Phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá Houttuynia cordata Thunb có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus..

Nội dung tài liệu: Phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá Houttuynia cordata Thunb có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus..

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 62 42 02 01 NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY DIẾP CÁ ( Houttuynia cordata Thunb.) CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TRÊN VI KHUẨN Staphylococcus aureus TỪ MỤN NHỌT (Furuncle) Ở NGƯỜI Cần Thơ, 2021
2. CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ sở Họp tại: Phòng Bảo vệ Luận án, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc: 14 giờ, ngày 04 tháng 07 năm 2020 Phản biện 1: Phản biện 2: Có thể tìM hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
3. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Huỳnh Văn Trương, Nguyễn Hữu Hiệp, Nguyễn Thị Thúy Duy. 2017. Phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Escherichia coli, Aeromonas hydrophila và Staphylococcus aureus tại tỉnh An Giang. Tạp chí Y học Việt Nam, 458(9):399- 409. 2. Truong Huynh Van and Hiep Nguyen Huu, 2017. Isolation of antibacterial endophytes from ( Houttuynia cordata Thunb.) grown in cantho city. Proceedings of FerVAAP2017, the 7th International Conference on Fermentation Technology for Value Added Agricultural Products the 12th Asian Biohydrogen Biorefinery Symposium, July 25th – 28th, Khon Kaen, ThaiLan, Page: 86 - 89. 3. Huỳnh Văn Trương, Nguyễn Hữu Hiệp. 2018. Phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh của cây Diếp cá ( Houttuynia cordata Thunb.) tại tỉnh Sóc Trăng có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người. Tạp chí Y học Việt Nam, 471(10):252- 261. 4. Huỳnh Văn Trương, Nguyễn Hữu Hiệp, Lý Tú Hương. 2019. Phân lập và định danh vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá “Houttuynia cordata Thunb.” tại tỉnh Kiên Giang có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 55(2):166-173. 5. Huynh Van Truong, Nguyen Huu Hiep, Nguyen Trung Kien, Nguyen Minh Phuong, Tran Huynh Trung, Ly Tu Huong, Huynh Gia Bao, Le Thi Cam Tu, Nguyen Thang, Tran Duc Tuong, Quach Van Cao Thi, 2020. Research on endophytic bacteria in Houttuynia cordata Thunb. with antibacterial activity against Staphylococcus aureus from human furuncles, International Journal of Scientific Engineering and Applied Science, Volume-6, Issue-11, page: 81-92. 3
4. Chương 1. GIỚI THIỆU 1.1. Tính cấp thiết của nghiên cứu Từ khi Alexander Flemming phát hiện ra kháng sinh đầu tiên là Penicillin thì kháng sinh đã được ứng dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn cho người cũng như động vật. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh một cách tùy tiện đã gây ra những tác hại không nhỏ như quen thuốc và kháng thuốc ngày càng phổ biến. Đó là nguyên nhân cần phải tìm ra kháng sinh mới để tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trong đó có vi khuẩn Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) là một vi khuẩn thường gặp trên da hoặc niêm mạc mũi chiếm 30% những người khỏe mạnh. Khi da bị tổn thương, trầy xước, tụ cầu khuẩn xâm nhập cơ thể và có thể gây ra một loạt các vấn đề từ nổi mụn nhẹ đến nhiễm khuẩn nặng, đặc biệt là ở trẻ em, người già, và những người có hệ miễn dịch yếu. Hầu hết các tụ cầu ban đầu nhạy cảm với kháng sinh nhóm beta-lactam như penicillin, methicillin. Vi khuẩn Staphylococcus aureus đề kháng methicillin (gọi tắt là MRSA), vi khuẩn Staphylococcus aureus đề kháng với methicillin đã được báo cáo và sự bùng phát của MRSA xảy ra ở châu Âu vào đầu những năm 1960 (Dien et al ., 2014). Trong thiên nhiên có rất nhiều cây có hoạt chất kháng khuẩn và được y học sử dụng để điều trị bệnh từ lâu như cây Diếp cá, có hoạt chất kháng khuẩn, kháng viêm, kháng oxy hóa để dùng làm thuốc chữa bệnh ngoài da, mụn nhọt, chóc lở, viêm phế quản Chính vì vậy gần đây thế giới y học có xu hướng, hướng đến những loại hợp chất kháng sinh, kháng viêm, kháng oxy hóa từ những cây dược liệu và thực vật. Hiện tại có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh ở cây dược liệu và thực vật, vi khuẩn nội sinh có khả năng giúp cây tăng trưởng tốt mà còn có khả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên (Strobel, 2003) và kích thích cây chủ sản xuất ra các hợp chất chuyển hóa trung gian (Hardoim et al ., 2008). Trong đó việc nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có các hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và kháng oxy hóa chưa được quan tâm nhiều. Vì vậy, luận án với tựa đề “Phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn 4
5. Staphylococcus aureus từ mụn nhọt (Furuncle) ở người” là việc làm có tính cấp thiết nên được nghiên cứu. 1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Phân lập và định danh được một số dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại các vùng sinh thái có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus và xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và kháng oxy hóa từ cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với vi khuẩn Staphylococcus aureus. 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Phân lập và khảo sát khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus của một số dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá được trồng tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ tương ứng với bốn vùng sinh thái nước mặn, nước lợ, đồi núi và nước ngọt. Định danh một số dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với vi khuẩn Staphylococcus aureus . Nghiên cứu ở mức độ in vitro các hoạt tính kháng oxy hóa và kháng viêm liên quan đến khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus của dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá được tuyển chọn. 1.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1 . Phân lập và tuyển chọn dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus, bao gồm các nội dung sau: Phân lập và khảo sát đặc điểm những dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá trồng tại các tỉnh Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Thành phố Cần Thơ. Tuyển chọn các dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch. 5
6. Nội dung 2. Định danh một số dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trên vi khuẩn Staphylococcus aureus bằng phương pháp giải trình tự vùng gen 16S rRNA và xây dựng mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh. Nội dung 3. Khảo sát khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus của cao chiết ethyl acetate dịch nuôi vi khuẩn, gồm các nội dung sau: Điều chế cao ethyl acetate của dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh. Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của cao ethyl acetate bằng cách xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibitory Concentration) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC (Minimum Bactericidal Concentration). Nội dung 4. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Diếp cá được tuyển chọn. Nội dung 5. Xác định hoạt tính kháng viêm in vitro của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Diếp cá được tuyển chọn. 1.4 Những đóng góp Mới về khoa học Nghiên cứu đã phân lập được 231 dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá. Trong đó có 65/231 dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người. Từ đó 13/65 dòng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh tại 13 địa điểm trong nghiên cứu có hoạt tính kháng khuẩn cao được giải trình tự đều thuộc chi Bacillus . Cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus , xác định được nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dao động từ 80 đến 160 µg/mL. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết dao động từ 640 đến 1280 µg/mL. Cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) ở cây Diếp cá, khảo sát in vitro cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết được xác định thông qua các phương 6
7. pháp trung hòa gốc tự do DPPH, ABTS +, RP, TAC và FRAP với giá trị EC 50 lần lược là 57,38 µg/mL, 57,01µg/mL, 32,00 µg/mL, 94,80 µg/mL và 41,41 µg/mL. Ngoài ra, hoạt tính kháng viêm của cao chiết cho thấy hoạt động ức chế sự biến tính của albumin huyết thanh bò. Cao chiết có khả năng ức chế 50% sự biến tính ở nồng độ 73,74 µg/mL. 1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 1.5.1 Ý nghĩa khoa học Phân lập, tuyển chọn và nhận diện được các dòng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người. Xác định được hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng viêm từ cao chiết ethyl acetate của dòng vi khuẩn nội sinh RGT2 ở cây Diếp cá, Kết quả của luận án có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo và bổ sung giáo trình giảng dạy. 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Cung cấp nguồn nguyên liệu ban đầu dòng vi khuẩn nội sinh RGT2, có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả luận án mở ra triển vọng, từ cao chiết ethyl acetate của dòng vi khuẩn nội sinh RGT2 ở cây Diếp cá, có tiềm năng cho việc điều trị các nhiễm trùng từ mụn nhọt và da ở người do vi khuẩn Staphylococcus aureus . Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểM thực vật cây Diếp cá Cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) tên khác là cây Giấp cá, Ngư tinh thảo (Đỗ Tất Lợi, 1999), rau Giấp cá, Tập thái, cỏ Vảy mèo (Thái), rau Ven, Phắc hoảy (Tày), Cù mua mía (Dao). Tên nước ngoài là Dokudame (Nhật Bản); E-Sung-Cho (Hàn Quốc); Khao-tong hoặc Plu-khao (Thái Lan); Houttuynia (Pháp) theo (Đỗ Huy Bích, 2004). Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb. (Đỗ Tất Lợi, 1999). Thành phần hóa học 7
8. Tinh dầu, Flavonoid, Alkaloid, Acid hữu cơ và acid béo và các thành phần khác. Công dụng của cây Diếp cá Tác dụng kháng khuẩn, tác dụng kháng virus, tác dụng kháng ung thư, tác dụng kháng viêm, tác dụng kháng oxy hóa và các tác dụng khác. 2.2 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh thực vật 2.2.1 Vi khuẩn nội sinh thực vật Vi khuẩn nội sinh có thể được tìm thấy ở hầu hết các cây đã được nghiên cứu, vi khuẩn nội sinh bên trong mô của các cây chủ và có thể tạo thành nhiều mối quan hệ khác nhau bao gồm cộng sinh, hội sinh (Ryan et al., 2008). Vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ, mà trái lại có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích thích sự sinh trưởng thực vật. Hơn nữa, một số vi khuẩn nội sinh có thể giúp cây chủ kháng lại mầm bệnh (Benhamou et al., 1996) và kích thích cây trồng chống chịu với nhân tố vô sinh và hữu sinh (Hallmann et al., 1997). 2.2.2 Các dòng vi khuẩn nội sinh thực vật thường gặp Dòng vi khuẩn nội sinh thực vật là dòng vi khuẩn thường gặp như Pseudomonas sp., Burkholderia sp. và Bacillus sp. (Lodewyckx et al., 2002). 2.3 Vi khuẩn Staphylococcus aureus Giới: Prokaryote, phân loại: Firmicute, lớp: Firmibacteria, họ: Micrococceae, giống: Staphylococcus Vi khuẩn Staphylococcus aureus là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, không hình thành dạng bào tử, có dạng tế bào tròn, Gram dương, không di chuyển, catalase và coagulase dương tính. Vi khuẩn Staphylococcus aureus phát triển tối ưu ở 30°C–37°C, nhưng vẫn có thể phát triển nhiệt độ từ 7°C–49°C. Khoảng pH cho sự tăng sinh của tụ cầu khuẩn là 4,5–9,3 đạt mức tăng trưởng tối ưu ở khoảng pH giữa 7,0-7,5. 2.4 Tổng quan về da người Da là một trong những cơ quan lớn nhất trong cơ thể. Một số chức năng quan trọng của da là bảo vệ cơ thể tránh tổn thương từ bên 8
9. ngoài, kiểm soát cân bằng dịch và điện giải, kiểm soát nhiệt độ, một trạm quan trọng của hệ thần kinh và hệ miễn dịch, hấp thụ và phản ứng với tia cực tím bằng cách tổng hợp vitamin D và tổng hợp lipid. Ngoài ra, da còn có chức năng thẩm mỹ quan trọng. Biểu hiện lâm sàng theo vùng da bị viêm Vùng mặt, thường viêm nang lông do tụ cầu ( Staphylococcus aureus ). Vùng râu, viêm nang lông sâu do tụ cầu vàng gây viêm lông, đôi khi còn nhiễm đồng thời các vi khuẩn Gram âm. Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương tiện nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng và phạM vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Các dòng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người, phân lập được tại các tỉnh Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và thành phố Cần Thơ. Thời gian nghiên cứu Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2015 đến tháng 12/2019 Địa điểm nghiên cứu Thu mẫu cây Diếp cá từ các đám cây Diếp cá với quy mô nhỏ được trồng để cung cấp rau ăn sống cho gia đình ở Phú Quốc, Hà Tiên và Rạch Giá của tỉnh Kiên Giang. Tịnh Biên, Phú Tân, Long Xuyên thuộc tỉnh An Giang. Mỹ Xuyên, Châu Thành, Vĩnh Châu và thành phố Sóc Trăng thuộc Tỉnh Sóc Trăng. Bình Thủy, Phong Điền và Ninh Kiều thuộc thành phố Cần Thơ. 3.1.2. Vật liệu Cây Diếp cá đã được nhận dạng theo Dược điển Việt Nam và các tài liệu liên quan thực vật đã được Bộ môn Dược liệu – Thực vật của Khoa Dược trường Đại học Y Dược Cần Thơ, định danh trước khi tiến hành thí nghiệm trong nghiên cứu. 9
10. Sử dụng dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus được phân lập từ mụn nhọt ở người được lưu trữ ở phòng thí nghiệm của Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Dược Cần Thơ cung cấp. 3.1.3. Dụng cụ và thiết bị Tủ an toàn sinh học – CHClab (Hàn Quốc). Tủ ủ vi khuẩn Memmert - IN110, (Đức). Máy lắc ngang Daihan - SHR-1D, (Hàn Quốc). Máy ly tâm 6.000 vòng/phút Hermle - Z206A, (Đức). Máy cô quay chân không Heidolph (Đức). Máy đo pH Metier Toledo (Đức). Máy đo quang phổ Thermo Scientific Multiskan GO, (Phần Lan). Nồi hấp tuyệt trùng, (Nhật), Đĩa 96 giếng đáy tròn (Italia) và một số dụng cụ khác. 3.1.4. Hóa chất Hóa chất dùng để xử lý mẫu, hóa chất ly trích DNA và phản ứng PCR, thuốc thử Resazurin sodium (Sigma) và một số hóa chất khác. Môi trường PDA đặc và bán đặc dùng để phân lập vi khuẩn và kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn. 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Phương pháp thu thập, xử lý Mẫu trong nghiên cứu Vi khuẩn Staphylococcus aureus Vi khuẩn Staphylococcus aureus được phân lập từ mụn nhọt do phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh trường Đại học Y Dược Cần Thơ cung cấp. Thu thập mẫu cây Diếp cá Cây Diếp cá được thu tại địa điểm thu mẫu, sau đó trữ mẫu trong thùng lạnh. Mẫu xử lý và phân lập tại phòng thí nghiệm. 3.2.2. Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá Sơ đồ quy trình phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá 10
11. Hình 3. 1. Quy trình phân lập vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá Độ ròng của vi khuẩn sẽ được kiểm tra bằng cách quan sát dưới kính hiển vi. Sau đó tách lấy những khuẩn lạc ròng lưu trữ trong tube giữ mẫu chuẩn có glycerin để tủ âm (-80ºC) cho đến khi làm tiếp các thí nghiệm tiếp theo của nghiên cứu. Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn được phân lập. Hình dạng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc, độ nổi của khuẩn lạc và dạng bìa khuẩn lạc. Khả năng di động, nhuộm Gram và hình dạng vi khuẩn 3.2.3. Xác định khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ở cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh được trình bày trong Hình 3.2. 11
12. Hình 3. 2. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus Đường kính kháng khuẩn = Đường kính vòng vô khuẩn – Đường kính vòng giấy lọc thấm vi khuẩn nội sinh 3.3. Nhận diện những dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn cao trên vi khuẩn Staphylococcus aureus bằng phương pháp giải trình tự vùng gen 16S rRNA. Sử dụng cặp mồi 16S RNA được thiết kế theo Lane (1991) với trình tự 27F 5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’ 1492R 5’ GGTTACCTTGTTACGACTT 3’ Sản phẩm PCR được giải trình tự bởi công ty 1st BASE tại Malaysia. Kết quả giải trình tự được so sánh với các trình tự có trong ngân hàng gene NCBI và kết hợp các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào để xác định tên loài của dòng vi khuẩn. 3.4. Khảo sát dịch nội bào, dịch ngoại bào và dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá được tuyển chọn có hoạt tính kháng khuẩn trên dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus Bằng cách lấy 100 µL dịch của dòng vi khuẩn nội sinh được tuyển chọn với mật số 10 8 tế bào/mL cho vào 900 µL môi trường PDA lỏng thu được dịch nuôi tăng sinh vi khuẩn là 1000 µL trong ống nghiệm có nắp đậy và thực hiện trong 03 ống nghiệm. Sau đó, 12
13. lấy 03 ống nghiệm có vi khuẩn trên được nuôi tăng sinh 24 giờ trên máy lắc ngang 150 vòng/phút. Sau 24 giờ, dịch vi khuẩn nuôi tăng sinh được thực hiện tiếp thí nghiệm ở 03 ống nghiệm, cụ thể như sau: Ống nghiệm thứ nhất phần dung dịch nuôi tăng sinh (1000µL) được tiến hành ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút thu lấy phần dịch nổi hay còn gọi là dịch ngoại bào. Ống nghiệm thứ hai phần dung dịch nuôi tăng sinh (1000µL) được tiến hành ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút, bỏ phần nước trong phía trên thu được tế bào vi khuẩn. Tế bào vi khuẩn được rửa sạch bằng nước muối sinh lý 3 lần bằng cách cho nước muối sinh lý 1000 µL vào phần tế bào vi khuẩn trộn đều sau đó ly tâm bỏ phần nước trong phía trên thực hiện 3 lần, thu được phần tế bào vi khuẩn đã rửa sạch. Sau đó bổ sung 1000 mL nước muối sinh lý và tiến hàng đánh siêu âm tế bào vi khuẩn ở nhiệt độ 37ºC trong 30 phút nhằm làm vỡ tế bào vi khuẩn giải phóng vật chất bên trong ra ngoài được gọi là dịch nội bào. Ống nghiệm thứ ba phần dung dịch nuôi tăng sinh (1000mL) được giữ nguyên bao gồm cả dịch ngoại bào và tế bào vi khuẩn còn sống được gọi là dịch hỗn hợp hay dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn. Sau khi thu được dịch ngoại bào, dịch nội bào và dịch hỗn hợp tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dựa theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch theo mô tả của (Bauer et al., 1966) bằng cách trải 100 µL dịch vi khuẩn Staphylococcus aureus mật số 10 8 tế bào vi khuẩn/mL lên bề mặt môi trường PDA đặc. Tiếp theo đó, khoanh giấy tẩm dịch ngoại bào, dịch nội bào và dịch hỗn hợp được đặt lên mặt đĩa petri đã trải vi khuẩn Staphylococcus aureus ủ ở 37ºC trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ ủ tiến hành đo đường kính vòng vô khuẩn (không bao gồm khoanh giấy 6 mm) được đo bằng thước đo. 3.5. Điều chế các cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh từ dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá Sau khi đã xác định được khả năng kháng khuẩn của dịch nội bào, dịch ngoại bào và dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn. Phần dịch nào cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất sẽ được chọn để tiến hành ly trích cao chiết với dung môi ethyl acetate như mô tả như sau: Vi khuẩn nội sinh (40 mL) điều chỉnh mật số về 10 8 tế bào vi khuẩn/mL 13
14. được chủng vào 3960 mL môi trường PDA lỏng. Sau đó mẫu được nuôi tăng sinh 24 giờ trên máy lắc ngang 150 vòng/phút. Tiến hành ly trích cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh của dòng vi khuẩn nội sinh bằng cách chiết lỏng-lỏng với dung môi ethyl acetate theo tỷ lệ 1:2, tiến hành cô quay đuổi dung môi thu được cao chiết ethyl acetate từ vi khuẩn nội sinh (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Cao chiết được lưu trữ và bảo quản ở nhiệt độ 4ºC sử dụng cho các khảo sát tiếp theo. 3.6. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethyl acetate từ vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá. 3.6.1. Định tính thành phần hóa học của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh Cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh được định tính về sự hiện diện của các thành phần hóa học như alkaloid, flavonoid, steroid, glycoside, saponin và tannin theo mô tả của (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007), cụ thể như sau: Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm alkaloid - Định tính bằng thuốc thử Dragendroff và thuốc thử Wagner Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm flavonoid - Định tính bằng thuốc thử H 2SO 4 đậm đặc và thuốc thử 1% NaOH/ethanol Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm Steroid – Tri terpenoid - Thuốc thử Salkowski và thuốc thử Rosenthaler Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm glycoside - Định tính bằng thuốc thử Fehling và thuốc thử Keller- Killiani Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm saponin - Dựa vào sự tạo bọt của saponin: nước cất 5 mL được cho vào ống nghiệm và được thêm 3 giọt dung dịch ethanol có chứa mẫu cao chiết để thử nghiệm, bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh, để yên 15 phút, sau đó quan sát cột bọt trong ống nghiệm. Nếu trong ống nghiệm có cột bọt bền thì mẫu thử có chứa saponin. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm tannin 14
15. - Dung dịch cao chiết 2 mL được cho vào ống nghiệm, sau đó được thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%. Nếu có sự hiện diện của tannin thì dung dịch sẽ xuất hiện tủa bông trắng. Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm polyphenol - Định tính bằng thuốc thử FeCl 3 5% 3.6.2. Định lượng thành phần hóa học trong cao chiết ly trích từ dịch nuôi dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá. Phương pháp định lượng polyphenol Tổng hàm lượng polyphenol được đo bằng phương pháp so màu Folin-Ciocalteu (Singleton et al ., 1999). Hàm lượng polyphenol được xác định tương đương miligam gallic acid trên mỗi gram cao chiết (mg GAE/g cao chiết). Phương pháp định lượng flavonoid Tổng hàm lượng flavonoid được xác định theo quy trình được mô tả bởi (Sultana et al ., 2007) với một số hiệu chỉnh. Hàm lượng flavonoid được xác định tương đương miligam quercetin trên mỗi gram cao chiết (mg QE/g cao chiết). 3.6.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Phương pháp khuếch tán giếng thạch bằng cách xác định đường kính vòng vô khuẩn Phương pháp khuếch tán giếng thạch được sử dụng để xác định đường kính vòng vô khuẩn (Bauer et al., 1966). Đo mật số vi khuẩn đạt 108 tế bào/mL (OD = 0,08) được dịch vi khuẩn. Tiến hành nhỏ 100 µL dịch vi khuẩn Staphylococcus aureus vừa pha lên môi trường PDA đặc cần thử hoạt tính, trải đều trên mặt đĩa thạch môi trường PDA và đục 05 giếng lên đĩa thạch với đường kính 6 mm tương đương với các thử nghiệm ở các mức nồng độ 80, 160, 320, 640, 1280 µg/mL của cao chiết. Sau đó cho 50 µL dung dịch cao chiết ở từng nồng độ vào các giếng thạch trên đĩa petri môi trường PDA vừa trải vi khuẩn Staphylococcus aureus và ủ ở nhiệt độ 37ºC trong 24 giờ. Kết quả khả năng kháng khuẩn được đánh giá qua đường kính vòng vô khuẩn được tạo ra (đã trừ đường kính giếng thạch), đơn vị là mm sau 24 giờ ủ mẫu ở nhiệt độ 37ºC. 15
16. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration - MIC) của cao chiết ly trích từ vi khuẩn nội sinh được xác định bằng phương pháp pha loãng trên đĩa 96 giếng dựa vào sự đổi màu của thuốc thử resazurin (Elshikh et al., 2016; Pejin et al ., 2014). Nồng độ MIC là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ thử nghiệm của các cao chiết dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá được tuyển chọn có thể ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn (nồng độ không làm đổi màu thuốc thử resazurin). Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum Bactericidal Concentration - MBC) của cao chiết ly trích từ dịch nuôi vi khuẩn nội sinh được xác định bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt như sau: nhỏ 30 µL dịch thử nghiệm ở các giếng không đổi màu của resazurin lên bề mặt môi trường PDA đặc và sau 24 giờ quan sát sự sống sót của vi khuẩn. Nồng độ MBC là nồng độ thấp nhất trong dãy nồng độ của các cao chiết có thể tiêu diệt toàn bộ vi khuẩn trong giếng, không có khuẩn lạc nào xuất hiện trên môi trường thạch PDA (Omara, 2017). 3.7. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ethyl acetate từ dòng vi khuẩn nội sinh. 3.7.1. Phương pháp kháng oxy hóa tổng (TAC) Hoạt tính kháng oxy hoá tổng (total antioxidant capacity - TAC) của cao chiết ly trích từ vi khuẩn nội sinh được đánh giá theo mô tả của (Prieto, 1999). Hoạt tính kháng oxy hóa còn được đánh giá thông qua độ hấp thu quang phổ, hàm lượng chất kháng oxy hóa tương đương µg/mL trolox và giá trị EC 50 (nồng độ mà tại đó trung hòa được 50% gốc tự do) theo mô tả của (Prieto et al. , 1999). 3.7.2. Phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS •+ Hoạt tính kháng oxy hóa được xác định bằng phương pháp khử màu ABTS •+ (2,2-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) mô tả bởi (Nenadis et al ., 2004). Sau đó, hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 734 nm. Tinh chất trolox được sử dụng như đối chứng dương. 16
17. Hiệu suất (%) = 100 × (1-Vt/Vc). Trong đó có, Vt: độ hấp thu quang phổ của mẫu thử có chứa cao chiết hoặc chất chuẩn, Vc: độ hấp thu quang phổ của mẫu đối chứng âm (methanol). Bên cạnh đó, hoạt tính kháng oxy hóa còn được đánh giá thông qua hàm lượng chất kháng oxy hóa tương đương µg/mL trolox và giá trị EC 50 (nồng độ mà tại đó trung hòa được 50% gốc tự do) theo mô tả của (Nenadis et al. , 2004). 3.7.3. Xác định năng lực khử (RP) Năng lực khử (Reducing power – RP) của cao chiết ly trích từ vi khuẩn nội sinh được thực hiện theo phương pháp của (Oyaizu, 1986). Độ hấp thu quang phổ của hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 700 nm. Tinh chất trolox được sử dụng như đối chứng dương. 3.7.4. Khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết ly trích từ vi khuẩn nội sinh được xác định nhờ phương pháp trung hòa gốc tự do (2, 2- Diphenyl-1-Picrylhydrazyl –DPPH) được mô tả bởi (Sharma and Bhat, 2009). Sau đó, đo độ hấp thu quang phổ của DPPH ở bước sóng 517 nm. Tinh chất trolox được sử dụng như đối chứng dương. 3.7.5. Phương pháp xác định tiềM năng khử (FRAP) Tiềm năng khử của cao chiết ly trích từ vi khuẩn nội sinh được xác định bằng cách xác định khả năng khử (Ferric reducing- antioxidant power –FRAP) (Benzie and Strain, 1996), có hiệu chỉnh. Xác định độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 593 nm. Tinh chất trolox được sử dụng như đối chứng dương. 3.8. Khảo sát hoạt tính kháng viêM in vitro của cao chiết ly trích từ vi khuẩn nội sinh Khả năng kháng viêm của cao chiết ly trích từ vi khuẩn nội sinh được khảo sát thông qua hoạt động ức chế sự biến tính protein được thực hiện theo phương pháp của (Shahzad et al ., 2017) có hiệu chỉnh. Sau khi làm mát, tiến hành đo độ hấp thu quang phổ tại bước sóng 660 nm. Diclofenac được sử dụng như đối chứng dương. 3.9. Phân tích và xử lý số liệu Số liệu được phân tích và xử lý thống kê bằng phần mềm 17
18. Minitab 16 (Anova-Fisher’s). Các biểu đồ được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel 2016. Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả khảo sát các đặc điểM khuẩn lạc và đặc điểM của các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá phân lập được trong nghiên cứu 4.1.1 Kết quả khảo sát đặc điểM khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá Kết quả khảo sát 231 dòng vi khuẩn nội sinh được phân lập thể hiện ở Bảng 4.1 của 04 tỉnh thành như Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ trong nghiên cứu cho thấy về đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có màu trắng đục chiếm đa số, bên cạnh đó còn có các khuẩn lạc màu vàng, màu trắng ngà, màu trắng, màu đỏ nâu và màu nâu nhạt thể hiện có sự đa dạng về màu sắc của khuẩn lạc ở địa điểm nghiên cứu. Ngoài ra, hình dạng các khuẩn lạc có dạng tròn chiếm đa số và độ nổi các khuẩn lạc có dạng mô chiếm tỷ lệ cao. Tiếp đó, dạng bìa nguyên của các khuẩn lạc chiếm số lượng nhiều hơn dạng bìa răng cưa cũng được thể hiện ở Bảng 4.1. Bảng 4. 1 Đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập được ở cây Diếp cá tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ Kiên Sóc An Cần Tổng Đặc điểM khuẩn lạc Giang Trăng Giang Thơ cộng Màu trắng 6 5 4 5 20 Màu trắng đục 33 34 28 35 130 Màu trắng ngà 8 9 7 9 33 Màu Màu vàng 3 2 2 2 9 sắc Màu vàng nhạt 8 8 7 8 31 Màu đỏ nâu 1 1 1 1 4 Màu nâu nhạt 1 1 1 1 4 Hình Dạng hình tròn 40 41 33 41 155 dạng Dạng hình không đều 20 19 17 20 76 Độ Độ nổi mô 36 36 30 37 139 nổi Độ nổi lài 24 24 20 24 70 Dạng Bìa nguyên 44 44 36 45 169 bìa Bìa răng cưa 16 16 14 16 62 18
19. Từ Bảng 4.1 khuẩn lạc của 231 dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá của 04 tỉnh thành trong nghiên cứu khuẩn lạc có màu trắng đục chiếm 133/231 khuẩn lạc. Về hình dạng khuẩn lạc có dạng hình tròn chiếm 168/231 khuẩn lạc. Về độ nổi của khuẩn lạc có 139/231 khuẩn lạc. Ngoài ra, dạng bìa của khuẩn lạc thì dạng bìa nguyên chiếm 169/231 khuẩn lạc trong nghiên cứu. 4.1.2 Kết quả khảo sát đặc điểM của các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá Từ Bảng 4.1. Các dòng vi khuẩn nội sinh có dạng hình que dài que dài chiếm 124/231 dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá. Nhuộm Gram các dòng vi khuẩn nội sinh với tỷ lệ vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương gần tương đương với nhau. Ngoài ra, khảo sát sự di dộng cho thấy có 144/231 dòng vi khuẩn di dộng. Nhiều nghiên cứu trên thế giới về vi khuẩn nội sinh cho thấy đều có xuất hiện ở lá, thân và rễ của thực vật. Nhận định này được thể hiện thông qua các nghiên cứu như nghiên cứu của Handayani et al., (2017) lấy mẫu từ rễ, thân và lá của cây ngập mặn từ rừng ngập mặn Pichavaram, Chidambaram, Tamilnadu của Ấn Độ, phân lập được các dòng vi khuẩn nội sinh. Bảng 4. 2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn phân lập được ở cây Diếp cá tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ Kiên Sóc An Cần Tổng Đặc điểM Giang Trăng Giang Thơ cộng Hình que 19 16 15 18 68 ngắn Hình Hình que 32 34 25 33 124 dạng dài Dòng Hình chuỗi 9 10 10 10 39 vi Gram khuẩn Nhuộm 31 31 23 28 147 dương Gram Gram âm 29 29 27 33 118 Di động 37 39 30 38 144 Sự di Không di động 24 21 20 23 88 động 19
20. Theo nghiên cứu của El Deeb et al., (2013) cũng mô tả về vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân và lá của cây P. tenuiflorus và trong số 28 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được từ các bộ phận khác nhau của cây P. tenuiflorus. 4.2 Kết quả khảo sát đặc điểM pH đất trồng cây Diếp cá trong nghiên cứu Khảo sát về đặc điểm pH đất trồng cây Diếp cá ở nơi thu mẫu trong nghiên cứu ở các vùng sinh thái khác nhau như ở Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ. Cho thấy đặc điểm pH đất trồng cây Diếp cá trong khoảng pH từ 6,0–6,5 ở các khu vực lấy mẫu nghiên cứu, cho dù các nơi này có các vùng sinh thái khác nhau như nước mặn, nước lợ và nước ngọt. Từ đó có thể nói rằng để cây Diếp cá sống và phát triển tươi tốt pH đất nơi trồng cây Diếp cá cũng là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá. 4.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus Qua khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, những dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus trong nghiên cứu có đường kính vòng vô khuẩn khoảng từ 10–33 mm. Có 65/231 dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus. Qua kết quả thống kê của 65 dòng vi khuẩn của nghiên cứu khảo sát bằng các vòng vô khuẩn của các mốc thời gian 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ có thể chia thành 3 nhóm. NhóM 1: Có 20 dòng vi khuẩn nội sinh với những đặc điểm như sau Đường kính vòng vô khuẩn cao và ổn định qua 3 thời điểm, giá trị đường kính vòng vô khuẩn thấp nhất là 20 mm và cao nhất là 33 mm. Đây là những dòng cho hiệu quả cao và ổn định qua 3 thời điểm. Có thể chọn những dòng để làm các bước nghiên cứu tiếp theo. NhóM 2: Có 23 dòng vi khuẩn nội sinh với những đặc điểm như sau Đường kính vòng vô khuẩn dao động từ 15 mm đến 19 mm, các dòng này hiệu quả trung bình và có biến động theo thời gian. NhóM 3: Có 22 dòng vi khuẩn nội sinh với những đặc điểm như sau 20
21. Đường kính vòng vô khuẩn theo thời gian thấp biến thiên từ 10 mm đến 14 mm, các dòng này sẽ cho hiệu quả thấp. Từ đó chọn các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá của nhóm 1 thuộc các tỉnh Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ có hoạt tính kháng khuẩn cao trên vi khuẩn Staphylococcus aureus cho nghiên cứu tiếp theo là giải trình tự và nhận diện Blast N trong cơ sở dữ liệu NCBI. 4.4. Kết quả nhận diện 13 dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn cao trên vi khuẩn Staphylococcus aureus bằng phương pháp giải trình tự vùng 16S rRNA tại 13 địa điểM trong nghiên cứu Mười ba dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn cao trên vi khuẩn Staphylococcus aureus đều thuộc chi Bacillus thể hiện Bảng 4.3. Bảng 4. 3 Kết quả giải trình tự các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá được tuyển chọn tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ Dòng Độ VKNS Kết quả nhận diện dòng vi khuẩn từ tương STT phân lập Blast trên cơ sở dữ liệu NCBI đồng từ cây (%) Diếp cá 1 HTT2 Bacillus amyloliquefaciens strain CD2901 97 2 PQT4 Bacillus megaterium strain 22 97 3 RGT2 Bacillus subtilis strain B237 96 4 MXT9 Bacillus amyloliquefaciens strain JNL 96 5 STL3 Bacillus subtilis strain HB9 96 6 CTL3 Bacillus pumilus HB29 97 7 VCT3 Bacillus velezensis strain JC-K3 97 8 TBT2 Bacillus subtilis JCM 1465 97 9 PTL5 Bacillus amyloliquefaciens MPA 1034 96 10 LXT2 Bacillus megaterium ATCC 14581 97 11 PDT2 Bacillus amyloliquefaciens strain CD2901 98 12 NKT3 Bacillus subtilis strain LPB4 98 13 BTT4 Bacillus megaterium strain 22 96 4.5 Cây phả hệ của các dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 21
22. Cây phả hệ các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá qua phân tích kết quả của 65 dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus so sánh trình tự tương đồng trên các dòng vi khuẩn được xác định thuộc 2 chi là Bacillus và Pseudomonas. Trong chi Pseudomonas có loài Pseudomonas weihenstephanensis được xác định, đối với chi Bacillus có 6 loài được xác định gồm Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus velezensis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus và Bacillus tequylensis ; trong đó chỉ có một dòng thuộc Bacillus pumilus là dòng CTL3 và một dòng thuộc loài Bacillus stequylensis là PDR1. Qua Hình 4.1 cây phả hệ có mối quan hệ di truyền giữa các dòng vi khuẩn dựa vào một phần trình tự 16S rRNA được vẽ bằng phần mềm MEGA-X theo (Kumar et al., 2018) qua phương pháp phân tích Maximum Likelihood với bootstrap 1000 lần, phân tích được thực hiện trên đoạn 817 nucleotide theo thang tỷ lệ thể hiện sự thay đổi nucleotide tương ứng 0.05. 22
23. Hình 4. 1. Cây phả hệ các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus aureus trong nghiên cứu. Xét về vị trí địa lý, nhiều dòng Bacillus sp. ở An Giang và Sóc Trăng trong nghiên cứu này có độ tương đồng cao. Cụ thể, chủng LXT5-AG - B. velezensis xuất hiện cùng nhánh với nhóm B. velezensis thu ở Sóc Trăng gồm MXR2-ST, VCT3-ST và MXT2-ST (với chỉ số bootstrap 68%). Nhóm thuộc B. amyloliquefaciens gồm MXT9-ST, STT2-ST, CTR5-ST có độ tương đồng cao. Đối với nhóm B. megaterium , sự tương đồng của các dòng thu ở Sóc Trăng 23
24. và An Giang rất cao với chỉ số bootstrap 99%, bao gồm các dòng TBT1-AG, PTL6-AG, LXT1-AG, LXT2-AG, CTT3-ST và VCT5- ST. Bên cạnh đó, trong giản đồ có một nhóm cùng là Bacillus subtilis, nằm trên cùng một nhánh nhưng thu ở các tỉnh khác nhau như PTL5-AG, RGT2-KG, và STL3-ST. Tuy nhiên, chỉ số bootstrap của nhánh chỉ 53% nên khả năng các dòng này tương đồng không được chắc chắn. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy ở các tỉnh Kiên giang, Sóc Trăng, An Giang và thành phố Cần Thơ dù có khác về mặt sinh thái, vùng nước mặn hay lợ đến vùng núi cao như ở Tịnh Biên của An Giang nhưng các dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá vẫn không có khác biệt nhiều. 4.6. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của dòng vi khuẩn RGT2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch ngoại bào, dịch nội bào và dịch nuôi tăng sinh của dòng vi khuẩn RGT2 được trình bày trong Bảng 4.4. Kết quả cho thấy dịch nuôi tăng sinh cho đường kính vòng vô khuẩn kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus đạt 32,00 a±1,00 mm, lớn hơn khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với dịch ngoại bào. Bảng 4. 4 Kết quả khảo sát đường kính (mm) vòng vô khuẩn của dịch nội bào, dịch ngoại bào và dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh Đường kính vòng vô khuẩn Dịch vi khuẩn (MM) Dịch ngoại bào 7,67 b±0,58 Dịch nội bào 0,00 c±0,00 Dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn 32,00 a±1,00 Ghi chú: Các giá trị có mẫu tự theo sau trong cùng một cột giống nhau khác biệt không có ý nghĩa ở mức 5%. Dựa trên kết quả khảo sát và những phân tích trên, dịch nuôi tăng sinh của dòng vi khuẩn RGT2 được chọn để ly trích cao chiết với dung môi ethyl acetate. 24
25. 4.7 Kết quả điều chế, định tính và định lượng thành phần hóa học cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 là vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá 4.7.1 Điều chế cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 Từ 4000 mL dung dịch nuôi tăng sinh của dòng RGT2 được chiết lỏng lỏng với 12 lít dung môi ethyl acetate qua quá trình cô đuổi dung môi thu được 0,641 gam cao chiết ethyl acetate. Cao chiết thu được ở trạng thái đặc sệt, có màu vàng đồng và mùi thơm đặc trưng. 4.7.2 Định tính các nhóM hóa học từ cao chiết dịch nuôi dòng vi khuẩn RGT2 Bảng 4. 5 Kết quả khảo sát các nhóm chức có hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 Kết quả NhóM Thuốc thử Hiện tượng cao chức chiết Xuất hiện kết tủa màu vàng đậm đến cam, màu đỏ hoặc H SO + 2 4 đđ xanh dương đỏ, hoặc từ màu Flavonoid cam đến đỏ. 1% NaOH / Xuất hiện màu vàng đến cam- + ethanol đỏ. Polyphenol FeCl 3 5% Dung dịch xanh đen + Alkaloid Dragendorff Kết tủa đỏ nâu - Dung dịch tách lớp, lớp dưới có Salkowski + Steroid màu đỏ đậm Rosenthaler Xuất hiện màu xanh lục nhạt + Saponin Lắc mạnh 1 phút Tạo bọt - Tannin Gelatin mặn Kết tủa bông trắng + Fehling Xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch. + Glycoside Xuất hiện tím đỏ hay nâu ở mặt Keller - killiani + phân cách giữa 2 lớp chất lỏng Ghi chú: dấu (+) có hiện diện Bảng 4.5 trong nghiên cứu này, cao chiết được ly trích từ dòng vi khuẩn RGT2 cũng có chứa những hợp chất thuộc nhóm 25
26. polyphenol, flavonoid, alkaloid, tannin, glycoside và steroid nên cũng sẽ có tiềm năng về hoạt tính sinh học rất cao. Trong các nhóm hợp chất trên, polyphenol và flavonoid được xem là có vai trò quan trọng trong việc quy định hoạt tính kháng khuẩn. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng polyphenol và flavonoid đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động kháng khuẩn và có mối quan hệ mật thiết với các hoạt tính sinh học khác (Shah et al., 2018). Do đó, Từ nghiên cứu này đã tiến hành định lượng polyphenol và flavonoid. 4.7.3 Định lượng hàM lượng polyphenol tổng và flavonoid toàn phần từ cao chiết dịch nuôi dòng vi khuẩn RGT2 Trên cơ sở các đường chuẩn này, kết quả hàm lượng polyphenol tổng (TPC) và flavonoid toàn phần (TFC) trong cao chiết được xác định có giá trị lần lượt là 39,54 mg GAE/g cao chiết và 330,03 mg QE/g cao chiết được trình bày theo Bảng 4.6. Như vậy dựa trên những nghiên cứu trước đây có thể giải thích rằng khả năng kháng khuẩn của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 không chỉ phụ thuộc vào hàm lượng polyphenol và flavonoid mà còn phụ thuộc chính vào thành phần polyphenol, flavonoid mà các cao chiết này sở hữu. Bảng 4. 6 Kết quả hàm lượng polyphenol và flavonoid của cao chiết Thành phần định lượng Phương trình tuyến tính HàM lượng y = 0,0918x + 0,0487 TPC (mg GAE/g cao chiết) 39,54±2,50 (R² = 0,9862) y = 0,0052x – 0,0087 TFC (mg QE/g cao chiết) 330,03±11,55 (R² = 0,989) Nói chung, vai trò thiết yếu của flavonoid trên liên quan đến bệnh như bệnh nhiễm khuẩn. Các flavonoid tác động đến vị trí đang bị viêm bằng cách tác động đến các tế bào viêm, giải phóng ROS, RNS và các cytokine tiền viêm để loại bỏ mầm bệnh ngoại lai trong đó có vi khuẩn và sửa chữa các mô bị thương (Sulistiyani et al., 2019). 26
27. 4.8 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 Thí nghiệm tiến hành thăm dò khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 ở các nồng độ 80, 160, 320, 640 và 1280 µg/mL. Hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của cao chiết và kháng sinh được minh họa trong Hình 4.2. Hình 4. 2 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 và vancomycin Đường kính vòng vô khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus thử nghiệm thì vancomycin có vòng vô khuẩn lớn hơn cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2. Nhưng cũng từ đó cho thấy cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng RGT2 có hoạt tính kháng khuẩn cũng tốt trên vi khuẩn Staphylococcus aureus như không bằng vancomycin. 4.9 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2. Xác định dựa vào nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) (Mak et al., 2013). Chất chỉ thị màu resazurin có màu xanh trong dung dịch, các giếng có sự đổi màu của dung dịch resazurin từ màu xanh chuyển sang màu hồng cho thấy có sự tăng trưởng của vi khuẩn trong giếng. Kết quả được thể hiện trong Bảng 4.8. 27
28. Bảng 4. 8 Nồng độ ức chế và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của cao chiết và vancomycin Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) (µg/ML) (µg/ML) Cao chiết Vancomycin Cao chiết Vancomycin 80<MIC≤160 MIC<80 640<MBC≤1280 160<MBC≤320 Theo Hình 4.3 cho thấy ở các giếng không có sự hiện diện của cao chiết hoặc kháng sinh vancomycin mà chỉ có môi trường PDA lỏng, nước muối sinh lý và DMSO 10% sử dụng làm các dung môi, môi trường không ảnh hưởng trong quá trình thí nghiệm, thì các giếng từ màu xanh đều chuyển sang màu hồng. Cao chiết được sử dụng ở nồng độ 160 µg/mL làm cho dung dịch trong giếng có màu xanh tím, điều này chứng minh được rằng bắt đầu từ nồng độ 160 µg/mL vi khuẩn Staphylococcus aureus đã bị ức chế hoàn toàn. Từ đây, nghiên cứu đã xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 đối với dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus dao động từ 80 đến 160 µg/mL. Hình 4. 3 Thử nghiệm cao chiết và kháng sinh vancomycin với thuốc thử resazurin Ghi chú: 1-Giếng chỉ có vi khuẩn, DMSO 10% và resazurin; 2-Giếng chỉ có vi khuẩn, môi trường PDA, nước muối sinh lý và resazurin; 3-Giếng chỉ có vi khuẩn, cao chiết hoặc kháng sinh nồng độ 80 µg/Lvà resazurin; 4-Giếng chỉ có 28
29. vi khuẩn, cao chiết hoặc kháng sinh nồng độ 160 µg/Lvà resazurin; 5-Giếng chỉ có vi khuẩn, cao chiết hoặc kháng sinh nồng độ 320 µg/Lvà resazurin; 6-Giếng chỉ có vi khuẩn, cao chiết hoặc kháng sinh nồng độ 640 µg/Lvà resazurin; 7- Giếng chỉ có vi khuẩn, cao chiết hoặc kháng sinh nồng độ 1280 µg/Lvà resazurin. Dựa vào kết quả khảo sát giá trị MIC, nghiên cứu tiếp tục khảo sát nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết thông qua việc kiểm tra sự tái sinh của vi khuẩn Staphylococcus aureus từ nồng độ 160 µg/mL (giếng đầu tiên có màu xanh), 320, 640, 1280, 2560, 5120 và 10240 µg/mL. bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt sau. Từ việc quan sát sự tái sinh lại của vi khuẩn Staphylococcus aureus trên môi trường thạch PDA như mô tả trong Hình 4.3 có thể xác định được nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của cao chiết. Dựa vào Hình 4.4 có thể thấy rằng vi khuẩn Staphylococcus aureus vẫn phát triển được trên môi trường thạch PDA ở nồng độ cao chiết 640 µg/mL (4A), khi tăng nồng độ cao chiết lên 1280 µg/mL (5A) thì không phát hiện bất kỳ khuẩn lạc nào xuất hiện. Điều này chứng tỏ ở nồng độ cao chiết 1280 µg/mL vi khuẩn Staphylococcus aureus đã bị tiêu diệt hoàn toàn. Từ đó nghiên cứu xác định được nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của cao chiết được ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 dao động từ 640 đến 1280 µg/mL. Tương tự như cao chiết, kháng sinh vancomycin cũng được khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu thể hiện Hình 4.4. Như vậy, kháng sinh vancomycin có nồng độ ức chế tối thiểu trên vi khuẩn Staphylococcus aureus thấp hơn 80µg/mL. Hình 4. 4 Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 và vancomycin 29
30. Ghi chú: A-Cao chiết; B-Kháng sinh vancomycin. 1-Nồng độ cao chiết 0 µg/mL, 2-Nồng độ cao chiết 160 µg/mL; 3-Nồng độ cao chiết 320 µg/mL; 4- Nồng độ cao chiết 640 µg/mL; 5-Nồng độ cao chiết 1280 µg/mL; 6-Nồng độ cao chiết 2560 µg/mL; 7-Nồng độ cao chiết 5120 µg/mL; 8-Nồng độ cao chiết 10240 µg/mL. 1’-Nồng độ kháng sinh 0 µg/mL; 2’-Nồng độ kháng sinh 80 µg/mL; 3’- Nồng độ kháng sinh 160 µg/mL; 4’-Nồng độ kháng sinh 320 µg/mL; 5’-Nồng độ kháng sinh 640 µg/mL; 6’-Nồng độ kháng sinh 1280 µg/mL; 7’-Nồng độ kháng sinh 2560 µg/mL; 8’-Nồng độ kháng sinh 5120 µg/mL. Như trình bày trong Hình 4.4, kháng sinh vancomycin làm chết hoàn toàn vi khuẩn Staphylococcus aureus từ nồng độ 320 µg/mL (4’B), thì không phát hiện bất kỳ khuẩn lạc nào xuất hiện Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) được xác định là dao động từ 160 đến 320 µg/mL. 4.10 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2. Hoạt tính kháng oxy hóa ngoài được đánh giá dựa trên hiệu suất trung hòa, hàm lượng chất kháng oxy hóa tương đương µg/mL trolox thì còn được đánh giá dựa vào nồng độ trung hòa hoặc khử 50% gốc tự do (EC 50 - effective concentration of 50%) được trình bày trong Bảng 4.9 Bảng 4.9 Nồng độ trung hòa và khử được 50% gốc tự do của cao chiết Mẫu Giá trị EC 50 (µg/ML) thử ABTS •+ DPPH RP TAC FRAP Cao 57,01±0,50 57,38±2,30 32,00±0,37 94,80±3,16 41,41±0,31 chiết Trolox 2,40±0,02 7,22±0,17 3,05±0,27 2,32±0,08 1,57±0,01 Từ kết quả Bảng 4.9 cho thấy cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 có khả năng kháng oxy hóa đa dạng trên nhiều gốc tự do khác nhau với giá trị EC 50 dao động từ 32,00 µg/mL ở phương pháp RP đến 94,80 µg/mL ở phương pháp TAC. Như vậy, cao chiết trong nghiên cứu này được đánh giá là có năng lực khử mạnh. Tuy nhiên, hoạt động kháng oxy hóa của cao chiết ở tất cả các phương pháp đều yếu hơn tinh chất trolox. 4.11 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng viêM của cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) ở cây Diếp cá. 30
31. Giá trị IC 50 của cao chiết ức chế sự biến tính albumin huyết thanh bò được trình bày trong Bảng 4.10. Bảng 4. 10 Hoạt tính kháng viêm của cao chiết và chất chuẩn Diclofenac Mẫu thử Phương trình tuyến tính Giá trị IC 50 (µg/ML) Cao chiết y = 0,6299x + 3,5568 (R² = 0,9857) 73,74 a±1,77 Diclofenac y = 2,7461x + 6,6576 (R² = 0,9747) 15,79e±0,55 Ghi chú: Các giá trị có mẫu tự theo sau trong cùng một cột giống nhau khác biệt không có ý nghĩa ở mức 5%. Dựa vào kết quả được trình bày trong Bảng 4.10 có thể thấy rằng, khả năng ức chế sự biến tính albumin huyết thanh bò của cao chiết ly trích từ dòng RGT2 (IC 50 =73,74 µg/mL) cao hơn diclofenac (IC 50 =15,79 µg/mL) 4,67 lần. Qua kết quả nghiên cứu và so sánh trên thấy rằng cao chiết có tiềm năng kháng viêm in vitro bằng phương pháp ức chế sự biến tính protein albumin huyết thanh bò. Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Hai trăm ba mươi mốt dòng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ lá, thân và rễ. Cây Diếp cá được trồng tại các vùng sinh thái như nước mặn, nước lợ và nước ngọt hay biển đảo, núi cao và đồng bằng thể hiện ở Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ phân lập đều có các dòng vi khuẩn nội sinh. Phân lập được 65/231 dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn tốt trên vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người đã được xác định. Trong đó có 13/65 dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trên dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus với vòng vô khuẩn từ 20– 33 mm, tất cả đều thuộc chi Bacillus . Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh (24 giờ) dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus dao động từ 80 đến 160 µg/mL. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) 31
32. của cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh (24 giờ) dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus dao động từ 640 đến 1280 µg/mL. Cao chiết ly trích từ dịch nuôi tăng sinh (24 giờ) dòng vi khuẩn (RGT2) ở cây Diếp cá, khảo sát in vitro cũng cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa và kháng viêm. Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết được xác định thông qua các phương pháp trung hòa gốc tự do •+ DPPH; ABTS ; RP; TAC và FRAP với giá trị EC 50 lần lược là 57,38 µg/mL; 57,01 µg/mL; 32,00 µg/mL; 94,80 µg/mL và 41,41 µg/mL. Hoạt tính kháng viêm cao chiết được khảo sát dựa trên hoạt động ức chế sự biến tính của albumin huyết thanh bò. Cao chiết có khả năng ức chế 50% sự biến tính ở nồng độ 73,74µg/mL. Kết quả nghiên cứu cho thấy dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) ở cây Diếp cá không chỉ có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus mà còn có khả năng kháng oxy hóa, kháng viêm. Kết quả này có tiềm năng trong lĩnh vực điều trị các bệnh lý cho con người về mụn nhọt và nhiễm khuẩn da do vi khuẩn Staphylococcus aureus. 5.2 Đề xuất Khảo sát thêm các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá khác có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus . Tiếp tục nghiên cứu cao chiết từ dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá để tìm ra hợp chất hóa học có tính kháng khuẩn trên dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus và thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa, kháng viêm trên lâm sàng trước khi ứng dụng vào thực tiễn. 32