Phát triển sinh khối vi rút nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

Nội dung tài liệu: Phát triển sinh khối vi rút nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THANH HẢI HÀ PH¸T TRIÓN SINH KhèI Virus NH¢N §A DIÖN (NPV) TR£N TÕ BµO S¢U KHOANG PHôC Vô S¶N XUÊT THUèC TRõ S¢U SINH HäC Ngành : Công nghệ Sinh học Mã số : 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2020
2. Công trình được hoàn thành tại TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Hoàng Đình Hoà PGS.TS. Lê Văn Trịnh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá Luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi giờ phút ngày tháng năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Quốc gia Việt Nam 2. Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
3. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu Sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) là một trong số các đối tượng sâu hại quan trọng trên các cây trồng cạn, phân bố rộng ở nhiều nước thuộc khu vực nhiệt đới và á nhiệt đới. Đây là một loài sâu ăn tạp, có thể sống và gây hại trên 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau (Kumari và Singh, 2009; Hong, 2002). Ở Việt Nam, sâu khoang thường phát sinh phá hại nặng trên nhiều loại cây trồng, điển hình như các loại rau họ Thập tự, cà chua, nho, đậu tương, lạc, v.v. (Viện Bảo vệ thực vật, 2003). Để bảo vệ khỏi tác hại do sâu khoang, nông dân thường sử dụng nhiều loại thuốc hóa học bảo vệ thực vật với liều lượng cao, để lại tồn dư độc hại trong sản phẩm gây độc hại đáng kể đối với sức khỏe người sản xuất và tiêu dùng sản phẩm, ô nhiễm môi trường và tổn hại đến quần thể các loài sinh vật có ích trên đồng ruộng. Trên đồng ruộng, sâu khoang thường bị chết do virus nhân đa diện (NPV), là loài rất chuyên tính và có hiệu quả gây chết cao đối với sâu khoang, không lây nhiễm trên các loài không phải là ký chủ (Kitajima, 1989; Kamakoff và Ward, 2007). Vì vậy, việc nghiên cứu khả năng phát triển sinh khối NPV trên tế bào phục vụ sản xuất chế phẩm NPV là cần thiết. Lâu nay, việc phát triển sinh khối NPV vẫn theo phương pháp thủ công với qui mô nhỏ hẹp nên không thể sản xuất qui mô công nghiệp. Để có thể tạo được khối lượng lớn sinh khối NPV, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng để sản xuất chế phẩm NPV (Granados và Blissard, 2007; Goodman, 2008; Elanchezyan, 2009). Để đóng góp tư liệu khoa học về tiềm năng và khả năng nhân sinh khối NPV trên tế bào nuôi nhân, làm cơ sở cho việc phát triển chế phẩm sinh học phục vụ phòng trừ sâu hại ở nước ta, việc thực hiện đề tài: “Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học“ là vấn đề cần thiết nhằm đáp ứng yêu cầu của thực tiễn sản xuất nông nghiệp. 2. Mục đích, yêu cầu cần đạt của đề tài 2.1. Mục đích - Trên cơ sở đánh giá tiềm năng ký sinh tự nhiên, tiến hành tuyển chọn chủng vi rút nhân đa diện (NPV) có hoạt lực cao trong phòng chống sâu khoang. 1
4. - Xác định được kỹ thuật nuôi nhân tế bào sâu khoang và lây nhiễm phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại. 2.2. Yêu cầu cần đạt - Đánh giá được khả năng gây chết sâu khoang ngoài tự nhiên, thu thập và tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang. - Nghiên cứu xác định được điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV trên tế bào nuôi nhân. - Thử nghiệm phát triển được chế phẩm virus nhân đa diện (NPV) sâu khoang dạng bột thấm nước có hiệu quả cao phòng trừ sâu khoang hại cây trồng. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học - Các dẫn liệu đánh giá tiềm năng gây chết sâu khoang của NPV trên đồng ruộng và tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao có ý nghĩa to lớn trong định hướng khai thác, sử dụng NPV để quản lý sâu hại cây trồng nông nghiệp. - Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào sẽ góp phần làm sáng tỏ tiềm năng ứng dụng trong phát triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học. - Kết quả nghiên cứu tinh sạch thể vùi (OB) của NPV sâu khoang, thử nghiệm tạo chế phẩm sinh học NPV dạng bột thấm nước có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng làm cơ sở định hướng tiêu chuẩn hoá chất lượng chế phẩm sinh học dựa trên số lượng thể vùi sau khi sản xuất. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả điều tra, thu thập và tuyển chọn 3 chủng NPV có tiềm năng cao trong phát sinh thể vùi và gây chết sâu khoang phục vụ phát triển chế phẩm sinh học. Với kết quả phát triển được 2 chế phẩm NPV có hiệu lực trừ sâu cao sẽ góp phần định hướng xây dựng qui trình sản xuất và sử dụng chế phẩm để phòng trừ sâu khoang, nhằm hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất nông sản an toàn và bảo vệ môi trường đồng ruộng. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng nghiên cứu - NPV sâu khoang: Được thu thập, phân lập và tuyển chọn từ sâu non sâu khoang chết do NPV ngoài đồng ruộng. 2
5. - Tế bào sâu khoang: Do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp, là dòng tế bào phát triển từ tế bào gốc của mô phôi sâu khoang, đã được nuôi nhân qua 135 chu kỳ. - Sâu non sâu khoang: Được nuôi nhân bằng lá bắp cải sạch. 4.2. Phạm vi nghiên cứu - Đánh giá tiềm năng gây chết sâu khoang của NPV trên bắp cải, lạc, đậu tương và khoai sọ ngoài đồng ruộng. Thu thập và tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang. - Xác định điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang - Điều kiện lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV trên tế bào sâu khoang. - Kỹ thuật tinh sạch thể vùi, tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước. 5. Những đóng góp mới của luận án - Lần đầu tiên cung cấp các dẫn liệu khoa học có hệ thống về khả năng phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) trên tế bào, phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học tại Việt Nam. - Bổ sung các dẫn liệu khoa học mới về mức độ phổ biến của NPV trên sâu khoang hại bắp cải, lạc, đậu tương và khoai sọ. Phân lập, tuyển chọn được 3 chủng NPV có tiềm năng (TL.1a; TL.2a; TL.3a), trong số đó TL.1a có hoạt lực cao nhất trong gây chết sâu khoang (80%) và hình thành thể vùi (2,6 x 108 OB/10sâu). - Bước đầu xác định được kỹ thuật tinh sạch thể vùi NPV. Phát triển được 2 chế phẩm sinh học NPV dạng bột thấm nước (NPV-1 và NPV-2) có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu khoang hại trên bắp cải (80,51- 82,29%) và đậu tương (96,92%). 6. Cấu trúc luận án Luận án gồm 142 trang, với các phần: mở đầu, nội dung (gồm 3 chương), kết luận và đề nghị, với 33 bảng số liệu và 14 hình. Tham khảo 121 tài liệu, trong đó có 19 tài tiếng Việt và 102 tài liệu tiếng Anh. CHƯƠNG 1 CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu Virus nhân đa diện (NPV) thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ khá cao và luôn tồn tại dưới dạng thể vùi (OB), các thể vùi có thể tồn tại tới 30 năm ngoài tự nhiên (Grzywacz et al.,1996). Khi sâu non ăn phải thức ăn có thể vùi NPV, gặp pH 3
6. cao của ruột giữa làm vỏ protein của thể vùi bị phá vỡ, giải phóng các thể hoạt động (virion) xâm nhiễm vào nhu mô ruột giữa. Sau đó lây nhiễm sang các mô bào khác của cơ thể. Sau 2-3 ngày sâu ngừng ăn và chết sau 5- 7 ngày (Sajap et al., 2000). Tuy nhiên, NPV chỉ có thể lây nhiễm và phát triển sinh khối trong các mô, tế bào sống của cơ thể côn trùng. (Kalmakoff và Ward, 2007; Elanchezhyan, 2009; Granados et al., 2007; Agathos et al., 2007). Vì vậy, cần nghiên cứu và có sự hiểu biết đầy đủ về điều kiện phát triển sinh khối tế bào côn trùng, lây nhiễm NPV trên tế bào trên cơ sở sử dụng các chủng NPV có hoạt lực cao đã được tuyển chọn để phát triển sinh khối NPV phục vụ phát triển thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại (Elanchezhyan, 2009). 1.2. Tổng quan tài liệu 1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 1.2.1.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng Sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius; Noctuidae: Lepidoptera) là đối tượng sâu hại quan trọng trong sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước trên thế giới (Kumari và Singh, 2009; Hong, 2002, Jadhav et al, 2015, Cherry et al., 2000). Sâu có thời gian phát dục khá dài, khả năng sinh sản lớn, nên dễ phát sinh gây hại nặng cho cây trồng (Hong, 2002, Nagamandla và Shantanu, 2018). 1.2.1.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại Virus nhân đa diện (NPV) là nhóm virus lớn và có hiệu quả gây chết cao đối với các loài côn trùng. Đặc biệt, các loài NPV rất chuyên tính và hoàn toàn không lây nhiễm trên các loài động vật có xương sống, chúng tồn tại dưới dạng các thể vùi (OB) có kích thước 1-7µm và khối lượng phân tử khoảng 25- 30 kDa. Chúng là những tác nhân sinh học rất hữu ích trong phòng trừ sâu hại cây trồng. (Farrar et al., 1999). 1.2.1.3. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng Lynn (2002) đã tổng kết thành qui trình chung cho việc nhân sinh khối tế bào côn trùng qua 11 công đoạn với các yêu cầu cụ thể khác nhau cho từng công đoạn nuôi nhân, các loại vật liệu và thiết bị, các bước thực hiện phát triển sinh khối tế bào. Kết quả nghiên cứu triển sinh khối tế bào côn trùng đã được thể hiện qua các công bố của nhiều nhà khoa học (Granados et al., 2007, Lynn, 2002, Weiss et al., 1981, 1996, Sudeep et al., 2005 và Murhammer, 2007, v.v. ). 4
7. 1.2.1.4. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối của tế bào côn trùng Elanchezhyan (2009) và nhiều tác giả khác chỉ rõ các yếu tố quan trọng có liên quan đến nhân nuôi thành công tế bào côn trùng, như: chủng loại môi trường, huyết thanh, nhiệt độ và pH môi trường nhân nuôi, v.v. Các nghiên cứu về điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào đã được thể hiện qua các công trình của Mishuhashi (1994); Bhutia et al. (2012); Lynn, (2003); Agathos (2007); Granados et al. (2007); Segura và Felio (2012) v.v. 1.2.1.5. Nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi Các tác giả đều chỉ rõ để lây nhiễm NPV trên tế bào côn trùng nuôi nhân có hiệu quả cần quan tâm nghiên cứu làm rõ các điều kiện thích hợp cho lây nhiễm dựa trên chỉ số MOI, môi trường, huyết thanh, nhiệt độ và pH môi trường , v.v. Nhiều nghiên cứu công bố về vấn đề này thể hiện qua các công trình của Mclntosh et al. (2003); Demir et al. (2009); Knudson et al. (1974); Petchprakob et al. (2007); Jakubowska et al. (2009) và nhiều tác giả khác. 1.2.1.6. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV Kanokwan et al. (2004) đã thực hiện tinh sạch thể vùi tinh bằng cách ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút để loại bỏ môi trường nuôi nhân, sau đó ly tâm lại bằng nước cất. Tipadee et al., (1988) tinh sạch thể vùi NPV sâu xanh áp dụng phương pháp ly tâm tốc độ 2500 vòng/phút trong 10 phút, sau đó 16.000 vòng/phút trong 90 phút. Theo Shapiro et al. (2008), các thành phần như Bentonite, Kaolin, bột tan và khoáng sét thường được sử dụng để tạo chế phẩm dạng bột thấm nước. Mushobozi et al. (2004) xác định công nghệ đơn giản nhất để tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước là sử dụng kaolin hoặc khoáng sét được nghiền với độ mịn để phun rải dễ dàng khi pha loãng. Theo Grzywacz, et al. (1996), chế phẩm phải đảm bảo tổng lượng thể vùi phun rải cho 1 ha cây trồng đạt từ 9 x 1010 đến 1 x 1012 OB/ha. 1.2.2. Nghiên cứu ở trong nước 1.2.2.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng Sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius; Noctuidae: Lepidoptera) là sâu hại quan trọng trên các cây trồng cạn đã được một số cơ quan, nhà khoa học quan tâm nghiên cứu từ những năm 1970. Các công trình nghiên cứu đã công bố tập trung vào đặc điểm sinh học, sinh thái học và biện pháp phòng trừ sâu khoang bằng thuốc hoá 5
8. học và các biện pháp canh tác, như: Viện Bảo vệ thực vật (2000, 2001, 2003, 2006), Nguyễn Duy Nhất (1970), Lê Văn Trịnh (1996), v.v. 1.2.2.2. Nghiên cứu NPV trên sâu hại Việc điều tra tiềm năng gây chết sâu hại của NPV và phân lập tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực trừ sâu cao đã được thể hiện qua các công trình công bố của các tác giả Nguyễn Văn Cảm et al. (1996), Trương Thanh Giản et al. (1996), Hoàng Thị Việt et al. (2002), Trịnh Thị Xuân (2016), Trần Văn Hai (2010), v.v. 1.2.2.3. Nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng Hoạt động nghiên cứu tế bào côn trùng ở Việt Nam mới chỉ bắt đầu từ năm 2011 với công trình công bố của Lê Văn Trịnh và Lê Thanh Hải Hà (2011) trong việc phát triển dòng tế bào sâu khoang. 1.2.2.4. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV Việc phát triển sinh khối NPV bằng cách lây nhiễm virus trên sâu hại, được nêu rõ trong các công trình nghiên cứu của Nguyễn Văn Cảm et al. (1996), Trương Thanh Giản et al. (1996), Hoàng Thị Việt et al. (2000) và Nguyễn Thị Hai (2005), v.v. 1.2.2.5. Nghiên cứu tạo dạng và sử dụng chế phẩm NPV phòng trừ sâu hại Việc tạo chế phẩm dạng dịch thể và bột khô nghiền từ sâu non chết bệnh đã được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu thể hiện qua các công trình đã công bố của các tác giả Nguyễn Văn Cảm et al. (1996); Trương Thanh Giản et al. (1996), v.v. Nhận xét chung: Virus nhân đa diện (NPV) là tác nhân sinh học hữu ích, phổ biến trên đồng ruộng và có tiềm năng cao trong phòng trừ sâu hại, được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Ở nước ngoài, việc nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng, phát triển sinh khối virus để phòng trừ sâu hại đã thực hiện với các qui mô khác nhau. Tại Việt Nam, chủ yếu tập trung nghiên cứu và phát triển sinh khối NPV bằng cách lây nhiễm NPV trên sâu non rồi nghiền, lọc tạo chế phẩm vào những năm 1990- 2005. Vì vậy, việc nghiên cứu nuôi nhân tế bào, tuyển chọn chủng virus nhân đa diện (NPV) có hoạt lực cao để lây nhiễm trên tế bào nhân nuôi, sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ sâu hại là yêu cầu cấp thiết, có tính thời sự trong sản xuất nông sản an toàn, hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hoá học, góp phần bảo vệ môi trường sinh thái ở nước ta. 6
9. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu - Các loại môi trường nuôi nhân tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV do công ty Invitrogen Life Technologies cung cấp, như: Excell 420- 14419C serum free (Sigma), Schneider (Sigma), TC - 100 BML-TC/10 (Sigma), TNM- FH (Sigma), IPL-41 (Sigma), Grace (Gibco), huyết thanh Fetal Bovine Serum (FBS) (Gibco), Photphatse Buffer Saline pH 7,2 (1X) (PBS) (Gibco), Trypan blue 0.4%, Trypsin- EDTA 10X (Gibco), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), Tryphto broth, và các loại kháng sinh, v.v. 2.1.2. Dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu: - Các dụng cụ nuôi nhân tế bào: bình cổ vếch có nắp lọc khuẩn loại 25cm2, 75 cm2, 250 cm2, 250ml và 1000ml (Corning SPL- Hàn Quốc). Hộp nhân nuôi, đánh giá tế bào Multiple Well Plates loại 12 giếng (Corning- Mỹ), v.v. - Dụng cụ, vật liệu nuôi sâu sâu khoang: lồng nuôi sâu, chậu nhựa, đĩa petri, bô can, ống tuýp, pank, kéo, chổi lông, giấy thấm và bông thấm nước, v.v. - Các trang thiết bị phục vụ nghiên cứu: buồng cấy vô trùng, máy lắc N-Biotek (Hàn Quốc), máy ly tâm từ 3000- 9.000 vòng/phút, tủ nuôi tế bào Binder (Mỹ), tủ lạnh sâu -960C và kính hiển vi soi nổi Zeiss (Đức), v.v. 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.2.1. Địa điểm nghiên cứu Các thí nghiệm trong phòng được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Đấu tranh Sinh học (Viện Bảo vệ thực vật), phường Đức Thắng, Bắc Từ Liêm, Hà Nội. Các thí nghiệm đồng ruộng tiến hành tại Đông Anh và Mỹ Đức (Hà Nội). 2.2.2. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 9/2014 đến tháng 12/2019 2.3. Nội dung nghiên cứu 1- Điều tra, thu thập và tuyển chọn chủng NPV sâu khoang có hoạt lực cao 2- Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân 3- Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 7
10. 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn NPV sâu khoang Theo phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật của Viện Bảo vệ thực vật (1997) và QCVN 01-38:2010/BNNPTNT. Phân lập tuyển chọn chủng NPV theo phương pháp của Grzywacz et al. (1996). Tiến hành điều tra, thu thập sâu khoang trên bắp cải và lạc tại Đông Anh (Hà Nội), lạc và khoai sọ tại Yên Phong (Bắc Ninh). Sâu thu được đem về phòng đánh giá và phân lập, tuyển chọn chủng NPV. Trong quá trình phân lập kết hợp với xác định hiệu quả gây chết sâu khoang và khả năng sinh thể vùi của virus. Từ đó lựa chọn chủng có tiềm năng phục vụ các nghiên cứu tiếp theo. 2.4.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân 2.4.2. 1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang Theo phương pháp của các tác giả Lynn và Shapiro (1998), Lynn (2002) và qui trình hướng dẫn của Invitrogen Life Technologies (2002). Đề tài tập trung nghiên cứu xác định điều kiện thích hợp để phát triển sinh khối tế bào sâu khoang như: chủng loại môi trường, pH, nhiệt độ, tỷ lệ bổ sung huyết thanh FBS. Xác định khả năng phát triển sinh khối tế bào ở điều kiện thích hợp, khi nhân nuôi với lượng 150ml môi trường trên bình cổ vếch 250ml và 750ml môi trường trên loại bình nuôi nhân có dung tích 1 lít. 2.4.2.2. Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang trên tế bào nhân nuôi - Phá vỡ vỏ bọc protein của thể vùi để giải phóng thể hoạt động của vi rút theo phương pháp của Tipvadee et al. (1988). Lây nhiễm NPV trên tế bào theo phương pháp của Lynn (1998; 2003), Grzywacz et al. (1996), v.v. Các thí nghiệm xác định khả năng lây nhiễm tạo thể vùi NPV sâu khoang, như: chỉ số lây nhiễm MOI, mật độ tế bào, môi trường, pH, nhiệt độ, tỷ lệ bổ sung huyết thanh FBS. Đánh giá hiệu quả gây chết sâu khoang của các chủng NPV được nhân sinh khối trên tế bào. - Xác định mật độ tế bào và số lượng thể vùi theo phương pháp của Lynn (2002) bằng cách đếm trên buồng đếm hồng cầu Neubauer dưới kính hiển vi. - Giải trình tự gen của NPV theo phương pháp phân tích PCR và so sánh với ngân hàng Genbank của Maeda et al. (1990). 8
11. 2.4.3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước 2.4.3.1. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sau lây nhiễm trên tế bào Tinh sạch thể vùi NPV bằng cách ly tâm dựa theo phương pháp của các tác giả Shapiro và Shepard (2007), Kanokwan et al. (2004) và Sajap et al. (2000). 2.4.3.2. Nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước Phát triển chế phẩm dạng bột thấm nước tiến hành dựa theo phương pháp của Shapiro et al. (2008) và Cisneros et al. (2002) với thành phần phụ gia gồm 60% bột tan và 40% bột khoáng sét. 2.4.3.3. Đánh giá hiệu lực gây chết sâu khoang của chế phẩm tạo được Theo phương pháp nghiên cứu đánh giá sâu, bệnh, cỏ dại và chuột hại cây trồng của Viện Bảo vệ thực vật (2000) và TCVN 12561:2018. Thí nghiệm tiến hành qua các bước trong phòng thí nghiệm, ngoài nhà lưới và trên đồng ruộng. 2.5. Phương pháp tính toán, xử lý số liệu Xử lý số liệu theo chương trình Irristat 4.0 và Statistix 8.2 trên Excel. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn NPV trên sâu khoang 3.1.1. Mức độ phổ biến và khả năng gây chết sâu khoang của NPV ngoài đồng Qua 2 đợt điều tra trên bắp cải, lạc, đậu tương và khoai sọ, mật độ sâu khoang phát sinh trên đậu tương: 2,71 con/m2, lạc: 1,65 con/m2, bắp cải: 1,52 con/m2 và khoai sọ: 0,93 con/m2. Trong đó, sâu trên bắp cải có tỷ lệ nhiễm NPV tới 21,67%, đậu tương:14,22%, lạc; 15,77% và trên khoai sọ là 16,82%. Hình 3.1. Triệu chứng sâu non sâu khoang chết do NPV trên lạc và bắp cải 9
12. Độ bắt gặp trên bắp cải có sâu chết bệnh chiếm 46,67% số điểm điều tra, trong đó 31,11% số điểm sâu chết có thể vùi NPV với mức độ phổ biến là ++, số liệu tương ứng trên đậu tương là 53,33 (mức độ phổ biến+++) và 37,78% (++), trên lạc: 57,78 (+++) và 48,89% (++) và khoai sọ có 36,67 (++) và 26,67% số điểm điều tra với mức độ phổ biến ++. Triệu chứng sâu khoang chết do NPV thể hiện qua Hình 3.1. 3.1.2. Phân lập, tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao Sau 4 chu kỳ phân lập đã chọn lọc được 3 chủng virus nhân đa diện (NPV) có tiềm năng cao, gồm các chủng có ký hiệu: TL.1a; TL.2a và TL3a có khả năng sinh thể vùi tương ứng đạt 2,9; 1,8 và 2,8 x 108 OB/10 sâu, hiệu lực gây chết sâu khoang đạt tương ứng 80,0; 80,56 và 80,0% (Bảng 3.5). Cả 3 chủng đã được lưu giữ, riêng chủng TL.1a được lựa chọn sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo do khả năng sinh thể vùi và hiệu quả gây chết sâu khoang cao và ổn định qua các chu kỳ phân lập, tuyển chọn. Bảng 3.5. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang của các chủng NPV đã được lựa chọn TT Chủng lựa chọn Ký hiệu Số thể vùi hình thành Hiệu quả sau phân lập chủng (x 108 OB/10 sâu) trừ sâu (%) 1 NPV1.3.1.1.2 TL.1a 2,9 80,00 a 2 NPV2.1.1.1.3 TL.2a 1,8 68,33 c 3 NPV3.1.1.1.3 TL.3a 2,8 73,33 b CV% - - - LSD 0,05 - - 0.71 Ghi chú: OB: thể vùi Hình 3.2. Thể vùi NPV màu trắng hình thành và lắng đọng dưới đáy ống nghiệm khi kiểm tra sâu khoang nhiễm NPV 10
13. Đánh giá hiệu quả gây chết sâu khoang và hàm lượng thể vùi hình thành của các chủng NPV được lựa chọn, xác định chủng TL.1a có hiệu lực gây chết sâu 80,0% và số lượng thể vùi hình thành đạt 2,0 x 108 OB/10 sâu vào 10 ngày sau lây nhiễm (NSLN). Chủng TL.3a đạt tương ứng là 73,33% và 1,85 x 108 OB/10 sâu, chủng TL.2a đạt 68,33% và 1,60 x 108 OB/10 sâu (tương ứng). Virion A B Hình 3.4. Hình 3.4. Thể thể vùi (OB) và thể hoạt động (virion) của chủng TL.1a A: Thể vùi (OB) với độ phóng đại 2000X B: Thể virus hoạt động (virion) với độ phóng đại 25.000X Kết quả ảnh chụp thể vùi (OB) dưới kính hiển vi với độ phóng đại 600X cho thấy rõ (Hỉnh 3.4), thể vùi (OB) có hình dạng hình khối không đều và nổi rõ các thể hoạt động (virion) ở bên trong, có kích thước 150 x 350nm. Thể hoạt động (virion) của NPV chụp dưới hiển vi điện tử (TEM) tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (Hà Nội), thể hoạt động (virion) với độ phóng đại 25.000X của chủng TL.1a có dạng hình trụ với kích thước 44,7 nm x 341nm. Kết quả quan sát tương tự như với kết quả đã công bố của nhiều tác giả đã công bố, kích thước thể vùi (OB) thường nằm trong khoảng 240 x 400nm và của thể hoạt động (virion) từ 40- 70 x 320- 450nm. 3.2. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi 3.2.1. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang 3.2.1.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang - Xác định môi trường thích hợp nuôi nhân tế bào Trong số 4 loại môi trường thí nghiệm, sinh khối tế bào phát triển tốt nhất trên môi trường Ex-Cell 420-14491C, sau 2 ngày nuôi nhân mật độ tế bào đạt tới 1,394x 1010 tế bào/ml. Đến 6 ngày sau nuôi nhân, mật độ tế bào đạt cao nhất tới 1,884 x 1010 tế bào/ml, ở 10 NSNN, mật độ tế bào vẫn đạt 1,630 x 1010 tế bào/ml. 11
14. - Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi nhân tế bào Với hàm lượng tế bào ban đầu 0,5 x 1010 tế bào/ml nuôi nhân ở các mức nhiệt độ 24, 26, 28 và 290C. Sau 6 ngày nhân nuôi, mật độ tế bào ở công thức nhiệt độ 280C đạt mức cao nhất trong số các công thức thí nghiệm, đạt tới 3,708 x 1010 tế bào/ml. A B C D Hình 3.6. Tế bào sâu khoang sau 6 ngày nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau. A: 240C; B: 260C, C: 280C và D: 290C - Điều kiện pH môi trường thích hợp nuôi nhân tế bào Thí nghiệm với 6 mức pH khác nhau, kết quả ở điều kiện pH là 6,8 mật độ tế bào trong sinh khối đạt cao nhất, tới 1,504 x 1010 tế bào/ml sau 2 ngày nuôi nhân, còn ở các mức pH khác mật độ tế bào đạt thấp hơn. Thời điểm sau 6 ngày, mật độ tế bào đều đạt mức cao ở tất cả các mức pH, cao nhất ở pH= 6,8 với mật độ tế bào đạt 2,125 x 1010 tế bào/ml và ở pH= 6,6 mật độ tế bào đạt 1,954 x 1010 tế bào/ml. Đến thời điểm sau 8 ngày, công thức pH là 6,8 mật độ tế bào vẫn đạt 1,241 x 1010 tế bào/ml, trong khi đó, ở các công thức với mức pH khác đều thấp hơn một cách có ý nghĩa. - Xác định tỷ lệ huyết thanh FBS bổ sung vào môi trường nhân tế bào Nhân nuôi tế bào với mức bổ sung FBS khác nhau, sau 2 ngày mật độ tế bào đạt từ 0,713- 0,937 x 1010 tế bào/ml, tương tự như công thức đối chứng không bổ sung FBS. Đến 6 ngày sau, tại tất cả các công thức bổ sung FBS đều đạt mật độ tế bào cao hơn so với đối chứng một cách có ý nghĩa, từ 1,079- 2,165 x 1010 tế bào/ml, trong đó với tỷ lệ bổ sung 25% đạt cao nhất tới 2,165 x 1010 tế bào/ml. Sau 10 ngày, công thức bổ sung 25% hàm lượng tế bào đạt tới 3,271 x 1010 tế bào/ml. - Mật độ tế bào khi nuôi nhân ở điều kiện thích hợp nhất Tiến hành 3 đợt thí nghiệm nuôi nhân tế bào theo các thông số tối ưu đã xác định (Bảng 3.11). Kết quả 2,018- 2,791 x 1010 tế bào/ml. Sau 4 ngày đạt từ 2,941- 3,150 x 1010 tế bào/ml. Hàm lượng tế bào đạt cao nhất sau 6 ngày nuôi nhân, từ 4,025- 5,750 x 1010 tế bào/ml và cao nhất ở thử nghiệm lần 2 (tháng 11/2016) mật độ tế bào đạt tới 12
15. 5,750 x 1010 tế bào/ml, cao hơn hẳn so với mật độ tế bào đạt được khi nuôi nhân tế bào sâu khoang trong từng điều kiện tối ưu riêng rẽ. Đến thời điểm 8 ngày sau nhân nuôi hàm lượng tế bào biểu hiện giảm rõ rệt, chỉ còn từ 1,990- 2,675 x 1010 tế bào/ml. Có thể sau khi sinh khối tế bào phát triển nhanh và đạt đỉnh cao mật độ vào thời điểm 6 ngày sau nuôi nhân đã làm thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, không đáp ứng nhu cầu phát triển sinh khối dẫn tới mật độ tế bào giảm thấp nhanh. Hình ảnh tế bào sau 6 ngày nuôi nhân thể hiện qua Hình 3.8 Bảng 3.11. Mật độ tế bào thu được khi nhân nuôi in vitro ở điều kiện thích hợp Mật độ tế bào (x 1010 tế bào/ml) sau các ngày nhân nuôi Đợt thí nghiệm 1 ngày 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 1 (10/2016) 2,055 b 2,302 b 2,941 a 4,025 ab 2,675 a 2 (11/2016) 2,791 a 2,809 a 3,150 a 5,750 a 2,475 a 3 (12/2016) 2,018 b 2,415 b 3,051 a 4,987 a 1,990 b Ghi chú: Trong cùng hàng, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05 600X 200X Hình 3.8: Tế bào sâu khoang sau nuôi nhân 6 ngày khi quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 600X và 200X Với các kết quả nghiên cứu về điều kiện thích hợp để nuôi nhân tế bào sâu khoang như đã nêu trên, khẳng định: hoàn toàn có thể nuôi nhân tế bào sâu khoang và điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào khi sử dụng môi trường Excell 420- 14419C ở nhiệt độ 280C, pH=6,8 và tỷ lệ FBS bổ sung là 25%. Khi nuôi nhân tế bào sâu khoang ở điều kiện thích hợp, mật độ tế bào đạt cao nhất, từ 4,025 đến 5,750 x 1010 tế bào/ml sau 6 ngày nhân nuôi. 13
16. 3.2.1.2. Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mô phòng thí nghiệm - Nhân sinh khối tế bào theo phương pháp tĩnh và lắc trên bình 250ml Nuôi nhân tế bào với lượng 150ml trên bình lọc khuẩn 250ml theo phương pháp tĩnh và lắc (tốc độ 50 vòng/phút), trên môi trường Ex-Cell 405 có bổ sung 25% FBS ở nhiệt độ 280C và pH 6,8. Xác định khi nuôi nhân tế bào theo phương pháp tĩnh, mật độ tế bào đạt từ 3,17- 3,445 x 1010 tế bào/ml với hệ số nhân số lượng tế bào tăng từ 6,26- 6,89 lần so với mật độ tế bào ban đầu. Mật độ tế bào trung bình đạt tương ứng 3,247 x 1010 tế bào/ml và 6,49 lần. Nuôi nhân theo phương pháp lắc với tốc độ 50 vòng/phút liên tục 24 giờ, mật độ tế bào đạt từ 4,58- 4,879 x 1010 tế bào/ml và hệ số nhân số lượng tế bào đạt từ 9,16- 9,76 lần so với mật độ tế bào ban đầu. Trung bình cả 6 lần thí nghiệm, mật độ tế bào đạt 4,752 x 1010 tế bào/ml với hệ số nhân tế bào đạt 9,50 lần. Bảng 3.12. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân theo phương pháp tĩnh và lắc trên bình lọc khuẩn 250ml Mật độ Phương pháp tĩnh Phương pháp lắc Lần thí ban đầu Mật độ tế bào HS nhân Mật độ tế bào HS nhân nghiệm (x 1010 tb/ml) (x 1010 tb/ml) (lần) (x 1010 tb/ml) (lần) 1 0,5 3,445 a 6,89 4,580 b 9,16 2 0,5 3,337 b 6,67 4,780 ab 9,56 3 0,5 3,129 c 6,26 4,590 a 9,18 4 0,5 3,170 c 6,34 4,595 b 9,19 5 0,5 3,270 cb 6,54 4,587 b 9,17 6 0,5 3,133 c 6,27 4,879 a 9,76 TB 0,5 3,247 6,49 4,752 9,50 CV (%) 3,192 - 6,219 - LSD0,05 0,616 - 0,494 - Ghi chú: tb: Tế bào; HS: Hệ số nhân; TB: Mật độ tế bào trung bình; Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05 14
17. A B Hình 3.7: A: Nhân tế bào theo phương pháp lắc; B: Nhân theo phương pháp tĩnh - Phát triển sinh khối tế bào theo phương pháp lắc trên bình 1 lít Nuôi nhân tế bào với lượng 750ml môi trường trên bình lọc khuẩn Erlemeeyer Flask dung tích 1,0 lít với môi trường Excell 420-14419C và 2 loại môi trường rẻ tiền hơn là Schneider S9895 và Grace. Tại thời điểm 6 ngày sau nuôi nhân, nuôi nhân theo phương pháp lắc với môi trường Excell 420-14419C đạt tới 4,08 x 1010 tế bào/ml, với môi trường Schneider S9895 đạt 2,97 x 1010 tế bào/ml, và môi trường Grace đạt 2,37 x 1010 tế bào/ml. Trong khi đó, ở công thức nuôi nhân theo phương pháp tĩnh, mật độ tế bào thu được tương ứng với 3 loại môi trường đạt 3,14, 2,62 và 2,15 x 1010 tế bào/ml. 3.2.2. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV sâu khoang trên tế bào nuôi nhân 3.2.2.1. Xác định điều kiện thích hợp cho lây nhiễm NPV - Xác định mật độ tế bào thích hợp Khi nhiễm với số lượng thể vùi 0,1 x 108 OB/ml trên các mật độ tế bảo khác nhau. Sau 1 ngày lây nhiễm với mật độ tế bào là 1,0 và 2,0 x 108 tế bào/ml số lượng thể vùi đạt 1,08 và 1,21 x 108 OB/ml, với công thức có mật độ tế bào cao nhất 3,0 x 108 tế bào/ml số lượng thể vùi hình thành cũng đạt tới 1,68 x 108 OB/ml. Sau 3 ngày, với công thức 1,0 và 2,0 x 108 tế bào/ml, số lượng thể vùi tương ứng là 1,14 và 1,45 x 108 OB/ml, còn khi nhiễm trên mật độ tế bào 3,0 x 108 tế bào/ml, số lượng thể vùi đạt tới 2,47 x 108 OB/ml. Sau 6 ngày lây nhiễm trên tế bào có mật độ 1,0 và 2,0 x 108 tế bào/ml số lượng thể vùi đạt 1,01 và 1,27 x 108 OB/ml (tương ứng), với mật độ tế bào 3,0 x 108 tế bào/ml, số thể vùi đạt tới 2,43 x 108 OB/ml. 15
18. - Xác định nồng độ virus thích hợp Lây nhiễm virus theo chỉ số MOI khác nhau với cùng mật độ tế bào cho lây nhiễm là 1,0 x 108 tế bào/ml. Sau 1 ngày nhiễm theo chỉ số MOI= 0,5, số thể vùi hình thành tới 0,97 x 108 OB/ml, với chỉ số MOI là 0,1 và 0,3 chỉ đạt 0,62 và 0,78 x 108 OB/ml (tương ứng). Sau 3 ngày lây nhiễm theo chỉ số MOI là 0,1 và 0,3 cho hàm lượng thể vùi hình thành đạt tương ứng là 1,47 và 1,25 x 108 OB/ml, cao hơn hẳn so với chỉ số MOI khi lây nhiễm 0,5. Sau 6 ngày lây nhiễm, tương ứng với 3 chỉ số MOI 0,1; 0,3 và 0,5 số thể vùi đạt 1,08, 0,53 và 0,37 x 108 OB/ml. - Xác định thời gian ủ lây nhiễm virus thích hợp Khi nhiễm vi rút theo chỉ số MOI là 0,1 trên sinh khối tế bào có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml. Kết quả số lượng thể vùi hình thành sau 1 ngày lây nhiễm đạt 0,72 x 108 OB/ml. Sau 3 ngày, số thể vùi đạt cao nhất tới 1,53 x 108 OB/ml. Nhưng sau đó số lượng thể vùi hình thành lại giảm dần, còn 1,13 x 108 OB/ml vào thời điểm sau 6 ngày và chỉ còn 0,95 x 108 OB/ml sau 10 ngày lây nhiễm. - Xác định môi trường thích hợp cho lây nhiễm Thí nghiệm với 4 loại môi trường khác nhau với dịch tế bào sâu khoang có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml và lây nhiễm theo chỉ số MOI 0,1 với môi trường pH 7,0 và nhiệt độ 280C. Kết quả sau 1 ngày nhiễm, trên môi trường Excell 420-14419C có số thể vùi hình thành cao nhất tới 1,316 x 108 OB/ml, môi trường Schneider S9895 đạt 1,142 x 108 OB/ml. Còn với môi trường TC-100- T3160 và IPL-41, số thể vùi hình thành đều đạt ở mức thấp, tương ứng đạt 0,980 và 0,925 x 108 OB/ml. Sau 3 ngày, số thể vùi hình thành ở công thức sử dụng môi trường Excell 420-14419C cho số thể vùi đạt cao nhất tới 2,014 x 108 OB/ml, với môi trường Schneider S9895 đạt 1,835 x 108 OB/ml, môi trường TC-100- T3160 đạt 1,422 x 108 OB/ml và thấp nhất trên môi trường IPL-41 chỉ đạt 1,341 x 108 OB/ml. Đến thời điểm sau 6 ngày, số lượng thể vùi hình thành khi sử dụng môi trường Excell 420-14419C là 1,290 x 108 OB/ml, còn với môi trường Schneider S9895 đạt 0,205 x 108 OB/ml. Các môi trường TC-100- T3160 và IPL-41 đều chỉ đạt 0,192 x 108 OB/ml. 16
19. - Xác định nhiệt độ thích hợp cho lây nhiễm Lây nhiễm virus theo chỉ số MOI 0,1 trên dịch tế bào sâu khoang có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml. Sau 1 ngày lây nhiễm ở nhiệt độ 26 ± 0,50C, số lượng thể vùi đạt 1,08 x 108 OB/ml, ở nhiệt độ 28 ± 0,50C đạt 1,15 x 108 OB/ml và số thể vùi đạt tới 1,31 x 108 OB/ml ở 30 ± 0,50C. Nhưng sau 3 ngày, số thể vùi đạt cao nhất lại ở nhiệt độ 28 ± 0,50C tới 1,85 x 108 OB/ml, còn với nhiệt độ 26 ± 0,50C và 30 ± 0,50C số lượng thể vùi đạt tương ứng là 1,37 x 108 và 1,58 x 108 OB/ml. Đến 6 sau lây nhiễm, số thể vùi hình thành ở nhiệt độ 28 ± 0,50C vẫn đạt tới 0,714 x 108 OB/ml, ở nhiệt độ 26 ± 0,5 và 30 ± 0,50C số thể vùi đạt 0,692 và 0,687 x 108 OB/ml (tương ứng). - Xác định pH môi trường thích hợp cho lây nhiễm Lây nhiễm với số lượng thể vùi 0,1 x 108 OB/ml trên dịch tế bào có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml. Kết quả sau 1 ngày, số lượng thể vùi hình thành cao nhất, tới 0,44 x 108 OB/ml ở điều kiện môi trường pH là 7,0. Sau 3 ngày, số lượng thể vùi hình thành lên tới 2,17 x 108 OB/ml khi pH = 7,0 và 1,94 x 108 OB/ml khi pH = 6,5, còn ở pH 6,0 và 7,5 số thể vùi đạt tương ứng 1,78 và 1,85 x 108 OB/ml. Sau 6 ngày, với pH= 7,0 số thể vùi vẫn đạt cao nhất 1,83 x 108 OB/ml, tiếp đến pH = 6,5 đạt 0,83 x 108 OB/ml, khi pH là 6,0 và 7,5 số thể vùi chỉ đạt 0,62 và 0,71 x 108 OB/ml (tương ứng). Như vậy, điều kiện thích hợp lây nhiễm NPV ở mật độ tế bào 1,0 x 108 tế bào/ml theo chỉ số MOI 0,1, thời gian ủ lây nhiễm trong 3 ngày trên môi trường Excell 420-14419C có pH = 7,0 và nhiệt độ 280C. 3.2.2.2. Mức độ phát triển sinh khối tế bào và hình thành thể vùi trong quá trình lây nhiễm NPV Sau 1 ngày, khi lây nhiễm với chỉ số MOI = 0,1, số lượng thể vùi đạt 1,17 x 108 OB/ml tăng gấp 11,7 lần với ban đầu, công thức chỉ số MOI là 0,3 và 0,5 số lượng thể vùi đạt tương ứng là 1,25 và 1,41 x 108 OB/ml, với mức tăng tương ứng là 41,67 và 28,2 lần so với số lượng ban đầu (Bảng 3.20). Sau 3 ngày khi lây nhiễm với chỉ số MOI là 0,1; 0,3 và 0,5 thì mật độ tế bào giảm lần lượt là 108,4; 88,7 và 76,9 lần, còn số lượng thể vùi hình thành tăng tương ứng 158,0; 41,0 và 25,4 lần (Bảng 3.20). 17
20. Sau 6 ngày, tương ứng với 3 công thức chỉ số MOI là 0,1; 0,3 và 0,5 mật độ tế bào chỉ còn 0,280, 0,256 và 0,264 x 106 tế bào/ml. Đồng thời, số lượng thể vùi tương ứng với 3 công thức lây nhiễm chỉ đạt 1,28; 1,10 và 1,13 x 108 OB/ml (Bảng 3.20). Bảng 3.20. Mật độ tế bào sâu khoang và số thể vùi hình thành sau các ngày lây nhiễm NPV theo chỉ số MOI khác nhau Công Sau nhiễm 1 ngày Sau nhiễm 3 ngày Sau nhiễm 6 ngày thức Tế bào Thể vùi Tế bào Thể vùi Tế bào Thể vùi thí (x 107 tế (x 108 (x 106 tế (x 108 (x 106 tế (x 108 nghiệm bào/ml) OB/ml) bào/ml) OB/ml) bào/ml) OB/ml) MOI 0,1 0,716 b 1,17 b 1,084 1,58 a 0,280 1,28 a MOI 0,3 0,551 c 1,25 b 0,887 1,23 b 0,256 1,10 b MOI 0,5 0,508 c 1,41 a 0,769 1,27 b 0,264 1,13 b Đ/C 1,203 a - 1,206 - 1,180 - CV (%) 2,551 0,458 1,673 0,393 6,428 4,251 LSD0,05 0,634 0,134 0,541 0,093 0,724 0,364 Ghi chú: Đ/C: Đối chứng là dịch tế bào, không nhiễm NPV. OB: Thể vùi; Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05 3.2.2.3. Mức độ gây chết sâu khoang và hình thành thể vùi của NPV nhân trên tế bào và trên sâu khoang • Hiệu quả gây chết sâu của NPV nhân trên tế bào và trên sâu Khi lây nhiễm NPV tạo ra từ lây nhiễm trên tế bào, hiệu lực trừ sâu khoang đạt 27,71% sau 2 ngày, 41,56% sau 3 ngày, đạt cao nhất tới 76,27% sau 6 ngày và vẫn đạt 62,13% sau 10 ngày lây nhiễm. Với NPV tạo ra từ sâu theo phương pháp truyền thống, hiệu lực trừ sâu khoang đạt thấp hơn hẳn so với NPV tạo ra từ tế bào, chỉ đạt 19,28% sau 2 ngày, 36,36% sau 3 ngày, 64,41% sau 6 ngày và đạt 54,27% sau 10 ngày. • Số lượng thể vùi hình thành của NPV nhân trên tế bào và trên sâu khoang Kết quả đánh giá, xác định khi sử dụng nguồn NPV tạo ra từ sâu non, mỗi cá thể sâu chết có số lượng thể vùi hình thành trung bình 200,3 thể vùi/sâu. Khi sử dụng nguồn NPV được nhân sinh khối từ tế bào, số lượng thể vùi hinh thành đạt 241,1 OB/sâu, gấp 1,2 lần so với nguồn NPV tạo ra từ sâu. 18
21. 3.2.2.4. Hiệu lực trừ sâu khoang của chủng TL.1a nhân trên tế bào và trên sâu Nhằm khẳng định lại lần nữa về hiệu lực gây chết sâu khoang của cả 3 chủng NPV đã chọn lọc qua thu thập ngoài đồng ruộng và phân lập trong phòng thí nghiệm. Kết quả, sau 3 ngày, hiệu lực trừ sâu của các chủng NPV đạt từ 27,33 - 43,33%, trong đó chủng TL.1a từ sâu có hiệu lực cao nhất đạt 43,33%, của TL.2a và TL.3a có hiệu lực trừ sâu thấp, chỉ đạt 27,33% và 35,00% (tương ứng). Trong khi đó, chủng TL.1a nhân trên tế bào đạt 38,63% (Bảng 3.23). Sau 7 ngày, hiệu lực gây chết sâu khoang của TL.1a nhân trên tế bào đạt tới 52,89%. Hiệu lực trừ sâu của các chủng TL.1a, TL.2a và TL.3a nhân từ sâu đạt tỷ lệ sâu chết tương ứng là 46,0, 37,33 và 46,67% (Bảng 3.23). Sau 10 ngày, hiệu lực trừ sâu của TL.1a nhân trên tế bào đạt cao nhất tới 80,47%, sử dụng virus nhân từ sâu của TL.1a, TL.2a và T.3a đạt hiệu quả trừ sâu khoang đạt tương ứng 78,67, 69,0 và 76,67%. Kết quả thí nghiệm đã chứng minh tính ổn định về hiệu lực phòng trừ sâu khoang qua các đợt đánh giá của chủng TL.1a đã được tuyển chọn sau khi phân lập. Chủng virus này được sử dụng để nghiên cứu phát triển chế phẩm trừ sâu khoang. Bảng 3.23. Hiệu lực trừ sâu khoang của các chủng TL.1a được nhân sinh khối trên tế bào và trên sâu Số thể vùi Số sâu khoang Hiệu lực gây chết sâu khoang Chủng NPV trước nhiễm thí nghiệm ở các ngày sau nhiễm (%) (OB/ml) (con) 3 ngày 7 ngày 10 ngày TL.1a từ tế bào 1,50 x 108 150 38,63 b 52,89 a 80,47 a TL.1a từ sâu 1,50 x 108 150 43,33 a 46,00 b 78,67 a TL.2a từ sâu 1,50 x 108 150 27,33 d 37,33 c 69,00 b TL.3a từ sâu 1,50 x 108 150 35,00 c 46,67 b 76,67 a Đối chứng 1,50 x 108 150 - - - CV (%) 4.43 2.99 2.99 LSD 0,05 3.1921 2.7271 4.5457 Ghi chú: OB: Thể vùi; Trong cùng cột, các giá trị kèm chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa ở độ tin cậy P ≤ 0,05 19
22. 3.3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang và tạo chế phẩm dạng bột thấm nước 3.3.1. Tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang Khi sử dụng từ 2- 4 lần nước cất vô trùng thì số lượng thể vùi thu lại từ 1,04 - 1,80 x 108 OB/ml, với tỷ lệ thu hồi chỉ đạt 37,14- 64,29% số thể vùi ban đầu trước khi tinh sạch. Nếu thực hiện 3 lần (gồm 2 lần nước cất xen kẽ với 1 lần SDS), lượng thể vùi thu hồi cao nhất tới 2,71 x 108 OB/ml, tỷ lệ thu hồi thể vùi bằng 96,79% lượng thể vùi ban đầu (Bảng 3.26). Khi sử dụng 4 lần, gồm: 2 lần SDS 0,1% xen kẽ với 2 lần nước cất, số lượng thể vùi đạt 2,10 x 108 OB/ml, đạt tỷ lệ thu hồi 85,71%. Thực hiện 5 lần, gồm: 2 lần SDS xen kẽ với 3 lần nước cất, số lượng thể vùi thu hồi lại 2,35 x 108 OB/ml, tương đương với tỷ lệ thu hồi 83,93% (Bảng 3.26). Bảng 3.26. Số lượng thể vùi sâu khoang và tỷ lệ thu hồi sau tinh sạch theo các phương pháp khác nhau Công Phương pháp tinh sạch Số lượng thể vùi Tỷ lệ thu thức thể vùi NPV sâu khoang (x 108 OB/ml) hồi (%) 1 2 lần bằng nước cất 1,04 37,14 2 3 lần bằng nước cất 1,50 53,57 3 4 lần bằng nước cất 1,80 64,29 4 2 lần: nước cất - SDS 2,33 83,21 5 3 lần: nước cất- SDS- nước cất 2,71 96,79 6 4 lần: SDS- nước cất- SDS- nước cất 2,40 85,71 7 5 lần: nước cất- SDS- nước cất- SDS- nước cất 2,35 83,93 Ghi chú: SDS: Sodium Dodecyl Sulfate; OB: Thể vùi 200X 600X Hình 3.8: Thể vùi NPV sâu khoang sau khi được tinh sạch khi quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 200X và 600X 20
23. Theo Huda et al. (2012), Lynn (2002), Nazli et al. (2012) thì SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) là một tác nhân tạo sủi, rất hiệu quả trong việc tinh sạch thể vùi từ dịch NPV vì SDS có tác dụng giúp cân bằng sinh lý tế bào, không gây phá vỡ vỏ protein của thể vùi và chống thể vùi kết mảng. Thể vùi NPV sau tinh sạch thể hiện rõ khi quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 200X và 600X (Hình 3.8). Phân tích trình tự gen bằng kỹ thuật PCR với 4 mẫu NPV sâu khoang nhân trên tế bào (ký hiệu SplNPV từ 2-5) và 1 mẫu NPV từ sâu non chết (SplNPV 6), so sánh với 9 trình tự gen SplNPV đã công bố của các nước. Kết quả, cả 5 mẫu phân tích đều có trình tự gen hoàn toàn tương tự nhau, đều thuộc loài Spodoptera litura Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV sâu khoang), giống Alphabaculovirus, họ Baculoviridae với độ tương đồng 100% khi so sánh trình tự gen của NPV trên ngân hàng GenBank và cùng nhánh với trình tự gen NPV trên sâu khoang Ấn Độ 3.3.2. Thử nghiệm tạo chế phẩm NPV sâu khoang dạng bột thấm nước Đã tạo được 2 loại sản phẩm dạng bột thấm nước có số thể vùi 2,0 x 109 OB/gam, liều lượng 500 gam/ha nhằm số thể vùi 1,0 x 1012 OB/ha để phòng trừ sâu khoang. Bao gồm: chế phẩm không có axit Boric (ký hiệu NPV-1 WP) và chế phẩm có bổ sung thêm 0,5% axit Boric (ký hiệu NPV-2 WP). Thành phần phụ gia tạo dạng bột thấm nước của hai chế phẩm virus nhân đa diện NPV bao gồm 60% bột tan và 40% kaoin. Sản phẩm có độ ẩm từ 10-12%, pH từ 6,8- 7,0 với nồng độ phun 0,1% (Hình 3.14). Hình 3.14. Đóng gói chế phẩm NPV sau khi tạo dạng sử dụng 3.3.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được 3.3.3.1. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trong phòng thí nghiệm của chế phẩm NPV-1 WP đạt 81,23%, chế phẩm NPV-2 WP hiệu lực đạt 87,14%. Trong khi đó, đối chứng sử dụng 500 sâu chết do NPV theo phương pháp truyền thống chỉ đạt 46,95%. 21
24. 3.3.3.2. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang ngoài nhà lưới Hiệu lực trừ sâu khoang trên rau bắp cải ngoài nhà lưới sau 7 ngày phun, chế phẩm NPV-1 WP đạt 81,13%, với chế phẩm NPV-2 WP đạt 82,92% chế phẩm. Nếu sử dụng 500 sâu chết bệnh nghiền lọc phun cho 1ha với nồng độ 5% theo phương pháp cũ, hiệu lực trừ sâu đạt 47,68%. Số lượng thể vùi hình thành trên các cá thể sâu chết sau khi phun chế phẩm NPV-1 WP đạt tới 1,13 x 109 OB/10 sâu, chế phẩm NPV-2 đạt 1,12 x 109 OB/10 sâu. Trong khi đó, khi phun dịch sâu chết bệnh số lượng thể vùi chỉ đạt 1,01 x 108 OB/10 sâu. 3.3.3.3. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng • Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên bắp cải Thí nghiệm trên diện hẹp tại Vân Nội (Đông Anh, Hà Nội) trong vụ Thu Đông 2017. Kết quả sau phun 10 ngày, hiệu quả trừ sâu của chế phẩm NPV-1 WP đạt 80,51% và chế phẩm NPV-2 WP có hiệu lực đạt 82,29%. Trong khi đó, ở công thức sử dụng chế phẩm sâu chết rồi nghiền lọc hiệu quả chỉ đạt 45,20% (Bảng 3.30). Bảng 3.30. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV trên bắp cải ngoài đồng ruộng tại Vân Nội (Hà Nội) Công Thành phần Liều lượng Mật độ sâu trước Hiệu lực (%) thức chế phẩm phun 1 ha phun (con/m2) 7NSP 10NSP CT 1 NPV-1 WP 500 gam 2,6 73,42 80,51 a CT 2 NPV-2 WP 500 gam 2,8 73,45 82,29 a CT 3 Sâu nghiền (đ/c 1) 500 sâu 2,4 24,94 45,20 b CT 4 Nước lã (Đ/c 2) - 2,8 - - CV (%) - - 26,863 16,482 LSD - - 20,468 22,518 Ghi chú: NSP: Ngày sau phun. Đ/c: Đối chứng Thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 với các liều lượng khác nhau tại Vân Nội (Hà Nội) trong vụ Đông Xuân 2018- 2019. Kết quả sau 5 ngày, với các liều lượng 400, 500 và 600 gam/ha tương ứng với số lượng thể vùi 0,8; 1,0 và 1,2 x 1012 OB/ha cho hiệu lực trừ sâu đạt 64,58, 71,67 và 77,78% (tương ứng), hiệu lực của thuốc hoá học Aba Fax 3.6EC đã đạt tới 82,29% . 22
25. Sau 7 ngày phun, hiệu lực trừ sâu ứng với liều lượng 400, 500 và 600 gam/ha đạt 81,75, 73,44; 75,63, thuốc hoá học đạt 81,90%. Sau 10 ngày, sử dụng 400 gam/ha, hiệu lực trừ sâu chỉ đạt 76,47%, với liều lượng 500 và 600 gam/ha đạt hiệu quả tương ứng 80,30 và 80,95%, Trong khi đó, thuốc hoá học hiệu lực chỉ còn 70,77%. • Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên đậu tương Thí nghiệm phun NPV1 WP với lượng 400 gam/ha, hiệu quả trừ sâu đạt 77,18% sau phun 5 ngày, đến 7NSP đạt 81,63% và 90,76% vào 10NSP. Phun 500 gam/ha, sau 5 ngày hiệu quả trừ sâu đạt 84,81%, đến 7 và 10NSP hiệu quả đạt 96,92%. Phun 600 gam/ha, đạt 89,2% vào 5NSP, đạt 97,56% vào 7NSP và 98,04% vào 10NSP. Trong khi đó, thuốc trừ sâu Aba- Fax 3.6EC sử dụng với liều lượng 200 gam/ha thì hiệu lực đạt 96,8 và 96,89% tương ứng các thời điểm 7 và 10NSP (Bảng 3.33). Bảng 3.33. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP khi phun với liều lượng khác nhau trên đậu tương ngoài đồng ruộng tại Mỹ Thành (Hà Nội) Công Loại thuốc Liều Sâu trước Hiệu lực ở các ngày sau phun (%) lượng phun thức 5 NSP 7NSP 10NSP (gam/ha) (con/m2) 1 NPV1 WP 400 2,63 77,18c 81,63 c 90,76 c 2 NPV1 WP 500 2,40 84,81 b 96,92 b 96,92 b 3 NPV1 WP 600 2,39 89,20 a 97,56 a 98,04 a 4 Aba Fax 3.6EC 200 2,81 73,40 c 96,80 b 96,89 b 5 Đối chứng Nước lã 2,42 - - - CV(%) - 25,948 18,924 10,016 LSD - 12,822 9,554 5,578 Ghi chú: NSP: Ngày sau phun Thí nghiệm phòng trừ sâu khoang trên đậu tương trên diện rộng, không nhắc lại với qui mô diện tích 1,0 ha tại Hợp tác xã Mỹ Thành (huyện Mỹ Đức, Hà Nội) trong vụ Xuân 2018. Khi sử dụng với liều lượng 500 gam/ha chế phẩm NPV-1 WP, hiệu lực trừ sâu đạt 73,44% vào thời điểm 5NSP và đạt 91,15% vào 10NSP. Trong khi sử dụng thuốc Aba Fax 3.6EC tại các thời điểm tương ứng đạt 75,33% và 75,6%. Qua theo dõi, chế phẩm NPV-1 WP không gây chết các sâu hại khác và các loài bắt mồi ăn thịt trên ruộng. Thể hiện sự chuyên tính của chế phẩm với sâu khoang và cần phải phát triển chế phẩm NPV các sâu hại khác để phối trộn với NPV sâu khoang, nhằm tạo ra sản phẩm có phổ rộng hơn để phòng trừ một lúc nhiều loài sâu hại. 23
26. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Xác định NPV là tác nhân sinh học thường phát sinh trên đồng ruộng với mức độ phổ biến từ 26,67- 48,89%, tỷ lệ sâu khoang chết do NPV từ 14,22- 21,67%. Đã phân lập và tuyển chọn được 3 chủng NPV (gồm TL.1a, TL.2a và TL.3a), trong đó TL.1a có hoạt lực gây chết sâu khoang tới 80,09% và khả năng hình thành thể vùi tới 2,9 x 108 OB/10 sâu. 1.2. Hoàn toàn có thể nhân sinh khối tế bào sâu khoang với điều kiện thích hợp trên môi trường Ex-Cell 420-14491C có bổ sung 25% FBS ở pH 6,8 và nhiệt độ 280C. Nhân nuôi tế bào ở điều kiện thích hợp, mật độ tế bào có thể đạt từ 4,025- 5,750 x 1010 tế bào/ml ở thời điểm 6 ngày sau nhân. Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang với lượng 150ml môi trường Excell 420-14419C trên bình 250ml theo phương pháp lắc đạt mật độ 4,580- 4,879 x 1010 tế bào/ml, với lượng 750ml trên bình 1 lít theo phương pháp lắc đạt 4,08 x 1010 tế bào/ml. 1.3. Xác định được điều kiện thích hợp lây nhiễm phát triển sinh khối NPV trên tế bào nuôi nhân khi mật độ tế bào 1,0 x 108 tế bào/ml theo chỉ số MOI là 0,1, thời gian ủ lây nhiễm trong 3 ngày trên môi trường Excell 14420-14491C có pH = 7,0 và nhiệt độ 280C. Lây nhiễm NPV trên tế bào có mật độ 1,0 x 108 tế bào/ml theo chỉ số MOI 0,1 đạt 1,58 x 108 OB/ml hình thành sau 3 ngày (mức độ tăng 158 lần so với ban đầu). Hiệu lực gây chết sâu khoang của NPV tạo ra trên tế bào đạt 76,27% và thể vùi hình thành tới 241,1 OB/sâu. 1.4. Tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang bằng phương pháp ly tâm 3 lần (2 lần nước cất xen kẽ 1 lần SDS) lắc với tốc độ 1500 vòng/phút trong thời gian 5 phút/lần, số lượng thể vùi thu được 2,71 x 108 OB/ml với tỷ lệ thu hồi đến 96,79%. 1.5. Bước đầu tạo được 2 chế phẩm dạng bột thấm nước NPV-1 WP và NPV-2 WP chứa 2x 109 OB/gam với phụ gia gồm 60% bột tan và 40% kaolin. Ngoài đồng ruộng, sử dụng 500 gam/ha chế phẩm NPV-1 WP, hiệu quả trừ sâu khoang trên bắp cải đạt 80,51%, NPV-2 WP đạt 82,29%, sử dụng NPV-1 WP trên đậu tương đạt 91,15%. 2. Đề nghị: Tiếp tục nghiên cứu sản xuất sinh khối NPV với qui mô lớn bằng công nghệ nuôi nhân tế bào để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học và sử dụng kết quả phục vụ nghiên cứu, giảng dạy, chỉ đạo phòng trừ sâu khoang trong sản xuất. 24
27. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 1. Lê Thanh Hải Hà, Lê Văn Trịnh, Hà Thị Thu Thuỷ (2017). Nghiên cứu kỹ thuật nuôi nhân Invitro tế bào sâu khoang (S. litura) phục vụ sản xuất chế phẩm virus NPV. Tạp chí Khoa học Viện Đại học Mở Hà Nội. Số 33 (07/2017). 32- 38. 2. Lê Thanh Hải Hà, Lê Văn Trịnh, Nguyễn Thị Nga (2017). Phân lập và đánh giá hiệu lực gây chết sâu khoang của vi rút NPV (Nucleo polyhedrosis virus). Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Số 23/2017. 58- 63. 3. Lê Thanh Hải Hà, Lê Văn Trịnh (2019). Nghiên cứu tinh sạch thể vùi Nucleo polyhedrosis virus (NPV) và tạo dạng chế phẩm. Tạp chí khoa học Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh. Số 14 (2). 12- 20. 4. Lê Thanh Hải Hà, Hoàng Đình Hoà, Lê Văn Trịnh, Nguyễn Thị Như Quỳnh (2020). Hiệu quả phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV phát triển từ tế bào nhân nuôi. Tạp chí Bảo vệ thực vật. Số 1/2020. 5-11.