Sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric

Nội dung tài liệu: Sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 62420201 TÊN NCS: TỪ VĂN QUYỀN SÀNG LỌC CÁC THẢO DƯỢC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE ĐỂ GIẢM SỰ TẠO THÀNH ACID URIC Cần Thơ, 2021
2. CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Đái Thị Xuân Trang Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ sở Họp tại: Hội trường 007, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ Vào lúc 14 giờ 00 ngày 23 tháng 4 năm 2021 Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Thị Ngọc Vân Phản biện 2: TS. Trần Tiến Tài Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
3. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Tên bài báo: “Phân lập và khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme xanthine oxidase từ sữa bò”; Tác giả: Từ Văn Quyền, Nguyễn Minh Chơn và Đái Thị Xuân Trang; Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, tập 54, số 3B (2018), trang 59-66. 2. Tên bài báo: “Khảo sát khả năng ức chế enzym xanthin oxidase của một số cây thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae) và họ Dền (Amaranthaceae)”; Tác giả: Từ Văn Quyền, Nguyễn Minh Chơn, Nguyễn Trọng Tuân và Đái Thị Xuân Trang; Tạp chí Dược học, số 514, trang 60-63. 3. Tên bài báo: “Khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của cao ethanol cỏ xước (Achyranthes aspera)”; Tác giả: Từ Văn Quyền, Nguyễn Minh Chơn, Nguyễn Trọng Tuân và Đái Thị Xuân Trang; Tạp chí Sinh lý học Việt Nam, tập 23, N°2, 6/2019, trang 9-14.
4. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Acid uric là sản phẩm được tạo thành do hoạt động của enzyme xanthine oxidase (XO). Nồng độ acid uric trong máu cao là nguyên nhân dẫn đến một số bệnh. Bệnh gout (Thống phong) là biểu hiện lâm sàng của tình trạng tăng acid uric máu. Bên cạnh đó, tăng acid uric trong máu thường kèm theo tăng nguy cơ mắc các bệnh như tim mạch, sỏi thận, đái tháo đường và các hội chứng chuyển hóa khác. Những bệnh có liên quan đến tăng acid uric trong máu đang khá phổ biến và có chiều hướng gia tăng trên thế giới. Ức chế enzyme XO là mục tiêu căn bản trong việc điều trị tăng acid uric máu. Các thảo dược, các hợp chất từ tự nhiên có hoạt tính ức chế enzyme XO ngày càng được quan tâm vì tính an toàn và hiệu quả trong việc phòng trị tăng acid uric trong máu. Vì vậy, đề tài “Sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric”. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Đề tài được thực hiện nhằm đạt được các mục tiêu sau: - Ly trích được enzyme XO từ sữa bò và xác định được các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO ly trích được. - Xác định được một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO. - Ly trích được một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược. - Đánh giá được tác dụng của thảo dược có hoạt tính ức chế enzyme XO lên nồng độ acid uric huyết thanh và hoạt tính enzyme XO gan chuột thực nghiệm. 1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu của đề tài là enzyme XO; 8 loại thảo dược bao gồm: Húng chanh, kinh giới, cây râu mèo, cây sương sáo, dền gai, nở ngày, nở ngày đất và cỏ xước; động vật được sử dụng trong nghiên cứu là chuột nhắt trắng Mus musculus var. Albino. Đề tài tập trung nghiên cứu phương pháp ly trích enzyme XO từ nguồn sữa bò ở trường Đại học Cần Thơ, xác định các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO như pH, nhiệt độ, nồng độ xanthine và enzyme XO; khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol các thảo dược; ly trích và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức 1
5. chế enzyme XO từ thảo dược tiềm năng; khảo sát ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm năng lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột thực nghiệm. 1.4 Ý nghĩa của luận án Luận án đã tạo được cơ sở khoa học về khả năng ức chế enzyme XO của 8 loại thảo dược bao gồm: Húng chanh, kinh giới, cây râu mèo, cây sương sáo, dền gai, nở ngày, nở ngày đất và cỏ xước. Luận án còn có một ý nghĩa đặc biệt là chứng minh được cao ethanol cỏ xước và hợp chất quercitrin được cô lập từ cây cỏ xước có hoạt tính ức chế enzyme XO mạnh; Cao ethanol cỏ xước có tác dụng làm nồng độ acid uric huyết thanh chuột bị tăng acid uric giảm xuống đạt mức bình thường. Từ đó, mở ra hướng ứng dụng cây cỏ xước và hợp chất quercitrin trong phòng trị tăng acid uric trong máu. 1.5 Những đóng góp mới của luận án - Đã phân lập được enzyme XO từ nguồn sữa bò địa phương có hoạt tính tương đương với hoạt tính của enzyme thương mại. Các điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO đã được xác định. - Cao chiết của 8 loại thảo dược ở đồng bằng sông Cửu Long đã được khảo sát khả năng ức chế enzyme XO. Cao chiết ethanol cỏ xước là một đối tượng mới đã được chứng minh có tác dụng ức chế enzyme XO và làm nồng độ acid uric huyết thanh chuột bị tăng acid uric xuống đạt mức bình thường. Đề tài đã ly trích được 3 hợp chất có khả năng ức chế enzyme XO từ cây cỏ xước. Trong đó, quercitrin có hoạt tính ức chế khá mạnh enzyme XO (IC50 = 37,7 µg/mL). CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện với 4 nội dung chính như sau: (1) Nội dung 1: Chuẩn bị nguồn enzyme XO từ sữa bò. (2) Nội dung 2: Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO in vitro của các thảo dược. (3) Nội dung 3: Ly trích một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược. (4) Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột thực nghiệm. 2
6. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chuẩn bị nguồn enzyme xanthine oxidase 2.2.1.1 Ly trích enzyme xanthine oxidase từ sữa bò Ba lít sữa bò tươi vừa vắt từ cơ thể bò được cho vào thùng lạnh, nhanh chóng mang về phòng thí nghiệm và tiến hành phân lập enzyme ở điều kiện 4°C. Trước tiên, 3 L sữa bò tươi được cho thêm vào các chất lần lượt như sau: 7,5 mL ethylenediaminetetraacetic acid 0,3 M, pH 7,0; 3 mL salicylate 1 M, pH 7,0; 3,6 g cysteine·HCl; 3 mL phenylmethylsulfonyl fluoride 0,1 M (được pha trong ethanol); 47,4 g Na2CO3; 4,74 g pancreatin. Hỗn hợp được khuấy trong 30 phút, sau đó để yên qua đêm ở 4°C. Sau 24 giờ, hỗn hợp được thêm 0,6 kg (NH4)2SO4 và khuấy trong thời gian 1 giờ. Tiếp theo, hỗn hợp được thêm 0,5 L 1-butanol lạnh (- 20°C), khuấy 30 phút và tiếp tục để yên hỗn hợp qua đêm ở 4°C. Sau 24 giờ, hỗn hợp tách thành 2 lớp: lớp phía trên màu trắng chứa lipid, lớp dưới có dạng dung dịch màu vàng đậm chứa enzyme XO. Lớp màu trắng chứa lipid được bỏ đi, lớp dung dịch màu vàng đậm phía dưới được sử dụng để tiếp tục ly trích enzyme XO. Ba trăm sáu mươi gram (NH4)2SO4 được thêm vào 2,25 L dung dịch màu vàng đậm. Hỗn hợp được khuấy trong 30 phút và để yên trong 1 giờ. Enzyme XO thô đông lại và nổi lên bề mặt, lớp chất lỏng phía dưới được loại bỏ. Phần enzyme XO thô tiếp tục được ly tâm 5.000 vòng/phút trong 20 phút. Sau khi ly tâm, hỗn hợp được phân thành 3 lớp: lớp chất lỏng phía trên, lớp chất rắn ở giữa và lớp chất lỏng khác ở phía dưới. Chất lỏng phía trên và phía dưới được loại bỏ, lớp chất rắn ở giữa được giữ lại để tiếp tục tinh sạch enzyme XO. Chất rắn sau ly tâm được cho vào thêm 45 mL dung dịch đệm phosphate 0,1 M; ethylenediaminetetraacetic acid 0,3 mM, salicylate 1 mM, phenylmethylsulfonyl fluoride 10 µM, pH 6,0 và thẩm tích trong 72 giờ. Sản phẩm sau thẩm tích được đông khô chân không và sau đó trữ ở - 20°C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 3
7. Hàm lượng protein hòa tan trong hỗn hợp enzyme XO trích được được xác định theo phương pháp Lowry 2.2.1.2 Xác định sự hiện diện của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập bằng phương pháp điện di SDS-PAGE Nguyên tắc: điện di SDS-PAGE là kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide có sự hiện diện của chất gây biến tính SDS (Sodium Dodecyl Sulphate). Các phân tử SDS mang điện âm sẽ tương tác với protein và bám dọc chiều dài phân tử. Phân tử protein hoàn toàn tích điện âm và dịch chuyển trong điện trường từ cực âm sang cực dương. Chất khử beta-mercaptoethanol khử cầu nối disulfite trong phân tử protein. Các tiểu đơn vị trong hỗn hợp enzyme có cùng mật độ điện tích và cùng di chuyển trong một điện trường như nhau. Khi đó tốc độ di chuyển trong điện trường của enzyme phụ thuộc chủ yếu vào kích thước phân tử và độ tinh sạch của sản phẩm. Gel điện di gồm 2 lớp: - Lớp gel tập trung: Nằm ở trên, giúp tập trung protein tạo thành một băng. Lớp gel tập trung này có kích thước lỗ rất lớn (acrylamide 4%) cho phép protein di chuyển nhanh và tập trung lại dưới tác dụng của điện trường. Lớp gel phân tích: Nằm ở dưới, giúp các protein từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu phân tách nhau theo trọng lượng phân tử. Đề tài thực hiện điện di với gel polyacrylamide 6%. 2.2.1.3 Xác định hoạt tính của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập Nguyên tắc: Hoạt tính của enzyme XO ly trích từ sữa bò được xác định thông qua lượng acid uric tạo thành theo phản ứng: XO Xanthine + O2 + H2O Acid uric + H2O2 Lượng acid uric tạo thành được định lượng bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 290 nm. Phương pháp: Hỗn hợp phản ứng gồm 1,9 mL dung dịch đệm phosphate (pH 7,5), 1 mL xanthine nồng độ 0,15 mM và 0,1 mL enzyme XO nồng độ 1 4
8. mg/mL. Mẫu trắng được thực hiện trong điều kiện không có enzyme, dung dịch enzyme được thay thế bằng dung dịch đệm với cùng thể tích. Phản ứng được thực hiện trong cuvette thạch anh có độ dày 1 cm. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 25°C. Thời gian phản ứng (T) được tính từ lúc cho enzyme vào hỗn hợp mẫu thử đến khi giá trị hấp thu tia UV bắt đầu không tăng thêm nữa. Độ hấp thu tia UV được đo ở bước sóng 290 nm. Hoạt tính của enzyme được tính bằng công thức: (Amẫu thử - Amẫu trắng) 3 C = 12,2 0,1 T Hoạt tính riêng của enzyme được tính theo công thức: C S = P Hoạt tính của enzyme có trong 1 mg enzyme thô ở thể rắn được tính theo công thức: C R = D Trong đó: A: độ hấp thu quang phổ lớn nhất của mẫu trong thời gian phản ứng. 12,2: hệ số hấp thụ milimol phân tử của acid uric tại bước sóng 290 nm (mM-1.cm-1) 3: thể tích hỗn hợp phản ứng (mL) 0,1: thể tích enzyme cho vào (mL) T: thời gian phản ứng C: hoạt tính của enzyme (U/mL enzyme) S: hoạt tính riêng của enzyme (U/mg protein) P: khối lượng protein có trong 1 mL dung dịch enzyme (mg protein/mL enzyme) R: Số đơn vị hoạt tính có trong 1 mg enzyme thô ở thể rắn (U/mg enzyme thô) D: Khối lượng enzyme thô ở thể rắn đã hòa tan trong 1 mL dung dịch enzyme (mg enzyme thô/mL enzyme) 5
9. 2.2.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên enzyme xanthine oxidase trích được Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt động của enzyme XO được thực hiện tương tự như thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme XO. Thí nghiệm gồm 2 nhân tố là pH với các mức độ pH 6,5; 7; 7,5 và 8,0; và nhiệt độ ở các mức độ 20, 25, 30 và 35°C. 2.2.1.5 Khảo sát nồng độ xanthine và xanthine oxidase phù hợp cho phản ứng Thí nghiệm được thực hiện trên đĩa 96 giếng Costar 3635. Nồng độ xanthine và enzyme XO phù hợp được chọn dựa vào hiệu suất phản ứng tạo thành acid uric từ xanthine, với sự xúc tác của enzyme XO ở nhiệt độ 25°C và pH 7,5 (xác định từ thí nghiệm trên). Hỗn hợp trong mỗi giếng thử bao gồm: 85 µL dung dịch đệm phosphate (0,05 M; pH 7,5), 60 µL xanthine, 30 µL enzyme XO, sau 30 phút cho thêm 25 µL HCl 1 N. Dung dịch xanthine được sử dụng trong thí nghiệm với các nồng độ 0; 0,075; 0,15; 0,3 và 0,6 mM. Dung dịch enzyme XO được sử dụng với các nồng độ 0; 0,005; 0,01; 0,02 và 0,04 U/mL. Song song với mỗi mẫu thử có một mẫu trắng. Mẫu trắng là mẫu được thực hiện tương tự như mẫu thử, nhưng HCl được cho vào trước enzyme. Độ hấp thu của lượng acid uric mới tạo thành trong phản ứng bằng độ hấp thu của mẫu thử trừ đi độ hấp thu của mẫu trắng tương ứng. Từ độ hấp thu của lượng acid uric mới tạo thành trong phản ứng, dựa vào đường chuẩn acid uric sẽ xác định lượng acid uric tạo thành. Mỗi phản ứng được thực hiện lặp lại 3 lần. Các nghiệm thức của thí nghiệm được bố trí theo kiểu thừa số 2 nhân tố: nồng độ xanthine và nồng độ enzyme XO. Hiệu suất phản ứng tạo thành acid uric từ xanthine dưới sự xúc tác của enzyme XO được tính theo công thức sau: Lượng acid uric tạo thành trên thực tế (mM) Hiệu suất phản ứng (%) = 100% Lượng acid uric tạo thành trên lý thuyết (mM) So sánh hiệu suất phản ứng giữa các nghiệm thức để chọn nồng độ xanthine và nồng độ enzyme XO phù hợp để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 6
10. 2.2.1.6 So sánh hoạt tính của enzyme xanthine oxidase phân lập từ sữa bò và enzyme xanthine oxidase thương mại Khả năng ức chế enzyme XO (được ly trích từ sữa bò) của AP được thực hiện trên đĩa 96 giếng dựa vào lượng acid uric tạo thành. Hỗn hợp trong mỗi giếng thử bao gồm: 50 µL dung dịch AP, 35 µL dung dịch đệm phosphate, 30 µL dung dịch enzyme XO 0,02 U/mL, ủ ở điều kiện 25°C trong 15 phút, tiếp theo cho thêm 60 µL dung dịch xanthine 0,15 mM ủ ở 25°C trong 30 phút. Sau đó, 25 µL HCl 1 N được thêm vào để cố định mẫu. Cuối cùng mẫu được đo ở bước sóng 290 nm để xác định lượng acid uric tạo thành. Các giếng thử là các giếng có nồng độ AP với các nồng độ lần lượt là: 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5 và 20 µg/mL. Giếng sử dụng AP với nồng độ 0 µg/mL được xem là giếng đối chứng. Tương ứng với mỗi giếng thử có một giếng trắng thử, tương ứng với giếng đối chứng có một giếng trắng đối chứng được thực hiện. Giếng trắng là giếng được thực hiện tương tự như giếng thử. Tuy nhiên, HCl được cho vào giếng trước khi cho enzyme XO vào. Mỗi giếng được thực hiện lặp lại 3 lần. Từ kết quả của thí nghiệm này, đường chuẩn theo phần trăm enzyme XO bị ức chế bởi AP được xây dựng. Khả năng ức chế enzyme XO thương mại của AP cũng được thực hiện tương tự như trên. Dựa trên cơ sở đó, hiệu quả ức chế của AP đối với enzyme XO phân lập từ sữa bò và enzyme thương mại được so sánh với nhau. Phần trăm ức chế được tính theo công thức I (%) = [(Ađối chứng - Athử)/ Ađối chứng] 100 Trong đó: Ađối chứng : Là độ hấp thu quang phổ của mẫu đối chứng Athử: Là độ hấp thu quang phổ của mẫu thử Ađối chứng= Ađối chứng – A mẫu trắng của mẫu đối chứng Athử= Athử - Amẫu trắng của mẫu thử 7
11. 2.2.2 Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của các thảo dược 2.2.2.1 Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của cao tổng ethanol được chiết từ các thảo dược Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa 96 giếng Costar 3635. Hỗn hợp phản ứng 200 µL trong mỗi giếng thử bao gồm 50 µL dung dịch cao chiết, 35 µL dung dịch đệm phosphate (0,05 M; pH 7,5), 30 µL dung dịch enzyme XO, ủ ở điều kiện 25°C trong 15 phút, tiếp theo cho thêm 60 µL dung dịch xanthine ủ ở 25°C trong 30 phút. Sau đó, 5 µL HCl 1 N được thêm vào để ngừng hoạt động của enzyme XO. Cuối cùng mẫu được đo ở bước sóng 290 nm để xác định lượng acid uric tạo thành. Cao ethanol của từng thảo dược được sử dụng với các nồng độ 0; 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200; 400 và 800 µg/mL. Trong đó, nghiệm thức sử dụng nồng độ 0 µg/mL là nghiệm thức đối chứng. Mỗi nồng độ được tiến hành lặp lại 3 lần. Song song với mỗi mẫu thử có 1 mẫu trắng. Mẫu trắng là mẫu được thực hiện tương tự như mẫu thử, nhưng HCl được cho vào hỗn hợp trước khi cho enzyme XO vào hỗn hợp nhằm tạo môi trường để enzyme không hoạt động được. Phần trăm ức chế được tính theo công thức % ức chế = [(∆Ađối chứng - ∆Athử)/∆Ađối chứng] ×100 Trong đó: A là độ hấp thu quang phổ của mẫu ở bước sóng 290 nm ∆Ađối chứng = Ađối chứng - Amẫu trắng của mẫu đối chứng ∆Athử = Athử - Amẫu trắng của mẫu thử Hiệu quả ức chế của cao ethanol được xác định dựa vào hiệu suất ức chế và giá trị IC50. Giá trị IC50 được tính dựa vào phương trình tuyến tính của từng cao chiết. - Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu suất ức chế hoạt động của enzyme XO và giá trị IC50. Hiệu suất ức chế hoạt động của enzyme XO được tính theo công thức: Độ hấp thu của mẫu đối chứng – Độ hấp thu của mẫu thí nghiệm H= × 100% Độ hấp thu của mẫu đối chứng 8
12. 2.2.2.3 IC50 và cách xác định Định nghĩa: IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% enzyme. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp. Cách xác định IC50: Tiến hành khảo sát hoạt tính của mẫu ở nhiều nồng độ 0; 6,25; 12,5; 25; 50; 100; 200; 400 và 800 µg/mL. Với mỗi loại thảo dược, chọn ít nhất 5 giá trị có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, một đường thẳng y=ax+b qua tất cả các điểm được vẽ với y là % ức chế và x là nồng độ. Thay y=50% vào phương trình sẽ thu được giá trị x. Đó chính là nồng độ ức chế được 50% enzyme (IC50). Cao chiết có khả năng ức chế enzyme XO mạnh nhất được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 2.2.3 Ly trích hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase 2.2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của các cao phân đoạn được chiết từ thảo dược tiềm năng a. Điều chế các cao phân đoạn Cao tổng của cây cỏ xước được hòa tan trở lại với nước (100 g cao trong 200 mL nước) trong bình chiết. Tiến hành chiết lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexane, ethyl acetate và n-butanol, phần dịch còn lại sau khi chiết với các dung môi gọi là phân đoạn nước. Phần dịch chiết của từng phân đoạn được cô cạn bằng máy cô quay chân không cho ra các cao tương ứng, với phân đoạn nước được tiến hành đông khô chân không để thu được cao nước. Các cao phân đoạn này được trữ ở 4°C để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. b. Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của các cao phân đoạn: được thực hiện tương tự cao tổng (đã trình bày ở mục 3.2.2.2). Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất ức chế enzyme XO của từng phân đoạn và chỉ số IC50 của từng phân đoạn (cách tính đã trình bày ở mục 2.2.2.3). 9
13. Phân đoạn ethyl acetate có khả năng ức chế enzyme XO mạnh nhất và được sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo. 2.2.3.2 Thí nghiệm 2: Cô lập các chất từ cao phân đoạn ethyl acetate Phân đoạn ethyl acetate được sử dụng để cô lập chất tinh khiết bằng phương pháp sắc ký cột hở (silica gel). Các hợp chất tinh khiết sau khi được cô lập sẽ được khảo sát khả năng ức chế enzyme XO. Cách làm tương tự như khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao tổng ethanol (đã trình bày ở mục 2.2.2.3). Tính được IC50 của mỗi chất. Chất có hoạt tính ức chế mạnh enzyme XO được tiếp tục xác định kiểu ức chế. Chất tinh khiết đã cô lập được tiến hành xác định cấu trúc phân tử của hợp chất. Cấu trúc phân tử hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ nghiệm như: HMBC, DEPT, 1D- và 2D-NMR kết hợp với các tài liệu tham khảo đã công bố. 2.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột thực nghiệm 2.2.4.1 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột bình thường Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng đực, khỏe mạnh, có trọng lượng trung bình 28,3±2,17 g. Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm và chia ngẫu nhiên thành 6 nghiệm thức (NT), mỗi NT 7 con chuột: + NT1 (Nhóm đối chứng sinh lý): chuột bình thường uống nước. + NT2: Nhóm uống dung môi pha thuốc là natri carboxymetyl cellulose (CMC-Na) 0,5%. + NT3 (Nhóm đối chứng thuốc): uống AP được pha trong CMC- Na 0,5% với liều 10 mg/kg. + NT 4, 5, 6 (Các nhóm thử): uống cao ethanol cỏ xước được pha trong CMC-Na 0,5% với các mức liều thử 150, 300 và 450 mg/kg. Chuột được uống nước hoặc CMC-Na 0,5% hoặc AP hoặc cao chiết với cùng thể tích 0,1 mL/10 g chuột vào lúc 9 giờ hàng ngày trong vòng 5 ngày. Trước khi dùng dung môi hoặc thuốc 1,5 giờ, chuột không 10
14. được ăn nhưng được uống nước bình thường. Ngày thứ năm, sau khi uống thuốc lần cuối 2 giờ, giải phẫu lấy máu từ tim chuột. Máu chuột được cho vào ống chống đông và mang đến Trung tâm Bảo vệ Sức khỏe Lao động và Môi trường Thành phố Cần Thơ để đo nồng độ acid uric. - Thông số đánh giá: + Nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm. + Tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột ở NT2, NT3, NT4, NT5 và NT6 so với NT1. C1 Ct I(%) = × 100% C1 Trong đó: I (%): Tỷ lệ giảm acid uric huyết thanh chuột ở NT2, NT3, NT4, NT5 và NT6 so với NT1. C1: Nồng độ acid uric huyết thanh chuột ở NT1. Ct: Nồng độ acid uric huyết thanh chuột ở NT2, NT3, NT4, NT5 và NT6. 2.2.4.2 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng đực, khỏe mạnh, có trọng lượng trung bình 28,3±2,17 g. Chuột được gây tăng acid uric cấp bằng tiêm kali oxonate vào màng bụng của chuột nhắt trắng. Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm và chia ngẫu nhiên thành 7 NT, mỗi NT 7 con chuột: + NT1 (Nhóm đối chứng sinh lý): chuột bình thường uống nước. + NT2: Nhóm uống dung môi pha thuốc CMC-Na 0,5%. + NT3 (Nhóm đối chứng bệnh lý): chuột uống CMC-Na 0,5%, gây tăng cấp acid uric bằng cách tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonate. + NT4 (Nhóm đối chứng thuốc) chuột uống thuốc đối chiếu AP được pha trong CMC-Na 0,5% liều 10 mg/kg, gây tăng cấp acid uric bằng cách tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonate. 11
15. + NT5, 6, 7 (Các nhóm thử): chuột uống cao ethanol cỏ xước được pha trong CMC-Na 0,5% với các mức liều 150, 300, 450 mg/kg, gây tăng cấp acid uric bằng cách tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonate. Chuột được uống nước hoặc CMC-Na 0,5% hoặc AP hoặc cao chiết với cùng với thể tích 0,1 mL/10 g trọng lượng chuột vào lúc 9 giờ hàng ngày trong vòng 5 ngày trước khi làm thực nghiệm. Trước khi dùng nước cất hoặc thuốc 1,5 giờ, chuột nhịn ăn nhưng được uống nước bình thường. Ngày thứ năm, chuột ở các NT được tiêm màng bụng kali oxonate pha trong nước cất với liều 500 mg/kg (NT1 và NT2, chuột được tiêm CMC-Na 0,5%) một giờ trước khi uống thuốc lần cuối. Sau khi uống thuốc 2 giờ, chuột được giải phẫu để lấy máu từ tim chuột. Máu chuột được cho vào ống chống đông và chuyển đến Trung tâm Bảo vệ Sức khỏe Lao động và Môi trường Thành phố Cần Thơ để đo nồng độ acid uric. - Thông số đánh giá: + Nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm. + Tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh chuột ở NT4, NT5, NT6 và NT7 so với NT3: C3 - Ct I% = x 100% Trong đó: C3 C3: nồng độ acid uric huyết thanh chuột ở NT3. Ct: nồng độ acid uric huyết thanh chuột ở NT4, NT5, NT6 và NT7. I (%): tỷ lệ giảm acid uric huyết thanh chuột ở NT4, NT5, NT6 và NT7 so với NT3. 2.2.4.3 Đánh giá ảnh hưởng của cao ethanol cỏ xước đến hoạt tính enzyme xanthine oxidase gan chuột thí nghiệm Gan chuột được lấy từ thí nghiệm ở mục 2.2.4.2 được sử dụng để khảo sát hoạt tính enzyme XO. Một gram gan của mỗi con chuột được cắt thành các mảnh nhỏ, cho vào ống nghiệm có sẵn 1 mL dung dịch đệm phosphate lạnh (pH = 7,5). Nghiền gan trong điều kiện lạnh đến khi thu được dịch đồng thể, sau đó thêm dần 14 mL dung dịch đệm phosphate lạnh vào dịch đồng thể và khuấy đều. Dịch nghiền thu được được ly tâm lạnh ở 4°C với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch nổi 12
16. tiếp đem ly tâm lạnh ở 4°C với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 60 phút. Sau khi ly tâm, phần dịch trong được dùng để thực hiện phản ứng xác định hoạt tính enzyme. Phản ứng enzyme được thực hiện trong ống nghiệm mẫu thử chứa 2,9 mL đệm phosphate (0,05M, pH 7,5), 2,5 mL dung dịch đệm cơ chất gồm xanthine 0,12 mM, EDTA 0,192 mM, kali oxonate 2,2 mM. Trước khi tiến hành phản ứng, dịch enzyme và cơ chất được ủ ở 37°C trong 15 phút. Thời gian phản ứng được tính từ lúc thêm 0,1 mL dịch enzyme vào ống nghiệm chứa dung dịch cơ chất. Tiếp tục ủ trong 30 phút. Sau đó, 0,5 mL HCl 1 N được thêm vào hỗn hợp để dừng phản ứng. Dung dịch sau phản ứng được đo ở bước sóng 290 nm. Cuvette thạch anh được sử dụng có độ dày 1 cm. Mẫu đối chứng được tiến hành tương tự như mẫu thử, nhưng 0,5 mL HCl 1 N được đưa vào ống nghiệm trước khi cho dịch enzyme vào để bất hoạt enzyme. Mẫu trắng là mẫu chứa 5,5 mL đệm phosphate (pH 7,5) và 0,5 mL HCl 1 N. Mỗi đơn vị hoạt tính (U) của enzyme XO được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác chuyển 1 µmol xanthine thành acid uric trong mỗi phút ở điều kiện 37°C và pH 7,5. Hoạt tính riêng của enzyme (U/g protein) được xác định là số đơn vị hoạt tính của enzyme có trong 1 g protein. Hàm lượng protein trong gan được định lượng bằng phương pháp Lowry . Thông số đánh giá của enzyme XO được trích từ gan chuột (Athử - Achứng) × V × 15 + Số đơn vị hoạt tính/1 g gan = 12,2 × Ve × T Số đơn vị hoạt tính có trong 1 g gan + Hoạt tính riêng (U/g protein) = Số g protein có trong 1 g gan Trong đó: Athử : độ hấp thu quang phổ của mẫu thử. Achứng: độ hấp thu quang phổ của của mẫu đối chứng. 13
17. 12,2: hệ số hấp thụ milimol phân tử của acid uric tại bước sóng 290 nm (mM-1.cm-1). V: thể tích phản ứng (mL). 15: hệ số pha loãng. Ve: thể tích enzyme cho vào phản ứng (mL). T: thời gian phản ứng (phút). + Mức độ ức chế enzyme được tính theo công thức: (1-B/A) x 100 (%) Trong đó, A và B là hoạt tính enzyme XO trên gan chuột nhóm đối chứng sinh lý và nhóm thử. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Chuẩn bị nguồn enzyme xanthine oxidase 3.1.1 Ly trích enzyme xanthine oxidase từ sữa bò Sữa bò là nguyên liệu được chọn để phân lập enzyme XO vì enzyme XO có nhiều trong sữa bò và enzyme XO từ sữa bò gần giống với enzyme XO từ cơ thể người. Trình tự acid amin tương đồng khoảng 90%. Ngoài ra, sữa bò là nguồn nguyên liệu dễ tìm, giá rẻ ở địa phương. Từ 3 L (3128 g) sữa bò tươi đã phân lập được 1,5 g enzyme thô ở trạng thái rắn, dạng bột. Từ kết quả này suy ra được hiệu suất ly trích enzyme XO từ sữa bò là 0,048%. 3.1.2 Hàm lượng protein hòa tan trong hỗn hợp protein thô 0,7 y = 1,465x - 0,0066 0,6 R² = 0,986 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Độ hấp thu OD ở 750 nm ở 750 OD thu hấp Độ 0 0,1 0,2 0,3 0,4 Nồng độ BSA (mg/mL) Hình 3.1: Sự phụ thuộc của độ hấp thu quang phổ vào nồng độ dung dịch protein chuẩn 14
18. Đường chuẩn BSA được xây dựng có phương trình là y=1,465x– 0,0066 (Hình 3.1). Từ độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 750 nm của dung dịch enzyme trích được, đối chiếu với đường chuẩn BSA, suy ra được hàm lượng protein là 0,509 mg/mg protein thô. 3.1.3 Xác định sự hiện diện của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập bằng phương pháp điện di SDS-PAGE Kết quả điện di cho thấy protein thô phân lập được từ sữa bò có sự xuất hiện của băng trùng với băng của enzyme XO thương mại và có trọng lượng phân tử khoảng 283 kDa (Hình 3.2). Hình 3.2: Kết quả điện di SDS-PAGE của enzyme XO phân lập và thương mại. Kết quả này là cơ sở ban đầu cho thấy enzyme trích được có thể là enzyme XO. 3.1.4 Xác định hoạt tính của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập Kết quả cho thấy số đơn vị hoạt tính có trong 1 mg enzyme thô là 0,2095 U và hoạt tính riêng của enzyme là 0,412 U/mg protein. Trong khi hoạt tính riêng của enzyme thương mại (Sigma Aldrich, Mỹ; mã hàng X1875) được công bố từ nhà sản xuất là 0,6 U/mg protein. So sánh hoạt tính riêng của enzyme XO phân lập được và enzyme XO thương mại cho thấy enzyme XO thương mại có độ tinh sạch cao hơn enzyme XO phân lập được. 15
19. 3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên xanthine oxidase trích được Kết quả trình bày ở Hình 3.3 cho thấy hoạt tính của enzyme XO cao nhất ở nhiệt độ 25C và pH 7,5, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với tất cả các nghiệm thức khác. Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Evans et al. (2005). Nhóm tác giả này đã xác định được pH tối ưu cho hoạt động của enzyme XO từ sữa bò là 7,5. Nhiều nghiên cứu về hoạt tính của enzyme XO thương mại trích từ sữa bò đã chọn pH 7,5 và nhiệt 25°C để thực hiện phản ứng (Anam et al., 2017; Bambrana et al., 2017). Vì vậy, pH 7,5 và nhiệt độ 25°C được chọn để thực hiện cho các thí nghiệm tiếp theo. 0,5 0,4 35°C 0,3 30°C 0,2 25°C 0,1 20°C Hoạt tính XO (U/mL) tínhXO Hoạt 0 6,5 6,75 7 7,25 7,5 7,75 8 pH Hình 3.3: Hoạt tính của enzyme XO ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau 3.1.6 Khảo sát nồng độ xanthine và xanthine oxidase phù hợp cho phản ứng Kết quả trình bày ở Hình 3.4 cho thấy ở các nghiệm thức nồng độ xanthine 0,075 mM có hiệu suất phản ứng cao nhất so với các nghiệm thức ở các nồng độ xanthine khác. Tuy nhiên, các hỗn hợp ở các nghiệm thức nồng độ xanthine 0,075 mM có độ hấp thu quang phổ từ 0,157 đến 0,234, không phù hợp cho việc nghiên cứu khả năng ức chế enzyme XO. Nghiệm thức được thực hiện với nồng độ xanthine 0,15 mM và nồng độ enzyme XO 0,02 U/mL có hiệu suất phản ứng cao hơn và khác biệt có ý 16
20. nghĩa thống kê so với các nghiệm thức nồng độ xanthine 0,3 và 0,6 mM. Đồng thời, độ hấp thu quang phổ của hỗn hợp ở nghiệm thức này từ 0,233 đến 0,388, phù hợp cho việc khảo sát hiệu quả ức chế enzyme XO. Vì vậy, nồng độ xanthine 0,15 mM và nồng độ enzyme XO là 0,02 U/mL được chọn để thực hiện các thí nghiệm về khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết. 100 80 60 Xanthine 0,075 mM 40 Xanthine 0,15 mM Xanthine 0,3 mM 20 Xanthine 0,6 mM 0 Hiệu suất phản ứng (%)ứng phản suất Hiệu 0 0,005 0,01 0,02 0,04 Nồng độ enzyme XO (U/mL) Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ xanthine và enzyme XO đến hiệu suất phản ứng hình thành acid uric 3.1.7 So sánh hoạt tính của enzyme xanthine oxidase phân lập từ sữa bò và enzyme xanthine oxidase thương mại Khi so sánh hoạt tính xúc tác của enzyme dựa trên hiệu quả ức chế của AP, kết quả cho thấy cả hai enzyme thương mại và enzyme phân lập có hoạt tính tương đương nhau ở tất cả các nồng độ khảo sát qua phép so sánh cặp ở mức ý nghĩa 5%. Từ đó có thể kết luận, enzyme XO được phân lập trong nghiên cứu này có thể thay thế enzyme XO thương mại để khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của các chất. 3.2 Khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của cao tổng ethanol được chiết từ các thảo dược Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol các thảo dược được trình bày trong Hình 3.5. 17
21. 100 Nở ngày Húng chanh 80 Cỏ xước 60 Râu mèo Nở ngày đất 40 Dền gai Kinh giới 20 Sương sáo Phần trăm chế (%) Phần ức trăm 0 0 500 1000 Nồng độ cao chiết (µg/mL) Hình 3.5: Khả năng ức chế enzyme XO của 8 loại cao chiết Kết quả cho thấy cao chiết ethanol cây nở ngày, húng chanh gần như không có khả năng ức chế enzyme XO ở các nồng độ khảo sát. Cao ethanol cây dền gai ức chế enzyme XO yếu, ở tất cả các nồng độ khảo sát tỉ lệ enzyme XO bị ức chế chưa đạt 50%. Vì vậy, với dãy nồng độ cao chiết đã khảo sát, chưa xác định được IC50 của cao chiết. Các cao chiết còn lại bao gồm cao ethanol cây sương sáo, râu mèo, kinh giới, nở ngày đất và cỏ xước đều cho thấy có hoạt tính ức chế enzyme XO với giá trị IC50 được trình bày trong bảng 3.1. Bảng 3.1: Giá trị IC50 của các thảo dược khảo sát Thảo dược IC50±sd Sương sáo 222a±2,95 Cây râu mèo 142,7b±3,91 Kinh giới 138,1c±1,56 Nở ngày đất 42,6d±2,94 Cỏ xước 17,5e±0,1 AP 9,24f±0,275 Ghi chú: Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p <0,01 Kết quả cho thấy, cao ethanol cây cỏ xước có tác dụng ức chế enzyme XO mạnh nhất trong các cao chiết khảo sát với IC50 là 17,5 18
22. μg/mL. IC50 của đối chứng dương AP là 9,24±0,275 μg/mL. Một số thảo dược có tác dụng ức chế mạnh enzyme XO đã được xác định như cao chiết methanol cây Ngãi cứu (Artemisia vulgaris), Tô mộc (Caesalpinia sappan), Đại bi (Blumea balsamifera), Cúc (Chrysanthemum sinense) và Chặc chìu (Tetracera scandens) có IC50 dưới 20 µg/mL. IC50 của đối chứng dương AP là 2,5 µM (Nguyen et al., 2004). Chiết xuất từ methanol của lá cây ngũ trảo (Vitex Negundo L.) và lá cây cà độc dược (Datura metel L.) IC50 lần lượt là 78,5 μg/mL và 76,8 μg/mL (Umamaheswari et al., 2007). 3.3 Ly trích hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase từ cao ethanol cỏ xước 3.3.1 Kết quả ly trích các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase từ cao ethanol cỏ xước Cỏ xước sau khi thu hái (33 kg), sấy khô thu được 2,8 kg. Tiến hành chiết với ethanol, cô quay đuổi dung môi thu được 242 g cao tổng. Bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng, từ 242 g cao tổng đã thu được 21,5 g cao n-hexane, 49,6 g cao ethyl acetate, 76,7 g cao n-butanol và 61,4 g cao nước. Khả năng ức chế enzyme XO của các phân đoạn cỏ xước được trình bày trong Bảng 3.2. Bảng 3.2: Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết cỏ xước và của AP Phân đoạn IC50 (µg/mL) n-Hexane Không ức chế Ethyl acetate 26,9 n-Butanol 112 Nước Không ức chế Cao tổng 17,5 AP 9,24 Kết quả cho thấy, cao ethyl acetate ức chế enzyme XO mạnh nhất trong các phân đoạn với IC50=26,9 µg/mL. Vì vậy, phân đoạn ethyl 19
23. acetate được chọn để tiếp tục tinh sạch chất có hoạt tính ức chế enzyme XO. Các hợp chất đã cô lập được ký hiệu lần lượt là CXQ01, CXQ02, CXQ03, CXQ04 và CXQ05. Trong 5 hợp chất ly trích được, hợp chất CXQ01 và hợp chất CXQ04 không có hoạt tính ức chế enzyme XO; 3 hợp chất còn lại là CXQ02, CXQ03 và CXQ05 có hoạt tính ức chế enzyme XO với IC50 lần lượt là 14,6; 103,2 và 37,7 µg/mL (Bảng 3.3). Bảng 3.3 Giá trị IC50 của các hợp chất Hợp chất IC50 (µg/mL) CXQ01 Không ức chế CXQ02 14,6 CXQ03 103,2 CXQ04 Không ức chế CXQ05 37,7 Tiến hành phổ nghiệm cấu trúc và đối chiếu với tài liệu tham khảo đã xác định cấu trúc của các chất CXQ02, CXQ03 và CXQ05 lần lượt là quercetin, hesperetin và quercitrin (Hình 3.6). (A) (B) (C) Hình 3.7: Cấu trúc hợp chất (A) CXQ02 (quercetin), (B) CXQ03 (hesperetin) và (C) CXQ05 (quercitrin) Quercetin là hợp chất đã từng được cô lập từ cây cỏ xước (Tôn Nữ Liên Hương et al., 2012). Sau khi xác định công thức phân tử của các hợp chất cô lập được cho thấy quercetin (CXQ02), hesperetin (CXQ03) có hoạt tính ức chế enzyme XO với IC50 lần lượt là 14,6; 103,2 µg/mL. Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Nagao et al. (1999). Nhóm nghiên cứu của Nagao đã công bố quercetin và hesperetin ức chế enzyme XO với IC50 lần lượt là 0,44 và >100 μM. 20
24. Quercitrin (CXQ05) ức chế enzyme XO khá mạnh với IC50 là 37,7 µg/mL. Quercitrin có cấu trúc phân tử giống với quercetin và có gắn thêm nhóm -O-a-L-rhamnoside ở vị trí C3 (Hình 3.7). Có lẽ vì thế mà quercitrin có hoạt tính ức chế enzyme XO. Quercitrin là hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO mà trước đây chưa được công bố. Vì vậy, quercitrin được nghiên cứu tiếp về kiểu ức chế. 3.3.2 Kiểu ức chế của hợp chất CXQ05 (quercitrin) Xanthine với các nồng độ 0,025; 0,05; 0,075; 0,1; 0,125 mM; Hợp chất CXQ05 (quercitrin) với nồng độ 25 và 50 µg/mL được đề tài chọn để dựng đồ thị Lineweaver-Burk (Hình 3.8). 200 160 120 [I] = 0 µg/mL 80 [I] = 25 µg/mL 40 [I] = 50 µg/mL 1/V0 (Phút/mM) 0 -40 10 60 1/[S] (1/mM) Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn 1/V0 theo 1/[S] với các nồng độ khác nhau của hợp chất CXQ05 (quercitrin) Hình 3.8 cho thấy ba đường thẳng tương ứng với 3 nồng độ CXQ05 (quercitrin) là 0; 25 và 50 µg/mL cắt nhau tại một điểm không nằm trên trục tung và trục hoành. Điều đó cho thấy, CXQ05 ức chế enzyme XO theo kiểu hỗn hợp. Kiểu ức chế này giống với kiểu ức chế của quercetin (Nagao et al., 1999). Sự giống nhau này có lẽ do cấu trúc của quercetin và quercitrin giống nhau, chỉ khác ở vị trí C3 của quercitrin có thêm nhóm -O-a-L-rhamnoside (Hình 3.7). 21
25. 3.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột thực nghiệm 3.4.1 Ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột bình thường Kết quả đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột bình thường được trình bày trong Bảng 3.4. Bảng 3.4: Ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột bình thường Nghiệm thức Nồng độ acid uric (µmol/L) ±SD Chuột bình thường uống nước 126,3a±11,6 Chuột bình thường uống CMC_Na 129,7a±42,1 Chuột bình thường uống AP 10 mg/kg 42,3b±19,1 Chuột bình thường uống cao chiết cỏ xước 150 mg/kg 128,3a±32,5 Chuột bình thường uống cao chiết cỏ xước 300 mg/kg 125,4a±33,3 Chuột bình thường uống nước cao chiết cỏ xước 450 131,3a±43,4 mg/kg Ghi chú: Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p <0,01; “-”: khác biệt không có ý nghĩa thống kê Kết quả cho thấy, các nghiệm thức chuột bình thường uống cao ethanol cỏ xước với các liều 150; 300; 450 mg/kg khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức chuột bình thường uống nước. Điều đó chứng tỏ, cao ethanol cỏ xước với các liều 150; 300; 450 mg/kg không có tác dụng làm thay đổi nồng độ acid uric huyết thanh chuột bình thường. AP ở nồng độ 10 mg/kg có tác dụng làm hạ acid uric trong máu chuột bình thường. Nghiên cứu của Nguyễn Thùy Dương và ctv. (2011) khi cho chuột bình thường uống AP 10 mg/kg và uống cao chiết cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) với các liều 300; 600; 1200 mg/kg cũng có kết quả tương tự. 22
26. 3.4.2 Ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate được trình bày trong Bảng 3.5. Bảng 3.5: Ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric huyết thanh chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate Nồng độ Nghiệm thức acid uric (µmol/L)±SD Chuột bình thường uống nước 127,3c±38,4 Chuột bình thường uống CMC_Na 0,5% 128,3c±31,9 Chuột bệnh tăng acid uric 261,9a±78,2 Chuột bệnh uống AP 10 mg/kg 42,3d±19,1 Chuột bệnh uống cao chiết cỏ xước 150 mg/kg 186b±2,1 Chuột bệnh uống cao chiết cỏ xước 300 mg/kg 129,4c±15,2 Chuột bệnh uống cao chiết cỏ xước 450 mg/kg 128,7c±31,9 Ghi chú: Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p <0,01. Kết quả cho thấy, hai nghiệm thức chuột bệnh uống cao chiết cỏ xước 300 mg/kg và chuột bệnh uống cao chiết cỏ xước 450 mg/kg có tác dụng làm hạ acid uric trong máu chuột bệnh tăng acid uric. Nồng độ acid uric trong máu chuột của 2 nghiệm thức này khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nồng độ acid uric chuột bình thường. Vì vậy, nồng độ cao ethanol cỏ xước 300 mg/kg được khuyến cáo sử dụng để làm giảm nồng độ acid uric trong máu chuột bệnh tăng acid uric. Các nghiên cứu về tác dụng hạ acid uric huyết thanh chuột thực nghiệm của một số flavonoid và của cao chiết cây hy thiêm cũng cho kết quả tương tự. Quercetin, morin, puerarin với liều 50 mg/kg; cao chiết cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) với các liều 300; 600; 1200 mg/kg có tác dụng hạ acid uric huyết thanh khá tốt trên chuột nhắt trắng gây tăng acid uric bằng kali 23
27. oxonate nhưng không thể hiện tác dụng này trên chuột bình thường (Mo et al., 2007; Nguyễn Thùy Dương và ctv., 2011) . 3.4.3 Ảnh hưởng của cao ethanol Cỏ xước đến hoạt tính enzyme xanthine oxidase gan chuột thí nghiệm Kết quả ảnh hưởng của cao ethanol cỏ xước đến hoạt tính enzyme XO gan chuột thí nghiệm được trình bày trong Bảng 3.6. Bảng 3.6: Ảnh hưởng của cao ethanol cỏ xước đến hoạt tính enzyme XO gan chuột thí nghiệm Tỉ lệ giảm Hoạt tính Nghiệm thức hoạt tính riêng±SD enzyme Chuột bình thường uống nước 3,11a±0,033 Chuột bình thường uống CMC_Na 0,5% 3,06a±0,077 Chuột bệnh tăng acid uric 3,14a±0,052 Chuột bệnh uống AP 10 mg/kg 0,843d±0,11 72,9 Chuột bệnh uống cao ethanol cỏ xước 150 mg/kg 2,62b±0,084 15,8 Chuột bệnh uống cao ethanol cỏ xước 300 mg/kg 1,79c±0,127 42,4 Chuột bệnh uống cao ethanol cỏ xước 450 mg/kg 1,87c±0,075 39,8 Ghi chú: Trong cùng một cột, những số có chữ theo sau khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p <0,01. Kết quả cho thấy, hoạt tính riêng của enzyme XO gan chuột ở nghiệm thức chuột bệnh uống cao ethanol cỏ xước với liều 150 mg/kg thấp hơn, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng. Điều đó chứng tỏ cao ethanol cỏ xước với liều 150 mg/kg đã có tác dụng ức chế enzyme XO trong gan chuột. Tỉ lệ enzyme XO gan chuột bị ức chế là 15,8%. Hoạt tính riêng của enzyme trong gan chuột ở 2 nghiệm thức chuột bệnh uống cao ethanol cỏ xước với liều 300 mg/kg và 400 mg/kg đều thấp hơn, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng bệnh. Hai nghiệm thức chuột bệnh uống cao ethanol cỏ xước với liều 300 mg/kg và 400 mg/kg khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi so sánh với nhau. Điều đó chứng tỏ cao ethanol cỏ xước ở hai mức liều 300 mg/kg và 450 mg/kg có tác dụng ức chế enzyme XO như nhau. Tỉ lệ enzyme XO gan chuột bị ức chế ở các nghiệm thức 300 mg/kg và nghiệm thức 450 mg/kg lần lượt là 42,4 và 39,8%. Điều này còn góp phần giải thích nguyên 24
28. nhân nồng độ acid uric trong máu chuột uống cao ethanol cỏ xước với nồng độ 300 mg/kg và 450 mg/kg khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Ở nghiệm thức chuột bệnh uống AP 10 mg/kg, hoạt tính riêng của enzyme XO có giá trị nhỏ nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với tất cả các nghiệm thức khác. Tỉ lệ enzyme XO bị ức chế là 72,9%. Điều này cũng góp phần giải thích nguyên nhân nghiệm thức chuột uống AP có nồng độ acid uric trong máu rất thấp. Kết quả nghiên cứu của đề tài tương đồng với kết quả nghiên cứu của Le et al. (2017). Nhóm nghiên cứu của Le (2017) đã cho thấy chuột uống AP 10 mg/kg có tỉ lệ enzyme XO gan bị ức chế là 73,2%; chuột uống cao chiết lá Đại bi Blumea balsamifera L.(DC) với nồng độ 2,5 g/kg thì tỉ lệ enzyme XO gan chuột bị ức chế là 26,8%. Một nghiên cứu khác cũng cho kết quả tương tự, cao phân đoạn n-butanol cây hy thiêm với liều 120 mg/kg có khả năng ức chế hoạt độ enzyme XO là 34,9% (p<0,01) (Nguyễn Thùy Dương và ctv., 2011a). CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận - Đã phân lập được enzyme XO từ sữa bò. Điều kiện phù hợp cho hoạt động của enzyme XO phân lập được xác định là pH 7,5; 25°C; 0,02 U/mL enzyme XO và 0,15 mM xanthine. Hiệu quả ức chế của AP đối với hoạt tính của enzyme XO phân lập và enzyme thương mại là tương đương nhau. - Cao ethanol nở ngày, húng chanh, dền gai ức chế enzyme XO rất yếu. Nồng độ ức chế 50% (IC50) enzyme XO của các cao ethanol cây sương sáo, râu mèo, kinh giới, nở ngày đất và cỏ xước lần lượt là 222±2,65; 143±4,04; 138±1,73; 42,5±2,99 và 17,5 µg/mL. Chất đối chứng AP có IC50 là 9,24 µg/mL. - Ba hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO được phân lập từ cao ethanol cỏ xước đó là quercetin, quercitrin và hesperetin với IC50 lần lượt là 14,6; 37,7 và 103,2 µg/mL. Hợp chất quercitrin ức chế enzyme XO theo kiểu hỗn hợp. - Cao ethanol cỏ xước có tác dụng làm nồng độ acid uric trong máu chuột bị tăng acid uric giảm xuống đạt mức bình thường và không có tác dụng làm thay đổi nồng độ acid uric huyết thanh chuột bình thường. 25
29. 4.2 Đề xuất Tiếp tục nghiên cứu tác dụng làm giảm nồng độ acid uric trong máu của các hợp chất trong cây cỏ xước, cụ thể là quercetin, quercitrin và hesperetin để có hướng sử dụng trong phòng trị tăng acid uric trong máu. TÀI LIỆU THAM KHẢO Le N.T.L., D.T. Bui, T.L.G. Tran, Q.D. Vũ, T.B. Trịnh, P.A.U. Nguyen, T.C. Diep, T.H. Nguyen, K.S. Ngo, 2017. Inhibitor xanthine oxidase of extract Blumea balsamifera L.(DC) leaves (Asteraceae). European journal of research in medical sciences, 5: 16-23. Mo, S.F., F. Zhou, Y.Z. Lv, Q.H. Hu, D.M. Zhang,L.D. Kong, 2007. Hypouricemic Action of Selected Flavonoids in Mice: Structure– Activity Relationships. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 30(8): 1551—1556. Nagao, A., M. Seki, H. Kobayashi, 1999. Inhibition of Xanthine Oxidase by Flavonoids, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 63: 1787-1790. Nguyễn Thùy Dương, Nguyễn Minh Khởi, Hoàng Thị Kim Huyền và Phùng Thanh Hương, 2011. Nghiên cứu tác dụng hạ acid uric huyết thanh của hy thiêm trên mô hình gây tăng cấp acid uric bằng kali oxonate. Tạp chí Dược liệu, 16/1 + 2: 79 – 82. Nguyen, M. T. T, S. Awale, Y. Tezuka, Q.L. Tran, H. Wantanabe, And S. Kadota, 2004. Xanthine oxidase inhibitory activity of Vietnamese Medicinal Plants. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 27/9: 1414- 1421. Tôn Nữ Liên Hương, Trần Đình Luận, Nguyễn Minh Hiền, 2012. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của thân cây cỏ xước (Achyranthes Aspera L.). Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, 21a: 114-118. Umamaheswari, M., K. AsokKumar, A. Somasundaram, T. Sivashanmugam, V. Subhadradevi, T. K. Ravi, 2007. Xanthine oxidase inhibitory activity of some Indian medical plants. Journal of Ethnopharmacology 109, 547–551. 26