Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro

Nội dung tài liệu: Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã ngành: 62 42 02 01 ĐÀO THỊ TUYẾT THANH TẠO DÕNG HOA HUỆ (Polianthes tuberosa L.) ĐỘT BIẾN BẰNG TIA GAMMA (60Co) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Cần Thơ, 2018
2. CÔNG TRÌNH ĐƢỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN BẢO TOÀN Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: , Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc giờ ngày tháng năm Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: 1. Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
3. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Nguyễn Bảo Toàn, Nguyễn Quang Thức và Đào Thị Tuyết Thanh, 2014. Xử lý tia gamma 60Co ở các liều chiếu xạ khác nhau trên cụm chồi hai giống hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) in vitro. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ. (4): 41 - 46. 2. Đào Thị Tuyết Thanh và Nguyễn Bảo Toàn, 2016. Hiệu quả của liều lượng tia gamma 60Co trên sự sinh trưởng của cụm chồi hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) in vitro, sự xuất hiện các cấu trúc bất thường và xác định LD50. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ. 45: 25 - 32. 3. Đào Thị Tuyết Thanh, Lê Thị Ngọc Quý và Nguyễn Bảo Toàn, 2017. Nghiên cứu đa dạng về sinh trưởng và dạng hoa của các dòng huệ đơn cánh (Polianthes tuberosa L.) nuôi cấy mô được xử lý bằng tia gamma 60Co. Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam. 2(75): 47 - 52. 4. Đào Thị Tuyết Thanh và Nguyễn Bảo Toàn, 2017. Sử dụng chỉ thị ISSR trong việc đánh giá đa dạng di truyền các dòng/giống hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) nuôi cấy mô do xử lý đột biến bằng tia gamma. Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam. 6(79): 20 - 24. 5. Đào Thị Tuyết Thanh và Nguyễn Bảo Toàn. Ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma lên sự sinh trưởng, ra hoa và hình thái của các dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) nuôi cấy mô. Tạp chí Công nghệ Sinh học. Đang chờ đăng.
4. CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) là một trong những cây hoa cắt cành phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, cây hoa huệ là loại cây trồng mang lại thu nhập cao hơn so với lúa hoặc các cây trồng khác. Vì vậy, cây hoa huệ đã được đưa vào chương trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng và được xem là cây trồng xóa đói giảm nghèo ở các tỉnh như Tiền Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và An Giang. Hiện nay, chỉ có hai giống hoa huệ với một tràng hoa gồm 6 cánh hoặc với hai tràng hoa gồm 12 cánh được canh tác chủ yếu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tuy nhiên, việc nhân giống hoa huệ chủ yếu bằng củ qua nhiều thế hệ dẫn đến giống bị thoái hóa nghiêm trọng, dễ bị sâu bệnh tấn công và làm giảm năng suất đáng kể. Do đó, nhu cầu về giống mới để thay thế đang rất cần thiết. Mặt khác, việc lai tạo giống mới ở cây hoa huệ theo kiểu truyền thống gặp phải một số hạn chế do tính bất tương hợp cao, vì hoa có nhụy và nhị chín không cùng lúc và hạt không tạo được trong điều kiện tự nhiên (Estrada-Basaldua et al., 2011). Hơn nữa, chỉ có giống hoa đơn thì tạo được hạt, nhưng hạt khó nẩy mầm. Có lẽ tạo đột biến là cách tốt nhất trong việc tạo giống hoa huệ mới. Trong các tác nhân đột biến vật lý, tia gamma được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả nhất (Matsumara et al., 2010). Kỹ thuật này làm tăng biến dị di truyền ở một số loài hoa như sự thay đổi về màu sắc, hình dạng, đặc tính sinh trưởng của hoa (Xu et al., 2012). Bên cạnh đó, kỹ thuật nuôi cấy in vitro cần được áp dụng để tăng số mẫu được chiếu xạ. Sự nhân giống cây hoa huệ in vitro đã được nghiên cứu (Huỳnh Thị Huế Trang và ctv., 2007; Hutchinson et al., 2004). Trong đó, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và chiếu xạ là phương pháp hiệu quả để làm cây sạch bệnh, nhân nhanh và có được biến dị. Sự kết hợp này 1
5. được áp dụng thành công trên cọ, táo, khoai tây, khoai lang và khóm (Ulukapi and Nasircilar, 2015) và hoàn toàn có thể áp dụng trong việc chọn tạo giống hoa huệ. Mặt khác, cánh hoa có vai trò quan trọng trong sự nở hoa, sự thụ phấn và giao phấn Đối với cây hoa kiểng, số lượng cánh hoa có liên quan lớn đến kiểu hình hoa. Khi xử lý tia gamma riêng lẻ và nuôi cấy in vitro kết hợp xử lý tia gamma đã làm thay đổi số lượng cánh hoa hồng, sự gia tăng số lượng cánh hoa cúc (Usenbaevard and Imankulova, 1974; Kahrizi et al., 2012; Nagatomi, 2001). Do đó, ở hoa huệ khả năng gây đột biến tạo nguồn biến dị mới về đặc điểm tăng số lượng cánh hoa rất cao khi nuôi cấy in vitro và xử lý tia gamma. Cho đến nay, ở Việt Nam, chưa có giống hoa huệ mới với nhiều cánh hoa được tạo ra theo phương pháp truyền thống cũng như các phương pháp chọn giống bằng kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại khác. Như vậy, cần thiết phải thực hiện nghiên cứu “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro”. 2. Mục tiêu 2.1. Mục tiêu chung: Chọn được dòng hoa huệ đột biến có số lượng cánh hoa nhiều hơn giống nghiên cứu, kích thước hoa to hơn và thơm. 2.2. Mục tiêu cụ thể: (1) Đánh giá kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo nguồn vật liệu mô sẹo và cụm chồi cho xử lý 60 chiếu xạ tia gamma ( Co); (2) Xác định liều gây chết 50% (LD50) của tia gamma (60Co) trên mô sẹo và cụm chồi hoa huệ sau 150 ngày nuôi cấy; (3) Xác định các dạng bất thường về kiểu hình của cây giai đoạn thuần dưỡng và (4) Chọn được 1 đến 2 dòng hoa huệ tăng về số lượng cánh hoa (nhiều hơn 12 cánh), kích thước hoa to và có mùi thơm theo phương pháp nhân giống truyền thống. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 2
6. Hai giống hoa huệ đơn và kép đang được canh tác ở tỉnh An Giang. Theo dõi đặc tính dòng đột biến khi trồng ngoài đồng qua 2 thế hệ. 4. Thời gian và địa điểm thí nghiệm - Thực hiện từ tháng 10/2013 đến tháng 8/2017 tại Trường Đại học Cần Thơ. Thí nghiệm xử lý chiếu xạ tại tại Phòng Công nghệ Bức xạ, thuộc Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng. Giống hoa huệ đơn trồng tại Thành phố Cần Thơ và giống hoa huệ kép trồng tại tỉnh Tiền Giang. 5. Những đóng góp mới của luận án - Sử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để làm vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy tạo mô sẹo và cụm chồi cho xử lý chiếu 60 xạ bằng tia gamma ( Co); xác định được liều gây chết 50% (LD50) của tia gamma trên mô sẹo giống hoa huệ đơn và cụm chồi giống hoa huệ kép in vitro. - Ở hai giống/dòng hoa huệ, xác định các dạng bất thường về hình thái lá và chồi sau 150 ngày nuôi cấy in vitro; xác định các dạng bất thường về hình thái lá, thân và củ sau 60 ngày trồng ngoài đồng; xác định đặc điểm sinh trưởng cũng như các dạng bất thường về hình thái hoa và mùi thơm giai đoạn sau 180 ngày trồng ngoài đồng. - Chọn được 2 dòng hoa huệ đột biến có đặc tính khác so với giống đang canh tác như tăng số cánh hoa lên 22 và 36 cánh, kích thước hoa to và hoa có mùi thơm bằng phương pháp nhân giống truyền thống sau 2 thế hệ trồng. - Đánh giá đa dạng di truyền bằng phương pháp PCR - ISSR để chứng minh sự khác biệt về gen giữa hai dòng hoa huệ đột biến so với hai giống hoa huệ đối chứng, cụ thể là có sự xuất hiện hoặc mất đi băng ADN; tiếp tục giải trình tự gen để so sánh trình tự ADN vùng ITS1/4 các dòng/giống hoa huệ này để thấy được các 3
7. dạng đột biến như thay thế, mất hoặc thêm một/một đoạn nucleotide. - Luận án đã xây dựng được quy trình tạo dòng hoa huệ đột biến bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro. 6. Bố cục của luận án Luận án dài 142 trang, gồm phần giới thiệu, tổng quan tài liệu, phương pháp nghiên cứu, kết quả thảo luận và phần kết luận và đề nghị và phần phụ lục. Luận án có 35 bảng, 35 hình và 277 tài liệu tham khảo. Chƣơng 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu thí nghiệm - Giống hoa huệ đang được canh tác ở xã Bình Thạnh Đông, huyện Phú Tân, tỉnh An Giang (Hình 3.1). Hình 3.1: Giống hoa huệ đơn và kép đang canh tác ở tỉnh An Giang Ghi chú: a: Giống hoa huệ đơn (HĐ) có hoa thơm với 6 cánh, phát hoa ngắn, lá nhỏ và b: giống hoa huệ kép (HK) có hoa thơm với 12 a b cánh, phát hoa dài hơn, lá lớn. 3.2. Phƣơng pháp thí nghiệm 3.2.1. Nội dung 1: Tạo vật liệu cho xử lý chiếu xạ bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro 3.2.1.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng cây hoa huệ - Quy trình khử mẫu và sử dụng môi trường nuôi cấy MS (Huỳnh Thị Huế Trang và ctv., 2007). * Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu cấy sống sau 30 ngày (%). 3.2.1.2. Tạo mô sẹo và cụm chồi hoa - Cấy truyền các mẫu đỉnh sinh trưởng này mỗi 30 ngày/lần và cấy 5 lần (M5). Môi trường nuôi cấy là môi trường cơ bản (BM) bao gồm môi trường MS (1962) bổ sung thiamine; pyridoxine; nicotinic acid; 1,0 mg/l riboflavin cho mỗi loại; agar (8 g/l); đường 4
8. (30 g/l) (Huỳnh Thị Huế Trang và ctv., 2007). Pha các chất như trên, điều chỉnh pH ở 5,8 hấp rồi khử trùng ở nhiệt độ 121°C, 1 atm trong 30 phút và chuẩn bị các túi môi trường nuôi cấy như Hình 3.2. a b Hình 3.2: Môi trường Hình 3.3: Đĩa petri được cấy mẫu túi nylon được chuẩn trước khi xử lý tia gamma (60Co) bị trước khi cấy mẫu Ghi chú: a: mẫu mô sẹo và b: cụm chồi - Môi trường tạo mô sẹo và chồi hoa huệ là môi trường BM bổ sung 1,0 mg/l NAA và 4,0 mg/l BA (Huỳnh Thị Huế Trang và ctv., 2007). 3.2.2. Nội dung 2: Xác định hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) trên hai giống/dòng hoa huệ bằng liều gây chết 50% (LD50) in vitro * Chuẩn bị mô sẹo ở giống hoa huệ đơn và cụm chồi ở giống hoa huệ kép - Cụm mô sẹo hoa huệ có kích thước 1,0 cm2 được cấy vào đĩa petri. Mỗi đĩa petri được đổ 20 ml môi trường cơ bản (không có chất điều hòa sinh trưởng), cấy 10 cụm mô sẹo/đĩa và chuẩn bị ít nhất 60 đĩa có cấy mẫu (Hình 3.3a). - Cụm chồi hoa huệ được cắt lá và rễ (nếu có) có chiều cao trung bình từ 1,0 - 1,2 cm, mỗi cụm có đường kính khoảng 1,0 cm, được cấy vào đĩa petri (Hình 3.3b). 3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của liều lƣợng tia (60Co) gamma đến sự sinh trƣởng và phát triển của cụm mô sẹo ở giống/dòng hoa huệ đơn Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 nhân tố, 10 nghiệm thức, 5 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một đĩa petri, mỗi đĩa petri cấy 10 cụm mô sẹo trên môi trường BM. 5
9. Nghiệm thức không xử lý chiếu xạ là đối chứng (ĐC). Cụm mô sẹo được chiếu xạ bằng tia gamma (60Co) với suất liều chiếu xạ 1,58 kGy/giờ. Thí nghiệm được bố trí theo Bảng 3.1. Bảng 3.1: Bố trí các liều chiếu xạ và nghiệm thức ở giống hoa huệ đơn Giống Liều chiếu xạ (Gy) ĐC 5 10 15 20 25 30 40 50 60 HĐ NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 Sau khi xử lý chiếu xạ, các cụm mô sẹo được cấy vào môi trường BM bổ sung 1,0 mg/l NAA và 6,0 mg/l BA (Lê Lý Vũ Vi và ctv., 2014) để tái sinh chồi và nhân chồi, cấy truyền sau mỗi 30 ngày (1 cụm mô sẹo/chồi/túi). * Chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ cụm mô sẹo tái sinh thành chồi sau 30 ngày (%). Quan sát các cụm chồi tại thời điểm 150 ngày sau khi xử lý chiếu xạ. - Tỷ lệ chết (%) = (Tổng số chồi chết/Tổng số chồi) x 100. Cụm mô sẹo được xem là chết khi không tái sinh được thành chồi và mất màu xanh hoặc không tạo được chồi mới. - Tính liều gây chết LD50 theo mô tả của Randhawa (2009). - Chiều cao chồi (cm), số chồi/cụm chồi, số lá/cụm chồi. - Cụm chồi bất thường ghi nhận ở lá, rễ, chồi, chùn đọt 3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sự sinh trƣởng và phát triển của cụm chồi ở giống/dòng hoa huệ kép Thí nghiệm này sử dụng cụm chồi của giống hoa huệ kép và bố trí liều chiếu xạ tương tự thí nghiệm 1 (Bảng 3.2). Bảng 3.2: Bố trí các liều chiếu xạ và nghiệm thức ở giống hoa huệ kép Giống Liều chiếu xạ (Gy) ĐC 5 10 15 20 25 30 40 50 60 HK NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 6
10. Sau khi xử lý chiếu xạ, các cụm chồi được cấy vào môi trường nhân chồi tương tự như ở thí nghiệm 1, cấy truyền sau mỗi 30 ngày (1 cụm chồi/túi). * Chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ chết (%), tính liều gây chết LD50, chiều cao chồi (cm), số chồi, số lá và các dạng cấu trúc bất thường sau 150 ngày: (thực hiện tương tự thí nghiệm 1). Cụm chồi chết khi mất màu xanh hoặc không tạo được chồi mới. 3.2.2.3. Nhân chồi và tạo rễ thành cây hoa huệ hoàn chỉnh - Môi trường nhân chồi vẫn sử dụng môi trường BM bổ sung 1,0 mg/l NAA và 6,0 BA mg/l (Lê Lý Vũ Vi và ctv., 2014), cấy truyền 3 lần, 30 ngày cấy truyền 1 lần, cấy 10 cụm chồi/túi môi trường. - Sau khi nhân khoảng 500 chồi, chuyển sang môi trường tạo rễ là môi trường BM bổ sung 4 ml/l atonik (Lê Lý Vũ Vi và ctv., 2014) trong 60 ngày, 30 ngày cấy truyền 1 lần, cấy 10 chồi/túi môi trường đến khi cây ra rễ. 3.2.3. Nội dung 3: Xác định sự đa dạng về mặt hình thái của cây con giai đoạn thuần dƣỡng trong nhà lƣới - Quy trình thuần dưỡng theo Nguyễn Minh Kiên (2011). * Chỉ tiêu theo dõi sau 30 ngày: Tần số cây bất thường về hình thái (%): dạng sọc lá, lá uốn éo (nếu có) 3.2.4. Nội dung 4: Chọn các dòng hoa huệ tăng về số cánh hoa, kích thƣớc hoa và hoa có mùi thơm theo phƣơng pháp truyền thống 3.2.4.1. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự sinh trƣởng và phát triển của giống/dòng hoa huệ đơn sau khi xử lý tia gamma (60Co) ở ngoài đồng a. Trồng lần 1 (VĐM1) - Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, 8 nghiệm thức với 3 lần lặp lại (3 lô) gồm ĐC củ 7
11. (cây trồng từ củ), ĐC cấy mô (cây trồng từ mẫu cấy mô không chiếu xạ tia gamma) và cây trồng từ mẫu cấy mô được xử lý với các liều tia gamma (60Co) lần lượt là 5; 10; 15; 20; 25 và 30 Gy. Mỗi lô trồng 50 cây, cây trồng từ củ có đường kính củ từ 1,0 - 1,2 cm và cây huệ cấy mô hoặc đã xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co) có 3,0 - 6,0 lá, cao 6,0 - 10,0 cm và có 1,0 - 2,0 chồi. Mỗi nghiệm thức đánh dấu 5 điểm, mỗi điểm 3 bụi huệ. - Sơ đồ bố trí lô thí nghiệm thể hiện ở hình 3.4a. Quy trình canh tác giai đoạn ngoài đồng được thực hiện theo Lê Lý Vũ Vi và ctv. (2014). Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng * Chỉ tiêu theo dõi - Tỷ lệ chết của cây sau khi trồng 60 ngày. - Các chỉ tiêu về sinh trưởng ở 180 ngày trồng: Số chồi: đếm các chồi đã có lá bung ra; số lá: đếm số lá/bụi vào thời điểm cây ra hoa; số củ/bụi: đếm số củ/bụi và đường kính củ (cm). - Các chỉ tiêu về hoa: Thời gian ra hoa khi có 25% cây tạo phát hoa (ngày); chiều cao phát hoa (cm); số hoa/phát hoa; đường 8
12. kính hoa (cm). Ghi nhận dạng bất thường ở lá, thân, hoa và mùi thơm ở hoa (khi có 75% cây có phát hoa). - Cách chọn dòng đột biến mong muốn bằng cách chọn lọc cá thể. Đặt tên: Dòng hoa huệ + Số cánh hoa + Liều chiếu xạ. - Thực hiện đánh giá mùi thơm bằng cảm quan (phương pháp ngửi). Mức độ thơm được đánh giá bởi 10 người rồi lấy điểm trung bình theo quy ước: 0 điểm: không thơm; 1 điểm: thơm bình thường và 2 điểm: thơm nhiều. Nghiệm thức cây trồng từ củ là đối chứng. Mỗi nhóm cây đánh giá 3 phát hoa khi hoa dưới cùng của phát hoa nở hoàn toàn. b. Trồng lần 2 (VĐM2) Nếu chọn lọc được 1 số dòng hoa huệ có tính trạng hoa với số lượng cánh hoa nhiều hơn 12 cánh, hoa to và có mùi thơm tiếp tục trồng lần 2. Nếu không sẽ trồng riêng để nhân củ giống và lưu trữ nguồn củ giống. * Chỉ tiêu theo dõi đến khi có 100% cây ra hoa: - Ghi nhận chỉ tiêu về sinh trưởng, ra hoa, các dạng bất thường ở số lượng cánh hoa (nhiều hơn 12 cánh) và đánh giá mùi thơm tương tự khi trồng lần 1. 3.2.4.2. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự sinh trƣởng và phát triển của giống/dòng hoa huệ kép sau khi xử lý tia gamma (60Co) ở ngoài đồng a. Trồng lần 1 (VKM1) Thí nghiệm được bố trí tương tự với giống hoa huệ đơn. Mỗi lô trồng 30 cây. Cây đem trồng có từ 3,0 - 5,0 lá, cao từ 5,0 - 10,0 cm và có 1,0 - 2,0 chồi. Mỗi nghiệm thức đánh dấu 3 điểm, mỗi điểm 3 bụi huệ. - Sơ đồ bố trí thí nghiệm theo hình 3.4b. Quy trình canh tác thực hiện tương tự như thí nghiệm 3 mục 3.2.4.1. * Chỉ tiêu theo dõi: Thực hiện tương tự với Thí nghiệm 3, mục 3.2.4.1a. 9
13. b. Trồng lần 2 (VKM2): Thực hiện tương tự như ở mục 3.2.4.1b. * Chỉ tiêu theo dõi đến khi có 100% cây ra hoa: Thực hiện tương tự như ở mục 3.2.4.1b. 3.2.4.3. Đánh giá đa dạng ADN ở giống/dòng hoa huệ đột biến a. Đánh giá sự đa dạng di truyền bằng phƣơng pháp đánh dấu phân tử ISSR - PCR Sử dụng 14 mồi ISSR (Mengli et al., 2012; Khandagale et al., 2014) (Bảng 3.3). Bảng 3.3: Danh sách mồi ISSR sử dụng cho nghiên cứu Tên mồi Trình tự (5’- 3’) Tên mồi Trình tự (5’- 3’) 3A01 (GA)8TC 808 (AG)8C 3A07 (AG)7CTT 836 (AG)8YA 3A21 (TG)7ACC 840 (AG)8YT 3A39 (CA)7GTA 842 (AG)8YG 3A42 (GACA)4C 855 (AC)8YT 3A62 (TG)7ACT 857 (AC)8YG UBC873 GACAGACAGACAGACA P23SR1 GGCTGCTTCTAAGCCAAC - Các đoạn ADN khuếch đại là đa hình sẽ được ghi nhận và xác định vị trí các băng ADN xuất hiện mới hoặc mất đi trên 2 dòng huệ đột biến so với băng ĐC (giống hoa huệ 12 cánh) (tính bằng bp). Vẽ sơ đồ hình nhánh bằng phần mềm NTSYSpc v2.1 (Rohlf, 2000). b. Giải trình tự vùng ITS : Sử dụng cặp mồi vi khuẩn với trình tự sau ( White et al., 1990): ITS1: 5’ - TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3’ ITS4: 5’ - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3’ - Kiểm tra đoạn ITS bằng công cụ BLAST (Basic Local Alignmet Search Tool) trên NCBI (National Center for Biotechnology Information) để chắc chắn các trình tự này là từ các 10
14. loài thuộc chi Polianthes spp. Xếp hàng (alignment) các trình tự để xác định vị trí và các dạng đột biến ADN. Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nội dung 1 4.1.1. Tỷ lệ sống khi nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng hai giống hoa huệ Sau 30 ngày nuôi cấy, giống hoa huệ đơn có tỷ lệ đỉnh sinh trưởng sống chiếm tỷ lệ 40% trong khi ở giống hoa huệ kép tỷ lệ sống là 60%. 4.1.2. Nhân cụm mô sẹo (callus) và cụm chồi Mẫu đỉnh sinh trưởng còn sống được cấy truyền sang môi trường nhân chồi sau 180 ngày để đủ số lượng mẫu mô sẹo và cụm chồi cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co). Có sự xuất hiện cùng một lúc mô sẹo và chồi ở hai giống hoa huệ đơn và kép. 4.2. Nội dung 2 4.2.1. Hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sự sinh trƣởng và phát triển của mô sẹo giống/dòng hoa huệ đơn 4.2.1.1. Tỷ lệ tái sinh chồi Ở liều chiếu xạ cao nhất 60 Gy, không có cụm mô sẹo nào tạo được chồi. Dòng hoa huệ ở liều chiếu xạ 50 Gy có tỷ lệ tái sinh chồi thấp nhất 6%. Ngược lại, nghiệm thức ĐC cấy mô không xử lý đột biến cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất đến 90%. 4.2.1.2. Tỷ lệ chết của cụm mô sẹo/chồi Ở liều chiếu thấp nhất (5 Gy) có 22% cụm mô sẹo/chồi chết. Khi liều chiếu xạ 15 Gy tăng dần đến 50 Gy cho tỷ lệ chết ở mức cao (trên 50%) và ở 60 Gy, tất cả cụm mô sẹo/chồi chết. 11
15. 4.2.1.3. Liều gây chết LD50: Giá trị LD50HĐ của giống hoa huệ đơn là khi xử lý tia gamma 60Co là 10,96 ± 2,96 Gy (Hình 3.1). Hình 4.1: Đồ thị tương quan hồi quy để xác định LD50 của các liều chiếu xạ khác nhau ở giống/dòng hoa huệ đơn sau 150 ngày nuôi cấy Ghi chú: Đường biểu diễn Log(LD50HĐ) Đường biểu diễn Log(LD84HĐ) và Log(LD16HĐ) 4.2.1.4. Số chồi, chiều cao chồi và số lá Ở các liều chiếu xạ 5 và 10 Gy, có số chồi, chiều cao chồi và số lá cao nhất. Ngược lại, nghiệm thức 30 và 40 Gy, sự hình thành chồi và lá mới cũng như chiều cao chồi rất thấp. Liều 50 và 60 Gy, cây không tạo được bất kỳ chồi mới nào (Bảng 4.1). Liều chiếu Chiều cao Số chồi Số lá Bảng 4.1: Số chồi, chiều xạ (Gy) chồi (cm) 0 3,2b 6,4a 14,7b cao chồi và số lá của 5 4,2a 6,2ab 18,3a giống/dòng hoa huệ đơn b ab a 10 3,5 5,9 17,5 60 15 2,5c 5,4b 11,0c đã xử lý tia gamma ( Co) 20 1,9d 3,9c 7,9d sau 150 ngày nuôi cấy cd c e 25 2,0 3,8 3,7 Ghi chú: Các số có chữ số theo 30 0,9e 3,7c 2,3ef sau giống nhau là khác biệt 40 0,5e 0,7d 1,2fi 50 0,0f 0,1d 0,07i không có ý nghĩa thống kê qua 60 0,0f 0,0d 0,0i phép thử Duncan; *: khác biệt F * * * ở mức ý nghĩa 5%. CV (%) 22,9 21,4 26,0 12
16. 4.2.1.5. Tác động của các liều chiếu xạ tia gamma (60Co) trên các cấu trúc bất thƣờng ở giống/dòng hoa huệ đơn Có 4 kiểu cấu trúc bất thường ở các giống/dòng hoa huệ đơn do ảnh hưởng của các liều gamma khác nhau. ĐC cấy mô có dạng chồi bình thường; ở 5; 10; 15 và 20 Gy, dạng chồi có lá dính nhau, cuộn tròn; chồi 25; 30 và 40 Gy lá co dúm và cuộn tròn; chồi 50 và 60 Gy bị mất sắc tố diệp lục 4.2.2. Hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sự sinh trƣởng và phát triển của cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép 4.2.2.1. Tỷ lệ chết của cụm chồi Với các liều chiếu xạ dưới 40 Gy, tỷ lệ chết của các cụm chồi đều dưới 50%. Tỷ lệ này tăng đột biến khi cây được xử lý với liều 50 Gy và đạt tỷ lệ chết 100% ở liều xử lý 60 Gy. 4.2.2.2. Liều gây chết LD50: Giá trị LD50 HK của giống hoa huệ kép là 22,91 Gy ± 4,01 Gy (Hình 4.2). Hình 4.2: Đồ thị tương quan hồi quy để xác định LD50 của các liều chiếu xạ khác nhau ở giống/dòng hoa huệ kép sau 150 ngày nuôi cấy Ghi chú: Đường biểu diễn Log(LD50HK) Đường biểu diễn Log(LD84HK) và Log(LD16HK) 4.2.2.3. Số chồi, chiều cao chồi và số lá Ở các liều chiếu xạ từ 5; 15 và 25 Gy, số chồi gia tăng theo thời gian ở tất cả các nghiệm thức. Chiều cao chồi đạt giá trị cao nhất ở nghiệm thức 5 và 15 Gy. Nghiệm thức 25 Gy, cây tạo số lá nhiều nhất (khoảng 21 lá). Mặc dù ở liều chiếu xạ gây chết hoàn toàn 60 Gy không cho sự gia tăng số chồi và chiều cao chồi nhưng 13
17. vẫn có sự gia tăng số lá ở các thời điểm nuôi cấy 150 ngày (Bảng 4.2). Bảng 4.2: Số chồi, chiều cao chồi và số lá của giống/dòng hoa huệ kép đã xử lý tia gamma (60Co) sau 150 ngày nuôi cấy Ngày Liều 0 150 chiếu Chiều cao Chiều cao xạ (Gy) Số chồi Số lá Số chồi Số lá chồi (cm) chồi (cm) 0 3,4 1,1 2,2 7,3a 5,4b 18,0b 5 3,4 1,1 2,2 6,9ab 7,0a 18,6ab 10 3,4 1,0 2,2 6,3bc 6,0b 20,1ab 15 3,5 1,1 2,3 6,7abc 6,6a 21,7a 20 3,3 1,1 2,3 6,1c 6,2c 10,5c 25 3,5 1,1 2,2 6,1c 5,6b 21,1a 30 3,4 1,1 2,2 4,8d 2,7d 4,6d 40 3,5 1,1 2,2 4,2de 2,4d 9,9c 50 3,4 1,1 2,1 3,6ef 1,1e 4,7d 60 3,4 1,1 2,1 3,4f 1,2e 3,2d F ns Ns ns * * * CV (%) 6,4 3,6 8,6 10,6 13,3 21,8 Ghi chú: Các số có chữ số theo sau giống nhau là khác biệt không có ý nghĩa thống kê qua phép thử Duncan; *: khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. 4.2.2.4. Tác động của các liều chiếu xạ tia gamma (60Co) trên các cấu trúc bất thƣờng ở giống/dòng hoa huệ kép Có 6 kiểu cấu trúc bất thường dưới tác động của các liều bức xạ gamma khác nhau ở giống/dòng hoa huệ kép. ĐC cấy mô và 5 Gy có chồi bình thường; chồi 10 Gy có lá co dúm; chồi 15 Gy có lá mất sắc tố và tạo rễ; chồi 20 Gy với lá có răng cưa và chùn đọt; ở 25 và 40 Gy chồi chùn đọt và mất sắc tố; chồi 30 và 50 Gy có lá cuộn tròn, dính và mất sắc tố và ở 60 Gy cụm chồi hóa nâu. 4.2.3. Nhân chồi và tạo rễ thành cây hoàn chỉnh Ở giống/dòng hoa huệ đơn, giai đoạn nhân chồi trong 90 ngày cho hệ số nhân chồi tốt, chồi xanh, khỏe. Trung bình 1 chồi ban đầu cho trung bình khoảng 4,5 chồi sau 30 ngày nuôi cấy trừ liều chiếu xạ 25 và 30 Gy. 14
18. Đối với giống/dòng hoa huệ kép, hệ số nhân chồi cao ở các nghiệm thức ĐC cấy mô; 5 và 10 Gy, trung bình 1 chồi ban đầu cho 6,5 chồi. Các nghiệm thức còn lại cho hệ số nhân chồi thấp hơn trung bình 2,5 - 3,5 chồi. Các nghiệm thức 40 và 50 Gy chồi ở cả hai giống sinh trưởng rất yếu và chết dần nên không tạo được cây hoàn chỉnh. Khi chuyển sang môi trường tạo rễ chồi huệ đơn và kép với tỷ lệ ra rễ khoảng 95,0% và 97,0% ở tất cả các nghiệm thức sau 60 ngày nuôi cấy. 4.3. Nội dung 3 4.3.1. Tỷ lệ chết của các giống/dòng hoa huệ đơn Nghiệm thức ĐC củ có số cây con chết ít nhất (3 cây) và ĐC cấy mô có số cây con chết nhiều nhất (30 cây), chiếm tỷ lệ khoảng 10,0%. 4.3.2. Tỷ lệ chết của các giống/dòng huệ kép Ở các giống/dòng hoa huệ kép, số cây chết thấp nhất ở nghiệm thức ĐC củ với tỷ lệ 3,0%. Trái lại, các nghiệm thức ĐC cấy mô và 5 Gy cho số cây chết nhiều nhất (trên 20 cây) chiếm tỷ lệ 8,5 và 7,2%. 4.3.3. Các dạng bất thƣờng về kiểu hình của các giống/dòng hoa huệ đơn và kép Chồi bất thường giai đoạn in vitro đều không tạo được cây hoàn chỉnh do không tạo được rễ và có sức sống rất yếu hoặc cây chết trong quá trình thuần dưỡng. Ở giai đoạn này, cây còn nhỏ nên sự khác biệt về hình thái lá và chồi không nhận thấy rõ ràng. 4.4. Nội dung 4 4.4.1. Các đặc điểm sinh trƣởng và ra hoa ở giống/dòng hoa huệ đơn khi trồng lần 1 (M1) - Tỷ lệ cây chết Sau 60 ngày trồng ngoài đồng, tỷ lệ cây chết của cây hoa huệ đơn gia tăng khi liều chiếu gia tăng. Tuy nhiên, nghiệm thức trồng 15
19. từ cây cấy mô, nghiệm thức ở liều 5 và 10 Gy có tỷ lệ chết bằng nhau là 4,0%. Liều chiếu xạ 25 và 30 Gy có số lượng cây chết cao nhất chiếm 8,0%. - Số chồi, số lá, số củ và đƣờng kính củ Ở các liều chiếu xạ càng cao thì sự gia tăng số chồi càng ít (trừ nghiệm thức xử lý ở liều 5 Gy). Nghiệm thức ĐC củ cây hoa huệ cho số chồi cao nhất. Số lá của các nghiệm thức có sự chênh lệch khá cao từ 48,9 đến 130,3 lá. Dòng hoa huệ ở liều chiếu xạ 25 Gy tạo được nhiều củ nhất (14,5 củ) so với giống hoa huệ trồng từ củ (13,5 củ). Trong tất cả các giống/dòng hoa huệ được xử lý chiếu xạ, ở liều 25 Gy, cây cho số củ tốt nhất và nghiệm thức ĐC củ và ĐC cấy mô có số lượng chồi và lá vượt trội hơn so với các dòng hoa huệ còn lại. Dòng hoa huệ 15 và 25 Gy có đường kính củ lớn nhất khoảng 4,1 cm (Bảng 4.3). Liều chiếu Số Số lá Số củ Đƣờng kính Bảng 4.3: Các chỉ tiêu xạ (Gy) chồi củ (cm) sinh trưởng của các ĐC củ 9,4a 107,8b 13,5ab 3,0d b a b c giống/dòng hoa huệ đơn ĐC cấy mô 7,3 130,3 13,0 3,4 sau 180 ngày trồng 5 5,1de 89,7c 11,5c 3,3cd bc ab c e Ghi chú: Các số có chữ số 10 7,0 121,0 10,9 2,7 theo sau giống nhau là khác 15 5,6cd 89,6c 8,3d 4,1a biệt không có ý nghĩa thống 20 4,2de 48,9e 6,4e 3,1cd 25 4,7de 80,9cd 14,5a 4,1a kê qua phép thử Duncan; *: 30 3,8e 67,0d 9,5d 3,7b khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. F * * * * CV (%) 14,1 9,1 7,1 4,4 - Thời gian ra hoa, chiều cao phát hoa, số hoa/phát hoa và đƣờng kính hoa Các nghiệm thức ĐC củ, nghiệm thức chiếu xạ 10 và 25 Gy có thời gian ra hoa ngắn nhất khoảng 147 ngày. Ngược lại, các dòng hoa huệ từ cây cấy mô, nghiệm thức xử lý các liều 5, 20 và 30 Gy có thời gian ra hoa kéo dài nhất khoảng 175 ngày. 16
20. Dòng hoa huệ xử lý với liều 20 và 25 Gy có chiều cao phát hoa lần lượt là 118,0 và 122,7 cm trong khi cây ĐC củ và ĐC cấy mô chỉ cao 91,0 và 103,0 cm. Dòng hoa huệ ở liều 25 Gy có số hoa/phát hoa nhiều nhất (41,3 hoa). Mặc dù, dòng hoa huệ ở liều chiếu xạ 20 Gy có chiều cao phát hoa tốt nhưng hoa đóng thưa hơn nên số hoa ít nhất (28 hoa). Dòng có đường kính hoa to nhất là dòng 25 Gy (3,6 cm). Trái lại, dòng hoa huệ có đường kính hoa thấp nhất khi được chiếu xạ với liều 5 và 30 Gy (1,8 cm và 2,9 cm). Ở dòng hoa huệ với liều 5 Gy có hoa không nở hoàn toàn nên đường kính hoa là nhỏ nhất (Bảng 3.4). Bảng 4.4: Đặc điểm ra hoa của giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 Liều chiếu xạ Thời gian ra Chiều cao Số hoa/phát Đƣờng kính (Gy) hoa (ngày) phát hoa (cm) hoa hoa (cm) ĐC củ 147,7a 91,0d 36,0abc 3,0b ĐC cấy mô 175,3bc 103,0cd 31,3cd 3,0b 5 175,0bc 107,3bc 34,0bcd 1,8c 10 152,7a 108,7bc 36,0abc 3,5a 15 162,0ab 108,0bc 40,7ab 3,5a 20 177,7bc 118,0ab 28,0d 3,1b 25 155,7a 122,7a 41,3a 3,6a 30 181,3c 110,0bc 30,7cd 2,9c F * * * * CV (%) 5,8 6,3 10,7 6,8 Ghi chú: Các số có chữ số theo sau giống nhau là khác biệt không có ý nghĩa thống kê qua phép thử Duncan; *: khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. - Các đặc điểm bất thƣờng ở các dòng hoa huệ đơn đƣợc xử lý tia gamma (60Co) + Ở lá: Sau 60 ngày trồng ngoài đồng, có 7 dạng bất thường ở lá các dòng hoa huệ đơn. ĐC củ và ĐC cấy mô có lá bình thường; cây 5 và 20 Gy với lá có sắc tố màu tím; cây 10 Gy với lá dưới cùng có 1 lá nhỏ nằm bên phải và 1 lá lớn hơn nằm bên trái; cây 15 Gy với lá có sọc trắng dọc hai bên mép lá; cây 25 Gy với lá 17
21. dính 1/3 lá từ thân lá ra chóp lá và lá mọc hai hàng nhưng không đối xứng và cây 30 Gy với lá dưới cùng có 3 lá dưới cùng rất nhỏ, bản lá rộng và dày. + Ở thân và củ: Ở các dòng hoa huệ đơn, có 3 kiểu hình bất thường sau khi xử lý đột biến. Cây 15 Gy với thân có bẹ lá xếp lệch thành hình tia; cây 20 Gy với thân có bẹ lá mọc xếp chồng lên nhau thành 2 bên ngay hàng và cây 25 Gy với cây tạo củ sớm. + Ở hoa: Dòng hoa huệ ở nghiệm thức 5 Gy cho hoa không nở hoàn toàn nên không xác định số cánh hoa trong khi những dòng được xử lý với các liều 15; 25 và 30 Gy xuất hiện hoa với 7 cánh và 8 cánh trên cùng phát hoa với tần số cao (lên đến 75%) (Hình 3.3). - Mùi thơm: Ở các dòng hoa huệ tăng số cánh lên 7 hoặc 8 cánh ở liều 15; 25 và 30 Gy được đánh giá 2 điểm. Dòng hoa huệ với liều xử lý 5 Gy với đặc điểm hoa không nở hoàn toàn được nên mất đi mùi thơm. Ở giống/dòng hoa huệ đơn không có đột biến cánh hoa dạng kép (nhiều hơn 12 cánh) nên những dòng đột biến này được chọn lọc và theo dõi riêng. Hình 4.3: Các dạng hoa huệ đơn với số cánh hoa tăng khi ra hoa lần 1 a b c d Ghi chú: a: ĐC củ (hoa có 6 cánh); b: 15 Gy (hoa có 7 và 8 cánh); c: 25 Gy (hoa có 7 và 8 cánh) và d: 30 Gy (hoa có 7 và 8 cánh). 4.4.2. Các đặc điểm sinh trƣởng và ra hoa ở các giống/dòng hoa huệ kép khi trồng lần 1 (M1) - Tỷ lệ cây chết Cây ĐC củ không có cây chết trong khi cây ĐC cấy mô có số cây chết nhiều nhất (8 cây) chiếm tỷ lệ 4%. Nghiệm thức 15 và 25 Gy có số cây chết ít nhất với tỷ lệ (3,3%). Ở liều chiếu xạ 10 Gy và 18
22. 30 Gy cho số cây chết bằng nhau (5 cây), nhưng cho tỷ lệ chết khác nhau. - Số chồi, số lá, số củ và đƣờng kính củ Nghiệm thức ĐC củ và nghiệm thức 25 và 30 Gy chỉ tạo được khoảng 4,0 chồi, trong khi đó số chồi đạt được cao nhất ở các nghiệm thức 0; 5; 10; 15 và 20 Gy (trung bình khoảng 6 chồi). Cây ĐC trồng từ củ và cấy mô có số lá trung bình hơn 29,0 lá thì ở các liều chiếu xạ 5; 10 và 20 Gy có số lá lần lượt là 36,8; 40,5 và 35,9 lá. Ở liều chiếu xạ 25 Gy, cây có số lá ít nhất (chỉ bằng 50% số lá đạt được khi so với cây có số lá cao nhất ở liều 10 Gy). Tuy nhiên, cây ở liều chiếu xạ cao nhất 30 Gy lại cho số lá cao hơn ở cây 15 Gy. Cây ĐC củ và nghiệm thức 5 và 15 Gy có số củ cao nhất (khoảng 14,0 củ) đều cho đường kính nhỏ trung bình khoảng 3,8 cm. Ngược lại, nghiệm thức có số củ ít nhất gồm nghiệm thức ĐC cấy mô; 10; 20 và 30 Gy có số củ ít nhưng cho đường kính củ đạt trung bình khoảng 4,0 cm (Bảng 4.5). Liều chiếu Số chồi Số lá Số củ Đƣờng Bảng 4.5: Các chỉ tiêu xạ (Gy) kính củ ĐC củ 3,9b 28,9abcd 13,9ab 3,8ab sinh trưởng của các ĐC cấy mô 5,8a 29,3abcd 9,1d 4,2a giống/dòng hoa huệ 5 6,0a 36,8ab 13,0ab 3,8ab kép sau 180 ngày a a d ab 10 5,7 40,5 7,7 3,8 Ghi chú: Các số có chữ số 15 6,1a 21,3cd 14,4a 3,8ab theo sau giống nhau là 20 6,2a 35,9abc 10,7c 4,1ab khác biệt không có ý nghĩa 25 4,3b 19,3d 12,4b 3,6b 30 3,6b 23,8bcd 7,9d 3,9ab thống kê qua phép thử F * * * * Duncan; *: khác biệt ở mức CV (%) 10,4 26,6 8,1 6,6 ý nghĩa 5%. - Thời gian ra hoa, chiều cao phát hoa, số hoa/phát hoa và đƣờng kính hoa Thời gian ra hoa của nghiệm thức ĐC củ và cây ở liều chiếu xạ 10 Gy là ngắn nhất (156 ngày). Ngược lại, cây xử lý chiếu xạ với liều 15 Gy có thời gian ra hoa kéo dài nhất lên đến 188,7 ngày. Trong khi chiều cao phát hoa ngắn nhất ở cây 30 Gy là 64,3 cm thì 19
23. chiều cao phát hoa trung bình trong khoảng 82,3 đến 97,7 cm ở nghiệm thức ĐC củ và các liều chiếu xạ 0; 5 và 10 Gy. Ngược lại, chiều cao phát hoa lớn nhất hơn 100 cm ở các nghiệm thức chiếu xạ với liều 15; 20 và 25 Gy. Số hoa ít nhất ở dòng hoa huệ khi xử lý liều chiếu xạ 10 Gy là 38,7 hoa trên phát hoa. Ngược lại, số hoa trên phát hoa nhiều nhất trên nghiệm thức ĐC cấy mô và dòng 5 Gy với trung bình khoảng 52 hoa/phát hoa. Đường kính hoa nhỏ nhất ở nghiệm thức ĐC củ; ĐC cấy mô; 5; 10 và 30 Gy (khoảng 4,0 cm). Các liều chiếu xạ còn lại có đường kính hoa lớn hơn (5,0 cm) (Bảng 4.6). Bảng 4.6: Đặc điểm ra hoa của giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 Liều chiếu xạ Thời gian ra Chiều cao Số hoa/phát Đƣờng kính (Gy) hoa (ngày) phát hoa (cm) hoa hoa (cm) ĐC củ 157,7d 97,7b 37,0b 4,1bc ĐC cấy mô 161,0cd 89,2b 51,7a 4,1bc 5 163,0cd 90,2b 52,3a 4,2bc 10 156,0d 82,3b 38,7b 3,8cd 15 188,7a 102,3a 48,0a 5,1a 20 177,7ab 106,3a 45,7a 5,3a 25 170,0bcd 104,7a 46,0a 5,2a 30 175,0abc 64,3c 45,3a 4,4b F * * * * CV (%) 4,5 17,8 54,6 9,1 Ghi chú: Các số có chữ số theo sau giống nhau là khác biệt không có ý nghĩa thống kê qua phép thử Duncan; *: khác biệt ở mức ý nghĩa 5%. - Các đặc điểm bất thƣờng ở các dòng hoa huệ kép đƣợc xử lý tia gamma (60Co) + Ở lá: Kết quả cho thấy rằng có các dạng bất thường ở hình dạng lá và màu sắc lá. Cây ĐC củ với lá mảnh; cây ĐC cấy mô; 5 và 10 Gy với lá có sắc tố màu tím ở gốc và có lá nhỏ dưới cùng nằm bên phải; cây 10 Gy với lá dưới cùng nhỏ nằm bên phải; cây 15 Gy có lá dính từ chóp lá vào trong; cây 20 Gy với lá có sọc vàng dọc theo chiều dài lá; cây 20 Gy có lá nhỏ dưới cùng nằm bên trái; 20
24. cây 25 Gy với lá dưới cùng có 2 lá nằm bên phải và cây 30 Gy với lá dưới cùng có 3 lá dưới cùng rất nhỏ, bản lá rộng và dày. + Ở thân và củ: Có tất cả 5 kiểu hình ở thân và củ ở các dòng hoa huệ kép đột biến. ĐC củ với thân có bẹ lá mọc xếp chồng lên nhau thành 2 bên ngay hàng; cây 5 và 10 Gy với thân có bẹ lá mọc xếp chồng lên, nhưng mọc lệch nhau thành hình tia với 4 lá; cây 15 Gy với thân có bẹ lá mọc xếp chồng lên hoặc cây tạo củ sớm, nhưng mọc lệch nhau thành hình tia với 6 lá; cây 25 Gy với thân có bẹ lá mọc xếp chồng lên, nhưng mọc lệch nhau thành hình tia với 8 lá. + Ở hoa: Có tất cả 18 kiểu hình khác nhau ở các dòng hoa huệ kép được xử lý chiếu xạ. Nghiệm thức ĐC cấy mô không có cây bất thường về số lượng cánh hoa nhưng có 2 cây có hoa với nhị vàng chiếm tần số 2,3%. Liều lượng chiếu xạ 5 Gy không làm thay đổi số cánh hoa nhưng cánh hoa có dạng suông dài, có vết màu xanh và thơm hoặc hoa có nhị vàng với tần số là 4,6%. Kiểu hình hoa bất thường xuất hiện nhiều nhất cây với liều chiếu xạ 10 và 15 Gy. Ở 10 Gy hoa xuất có sự giảm số cánh hoa từ 12 cánh còn 4; 5; 6; 9 và 10 cánh và có mùi thơm với tần số thấp. Ở các liều chiếu xạ cao hơn 15; 20 và 25 Gy, có sự gia tăng số cánh hoa gấp hai, gấp ba so với ĐC. Liều chiếu xạ 15 Gy cho dạng hoa 13; 16; 17; 18 và 19 cánh (tần số 1,1%). Liều chiếu xạ 20 Gy còn cho hoa với số cánh hoa tăng lên 22 cánh với tần số 5,8%, hoa có 36 và hơn 40 cánh với tần số 3,5%. Khi xử lý chiếu xạ với liều cao 30 Gy cho hoa với hình dạng méo mó, hoa trắng xanh và không nở hoàn toàn được và mất mùi thơm (khoảng 80%), có thể ít hơn 12 cánh với tần số 4,6% hoặc lên đến hơn 40 cánh với tần số 62,1% (Hình 4.4; Hình 4.5; Hình 4.6). 21
25. Nhị vàng a b c d e f g h Vết xanh Hình 4.4: Các bất thường về hình thái hoa ở các giống/dòng hoa huệ kép khi ra hoa lần 1 Ghi chú: a và c: hoa 12 cánh ở liều chiếu xạ 0 và 5 Gy; b: hoa có 6 cánh ở liều chiếu xạ 10 Gy; d: hoa có ít hơn 12 cánh ở liều chiếu xạ 30 Gy; e, f và g: hoa có 24 cánh và hơn 24 cánh ở liều chiếu xạ 15, 20 và 25 Gy và h: hoa có 4, 5, 6 và 10 cánh ở liều chiếu xạ 10 Gy. Hình 4.5: Dạng hoa bất thường với hoa nở và có mùi thơm ở các giống/dòng hoa huệ kép khi ra hoa lần 1 a Ghi chú: a: 15 Gy (hoa có 24 b c cánh); b: 20 Gy (hoa có 36 cánh; c: 20 Gy (hoa có hơn 40 cánh). + Mùi thơm: Dựa theo số lượng cánh hoa chia thành 4 nhóm: nhóm 1 hoa có 4; 5; 6; 9 và 10 cánh, nhóm 2 hoa có 13; 14; 16; 17; 18; 19; 22 hoặc 24 cánh, nhóm 3 hoa có hơn 24 cánh và nhóm 4 hoa không nở hoàn toàn. Dòng hoa huệ với liều xử lý 20; 25 và 30 Gy với đặc điểm hoa có rất nhiều cánh và không nở hoàn toàn không có mùi thơm. Tuy nhiên, mùi thơm các dòng hoa huệ nhóm 1 được đánh giá là 2 điểm thơm hơn ở các dòng hoa huệ nhóm 2 và giống ĐC được đánh giá là 1 điểm. Nhóm hoa thứ 3 và 4 không có mùi thơm được đánh giá là 0 điểm. 4.4.3. Trồng lần 2 (M2) Trong số các dòng hoa huệ có số lượng cánh hoa nhiều hơn 12 cánh, chọn được 2 dòng hoa huệ kép phù hợp mục tiêu có số lượng cánh hoa 22 và 36 cánh để trồng lần 2 (Hình 4.6). Từ đây, ghi nhận các kích thước một số bộ phận và đặc điểm hoa của các nhóm cây dựa trên số lượng cánh hoa (Bảng 4.7). 22
26. a b c d Hình 4.6: Các giống hoa huệ địa phương và dòng hoa huệ đột biến chọn được khi trồng lần 2 Ghi chú: a: ĐC củ hoa 6 cánh; b: ĐC củ 12 cánh; c: dòn g hoa bất thường 22 cánh và d: dòng hoa bất thường 36 cánh Bảng 4.7: Đặc điểm nông học của các giống/dòng hoa huệ chọn được sau khi trồng lần 2 Đặc tính ĐC 6 cánh ĐC 12 cánh Dòng 22 cánh Dòng 36 cánh Số chồi 6,0 5,0 7,0 8,0 Số lá 8,0 9,5 18,0 14,0 Số lá/phát hoa 12,0 24,5 15,0 20,0 Chiều dài lá (cm) 49,9 45,0 46,5 43,0 Chiều rộng lá (cm) 1,2 1,4 1,3 0,9 Chiều dài lóng thân (cm) 6,9 8,0 15,3 10,0 Số củ 4,0 3,0 4,0 6,0 Đường kính củ (cm) 3,0 3,8 4,1 4,2 Thời gian ra hoa (ngày) 147,7 120,0 123,0 145,0 Chiều cao phát hoa (cm) 91,0 97,7 141,0 133,0 Chiều cao cụm hoa (cm) 35,0 42,1 46,0 39,0 Số hoa/phát hoa 36,0 37,0 38,0 40,0 Thời gian hoa tàn (ngày) 7,0 14,0 16,0 20,0 Đường kính hoa (cm) 3,0 4,1 5,1 5,4 4.4.4. Đánh giá đa dạng di truyền các giống/dòng hoa huệ bất thƣờng chọn đƣợc 4.4.4.1. Kết quả phân tích sự đa hình chỉ thị ISSR sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền các dòng/giống hoa huệ Trong 14 mồi ISSR thu được 4 mồi có khuếch đại rõ và cho tổng số là 84 phân đoạn được nhân lên với trung bình 21,0 ± 5,89 23
27. băng/đoạn mồi. Trong đó có 84 phân đoạn đa hình chiếm tỷ lệ 100%. Số lượng băng đa hình từ 13 (đoạn mồi 808) đến 27 băng (đoạn mồi 3A39). Kích thước các mồi dao động trong khoảng 150 - 3.000 bp. 4.4.4.2. Đánh giá đa dạng di truyền của các giống/dòng hoa huệ nghiên cứu bằng sự khác biệt vị trí các băng ADN Phân tích ISSR với mồi UBC 873 cho sản phẩm khuếch đại 23 băng ADN có kích thước phân tử trong khoảng 200 đến 3.000 bp. Cây hoa huệ đột biến với 22 cánh xuất hiện thêm băng ADN ở hai vị trí 250 bp và 1.000 bp trong khi đó băng ADN mất đi ở vị trí 300; 350; 850; 1.250 và 3.000 bp so với giống hoa huệ gốc có 12 cánh. Đối với dòng hoa huệ đột biến có 36 cánh, băng ADN bị mất đi ở vị trí 300; 350; 850 và 1.250 bp còn ở các vị trí 1.000 và 2.750 bp lại xuất hiện băng ADN mới so với giống gốc. Với mồi P23SR1, sự xuất hiện các băng ADN mới ở cả hai dòng hoa huệ đột biến ở các vị trí 500; 600; 800; 1.750 và 2.000 bp so với giống gốc. Đồng thời 2 dòng đột biến này cũng có vị trí các băng ADN khác biệt nhau nên có thể phân biệt với nhau. Hai mồi 3A39 và 808 cũng có sự xuất hiện mới và mất đi băng ADN, nhưng với số lượng ít hơn chỉ với 1 băng khác biệt so với ĐC (Hình 4.7). c. Kết quả về mối quan hệ di truyền giữa các giống/dòng hoa huệ nghiên cứu Kết quả hệ số tương đồng di truyền về kiểu gen của các giống/dòng hoa huệ nghiên cứu, dựa trên cơ sở phân tích 4 mồi ISSR đa hình (Bảng 4.8). Hệ số này biến thiên trong khoảng 0,375 đến 0,786. Trong những kiểu gen nghiên cứu, chỉ số tương đồng thấp nhất là 0,375 giữa giống hoa huệ gốc 12 cánh và dòng hoa huệ đột biến có 22 cánh. Vì vậy hai giống/dòng này thể hiện sự khác biệt lớn về mặt di truyền. Kiểu gen hoa có 6 cánh và dòng đột biến có 36 cánh cho thấy có mối quan hệ di truyền gần nhau vì có chỉ số tương đồng cao nhất (0,786). 24
28. Sơ đồ nhánh dựa trên sự phân tích đa hình các mồi ISSR chia 4 kiểu gen hoa huệ thành hai nhóm chính với chỉ số tương đồng 0,43%. Nhóm thứ nhất gồm 3 kiểu gen với hoa 6, 22 và 36 cánh. Nhóm thứ hai chỉ có giống có hoa 12 cánh. Điều này cho thấy, mặc dù hai dòng hoa huệ đột biến phát sinh từ việc xử lý đột biến giống hoa huệ gốc có 12 cánh nhưng lại có mối quan hệ di truyền gần gũi với giống hoa huệ 6 cánh hơn. Có lẽ mối quan hệ di truyền với hệ số tương đồng thấp giữa 2 dòng hoa huệ đột biến với giống gốc là do một số hạn chế trong kỹ thuật PCR - ISSR (Hình 4.8). M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 3.000 bp Hình 4.7: Phổ 3.000 bp 2.000 bp điện di sản phẩm 900 bp PCR của các dòng 1.250 bp 600 bp 850 bp hoa huệ đột biến 300 bp và giống gốc với một số mồi ISSR b a a) Mồi UBC 873; b) mồi P23SR1; c) Mồi M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 3A39; d) Mồi 808. 1: giống hoa huệ đơn 6 1.000 bp 1.250 bp cánh, 2: dòng hoa 700 bp 600 bp huệ 22 cánh, 3: dòng hoa huệ 36 cánh, 4: giống hoa huệ kép 12 c d cánh. M: Thang chuẩn 100 bp , : băng ADN mới, : băng ADN mất đi. Bảng 4.8: Hệ số tương đồng di truyền của các giống/dòng hoa huệ chọn được với 4 cặp mồi ISSR Giống Dòng đột Dòng Giống hoa hoa 6 biến 22 đột biến 12 cánh cánh cánh 36 cánh Giống hoa 6 cánh 1,000 Dòng đột biến 22 cánh 0,643 1,000 Dòng đột biến 36 cánh 0,786 0,571 1,000 Giống hoa 12 cánh 0,429 0,375 0,500 1,000 25
29. Hình 4.8: Sơ đồ hình nhánh về mối quan hệ di truyền giữa các kiểu gen hoa huệ dựa trên dữ liệu ISSR 4.4.4.3. Giải trình tự vùng ITS các giống/dòng hoa huệ Kết quả BLAST trên NCBI cho thấy các trình tự ITS của giống hoa huệ có 6 và 12 cánh cũng như hai dòng hoa huệ đột biến với 22 và 36 cánh tương đồng cao với các trình tự ITS của 2 loài thuộc chi Polianthes spp. khoảng 95 - 99%. Khi so sánh trình tự ADN vùng gen này của các mẫu cây, giữa hai giống hoa huệ đơn và kép có 12 vị trí khác nhau về nucleotid. Khi so sánh trình tự ADN hai dòng hoa huệ đột biến có 22 cánh và 36 cánh có 32 và 33 vị trí sai khác về nucleotid theo thứ tự so với giống gốc có 12 cánh với các dạng đột biến thay thế, mất hoặc thêm 1 nucleotide hoặc 1 đoạn nucleotide. Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận (1) Môi trường BM + 1,0 mg/l NAA + 4,0 mg/l BA thích hợp cho tạo mô sẹo và cụm chồi in vitro; (2) Khi xử lý tia gamma 60 ( Co), LD50 của các giống/dòng hoa huệ đơn trong khoảng 10 - 15 Gy (giá trị tính là 10,96 ± 2,96 Gy) còn LD50 của các giống/dòng hoa huệ kép trong khoảng 20 - 25 Gy (giá trị tính là 22,91 ± 4,01 Gy); (3) Giai đoạn thuần dưỡng, các cây còn nhỏ nên sự khác biệt về hình thái lá và chồi không nhận thấy rõ ràng và (4) Dòng hoa 26
30. huệ đơn đột biến ở liều 25 và 30 Gy có sự tăng cánh hoa, mùi thơm tốt hơn nhưng không tạo được dạng hoa kép. Ở hoa huệ kép chọn được 2 dòng đột biến tiềm năng nhất về đặc điểm hoa to và có mùi thơm với 22 và 36 cánh ở liều chiếu xạ 20 Gy. Quy trình tạo dòng hoa huệ đột biến bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro như sau: 5.2. Đề nghị Tiếp tục theo dõi đặc điểm nông học của các dòng hoa huệ đột biến mới chọn lọc được. Sau đó, nhân nhanh số lượng cây để ứng dụng cho sản xuất và thương mại. 27