.26). Kết quả trình bày trong Hình 4.26 cho thấy chia thành 02 nhánh A và nhánh B, phân biệt nhóm protein và nhóm polysaccharide. Bảng 4.21 Kết quả giải trình tự 07 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học độ ST Dòng vi Số đồng Tên vi khuẩn đồng hình T khuẩn nucleotit hình (%) AB986572 Bacillus tequilensis, 99 1 PO.08A 1018 strain: Cs.10-4.1.9 KX214613 Bacillus sp. strain 2N-14 99 KC172004 Bacillus 99 methylotrophicus strain JF29 2 PO.03B 676 KU179336 Bacillus subtilis strain 99 L23 FJ392729 Bacillus subtilis strain 99 3 PO.01C 743 M3-7 KX214613 Bacillus sp. strain 2N-14 99 AB986572 Bacillus tequilensis, 99 4 PRO.07.04 684 strain: Cs.10-4.1.9 LC065158 Bacillus sp. NCCP-1131 99 MG430224 Bacillus megaterium 98 strain CS17 5 PRO 04.01 1413 KU991810 Bacillus aryabhattai 98 strain J5 KP735610 Bacillus subtilis strain 98 6 PRO 01.C 1424 SH23 KY283142 Bacillus sp. strain ZJ-1 97 MG430224 Bacillus megaterium 98 strain CS17 7 PRO 03.B 823 KY283142 Bacillus sp. strain ZJ-1 97 17
20. 4.2. Phân lập, nhận diện các dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hoá Nitơ Đề tài đã phân lập được 59 dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ. Trong đó có 15 dòng phân lập được trên môi trường nitrite, 18 dòng Nhánh A 18
21. trên môi trường nitrate, 15 dòng trên môi trường ammonium và 11 dòng trên môi trường tổng (nitrite, nitrate, ammonium). - Đặc điểm hình thái khuẩn lạc: 15 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường nitrite quan sát 48 giờ sau khi cấy phần lớn khuẩn lạc có dạng hình tròn, mô, trắng đục và bìa nguyên. - Đặc điểm hình thái khuẩn lạc: 18 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường nitrate quan sát 48 giờ sau khi cấy phần lớn khuẩn lạc có dạng hình tròn, mô, trắng trong và bìa nguyên (Hình 4.8). Hình dạng: khuẩn lạc có dạng tròn chiếm tỷ lệ 100%. Màu sắc: khuẩn lạc có màu trắng đục chiếm 53,5%, trắng trong là 25,4% và trắng vàng là 21,1%. Dạng bìa: vi khuẩn có dạng bìa nguyên chiếm 73,2%, và vi khuẩn có dạng bìa răng cưa chiếm 26,8%. - Đặc điểm hình thái khuẩn lạc: Trên môi trường ammonium, quan sát 48 giờ sau khi cấy, có 15 dòng vi khuẩn được phân lập phần lớn khuẩn lạc có dạng hình tròn, mô, trắng đục và bìa nguyên. - Có tổng cộng 11 dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường tổng (gồm 03 loại nitơ là ammonium, nitrite và nitrate), phần lớn có khuẩn lạc màu trắng đục, dạng bìa nguyên và độ nổi mô. Hình dạng: Khuẩn lạc dạng tròn có 10/11 chiếm tỷ lệ cao 91%, và dạng không đều có 1/11 dòng chiếm 9%. Màu sắc: khuẩn lạc có màu trắng đục chiếm 54,5%, trắng vàng là 18%, và dòng màu vàng chiếm 27,5%. Dạng bìa: khuẩn lạc có dạng bìa nguyên chiếm 63,5% so với dạng bìa răng cưa chiếm 36,5%. Độ nổi: khuẩn lạc có độ nổi mô chiếm 72,5% còn lại 27,5% có độ nổi lài. Kích thước: khuẩn lạc có kích thước lớn 01 mm chiếm tỷ lệ 45,5% và có kích thước từ 01 mm trở xuống chiếm 54,5%. 19
22. Bảng 4.22 Kết quả giải trình tự 11 dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ. Số Mức độ TT Dòng vi khuẩn Tên vi khuẩn đồng hình nucleotit đồng hình (%) KP761420 Bacillus altitudinis strain 99 SP028 1 HNi.01.03.DL 1232 KC915229 Bacillus pumilus strain 99 ESR21 JX010951 Rhodococcus erythropolis 98 strain A6 2 HNi.01.04.B 1172 KM282585 Rhodococcus sp. BF-5 98 (2014) KM893074 Stenotrophomonas 99 3 HNi.01.03.B 875 maltophilia strain LH15 KF516076 Stenotrophomonas sp. NTa 99 KJ870193 Sphingobacterium 99 multivorum strain B13 4 HNi.01.08.C 880 KJ000804 Sphingobacterium sp. SCU- 98 B137 KX350046 Stenotrophomonas 98 5 HNa.02.03.C 1451 maltophilia strain F3-2-41 DQ991144 Stenotrophomonas sp. BMC 98 KC775771 Achromobacter xylosoxidans 99 6 HNa.02.07.B 872 strain 7B GU367388 Achoromobacter sp. BIT-56 98 NR_114151 Ochrobactrum oryzae strain 98 NBRC 102588 7 HAm.03.06.D 1454 AJ920029 Ochrobactrum shiyianus, 98 strain WSH-W04T KC431781 Enterobacter hormaechei 8 HAm.03.05.C 1471 99 strain RB3 KJ396827 Stenotrophomonas 99 maltophilia strain IR50 9 HAm.03.01.B 1119 EU770269 Stenotrophomonas sp. 99 A18(2008) MF144477 Enterobacter cloacea strain 98 FQ30 10 HAm.03.06.C 1121 KY672864 Enterobacter sp. strain BAB- 98 6042 KU977111 Agrobacterium sp. strain 98 yangyueN8 11 HAm.03.06.Dr 1035 KX449275 Agrobacterium tumefaciens 98 strain VN2013-48 20
23. Từ cây phả hệ (Hình 4.28) cho thấy có 02 nhánh lớn là nhánh I và nhánh II. Mỗi nhánh lớn chia làm nhiều nhánh phụ (cluster). Do vậy có thể nói rằng các dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ thuộc nhiều nhóm khác nhau về mặt di truyền. Cụ thể: 4.3. Phân lập, nhận diện dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P Kết quả phân lập được 08 dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P Đặc điểm hình thái khuẩn lạc: 08 dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường lân quan sát 72 giờ sau khi cấy phần lớn khuẩn lạc có dạng hình tròn, mô, trắng đục và bìa nguyên. Hình dạng: Khuẩn lạc dạng tròn chiếm tỷ lệ 87,5% và dạng không đều chiếm 12,5%. Màu sắc: phần lớn khuẩn lạc có màu trắng đục (75%) các màu còn lại chiếm tỷ lệ rất thấp 25%. Dạng bìa: có dạng bìa nguyên chiếm 87,5% so với 12,5% có dạng bìa răng cưa. Độ nổi: 100% khuẩn lạc có độ nổi mô. 21
24. Bảng 4.23. Kết quả giải trình tự 3 dòng vi khuẩn tích luỹ Poly-P. độ Dòng vi Số TT Tên vi khuẩn đồng hình đồng khuẩn nucleotide hình (%) KC456633 Bacillus subtilis strain 98 1 Poly-P.1.A 960 TUST019 KR703626 Bacillus sp. JES1 98 KU877333 Bacillus sp. M29(2016b) 98 2 Poly-P.03.C 1280 KU179323 Bacillus subtilis strain L4 97 KU179345 Bacillus aryabhattai Poly- 99 3 737 strain L42 P.06.4.B MG430247 Bacillus megaterium 99 strain CS40 Từ cây phả hệ cho thấy, cả 02 dòng vi khuẩn Poly-P.1.A và Poly-P.03.C ở nhánh A và dòng Poly-P.06.4.B ở nhánh B đều có quan hệ gần gũi với các dòng vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Do đó, cả 03 dòng vi khuẩn này đều thuộc chi Bacillus (Hình 4.29). Các dòng vi khuẩn sau khi phân lập và nhận diện và được tuyển chọn qua khả năng kết tụ trong môi trường có Kaolin và trong việc xử lý nước thải hủ tiếu Mỹ Tho. Kết quả là: tuyển chọn được 22
25. dòng vi khuẩn kết tụ sinh học là Bacillus subtilis PRO.01.C và Bacillus subtilis PO.03.B; dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ gồm Bacillus altitudinis HNi.01.03.DL, Stenotrophomonas maltophilia HNa.02.03.C, Enterobacter hormaechei HAm.03.05.C và dòng vi khuẩn tích lũy poly-P Bacillus megaterium Poly-P.06.4.B. 4.4. Khả năng xử lý nước thải của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P tốt nhất 4.4.1. Ở thể tích 100 mL Ở pH = 7, sự kết hợp giữa 01 dòng vi khuẩn kết tụ protein và 01 dòng vi khuẩn kết tụ polysaccharide cho kết quả như sau: Sự kết hợp giữa dòng PRO.01.C + PO.03.B cho hiệu quả kết quả kết tụ ở nước thải cao nhất với 33,04%. Và giảm lượng TSS (tổng rắn lơ lửng = total suspended solid) trong nước thải (Bảng 4.28). PO.07.04 + PRO.01.C 29.29 PO.01.C + PRO.01.C 30.01 PO.03.B + PRO.01.C 33.04 tổ tổ cáchợpdòng dòng vikhuẩnkết Đới chứng 0.23 0 5 10 15 20 25 30 35 Tỉ lệ % kết tụ Hình 4.36 Tỷ lệ kết tụ trung bình của tổ hợp các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học xử lý trong 100 mL nước thải hủ tiếu Mỹ Tho. 23
26. Bảng 4.28 Hiệu quả của sự kết hợp 02 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học trên lượng TSS của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho. Nghiệm thức Hàm lượng TSS (mg/L) PO.07.04 + PRO.01.C 1,197 PO.01.C + PRO.01.C 0,933 PO.03.B + PRO.01.C 0,733 Đối chứng 1,863 CV(%) 3,57 LSD.01 0,116 4.4.2. Ở thể tích 1 L Kết hợp các dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học protein và polysaccharide ở 1 L nước thải nước thải hủ tiếu Mỹ Tho. Kết quả từ thí nghiệm trên cho thấy tỷ lệ kết tụ sinh học cao và chỉ tiêu TSS giảm tốt nhất sẽ được chọn ứng dụng vào xử lý nước thải ở thể tích 1 L (Hình 4.37). PO.03.B + PRO.01.C 30.86 Đới chứng 1.98 tổ tổ 2hợp dòng vikhuẩn kết tụ 0 5 10 15 20 25 30 35 tỉ lệ % kết tụ Hình 4.37 Tỷ lệ kết tụ trung bình của 2 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học PO.03.B và PRO.01.C xử lý trong 1 L nước thải hủ tiếu Mỹ Tho. 24
27. Bảng 4.29: Hiệu quả của sự kết hợp 02 dòng vi khuẩn kết tự sinh học trên lượng TSS của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho ở 1-L nước thải. Nghiệm thức Hàm lượng TSS (mg/L) PO.03.B + PRO.01.C 0,233 Đối chứng 3,000 CV (%) 3,96 LSD.01 0,176 Kết quả từ Bảng 4.29 và Hình 4.37 cho thấy nghiệm thức kết hợp giữa 02 dòng vi khuẩn PRO.03.B và PO.01.C có tỷ lệ kết tụ tốt hơn và đã làm giảm chỉ tiêu TSS tốt hơn so với mẫu nước thải ban đầu. Từ kết quả trên, ứng dụng 02 dòng vi khuẩn kết hợp để xử lý trên 10 L nước thải hủ tiếu Mỹ Tho. Đề tài nghiên cứu cũng chọn 04 vi khuẩn chuyển hoá N (HNi.01.03.DL, HNa.02.03.C, HAm.03.05.C, COM.04.07.C), 01 dòng vi khuẩn tích luỹ Poly-P.06.4.B để tiến hành ứng dụng xử lý nước thải với thể tích 1-L trong 03 ngày. Từ ngày 2 đến ngày 3, hàm lượng orthophosphate trong nước thải giảm đi ít lại từ 13,13 mg/L còn 11,32 mg/L, do lúc này vi khuẩn đã tích luỹ gần như là đủ lượng polyphosphate bên trong tế bào và có xu hướng giải phóng orthophosphate ra môi trường bên ngoài. Vì vậy kết hợp kết quả khảo sát khả năng xử lý ammonium và polyphosphate của các dòng vi khuẩn tích luỹ Poly-P, chọn dòng vi khuẩn poly-P.06.4.B có sục khí là dòng vi khuẩn có khả năng xử lý polyphosphate và ammonium hiệu quả nhất. Sau khi thử nghiệm khả năng xử lý của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P chọn được dòng HNa.02.03.C và Poly-P.06.04.B có khả năng xử lý đạt hiệu quả cao. Tiến hành ứng dụng kết hợp 02 dòng vi khuẩn này để xử lý nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho ở dung tích 1-L, kết quả trình bày ở Hình 4.43. 25
28. Hình 4.43 Hàm lượng ammonium và orthophosphate (mg/L) nước thải sau khi xử lý. Kết quả này cho thấy hiệu quả xử lý của 02 dòng vi khuẩn HNa.02.03.C và Poly-P.06.4.B rất tốt, có thể ứng dụng ra mô hình lớn hơn. 4.4.3. Ở thể tích 10L Kết hợp giữa 02 dòng vi khuẩn PRO 03.B và PO 01.C có tỷ lệ kết tụ tốt hơn và đã làm giảm chỉ tiêu TSS xuống 1,597 mg/L tốt hơn so với mẫu nước thải đối chứng từ 2,030 mg/L xuống còn 0,433 mg/L. PO.03.B + PRO.01.C 42.54 Đới chứng 0.82 tổ tổ 2hợp dòng vikhuẩn kết tụ sinhhọc 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 tỉ lệ % kêt tụ Hình 4.38 Tỷ lệ kết tụ trung bình của tổ hợp 02 dòng vi khuẩn kết tụ sinh học PO.03.B và PRO.01.C xử lý trong 10 lít nước thải hủ tiếu Mỹ Tho. 26
29. Bảng 4.30 Hiệu quả của sự kết hợp 02 dòng vi khuẩn kết tự sinh học trên lượng TSS của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho ở 10-L nước thải. Nghiệm thức Hàm lượng TSS (mg/L) PO.03.B + PRO.01.C 0,433 Đối chứng 2,030 CV (%) 1,57 LSD.01 0,053 Việc kết hợp 02 dòng vi khuẩn PO.03.B và PRO.01.C trong việc xử lý nước thải cho tỷ lệ kết tụ cao và giảm tỷ lệ TSS tốt ở 3 mức thể tích 100-mL, 1-L, 10-L. Kết quả này tiếp tục ứng dục cho thí nghiệm tiếp theo. Sau khi thử nghiệm khả năng xử lý của dòng vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P chọn được dòng HNa.02.03.C và Poly-P.06.4.B có khả năng xử lý đạt hiệu quả cao. Tiến hành ứng dụng kết hợp 02 dòng vi khuẩn này để xử lý nước thải sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho ở dung tích 10-L với 03 lần lặp lại. Kết quả nước thải có bổ sung vi khuẩn sau khi xử lý có hàm lượng orthophosphate từ 27,2 mg/L giảm xuống còn 0,72 mg/L và tổng P từ 13,1 mg/L giảm còn 8.7 mg/L khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng đồng thời cả hai đạt quy chuẩn B của QCVN: 40/2011 BTNMT. Kết quả này cho thấy hiệu quả xử lý của 02 dòng vi khuẩn HNa.02.03.C và Poly-P.06.4.B rất tốt, có thể ứng dụng ra mô hình lớn hơn (100-L và 1000-L). 4.4.4. Ở thể tích 100 L Kết quả từ Bảng 4.31 cho thấy pH nước thải lúc đầu là 3,84 và nghiệm thức đối chứng (NT1) [không có vi khuẩn], pH nuớc thải gia tăng lên 4,61 nhưng bổ sung vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn Poly-P và nước thải là pH nước thải gia tăng 6,02. Tổng chất rắng lơ lửng (TSS) và nhu cầu oxi sinh học (BOD5) trong nước thải rất cao (620 và 950 mg/L, theo thứ tự) và 27
30. hàm lượng TSS và BOD5 trong nước thải giảm mạnh sau 04 ngày. Đặc biệt trong các nghiệm thức có ứng dụng vi khuẩn, hàm lượng BOD5 trong nước thải giảm chỉ còn 1/3 (so với ban đầu). Tổng nitơ (TN) trong nước thải giảm nhưng tổng phopho (TP) trong nước thải lại gia tăng. Bảng 4.31 Hiệu quả của vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa Nitơ và vi khuẩn tích lũy Poly-P trên pH và lý, hóa tính của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho. * Vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa Nitơ và vi khuẩn tích lũy Poly-P 4.4.5. Ở thể tích 1000 L Trong bồn 1000 lít, pH của nước thải hủ tiếu có sự diển biến mạnh mẻ hơn như khi bổ sung vi khuẩn kết tụ sinh học vào nước thải làm pH nước thải bắt đầu thay đổi theo chiều hướng tăng lên, đặc biệt khi thêm vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn poly-P làm pH nước thải tăng mạnh mẻ so với pH của nước thải của nghiệm thức đối chứng (Hình 4.45) Hàm lượng BOD5 trong nước thải có bổ sung vi khuẩn giảm mạnh trong 2 giai đoạn: xử lý vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn Poly-P (gấp 2,4 lần so với ban đầu). Trong nghiệm thức đối chứng, hàm lượng BOD5 chỉ giảm ở giai đoạn bổ sung vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn Poly-P (Hình 4.46), điều này chứng tỏ vai trò của vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn Poly-P đến hàm lượng BOD5 trong nước thải. Tương tự như trường hợp BOD5, hàm lượng TSS của nước thải chỉ giảm mạnh ở giai 28
31. đoạn vi khuẩn chuyển hóa nitơ và vi khuẩn Poly-P trong nước thải (hơn 23,6 lần so với ban đầu). pH7 đối chứng 6.5 vi khuẩn Hàm LSD.01 =0.21 lượng 6 CV =1.22% TSS (mg/L) 5.5 5 4.5 ban đầu vi khuẩn kết tụ vi khuẩn N-P sinh học Dòng vi khuẩn Hình 4.45 Hiệu quả của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P trên pH của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho sau 4 ngày xử lý. 29
32. LSD.01 (BOD)=25 CV (BOD)= 2.11 LSD.01 (TSS) = 11 1400 CV (TSS) = 5,41% đối chứng mg/L của TSS 1200 1000 nghiệm thức vi khuẩn của 800 TSS Hàm 600 lượng TSS 400 (mg/L) 200 0 ban đầu Vi khuẩn kết tụ vi khuẩn N-P Dòng vi khuẩn Hình 4.46 Hiệu quả của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P trên BOD5 và TSS của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho sau 4 ngày xử lý. Bổ sung vi khuẩn vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hoá Nitơ và tích luỹ Poly-P vào trong nước thải hủ tiếu cho thấy hàm lượng tổng N (TKN) giảm trong tất cả các giai đoạn (từ 45 mg/L giảm liên tục còn 7,5 mg/L [giảm 49,44%]) trong khi đó hàm lương TKN của nước thải của nghiệm thức đối chứng gia tăng trong tất cả giai đoạn (từ 45 mg/L tăng lên 120 mg/L), có lẻ giai đoạn các vi khuẩn kỵ khí tiếp tục hoạt động để phóng thích liên tục các nitơ vào nước thải. Điều đặc biệt bổ sung vi khuẩn kết tụ sinh học làm giảm lượng tổng phospho (TP) trong nước thải (từ 6,3 mg/L xuống 3,42 mg/L) nhưng bổ sung vi khuẩn chuyển hóa nitơ và Poly-P gia tăng lượng tổng P (9,35 mg/L) sau đó nước thải để yên trong 2 ngày thì tổng P giảm xuống 4,76 mg/L [số liệu không trình bày ở đây]. Ngược lại, hàm lượng tổng phospho trong nước thải của nghiệm thức đối chứng tăng trong tất cả các giai đoạn (từ 6,3 tăng lên 7.98 mg/L - giai đoạn vi khuẩn kết tụ sinh học) và (12,7 mg/L - giai đoạn vi khuẩn chuyển hóa N và tích lũy Poly-P) (Hình 4.47). 30
33. 140 đối chứng của TKN mg/L 120 nghiệm thức vi khuẩn của TKN 100 Hàm LSD.01 (TKN) = 5.7 lượng 80 C.V (TKN) = 2.12% TSS 60 LSD.01 (TP) = 1.5 (mg/L) C.V (TP) = 1.25% 40 20 0 ban đầu vi khuẩn kết tụ vi khuẩn N-P Dòng vi khuẩn Hình 4.47 Hiệu quả của các dòng vi khuẩn kết tụ sinh học, vi khuẩn chuyển hoá N và tích luỹ Poly-P trên TN và tổng TP của nước thải hủ tiếu Mỹ Tho sau 4 ngày xử lý. Như vậy, qua thí nghiệm 1000-L, kết quả rút ra được những nhận xét sau: 1. Bổ sung vi khuẩn cải thiện pH của nước thải hủ tiếu từ đó tạo môi trường thuận lợi cho vi khuẩn chuyển hoá nitơ và vi khuẩn tích lũy Poly-P hoạt động tốt 2. Vi khuẩn chuyển hoá nitơ và vi khuẩn tích lũy Poly-P hoạt động tích cực loại bỏ ammonium, giảm bớt P, BOD5 và TSS góp phần làm cho nước thải sạch hơn. Theo Pimpa (2004), cơ sở sản xuất bán hủ tiếu sử dụng tinh bột gạo như là nguồn nguyên liệu nên sản xuất ra một lượng lớn nước thải chứa nhiều tinh bột. Nước thải gây ra nhiều vấn đề về môi trường bởi vì nó chứa hàm lượng oxi hòa tan cao (BOD) và tổng chất rắn lơ lửng (TSS). 31
34. Sau cellulose, tinh bột là nguồn đường đa (polysaccharide) thứ hai tìm thấy trong tự nhiên, sản xuất bởi thực vật như là 1 dạng dự trữ. Cây trồng chủ yếu cho tinh bột là ngũ cốc, đặc biệt là bắp (ngô) kế tiếp là lúa mì, lúa gạo và khoai tây (de Baere, 1999). Russ and Meyer-Pittroff (2004) khuyến cáo nước thải chứa tinh bột nên đo chính xác lượng hay chỉ số chất thải đặc biệt “specific waste index” để có thể đánh giá hay phân chia loại nước thải cho chính xác. Mironescu (2011) ghi nhận rắng tinh bột và protein trong nước thải của quá trình chế biến khoai tây có pH giảm bởi sự lên men của vi khuẩn lactic. Trong qui trình sản xuất hủ tiếu, gạo được ngâm trong 1 thời gian dài cần thiết để lên men tự nhiên. Trong suốt quá trình này, gạo được ngâm không chỉ hấp thu nước mà còn cho phép lên men tự nhiên nhiều loại vi sinh vật khác nhau đặc biệt là vi khuẩn lactic (LAB) (Li et al., 2015) và nấm men (Liu, 2007). Ảnh hưởng của vi khuẩn lac tic (LAB) và những vi khuẫn khác trong suốt quá trình lên men làm giảm pH nước thải. Gạo và nước ngâm gạo có pH ban đầu là 7 (trung tính) và giảm lần xuống còn bằng pH 4 khi qua trình lên men hoàn toàn (Li et al., 2015) và trong nghiên cứu của tôi, pH của nước thải giảm còn 4,68 sau 24 giờ hay 4,13 và 3,48 sau 48 giờ (Bảng 4.18). Các acid hữu cơ chính trong nước thải là acid lactic và acetic; nhưng acid lactic chiếm ưu thế hơn (Li et al., 2015), điều nàu cho thấy một vài vài vi khuẩn lac tic (LAB) thuộc nhóm dị hình (heterofermentative) (Lu et al., 2008), pH của nước thải sẽ là môi trường tốt cho vi khuẩn vi khuẩn kỵ khí (heterotrophic bacteria) phóng thích ra H2S (1 loại khí hôi thúi). Chất kết tụ sinh học là một loại đa phân tử phân hủy sinh học tiết ra từ vi sinh vật (biodegradable macromolecular flocculant secreted by microorganisms). Bởi vì sự sinh phân hủy của chúng, không độc và không tạo ra chất ô nhiểm thứ cấp, chất kết tụ sinh học được chú ý nghiên cứu và sử dụng rộng rãi (Li et al., 1999). Ứng dụng chất kết tụ sinh học trong xử lý nước thải hủ tiếu được nghiên cứu dưới nhiều điều kiện khác khác như quá trình chế biến thực phẩm và sử dụng hóa chất (Salehizadeh và Shojaosadati, 2001). Trong nghiên cứu của tôi, ứng dụng vi khuẩn kết tụ sinh học vào trong nước thải hủ tiếu đã làm làm giảm lượng chất rắn lơ lửng 32
35. như tinh bột và hay protein trầm hiện hay lắng xuống đáy. Gong et al. (2008) quan sát thấy khi tỉ lệ kết tụ (flocculating activity) (%) đạt hơn 80% khi pH của nước thải (như thịt, bia, nước chấm và nước thải sông) hơn 6.0 lúc 36 giờ với vi khuẩn dòng Serratia ficaria SF-1. Kết quả này cũng chứng minh hàm lượng TSS nước thải mạnh (Hình 4.28) và pH của nước thải gia tăng (Hình 4.45) và kết quả này cũng giúp cho vi khuẩn chuyển hóa nitơ dị dưỡng và và vi khuẩn tích lũy Poly-P hoạt động hữu hiệu để loại bỏ hay chuyển hóa nitrogen và orthophosphate ra khỏi nước thải (Hình 4.48). Bên cạnh đó, hàm lượng BOD5 giảm mạnh mẻ do hoạt động tích cực của nhóm vi khuẩn này (Hình 4.46). Sự hoạt động hữu hiệu của vi khuẩn thuộc nitrate hóa dị dưỡng (heterotrophic nitrification) và vi khuẩn phản nitrate-hóa hiếu khí (aerobic denitrification) được nhiều báo cáo đề cập (Castignetii và Hollocher, 1984). Như vậy nitơ trong nước thải được loại bỏ với sự hợp tác của nhiều nhóm vi khuẩn khác nhau như Pseudomonas stutzeri, Alcaligenes faecalis, Paracoccus denitrificans và Thiosphaera pantotropha (Su et al., 2001; Stouthamer et al., 1997; Gupta và Gupta, 2001). Loại vi khuẩn này có thể có tiềm năng vượt qua những giới hạn về quá trình loại bỏ nitơ. Nghiên cứu tập trung vào vi khuẩn nitrate hóa dị dưỡng (heterotrophic nitrification) và vi khuẩn phản nitrate-hóa hiếu khí (aerobic denitrification) trong điều kiện hàm lượng ammonium thấp từ nước thải sinh hoạt và nghiên cứu xử lý nước thải có hàm lượng ammonium cực cao hiếm (Gupta và Gupta, 2001). Alcaligenes faecalis dòng số 4, là vi khuẩn nitrate hóa dị dưỡng (heterotrophic nitrification) và vi khuẩn phản nitrate-hóa hiếu khí (aerobic denitrification), được sử dũng để xử lý nước thải chăn nuôi heo chứa hàm lượng ammonium cực cao dưới điều kiện hiếu khí. Trong thí nghiệm liên tục và không chất thải rắn (SFW) + nhưng có trộn với phân heo, nước thải đạt đến 2000 NH4 –N mg/L và 12,000 COD mg/L và tỉ lệ ammonium loại bỏ khoảng 30 mg– N/L/h, 5–10 lần cao hơn tỉ lệ nhận được từ những vi khuẩn khác có cùng năng lực. Tỉ lệ phản nitrate-hóa (denitrification ratio) hơn + 65% loại NH4 –N, cho thấy dòng số.4 thể hiện tính nitrat-hóa dị 33
36. dưỡng và phản nitrat-hóa hiếu khí mạnh mẻ trong nước thải chăn nuôi heo (Zoo et al., 2000). Ứng dụng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri và Acinetobacter lwoffii để loại bỏ ammonia trong nước thải của bải rác được thực hiện để đánh giá năng lực loại bỏ ammonia ở những hàm lượng khác nhau ở điều kiện có hay không có sục khí trong phòng thí nghiệm. Thí nghiệm cho thấy những loại này có khả năng loại bỏ ammonia một cách hữu hiệu ở hai nồng độ 50 mg/l và 100 mg/l ammonia. Vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn Acinetobacter lwoffii dòng TN7 là những loài vi khuẩn tốt nhất để loại bỏ. Bên cạnh đó, cả hai loài này loại bỏ ammonia trong điều kiện hiếu khí (sục khí) tốt hơn không sục khí. Trong 3 ngày, hiệu quả loại bỏ ammonia của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b là 97,2% và 98,57% và vi khuẩn Acinetobacter lwoffii dòng TN7 là 96,32% là 98.31% trong nước thải bải rác chứa hàm lượng 50 mg/l và 100 mg/l, theo thứ tự (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thị Hoàng Nam, 2012). Trong thí nghiệm này, sử dụng hai dòng vi khuẩn kết tụ sinh học là Bacillus subtilis PRO.03.B, Bacillus subtilis PO.01.C xử lý kết tụ trong 1 giờ (quậy mạnh) sau đó để yên trong 4 giờ, lấy phần bên trên (phần trong) chuyển sang bồn mới để bổ sung 0,1% vi khuẩn chuyển hóa nitơ Stenotrophomonas maltophilia HNa.02.03.C và vi khuẩn poly-P Bacillus megaterium Poly- P.06.4.B, sục khí 8/24 (4 giờ buổi sáng, 4 giờ buổi chiều) liên tục trong 4 ngày, để yên 1 ngày, lấy mẫu để đo với kết quả: - pH = 6.13 - TSS = 17 mg/L - BOD5 = 23 mg/L - TKN = 7,57 mg/L - TP = 4,76 mg/L Đạt tiêu chuẩn B, của QCVN40:2011/BTNMT. 34
37. CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Tám cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho – tỉnh Tiền Giang đã thải ra một lượng nước thải khá lớn có pH thấp (chua), chứa nhiều độc chất có hàm lượng cao. Từ 08 mẫu thu được từ các cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho, tỉnh Tiền Giang, phân lập 109 dòng vi khuẩn bao gồm 59 dòng vi khuẩn chuyển hoá đạm với 15 dòng vi khuẩn trên môi trường nitrite, 18 dòng vi khuẩn trên môi trường nitrate, 15 dòng vi khuẩn trên môi trường ammonium và 11 dòng vi khuẩn trên môi trường nitơ tổng hợp; 42 dòng vi khuẩn sản xuất chất kết tụ sinh học bao gồm 23 dòng vi khuẩn kết tụ chất protein và 19 dòng vi khuẩn kết tụ chất polysaccharide; 08 dòng vi khuẩn tích luỹ poly-P trên những dòng môi trường chuyên biệt. Tuyển chọn được dòng vi khuẩn kết tụ sinh học là Bacillus subtilis PRO.01.C và Bacillus subtilis PO.03.B; dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ gồm Bacillus altitudinis HNi.01.03.DL, Stenotrophomonas maltophilia HNa.02.03.C, Enterobacter hormaechei HAm.03.05.C và dòng vi khuẩn tích lũy poly-P Bacillus megaterium Poly-P.06.4.B. 5.2 Đề xuất Ứng dụng mô hình này để xử lý nước thải cho từng cơ sở sản xuất hủ tiếu Mỹ Tho. Thiết lập hệ thống xử lý nước thải tập trung cho 08 cơ sở sản xuất trước khi đổ ra sông, rạch. Cần đánh giá tính an toàn sinh học trước khi đưa vào sử dụng. 35